Phân tích hàm lượng vitamin a trong một số loại ngũ cốc chế biến ở thành phố huế và một số vùng phụ cận bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ THỊ NHƯ NGỌC PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VITAMIN A TRONG MỘT SỐ LOẠI NGŨ CỐC CHẾ BIẾN Ở THÀNH PHỐ HUẾ VÀ MỘT SỐ VÙNG PHỤ CẬN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG H

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ THỊ NHƯ NGỌC

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG VITAMIN A TRONG MỘT SỐ LOẠI NGŨ CỐC CHẾ BIẾN Ở THÀNH PHỐ HUẾ VÀ MỘT SỐ VÙNG PHỤ CẬN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Hóa Phân Tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGÔ VĂN TỨ

THỪA THIÊN HUẾ, NĂM 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu ghi trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả luận văn

Lê Thị Như Ngọc

Lời Cảm Ơn

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS Ngô Văn Tứ đã

giao đề tài, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này, đồng thời đã bổ sung cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong bộ môn Hóa trường Đại học Sự phạm Huế đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học Cao học và thực hiện luận văn Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm và thực phẩm Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện luận văn

Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Xin chân thành cảm ơn!

Thừa Thiên Huế, năm 2016

Lê Thị Như Ngọc

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA i

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iii

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH 6

MỞ ĐẦU 9

NỘI DUNG 12

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 12

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NGŨ CỐC 12

1.2 GIỚI THIỆU VỀ NGŨ CỐC CHẾ BIẾN 14

1.3 TỔNG QUAN VỀ VITAMIN 15

1.3.1 Khái niệm, phân loại vitamin 15

1.3.1.1 Khái niệm vitamin 15

1.3.1.2 Phân loại vitamin 16

1.3.2 Vai trò của vitamin 17

1.3.3 Vitamin A 18

1.3.3.1 Lịch sử tìm ra vitamin A 18

1.3.3.2 Khái niệm vitamin A 18

1.3.3.3 β-caroten 19

1.3.3.4 Cấu tạo hóa học 19

1.3.3.5 Tính chất vật lí 21

1.3.3.6 Tính chất hóa học 21

1.3.3.7 Tính chất quang phổ 22

1.3.3.8 Chức năng 23

1.3.3.9 Ảnh hưởng của vitamin A đến sức khỏe con người 24

1.3.3.10 Nguồn cung cấp vitamin A 26

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN A 28

1.4.1 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS 28

1.4.1.1 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-VIS trực tiếp 28

1.4.1.2 Phương pháp đo phổ UV-VIS sau khi chiết tách vitamin A 29

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 30

1.4.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng trực tiếp 30

1.4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng sau khi thủy phân 31

1.4.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng sau khi chiết tách vitamin A 31

1.5 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 32

1.5.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC 32

1.5.2 Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC 32

1.5.3 Detector trong HPLC 34

1.5.4 Cách đánh giá peak, phương pháp định lượng theo HPLC 35

1.5.4.1 Cách đánh giá peak 35

1.5.4.2 Phương pháp định lượng 35

1.6 KẾT LUẬN CHUNG VỀ PHẦN TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 38

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 39

2.2 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 39

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và chuẩn bị mẫu 40

2.3.2 Chọn kỹ thuật xử lý mẫu 40

2.3.3 Chuẩn bị mẫu trắng 40

2.3.4 Khảo sát các điều kiện phân tích 41

2.3.4.1 Bước sóng phát hiện 41

2.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của pha động 41

2.3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng 41 2.3.5 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 41

2.3.5.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống HPLC 41

2.3.5.2 Tính đặc hiệu của phương pháp 41

2.3.5.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 41

2.3.5.4 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 42

2.3.5.5 Độ lặp lại 43

2.3.5.6 Độ đúng 43

2.3.5.7 Định lượng và tính toán kết quả 44

2.3.5.8 Xử lý số liệu thực nghiệm và đánh giá kết quả phân tích 44

2.3.6 Áp dụng phương pháp để định lượng vitamin A trong một số loại ngũ cốc chế biến trên địa bàn thành phố Huế và một số vùng phụ cận 47

