Phát hiện vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật phân tử = Detection of Escherichia coli which cause diarrheal disease in human by molecular technology

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ Tên đề tài: Phát hiện vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh tiêu chảy ở ng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

Tên đề tài: Phát hiện vi khuẩn Escherichia coli gây

bệnh tiêu chảy ở người bằng kỹ thuật phân

tử

Mã số đề tài: TN.18.14

Chủ nhiệm đề tài: TS Phạm Thanh Hiền

3 Danh sách các cán bộ thực hiện đề tài:

TT Học vị, họ và tên Đơn vị công tác Vai trò thực hiện đề tài

(Chủ nhiệm/Tham gia)

1 TS Phạm Thanh Hiền Bộ môn Vi sinh vật học,

Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN

Chủ nhiệm

4 Đơn vị chủ trì thực hiện: Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN

5 Thời gian thực hiện:

5.1 Theo hợp đồng: Từ tháng 6 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019

5.2 Gia hạn (nếu có): Gia hạn đến tháng 12 năm 2019

5.3 Thực hiện thực tế: Từ tháng 7 năm 2018 đến tháng 12 năm 2019

6 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt của đề tài: 25 triệu đồng

7 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có)

(Về mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; nguyên

nhân; ý kiến của Trường ĐHKHTN)

Không có

PHẦN II TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Viết theo cấu trúc một bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang, nội dung gồm các phần:

1 Đặt vấn đề

Tiêu chảy là bệnh có thể gặp ở mọi lứa tuổi, ở người lớn bệnh thường ít nguy hiểm đến tính mạng nhưng gây ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, khả năng lao động và sinh hoạt của người bệnh Tiêu chảy rất nguy hiểm đối với trẻ em dưới 5 tuổi, đặc biệt là ở trẻ từ 0 đến 2 tuổi Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, tỷ lệ mắc tiêu chảy trung bình ở trẻ em dưới

5 tuổi là trên 3 lần/ trẻ em/ năm Tuy nhiên, ở một số nước đang phát triển con số này có thể cao tới 12 lần/trẻ em/năm Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho biết, số lần bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ là 2,2 lần [2,19] Đây là bệnh đứng thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ dưới 5 tuổi chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp, trong đó hơn 80% số ca tử vong ở trẻ từ 0

- 2 tuổi Nguyên nhân chính gây tử vong khi bị tiêu chảy là do mất nước và điện giải, tiếp theo là suy dinh dưỡng Suy dinh dưỡng và tiêu chảy tạo thành một vòng xoắn bệnh lý: tiêu chảy dẫn đến suy dinh dưỡng và khi trẻ bị suy dinh dưỡng lại có nguy cơ bị tiêu chảy cao

hơn [2] Tác nhân chính gây bệnh là vi khuẩn E coli, trong đó có nhiều nhóm gây bệnh khác nhau như STEC (shiga toxin producing E coli), ETEC (enterotoxigenic E coli), EPEC (enteropathogenic E coli), EIEC (enteroinvasive E coli), EHEC (enterohemorrhagic E

2

coli), EaggEC (enteroaggregative E coli) và DAEC (diffusely adherent E coli) Vi khuẩn

thường mang các gen độc lực khác nhau giúp chúng có thể bám vào niêm mạc ruột, giải

phóng yếu tố tan máu và độc tố ruột Trong số các gen độc lực đó gen eae (E coli attaching

and effacing) được xem là gen phổ biến có mặt hầu hết trong các nhóm EPEC, EHEC Có

rất nhiều phương pháp khác nhau để xác nhận sự có mặt của gen eae như PCR, real time

PCR hoặc microarray… tuy nhiên kết quả của các phương pháp này thường bị phụ thuộc vào kỹ thuật, thao tác tiến hành và sử dụng các thiết bị đắt tiền