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH THEO PHƯƠNG PHÁP HPLC 48

3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chạy sắc ký 48

3.1.2 Bước sóng phát hiện 49

3.1.3 Ảnh hưởng của thành phần pha động 49

3.1.4 Ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động 50

3.2 KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU 52

3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘ TIN CẬY CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC XÁC ĐỊNH VITAMIN A 53

3.3.1 Độ ổn định của hệ thống HPLC sử dụng detectơ RF 53

3.3.2 Tính đặc hiệu của phương pháp 54

3.3.3 Khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 55

3.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 56

3.3.5 Độ lặp lại của phương pháp 56

3.3.6 Độ đúng của phương pháp 58

3.4 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 60

3.5 ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN A TRONG MỘT SỐ MẪU NGŨ CỐC CHẾ BIẾN Ở THÀNH PHỐ HUẾ VÀ MỘT SỐ VÙNG PHỤ CẬN 61

3.5.1 Mẫu phân tích 61

3.5.2 Phân tích và đánh giá hàm lượng vitamin A trong một số mẫu ngũ cốc chế biến lưu thông trên địa bàn thành phố Huế và một số vùng phụ cận theo thời gian lấy mẫu 62

3.5.3 Đánh giá kết quả phân tích hàm lượng vitamin A so với hàm lượng ghi trên bao bì sản phẩm 66 3.5.4 Đánh giá hàm lượng vitamin A trong cùng một mẫu ngũ cốc chế biến ở những điều kiện bảo quản khác nhau 67

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC P1

Phụ lục 1 Sắc ký đồ khảo sát khoảng thuyến tính, LOD và LOQ P1 Phụ lục 2 Sắc ký đồ khảo sát độ đúng P3 Phụ lục 3 Sắc ký đồ các mẫu ngũ cốc chế biến P5

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Analytical Chemists

Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức

16 IUPAC International Union Of Pure And

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

1 BẢNG

8 Bảng 3.1 Kết quả hệ số đuôi của các tỷ lệ hệ dung môi pha động 50

19 Bảng 3.12 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong ngũ cốc chế

64

22 Bảng 3.15

Kết quả đánh giá theo phương pháp ANOVA một yếu tố đối với các mẫu ngũ cốc chế biến ở những thời gian lấy mẫu khác nhau

65

23 Bảng 3.16 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong 06 mẫu ngũ

25 Bảng 3.18 Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong ngũ cốc

dinh dưỡng Diabet ở những cách bảo quản mẫu khác nhau 68

26 Bảng 3.19

Ma trận hàm lượng vitamin A (IU/100g) phân tích ANOVA một yếu tố đối với mẫu ngũ cốc dinh dưỡng Diabet ở những cách bảo quản mẫu khác nhau

68

27 Bảng 3.20

Kết quả đánh giá theo phương pháp ANOVA một yếu tố đối với mẫu ngũ cốc dinh dưỡng Diabet ở những cách bảo quản mẫu khác nhau

69

28 Bảng 3.21

Kết quả phân tích hàm lượng vitamin A trong mẫu ngũ cốc dinh dưỡng Diabet ở những thời gian sử dụng khác nhau

69

29 Bảng 3.22

Ma trận hàm lượng vitamin A (IU/100g) phân tích ANOVA một yếu tố đối với mẫu ngũ cốc dinh dưỡng Diabet ở những thời gian sử dụng khác nhau

70

30 Bảng 3.23

Kết quả đánh giá theo phương pháp ANOVA 1 yếu tố đối với mẫu ngũ cốc dinh dưỡng Diabet ở những thời gian sử dụng khác nhau

70

20 Hình 3.7 Biểu đồ hàm lượng vitamin A (IU/100g) trong một số

MỞ ĐẦU

Những năm đầu thế kỷ 20, các nhà khoa học phát hiện ra: trong thực phẩm, ngoài các thành phần như đạm, béo, đường, còn có những thành phần thiết yếu khác đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng Một trong những thành phần đó chính là