Năm 2000, Notomi và cộng sự đã phát triển một kỹ thuật mới khuếch đại DNA trên

cơ sở nguyên lý khuếch đại của PCR nhưng có độ đặc hiệu và độ nhạy cao gấp nhiều lần so với PCR, quá trình khuếch đại DNA diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt nên không cần phải sử dụng các máy móc hiện đại Hiện nay, LAMP được xem là một phương pháp phổ biến sử dụng trong chẩn đoán nhanh các tác nhân virut, vi khuẩn và nấm Với mong muốn tìm ra một phương pháp chẩn đoán nhanh nhưng vẫn đảm bảo độ chính xác, có thể tiến hành bằng các thiết bị đơn giản dễ dàng áp dụng rộng rãi tại các tuyến y tế cơ sở nhằm góp phần nâng

cao hiệu quả trong phòng chống, kiểm soát và điều trị vi khuẩn E coli gây tiêu chảy ở người chúng tôi đã lựa chọn kỹ thuật LAMP để phát hiện gen độc tố eae gây tiêu chảy Gen eae mã hóa cho protein intimin có trọng lượng phân tử là 94- 97 kDa là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC cần thiết cho việc tạo tổn thương mô học niêm mạc ruột Gen eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC nhưng không có ở những dòng vi khuẩn E coli thuộc hệ vi

khuẩn đường ruột thông thường [18] Đây được xem là một trong những chỉ thị phân tử để phát

hiện ra các vi khuẩn E coli gây tiêu chảy ở người

2 Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu

Mục tiêu: Phát triển được kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt gen eae đặc hiệu vi khuẩn E.coli

Phạm vi nghiên cứu

Nội dung 1: - Phân lập vi khuẩn E.coli gây bệnh từ mẫu phân trẻ bị tiêu chảy

- Thu thập các chủng nghi ngờ là nhiễm E.coli từ phòng xét nghiệm của bệnh viện

Thái Nguyên

Nội dung 2: - Phát hiện gen độc tố của vi khuẩn E.coli bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật nhân

gen đẳng nhiệt LAMP

- Sử dụng phần mềm thiết kế mồi dựa trên trình tự gen eae đã được công bố trên Genbank

- Tách chiết ADN: sử dụng các phương pháp thường quy hoặc kit thương mại

- Sử dụng kỹ thuật PCR nhân gen eae bằng các đoạn mồi đặc hiệu

- Sử dụng kỹ thuật LAMP nhân gen eae bằng 4 mồi đặc hiệu

- Xác định độ đặc hiệu của phương pháp LAMP

So sánh giới hạn phát hiện ADN của 2 phương pháp PCR và LAMP

3 Tổng quan tài liệu

Escherichia coli (E coli) là một loại vi khuẩn sống trong đường ruột của người và

động vật Có rất nhiều typ khác nhau nhưng hầu hết trong số chúng không gây bệnh và là

thành phần của khu hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa Dựa vào tính chất gây bệnh E.coli được chia thành EPEC (Enterophathogenic E.coli) - E.coli gây bệnh đường ruột [1]

 EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli) - E.coli gây chảy máu đường ruột (gồm hai

3

phân nhóm là EHEC1 và EHEC2)

 STEC – (Shiga toxin producing E.coli) – E.coli sinh độc tố shiga

 AEEC – (attaching and effacing E.coli) - E coli gây kết dính đường ruột

Trong những nhóm gây bệnh kể trên cần kể đến nhóm AEEC là nhóm có khả năng

sinh ra intimin gây ra hiện tượng kết dính niêm mạc ruột [2,10] được mã hóa bởi gen eae

lần đầu tiên được phát hiện ở nhóm EPEC và EHEC [9] Có ít nhất 27 dạng intimin khác

nhau đã được xác định dựa vào trình tự đầu 3’ của gen eae tạo nên sự đa dạng của nhóm vi

khuẩn đường ruột gây tiêu chảy này Có nhiều công bố sử dụng các kỹ thuật khác nhau để

phát hiện gen eae ví dụ như PCR [13, 2, 4], multiplex PCR [13] hoặc Real time PCR [6]

hay Microarray [7] tuy nhiên những phương pháp này không xác định được tất cả các chủng mang gen tổng hợp intimin và cần sử dụng các thiết bị đắt tiền cũng như các kỹ thuật viên được đào tạo Như vậy, những phương pháp này chỉ có thể áp dụng trong phòng thí nghiệm chứ không thể ứng dụng ngoài thực tế Do đó, việc phát triển một kỹ thuật mới, có thể xác định được tất cả các dạng intimin khác nhau chỉ trong một bước duy nhất và dùng

một thiết bị đơn giản là rất có triển vọng ứng dụng trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy do E coli