“vitamin”, vitamin gồm nhiều loại: vitamin A, B, C, D, E… mỗi loại có những tính chất và vai trò khác nhau trong cơ thể sống Có khoảng 40 vitamin và khoáng chất cần thiết cho con người, so với nhu cầu của các chất dinh dưỡng cơ bản như protein, gluxit, lipit thì nhu cầu về vitamin rất thấp, nó đảm nhận vai trò như là những chất xúc tác ở cơ thể sinh vật Dù lượng vitamin sử dụng rất ít nhưng khi thiếu 1 loại vitamin nào đó thì sẽ dẫn đến những rối loạn hoạt động sinh lý bình thường của cơ thể [13]

Vitamin A là phân tử hữu cơ cần thiết với lượng rất nhỏ cho hoạt động chuyển hóa bình thường của cơ thể sinh vật và có bản chất lý hoá học rất khác nhau,

là một chất dinh dưỡng thiết yếu cho con người và rất cần thiết cho hoạt động sống của các cơ thể sinh vật Nó không tồn tại dưới dạng một hợp chất duy nhất, mà dưới một vài dạng Trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, dạng tồn tại chính của vitamin A là dạng retinol Ngoài ra, cũng có thể tồn tại dưới dạng andehit là retinal, hoặc dạng axit là axit retinoic [50] Đặc biệt, vitamin A rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển xương ở trẻ em, cho sự nhìn thấy (cụ thể trong ánh sáng hoàng hôn), cho sự nguyên vẹn bề mặt biểu mô và niêm mạc Biểu hiện của bệnh thiếu vitamin A là quáng gà, sau đó có thể gây ra khô mắt, nhuyễn giác mạc và có thể gây

mù, đặc biệt ở trẻ em [49] Sừng hóa da và thay đổi tổ chức màng niêm mạc nên dễ

bị nhiễm trùng (viêm đường tiết niệu, viêm phế quản ) Bệnh thiếu vitamin A rất

dễ xảy ra ở trẻ em trước tuổi đi học, chủ yếu là ở các nước chậm phát triển, nó luôn kèm theo việc thiếu dinh dưỡng nói chung vì chất béo rất cần thiết cho sự hấp thụ caroten, protein kích thích việc hấp thụ vitamin A [49] [57]

Do đó, hàng năm ở các nước trên thế giới có tới 250.000 trẻ bị mù do thiếu vitamin A [51] Ngoài ra, vitamin A còn có tác dụng chống ung thư, chống lão hóa

do kìm hãm và ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự do Tuy nhiên, vitamin A hòa

tan trong chất béo nên việc thải lượng dư thừa từ ăn uống là khó khăn hơn so với các vitamin tan trong nước Do vậy, quá liều có thể dẫn đến ngộ độc vitamin A Nó

có thể gây buồn nôn, vàng da, dị ứng, chứng biếng ăn, nôn mửa, nhìn mờ, đau đầu, tổn thương cơ và bụng, uể oải và thay đổi tính tình [49] [58]

Hiện nay, nhu cầu ăn uống của con người ngày càng tăng, vì vậy cung cấp các vi chất dinh dưỡng trong nhiều loại thực phẩm là điều không thể thiếu Con người và động vật không thể hoàn toàn tự tổng hợp ra vitamin, nó thường có trong thực vật (các loại thảo mộc, rau cải, trái cây) Với tầm quan trọng của vitamin A nên hiện nay người ta đã bổ sung vitamin A vào trong ngũ cốc đã được chế biến, tuy nhiên hàm lượng vitamin A bao nhiêu thì lại chưa được kiểm soát nghiêm ngặt

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu vitamin A trong các loại thực phẩm, sữa tươi, sữa lỏng, các loại củ và hạt,…Ở Việt Nam, một số nghiên cứu của các tác giả trong nước về phân tích, đánh giá hàm lượng vitamin A trong một số đối tượng rau, củ, quả bổ sung cho cơ thể qua khẩu phần ăn hàng ngày Tuy nhiên, việc nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin A trong ngũ cốc chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ Trong những năm gần đây, đã có nhiều chương trình dự án nghiên cứu vai trò vitamin A trong việc giữ gìn và bảo vệ sức khỏe, đặc biệt là trẻ em và các bà mẹ trong giai đoạn sinh con Viện dinh dưỡng trung tâm kiểm nghiệm VSATTP đã tiến hành nghiên cứu đề tài xác định vitamin A trong thực phẩm (mã số H/QT/19.12.01 (20/11/2006) Tuy nhiên, các nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin A trong các loại ngũ cốc – nguồn thực phẩm trong đời sống hàng ngày chưa được nghiên cứu đầy đủ

Vì vậy, việc xác định vitamin A trong ngũ cốc chế biến góp phần khuyến cáo giúp cho người tiêu dùng có cơ sở lựa chọn khẩu phần ăn hợp lý nhằm đảm bảo lượng vitamin A cần thiết cho cơ thể, cũng như giúp cho các nhà quản lý trong việc kiểm soát VSATTP

Từ những yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Phân tích hàm lượng vitamin A trong một số loại ngũ cốc chế biến ở thành phố Huế và một số vùng phụ cận bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” đề

tài tập trung nghiên cứu các nội dung sau:

- Xây dựng quy trình phân tích vitamin A trong các mẫu ngũ cốc chế biến bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Áp dụng quy trình phân tích hàm lượng vitamin A trong các loại ngũ cốc chế biến ở thành phố Huế và một số vùng phụ cận

- Đánh giá và so sánh hàm lượng vitamin A trong từng loại ngũ cốc và khuyến cáo người tiêu dùng đặc biệt là đối tượng trẻ em

Tại Trung Quốc, tồn tại hai thuyết cơ bản hơi khác nhau một chút về ngũ cốc Một thuyết cho rằng ngũ cốc gồm năm loại: Đạo (lúa), thử (kê), tắc trong tiếng Quảng Đông thì là ngô, còn ở phương Bắc thì nó lại là kê, mạch (bao gồm đại mạch, tiểu mạch, hắc mạch và yến mạch), thục (đậu tương) Một thuyết khác lại cho rằng, ngũ cốc lại gồm: Ma (hạt gai dầu), thử, tắc, mạch, thục Hai thuyết này khác nhau ở chỗ một bên có lúa gạo nhưng không có gai dầu và ngược lại Khi kết hợp cả hai thuyết này lại sẽ có đạo, thử, tắc, mạch, thục, ma là sáu loại lương thực [51] [54]

Hình 1.1 Một số loại ngũ cốc nguyên hạt

Ngũ cốc là một loại thực phẩm cung cấp rất nhiều những dưỡng chất cho cơ thể Trên thị trường, có rất nhiều loại ngũ cốc nhưng nói chung chúng được phân loại thành 2 loại chính: Ngũ cốc nguyên hạt (nguyên chất) và ngũ cốc tinh chế (chế biến)

Ngũ cốc nguyên hạt là những loại ngũ cốc như lúa, lúa mì sau khi được chà xát, lấy đi lớp vỏ trấu bên ngoài, hạt vẫn còn giữ màng cám, mầm và phần chính

của hạt gọi là phôi nhũ [56] Thực phẩm nguyên hạt rất bổ và tốt cho sức khỏe Nó

chứa nhiều dưỡng chất phytonutriments như các chất chống oxi hóa, chất lignines, phytosterols (plant sterols), chứa nhiều loại vitamin (B, E), khoáng chất và nhiều chất xơ nhưng ngược lại rất ít chất béo Có thể nói, ngũ cốc nguyên hạt là thực phẩm của sự sống, sự trường tồn Vì vậy, đối với con người, chọn và sử dụng ngũ cốc làm thực phẩm chính không chỉ dự trữ, bảo quản được lâu mà còn là nguồn dinh dưỡng thích hợp để phòng bệnh cũng như để có được một sức khỏe tốt

Ngũ cốc tinh chế là các loại ngũ cốc thành phẩm đã được chiết tách, sản xuất qua quá trình tinh luyện và xử lý Quá trình tinh chế nói chung liên quan đến việc loại bỏ cám và mầm Nó trái ngược với ngũ cốc nguyên cám, tức là các sản phẩm ngũ cốc bao gồm ngũ cốc hoặc cám đã được thay đổi lớn từ thành phần tự nhiên của chúng Hơn nữa việc tinh chế bao gồm trộn, tẩy trắng và bổ sung thêm các vi chất, dưỡng chất dinh dưỡng làm phong phú thêm sản phẩm [16]

Hạt ngũ cốc được cấu tạo bởi ba bộ phận (vỏ cám, phôi, nội nhũ) và mỗi bộ phận có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng khác nhau [56]