Một công cụ chẩn đoán phân tử mới được gọi là khuếch đại đẳng nhiệt có tạo thành các loop (LAMP) đã chứng minh được rằng: ADN có thể được khuếch đại ở điều kiện đẳng nhiệt mà không cần phải có chu trình nhiệt biến đổi như PCR Không giống như PCR, ADN đích sử dụng trong phương pháp này không cần phải biến tính để tách chuỗi, lượng sản phẩm phản ứng sau khi được khuếch đại với một thời gian rất ngắn lại rất lớn và các phản ứng dương tính có thể phát hiện được bằng mắt thường thay vì phải điện di như phương pháp PCR [11] Ưu điểm của phương pháp này là rất đơn giản, chỉ cần một bể ổn nhiệt hoặc một thiết bị gia nhiệt có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định là có thể tiến hành phản ứng

Phương pháp LAMP sử dụng một ADN polymerase và 4 mồi được thiết kế đặc hiệu dựa trên 6 trình tự khác biệt trên gen đích Mồi trong có trình tự tương tự và bổ sung với trình tự mạch LAMP khởi đầu Cặp mồi ngoài có khả năng tách chuỗi phân tử ADN cùng

với sự hỗ trợ của Bst hoặc Bsm polymerase có hoạt tính tách chuỗi cao tạo ra phân tử ADN

mạch đơn Sợi đơn này sau đó sẽ tạo thành cấu trúc dạng kẹp tóc tạo điều kiện khởi đầu cho phản ứng khuếch đại bởi LAMP Đây là phương pháp mới hiện đang được dùng phổ biến để chẩn đoán nhanh trong lĩnh vực sinh y học dựa trên khả năng tổng hợp một lượng lớn ADN

mà không cần máy biến nhiệt được thực hiện bởi một ADN polymerase đặc biệt và ít nhất hai cặp mồi đặc hiệu Bước đầu tiên của quá trình khuếch đại, bốn mồi được sử dụng để tổng hợp khuôn cho phản ứng LAMP từ gen đích, sau đó hai mồi được sử dụng cho mỗi chu kỳ Toàn bộ quá trình khuếch đại đoạn ADN đích cần thời gian khoảng 40 đến 60 phút Sản phẩm cuối cùng nhận được là các đoạn ADN kép dạng gấp khúc có kích thước gấp nhiều lần kích thước của đoạn gen cơ sở Toàn bộ dung dịch sau phản ứng có thể quan sát được bằng mắt thường dưới sự thay đổi của các chỉ thị mà không cần điện di trên gel agarose ADN

polymerase thường được sử dụng trong các phản ứng LAMP là Bst ADN polymerase hoặc Bsm ADN polymerase có hoạt tính tự tách chuỗi cao Do sử dụng 2-3 cặp mồi bắt cặp bổ

sung với 6-8 đoạn trình tự trên gen đích nên phương pháp này có độ đặc hiệu và độ nhạy rất

4

cao, có thể thu được kết quả tốt ngay ở nồng độ ADN thấp [11] Oriel và cs năm 2010 đã

công bố sử dụng phương pháp LAMP có thể phát hiện được gen rim và p150 của vi khuẩn Theileria parva ở giới hạn 1 fg [12], còn Chen năm 2009 đã công bố có thể phát hiện được gen rimM của vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis và Mycobacterium bovis ở giới hạn là 1

pg [3] Như vậy có thể thấy phương pháp LAMP có giới hạn phát hiện thấp hơn nhiều so với phương pháp PCR hoặc Real-time PCR nên có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác hơn so với các phương pháp sinh học phân tử khác Tuy nhiên, mồi dùng cho phản ứng LAMP lại phức tạp hơn mồi cho phản ứng PCR thông thường Phản ứng LAMP cần phải sử dụng hai cặp mồi, một cặp có chiều dài khoảng 40 nucleotit và được thiết kế đặc biệt, cặp còn lại có chiều dài khoảng 20 nucleotit [11]

Thêm vào đó, toàn bộ quá trình từ lúc khuếch đại gen đích và phát hiện sản phẩm phản ứng đều diễn ra trong 1 ống thí nghiệm ở điều kiện đẳng nhiệt Ưu điểm của phương pháp này là có thể hạn chế sự nhiễm ADN ra khu vực xung quanh, điều mà phương pháp PCR không đảm bảo được do phải tiến hành điện di sản phẩm PCR và soi dưới máy UV Như vậy, nếu sử dụng phương pháp LAMP thì không cần đến các thiết bị phòng thí nghiệm hiện đại và rất dễ dàng thao tác ở ngoài phòng thí nghiệm

Kỹ thuật LAMP có những ưu điểm mà kỹ thuật PCR không có được như:

 Không đòi hỏi máy biến nhiệt đắt tiền như PCR bởi vì tất cả phản ứng diễn ra tại một nhiệt độ cố định, dao động từ 60- 65oC, tùy thuộc vào hàm lương GC trong mồi

 Kết quả có thể được đọc ngay bằng mắt thường sau khi phản ứng kết thúc mà không cần điện di trên gel agarose

 Thời gian thực hiện phản ứng rất ngắn, trong vòng 60 phút với giới hạn phát hiện cao hơn kỹ thuật PCR

 Sự khuếch đại đặc hiệu cao vì có đến 2-3 cặp mồi nhận biết 6-8 vùng riêng biệt trên ADN khuôn

 Trong phương pháp LAMP lượng ADN tổng hợp được lớn hơn gấp nhiều lần so với PCR

 Phương pháp LAMP có thể thực hiện khuếch đại RNA bằng cách bổ sung thêm enzym phiên mã ngược vào trong hỗn hợp phản ứng

Chính từ những ưu điểm đó, chúng tôi phát triển kĩ thuật này để phát hiện vi khuẩn

E.coli mang gen eae gây bệnh tiêu chảy ở người nhằm chẩn đoán nhanh chính xác tác nhân

gây bệnh trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà không cần mất nhiều thời gian như những

phương pháp thông thường khác

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

Cách tiếp cận

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện vi sinh vật gây bệnh, bao gồm

cả những phương pháp truyền thống và các phương pháp phân tử hiện đại Tuy nhiên, trong

chẩn đoán tiêu chảy do vi khuẩn E coli các phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc, thử các tính chất sinh vật, hóa học giúp phát hiện vi khuẩn E.coli nhưng không thể phân biệt giữa các vi khuẩn E coli hội sinh cư trú bình thường ở đường ruột với các vi khuẩn E coli

mang gen độc lực gây bệnh

5

Gen eae được phát hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn E.coli thuộc nhóm EPEC chủng O127 bởi

Jerse và cộng sự năm 1990 [9] và sau đó ở vi khuẩn nhóm EHEC chủng EDL933 bởi Yu và Kaper năm 1992 Không giống như trình tự đầu 5’, trình tự ở đầu 3’ có tính không đồng nhất [5] Có ít nhất 17 dạng intimin khác nhau và các dưới đơn vị [1, 2, 8] được xác định bằng phương pháp PCR và RFLP Tuy nhiên nếu chỉ sử dụng các phương pháp PCR thông

thường sẽ không phát hiện được hết các subtype của gen eae Phương pháp LAMP được

phát triển lần đầu tiên bởi Notomi và cộng sự năm 2000, Zablon 2012 ngoài tính đặc hiệu và nhạy (có thể phát hiện được ADN đích ở nồng độ pg) thì còn có khả năng phát hiện tất cả

các biến thể của eae trong cùng một phản ứng [11,14] Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết

kế mồi khuếch đại gen eae tại vùng 5’ của gen để có thể phát hiện được gen eae của hơn 20 dạng gen eae mã hóa intimin khác nhau cho kết quả nhanh và chính xác nhất so với phương

pháp PCR hoặc real time PCR

Nguyên liệu

- 25 mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy tại Khoa Vi sinh, Bệnh viện Trung ương

Thái Nguyên dùng cho nghiên cứu phân lập vi khuẩn E coli

- Các chủng vi khuẩn YTN1, YTN2, là các vi khuẩn E coli không gây bệnh, được

cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên

- Hóa chất gồm: SYBR Green I, Betain, Calcein, pepton, cao thịt, agar, phenol, chloroform, iso-amylalcohol, glycerol, ethanol, MgSO4, MnCl2, NaCl, HCl, NaCH3COO, axit acetic, lactose, sodium chloride, sodium citrate, sodium deoxycholate, Neutral red, nước cất, nước khử ion, bộ Kit API - 20E