Vỏ cám: Lớp vỏ bên ngoài của hạt, có nhiều lớp, giúp bảo vệ hai phần bên trong của hạt khỏi ánh sáng, côn trùng, nước và bệnh Nó chứa những hợp chất chống oxi hóa, sắt, kẽm, đồng, magie, các vitamin, chất xơ và các hoạt chất thực vật

Phôi: Nếu được thụ tinh bằng phấn hoa, phôi sẽ mọc mầm và hình thành cây mới Nó chứa các vitamin B, vitamin E, các chất chống oxi hóa, các hoạt chất thực vật và các chất béo không bão hòa

Nội nhũ: Nguồn cung cấp dinh dưỡng cho phôi, nếu hạt ngũ cốc được trồng thì nội nhũ sẽ cung cấp nguồn năng lượng thiết yếu cho cây con Là thành phần lớn nhất của hạt, nội nhũ chứa cacbohidrat dạng tinh bột, protein và một lượng nhỏ các vitamin và khoáng chất

Hình 1.2 Sơ đồ giải phẫu hạt ngũ cốc [56]

Ngũ cốc nguyên hạt chứa nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe, bao gồm chất xơ, tinh bột và các axit béo thiết yếu, các chất chống oxi hóa, các vitamin, các khoáng chất, lignin và các hợp chất phenolic; các hợp chất này có khả năng làm giảm nguy

cơ mắc bệnh tim mạch, ung thư, đái tháo đường, béo phì và các bệnh mãn tính khác; đồng thời trong một số nghiên cứu gần đây việc sử dụng ngũ cốc theo một chế độ

ăn thích hợp cũng góp phần quan trọng trong việc kiểm soát cân nặng

1.2 GIỚI THIỆU VỀ NGŨ CỐC CHẾ BIẾN

Ngũ cốc chế biến là loại ngũ cốc đã qua tinh chế, được nhà sản xuất tách, chiết

và bổ sung một số loại khoáng chất và thành phần dinh dưỡng để nâng cao hiệu quả dinh dưỡng đối với người tiêu dùng, đặc biệt là trẻ em

Ngũ cốc dinh dưỡng trên thị trường là sự kết hợp của hạt bắp, lúa mì, lúa mạch, gạo, đậu, yến mạch… đã được sấy khô và nghiền nhỏ Cách làm này sẽ làm cho hạt mất nước và trở nên giòn tan, giúp hàm lượng tinh bột có trong các loại đậu, hạt trở nên dễ tiêu hóa và dễ hấp thu hơn khi dung nạp vào cơ thể [56]

Ngũ cốc cung cấp nguồn dinh dưỡng qúy giá trong khẩu phần ăn của trẻ em Ngũ cốc chứa nhiều thành phần canxi, sắt, kẽm, các viatmin như A, B và C có lợi cho sự phát triển thể chất của trẻ Việc tiêu thụ từ 50 – 60 g ngũ cốc/ngày với trẻ đang trưởng thành sẽ rất có lợi cho trẻ, nhờ vào thành phần các chất dinh dưỡng dồi

dào có trong ngũ cốc Với trẻ nhỏ nên cho tiêu thụ loại ngũ cốc có hương vị tự nhiên hoặc ngũ cốc có bổ sung vitamin, không chất béo, lượng đường dưới 25% là tốt hơn cả Loại ngũ cốc nguyên hạt cung cấp nhiều chất dinh dưỡng hơn đối với trẻ

từ 8 đến 12 tuổi Trẻ tiêu thụ ngũ cốc thường xuyên sẽ giảm thiểu tình trạng béo phì, tăng cân đồng thời tốt cho sức khoẻ hơn so với trẻ ăn ít ngũ cốc [8] [49]

Hình 1.3 Một số sản phẩn ngũ cốc chế biến

1.3 TỔNG QUAN VỀ VITAMIN

1.3.1 Khái niệm, phân loại vitamin

1.3.1.1 Khái niệm vitamin

Vitamin là phân tử hữu cơ cần thiết với lượng rất nhỏ cho hoạt động chuyển hóa bình thường của cơ thể sinh vật và có bản chất lý hoá học rất khác nhau So với nhu cầu của các chất dinh dưỡng cơ bản như protein, gluxit, lipit thì nhu cầu về vitamin rất thấp, nó đảm nhận vai trò như là những chất xúc tác trong cơ thể sinh vật [13]

Con người và động vật không thể hoàn toàn tự tổng hợp ra vitamin, nó thường có trong thực vật (các loại thảo mộc, rau cải, trái cây) Dù lượng vitamin sử dụng rất ít nhưng khi thiếu 1 loại vitamin nào đó sẽ dẫn đến những rối loạn hoạt động sinh lý bình thường của cơ thể [13] [50]

1.3.1.2 Phân loại vitamin

Theo tính chất hòa tan, vitamin được chia làm hai loại: hòa tan trong nước,

và hòa tan trong chất béo Đây không phải là sự phân chia tuyệt đối nhưng trong mức độ đặc biệt nào đó, một số vitamin được hòa tan trong nước cũng có thể hòa tan trong chất béo và ngược lại [53]

Vitamin hòa tan trong nước: Gồm có vitamin C và hỗn hợp vitamin B Những vitamin này có tính chất tồn trữ ngắn hạn trong cơ thể, bằng cách thẩm thấu qua hệ thống tiêu hóa và hòa tan trong nước của cơ thể để tiến hành các nhiệm vụ riêng biệt của chúng Sau đó, chúng được thải ra ngoài cơ thể cùng các cặn bã khác qua sự bài tiết Do đó, khi chúng ta dùng lượng lớn hay quá độ các vitamin C và hỗn hợp vitamin B, chúng cũng không gây độc hại cho cơ thể [13]

Vitamin hòa tan trong chất béo: gồm có các vitamin A, D, E, và K Những vitamin này có tính chất tồn trữ dài hạn trong cơ thể ở các mô tầng chất béo và một

số bộ phận khác, nhất là ở gan Do đó, khi chúng ta dùng số lượng lớn hay quá độ các vitamin này, chúng có thể gây độc hại cho cơ thể [20] [53]

Bảng 1.1 Tính chất của các nhóm vitamin [13]

Tính chất

- Tồn tại ngắn trong cơ thể

- Được thải ra thường xuyên chủ yếu theo con đường bài tiết hoặc tiêu hóa

- Dễ thiếu hụt

- Phải cung cấp hàng ngày

- Không có tiền vitamin

- Có khả năng tồn tại vài ngày trong cơ thể

- Giữ lại lâu trong cơ thể ở các mô

mỡ và tập trung nhiều ở gan

- Khi thiếu triệu chứng phát sinh chậm chạp

- Không cần cung cấp hàng ngày

- Có chất tiền vitamin

1.3.2 Vai trò của vitamin

Khi được đưa vào cơ thể con người, vitamin là một chất xúc tác trong các hệ thống sinh hóa của cơ thể và có nhiệm vụ biến thể hay biến năng để giúp các tế bào

và các mô hoàn thành tốt đẹp những chức năng sinh lý riêng biệt, nhằm bảo tồn sự lành mạnh cho cơ thể [13]

Mỗi vitamin đều có nhiệm vụ và chức năng khác nhau Mặc dù trong một vài trường hợp đặc biệt, giữa các vitamin cũng có vài nhiệm vụ và chức năng trùng hợp nhưng mỗi vitamin không thể thay thế nhiệm vụ cho nhau Vitamin D hoạt động tốt hơn nếu có sự hiện diện của vitamin A Hơn nữa, hai vitamin D và A sẽ hoạt động tốt hơn nếu có sự hiện diện của vitamin B Vitamin E có thể có hiệu quả hơn khi được đi chung với hai vitamin D và A Vitamin C sẽ gây ảnh hưởng cho sự hữu dụng của vitamin A Sự khiếm khuyết trầm trọng của vitamin B1 có thể gây ảnh hưởng đến sự thẩm thấu của những vitamin khác Do đó, với nhiều diễn biến liên hệ bên trong cơ thể, sức khỏe cơ thể luôn luôn tùy thuộc vào những vai trò hoạt động phối hợp bên trong của những vitamin với nhau [13] [50]