- Mồi nhân gen (5’-3’): Mồi nhân gen eae bằng kỹ thuật PCR kí hiệu SK1/SK2 (Mồi

xuôi CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC;

Mồi ngược CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG) của vi khuẩn E coli

Mồi nhân gen eae bằng kỹ thuật LAMP: F3 (CGACGATTTGGTCGTTGAA);

B3 (TGTCATCGGTCATGTTGC);

FIB (CAAAATGATCTGCTGACCAGGCTTTTTAAGCATTTATACAGTTCTGAAAGC) BIP (ACAGTGCACTACCACTTTTAGGTTTTTCATTTTAGTCAGTTTATTCGTGTGA)

Phương pháp nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn

Các mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy được thu thập ngay khi người bệnh bị tiêu chảy cấp, bệnh phẩm được lấy trước khi người bệnh dùng thuốc kháng sinh Dùng que tre vô trùng lấy khoảng 1-2 ml phân cho vào hộp đựng mẫu vô trùng Hộp đựng mẫu phải dán nhãn, ghi đầy đủ thông tin người bệnh, người lấy mẫu và thời gian thu mẫu Sau đó, các mẫu phân được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm vi sinh để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo Các vi khuẩn được phân lập từ mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy trên môi trường chọn lọc DCL, ủ ấm ở 37o

C, sau 18 - 24 giờ, quan sát hình thái khuẩn lạc Trên môi trường

DCL các khuẩn lạc dạng S, có màu hồng, kích thước 1,5 - 2 cm nghi ngờ là vi khuẩn E coli

tiếp tục cấy ria sang đĩa môi trường thạch máu để kiểm tra các tính chất tiếp theo Những

khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn E coli được làm tiêu bản nhuộm Gram Nếu thấy là trực khuẩn Gram (-) được dự đoán là vi khuẩn E coli thì tiến hành thực hiện các kiểm tra tính

Tách chiết DNA từ vi khuẩn

Vi khuẩn sau khi được nuôi trong môi trường LB ở 28oC trong 18 giờ, thu sinh khối Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống eppendoft và ly tâm 5000 vòng/phút trong 7 phút thu

tế bào Tế bào được hòa tan trong 0,5 ml đệm TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8), ly tâm thu tế bào [8] Bổ sung 0,5 ml TE, 3 µl RNAse, 2 µl lysozyme, trộn đều và để nhiệt độ phòng trong 30 phút Thêm 30 µl SDS 10%, 3 µl proteinase K trộn đều ủ 37oC trong 60 phút Bổ sung 180 µl 5M NaCl, ủ 65oC trong 10 phút, ly tâm thu dịch nổi ở trên Chiết DNA hai lần bằng hỗn hợp Phenol: Choloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1), ly tâm thu pha trên DNA genome được tủa trong 70% cồn ở –20oC trong 30 phút Ly tâm thu tủa và làm khô, sau đó bổ sung 40 µl TE để hòa tan DNA genome Điện di kiểm tra sản phẩm DNA genome sau tách chiết trên gel 0,8% agarose

C trong 4

phút (2) Khuếch đại gen eae trong 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước Bước 1: Biến tính

sợi khuôn DNA ở 940C trong 30 giây Bước 2: Mồi bắt cặp bổ sung với đoạn gen tương đồng trên sợi khuôn ở 450

C trong 40 giây Bước 3: Tổng hợp kéo dài chuỗi ở 720C trong 1 phút 50 giây.(3) Phản ứng kết thúc ở 720C trong 5 phút 30 giây để tạo sợi DNA hoàn chỉnh

và ủ mẫu ở 220

C

Kỹ thuật LAMP

LAMP là phản ứng tự tổng hợp DNA vòng khi có mặt của Bst DNA polymerase ở điều

kiện đẳng nhiệt Phương pháp này sử dụng 2 cặp mồi khác nhau vì thế sản phẩm khuếch đại rất đặc hiệu Phản ứng có tốc độ nhanh, diễn ra trong khoảng thời gian ngắn chỉ từ 30- 60 phút