Ngoài ra, vitamin còn đóng góp nhiệm vụ kiểm soát việc sử dụng các chất dinh dưỡng khác như: khoáng chất, chất đạm, chất đường, và nước Mặc dù cơ thể không thể kéo dài cuộc sống mà không có những vitamin cần thiết, nhưng vitamin không phải là chất thay thế cho thực phẩm để nuôi sống và phát triển cơ thể Ở điểm này, có nhiều người thường hiểu lầm và nghĩ rằng vitamin có thể thay thế cho thực phẩm Vitamin không có giá trị năng lượng và cũng không phải là chất để cấu tạo

và tăng trưởng cơ thể như các chất đạm, đường, béo, nước, và khoáng chất Do đó, vitamin không có nhiệm vụ thay thế cho thức ăn Vì vậy, chúng ta không nên nghĩ rằng dùng vitamin trong lúc nhịn ăn uống để có sức khỏe tốt cho cơ thể

Mặc dù mỗi loại thực phẩm đều có chứa đựng một hoặc nhiều vitamin khác nhau với số lượng nhiều hay ít, nhưng phần đông người bình thường vì hoàn cảnh

và điều kiện sinh sống không thể thực hiện được một thói quen ăn uống, quân bình cho nhiều loại thức ăn khác nhau trong một khẩu phần ăn hàng ngày Cho nên, để

bổ sung và tránh tình trạng khiếm khuyết vitamin, chúng ta nên dùng thêm một số lượng nhỏ hỗn hợp các loại vitamin và khoáng chất [58]

1.3.3 Vitamin A

1.3.3.1 Lịch sử tìm ra vitamin A [50] [57]

Năm 1816, Các nhà sinh lý học Francois Magendie tiến hành thí nghiệm thiếu dinh dưỡng với chó dẫn đến loét giác mạc và tử vong cao - một tìm kiếm tương tự như tình hình lâm sàng thường gặp ở trẻ em do biếng ăn, trẻ sơ sinh bị bỏ rơi tại Paris Trong những năm 1880, Nicolai Lunin cho thấy rằng có một chất không rõ trong sữa, đó là điều cần thiết cho dinh dưỡng và Carl Socin gợi ý rằng một chất không rõ cho sự tăng trưởng trong lòng đỏ trứng là chất béo hòa tan

Năm 1909 Step đã tiến hành cho chuột ăn thực phẩm đã bị rút hết chất béo bằng hỗn hợp ete- rượu Với thí nghiệm này, Step đã đưa ra nhận xét rằng: trong thực phẩm có các yếu tố hòa tan trong chất béo cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể con người gọi là yếu tố A, sau này được gọi là vitamin nhóm A

Năm 1920: Osborn, Mendel và 1 số tác giả khác phát hiện thấy có các hợp chất tương tự như vậy ở thực vật Sau đó hai nhà bác học Eiler (năm 1929) và Mur (năm 1930) đã đưa ra ý kiến cho rằng các hợp chất tương tự đó là các carotene, chính là tiền thân của vitamin A hay là các provitamin A

Năm 1828-1831 nhà bác học Đức Karrer đã dùng phương pháp sắc ký để phân chia và phát hiện ra cấu trúc của vitamin A và caroten

Năm 1947, vitamin A được tổng hợp đầu tiên bởi hai nhà hóa học Hà Lan David Adriaan van Dorp và Jozef Ferdinand Arens

Năm 1950 nhiều nhà hóa học trong đó có Karrer đã tổng hợp thành công chất β- caroten là một trong 3 dạng đồng phân quan trọng của caroten

Vitamin A là tên của một nhóm các retinoids tan trong chất béo, bao gồm retinol, retinal, axit retinoic, và este retinyl [30] [58]

 Trong thực phẩm có nguồn gốc động vật: dạng chính của vitamin A là ancol retinol nhưng cũng có thể tồn tại dưới dạng andehit retinal hay dạng axit retinoic [30] [58]

 Các tiền chất của vitamin A tồn tại trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật gồm 3 loại là α, β, γ-caroten

Tất cả các dạng vitamin A đều có vòng β-ionon và gắn vào nó là chuỗi isoprenoit Cấu trúc này là thiết yếu cho độ hoạt động sinh hóa của vitamin

1.3.3.3 β-caroten [33]