Thành phần đệm LAMP 1X gồm (200 mM Tris HCl pH 8,8, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 1% Triton 100X, 25 mM MnCl2) Thành phần phản ứng (25µl): 5M Betatin, 1X buffer LAMP, 25 mM dNTPs, 25 mM MgSO4, 2 µM B3 và F3, 20 µM BIP và FIP, 8 U/µl Bst polymearas, DNA và dH2O đến thể tích cuối cùng Chu trình nhiệt như sau: 64o

C trong 60 phút, 80ºC trong 10 phút và kết thúc ở 22oC Sản phẩm LAMP được quan sát bằng điện di trên gel agarose 2% hoặc bằng mắt thường khi có bổ sung chỉ thị kim loại Calcein trước phản ứng Hỗn hợp Calcein và Mn2+

được thêm vào trước phản ứng Do sự có mặt của ion Mn2+, Calcein liên kết với Mn2+

không phát quang, dung dịch có màu da cam Khi phản ứng khuếch đại DNA xảy ra với sự có mặt của DNA đích, sản phẩm phụ là ion P2O74- được tạo thành sẽ kết hợp với ion Mg2+

tạo thành muối Mg2P2O7, sau đó ion Mn2+

đẩy Mg2+ khỏi muối để tạo thành muối Mn2P2O7 và giải phóng ion Mg2+ Mg2+ tự do trong dung dịch sẽ kết

7 hợp với Calcein tạo ra phức hợp Calcein-Mg phát quang [16]

8

Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP

Để xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP với các cặp mồi nhận biết gen eae của

vi khuẩn E coli gây tiêu chảy Chúng tôi sử dụng các vi khuẩn YTN1, YTN2 là những vi khuẩn E coli không gây bệnh được cung cấp bởi Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Dược

Thái Nguyên, genom được tách chiết theo phương pháp giống như các mẫu bệnh phẩm đã trình bày ở trên để sử dụng làm đối chứng âm trong phản ứng LAMP

Xác định độ nhạy của phản ứng LAMP

Nồng độ DNA ban đầu được xác định bằng máy nanodrop, sau đó tiến hành pha loãng theo cơ số 10 đến khi đạt các nồng độ pha loãng DNA mong muốn Xác định ngưỡng nồng độ DNA mà phản ứng vẫn diễn ra.DNA tổng số được tách trực tiếp từ khuẩn lạc theo

bước tiến hành như sau:

Điện di DNA trên gel agarose

Hóa chất điện di: agarose 0,8 -2 % (phụ thuộc vào kích thước phân tử ADN); dung dịch đệm 50x TAE (24,2% Tris-base, 5,7% axit acetic, 50 mM EDTA pH 8); dung dịch đệm tra mẫu đặc 5 lần (30% glycerol, 0,25% Bromophenol Blue, 0,25% Xylen Cyanol FF); dung dịch nhuộm 0,5 g/ml EtBr

Quy trình điện di:

- Chuẩn bị gel agarose: hòa 0,8 hoặc 2 gram agarose vào 100 ml dung dịch đệm 1x TAE tương ứng với gel 0,8% và gel 2%, cho vào lò vi sóng quay dung dịch agarose cho đến khi tan hết, để nguội đến khoảng 40-50oC, đổ dung dịch agarose vào khay gel điện di đã cài sẵn lược để tạo các giếng nhỏ chứa mẫu Độ dày của gel tuỳ thuộc mục đích sử dụng Để thời gian 30 phút cho gel đông và ổn định hoàn toàn Gỡ lược và đặt khay gel vào bể điện di,

đổ đệm 1x TAE tới khi ngập bề mặt gel từ 1 đến 2 cm

- Dung dịch sản phẩm phản ứng được trộn đều với đệm lót mẫu 5x (tỷ lệ 1:5 về thể tích) và được tra vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 90 V, trong khoảng thời gian 30 phút Thang DNA chuẩn được chạy cùng các mẫu

để xác định kích thước các băng của các mẫu cần xác định

- Sau khi điện di xong, bản gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm trong dung dịch chứa EtBr nồng độ 0,5 g/ml trong 20 phút, sau đó gel được rửa bằng nước, các băng DNA được quan sát dưới đèn tử ngoại (bước sóng 260-280 nm) trên máy soi DNA và chụp ảnh

5 Nội dung và kết quả nghiên cứu

5.1 Phân lập và định danh chủng vi khuẩn E coli

Từ 25 mẫu bệnh phẩm phân thu được từ bệnh nhân tiêu chảy tại Khoa Vi sinh - Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên vào tháng 6 năm 2018 Chúng tôi phân lập trên môi trường chọn lọc DCL, ủ ở 37o

C, sau 18- 24 giờ quan sát hình thái khuẩn lạc Các khuẩn lạc nghi

ngờ là vi khuẩn E coli sẽ được cấy trên môi trường thạch máu, nuôi ở nhiệt độ 35o

C, sau 18 -24 giờ khuẩn lạc phát triển với đường kính khoảng 1,5 mm, dạng S (tròn, bờ đều, lồi bóng), màu trắng đục, tan máu nhẹ hoặc không gây tan máu Trên môi trường chọn lọc DCL, sau

18 - 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn cho khuẩn lạc dạng S, màu hồng, kích thước khoảng 1,5 - 2

mm Kết quả được trình bày trong hình 1

9

Hình 1 Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường DCL

Kết quả đã sàng lọc được 25 mẫu vi khuẩn trực tiếp từ mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy, trong điều kiện vô trùng, chiếm 100% tổng số mẫu Các mẫu vi khuẩn đều có chung một dạng hình thái, màu sắc và kích thước hoàn toàn đồng nhất, không thấy có khuẩn lạc nào khác biệt và đều bắt màu vi khuẩn Gram âm

10

Toàn bộ 25 mẫu vi khuẩn này tiếp tục được định danh bằng bộ Kit API - 20E do hãng BioMerieux sản xuất Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên đĩa môi trường thạch máu, ở 37oC trong khoảng thời gian 18 - 24 giờ Chọn một khuẩn lạc đơn, điển hình để tiến hành thử nghiệm các tính chất sinh vật hóa học theo quy trình kèm theo của bộ kit

Kết quả trên hình 2 cho thấy: giếng đầu tiên là thử nghiệm ONPG, giúp nhận biết sự

có mặt của enzyme β - galatosidase, đây là enzym có liên quan tới quá trình dị hoá lactose, nếu dương tính cho kết quả màu vàng, âm tính cho kết quả màu trắng Ba phản ứng tiếp theo lần lượt là arginin, lysin và ornithin là thử nghiệm tách carboxyl của amino acid Phản ứng decarboxyl dương tính các giếng này sẽ chuyển sang màu đỏ, âm tính có màu vàng Chín giếng cuối là các phản ứng xác định sự lên men của carbohydrat (glucose, mannitol, inositol, sorbitol, rhamnose, sucrose, melibiose, amygdalin và arabinose) Sự lên men nếu diễn ra, các giếng sẽ chuyển sang màu vàng, âm tính cho kết quả màu xanh đậm Sự có mặt của sản phẩm H2S và gelatin hydrolysis (GEL) được thể hiện bằng mầu đen bao phủ khắp ống Phản ứng dương tính của tryptophan deaminase (TDA) thể hiện bằng màu nâu sẫm khi thêm thuốc thử là FeCl3 Như vậy các vi khuẩn đều có chung một số tính chất như: ONPG (+), Glu (+), Sor (+), H2S(-), Urea (-), IND (+), đây là những tính chất sinh hóa cơ bản của vi

khuẩn E coli Giữa các chủng vi khuẩn có thể có một vài tính chất sinh hóa khác nhau, như

chủng E11 cho phản ứng SAC dương tính, trong khi 4 chủng còn lại bao gồm E2, E4, E10, E25 đều có kết quả âm tính với SAC Tuy nhiên, khi kiểm tra bằng phần mềm APIweb thì

tất cả các chủng trên đều cho kết quả là vi khuẩn E coli với độ tương đồng từ 86,6 đến

99,9% Kết quả các phản ứng sinh hóa của 25 chủng vi khuẩn nghiên cứu được trình bày trong bảng 1

Bảng 1 Kết quả kiểm tra tính chất sinh vật hóa học các chủng E coli