Có nhiều dạng caroten khác nhau nhưng β-caroten là tiền vitamin A có hoạt tính sinh học cao nhất Khi chuyển hóa β-caroten bằng enzym carotenase sẽ thu được 2 phân tử vitamin A β-caroten không tự chuyển qua vitamin A mà phụ thuộc vào nhu cầu của cơ thể

Khi cơ thể cần vitamin A thì caroten sẽ chuyển thành vitamin A caroten có trong ớt, cà rốt, hành lá, bí đỏ, gấc β-caroten dư được tích lũy trong các mô mỡ

β-Khi đưa vào cơ thể động vật, caroten chuyển thành vitamin A nhờ hệ vi sinh đặc trưng Sự chuyển hóa này có thể xảy ra ở tuyến giáp trạng nhờ sự tham gia của chất tireogbulin (có tính chất của enzim carotenase) hay có nghiên cứu cho rằng vị trí chuyển hóa của caroten thành vitamin A là thành ruột non Ở thực vật, β – caroten có thể chuyển hóa thành vitamin nhờ sự phân cắt một nối đôi ở trung tâm

Hình 1.4 Mô tả quá trình tạo vitamin A từ β-caroten [33]

1.3.3.4 Cấu tạo hóa học [33] [47] [58]

Vitamin A tồn tại ở dạng retinol và tiền vitamin (provitamin) có màu vàng gọi

là caroten Ngoài ra, vitamin còn tồn tại dưới dạng retinal, axit retinoic và este retinyl [33]

Năm 1933 Kaner tìm ra cấu trúc hóa học của nhóm vitamin A Sau đó người

ta tổng hợp nó bằng phương pháp hóa học Vitamin A có thể coi như 1 ancol không

no cấu tạo gồm vòng Beta - ionon và gắn vào nó các chuỗi isoprenoit

Hai dạng retinol và retinal có thể chuyển hóa lẫn nhau, nhưng axit retionic không thể chuyển đổi ngược lại thành 2 dạng trên:

Este retinyl  retinol retinal axit retionic

1.3.3.5 Tính chất vật lí [13]

Vitamin A là chất kết tinh, màu vàng, nóng chảy ở nhiệt độ 620 – 640C Vitamin A không hòa tan trong nước nhưng hòa tan trong chất béo, dầu và đặc biệt

là các dung môi hữu cơ ít phân cực

Vitamin A có thể bị ảnh hưởng xấu bởi oxi hay không khí, ánh sáng và nhiệt

độ Sự ẩm ướt và độ ẩm không khí cao sẽ làm tăng các hiệu ứng Vì vậy sự biến đổi

có thể được giảm đáng kể khi tách nó khỏi nguồn oxi hay hơi ẩm và sự hiện diện của chất chống oxi hoá cùng với việc bảo quản ở nhiệt độ thấp

β-Carotene là tiền chất của vitamin A (carotenoid) quan trọng nhất, tan tốt trong CS2, cloroform, benzen, tan trung bình trong ete, dầu thực vật, tan ít trong metanol, etanol, nhưng không tan trong nước, axit, hợp chất alkan, có nhiệt độ nóng chảy cao 1760C – 1830C Tinh thể β-Caroten có dạng hình lăng trụ 6 mặt, màu tím đậm nếu kết tinh từ dung môi benzen, metanol và có hình thoi, màu đỏ nếu kết tinh

(all-E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl-1-Tên theo hệ thống CAS: Retinol

Vitamin A dễ bị oxi hóa trong điều kiện phòng thí nghiệm

Trong cơ thể dưới tác dụng của chất xúc tác sinh học vitamin A dạng retinol chuyển thành vitamin A dạng retinal

Vitamin A ở gan động vật tồn tại dưới dạng este với axit axetic và axit panmitic Phản ứng với SbCl3 cho phức màu xanh

Phản ứng với H2SO4 tạo sản phẩm có màu nâu

Vitamin A bị phân hủy khi có oxi không khí hoặc bị đun nhẹ, tuy nhiên nó khá bền đối với axit và kiềm Vitamin A và caroten tham gia vào quá trình oxi hóa – khử, có thể đồng thời là chất nhận và chất nhường oxi

 Tính chất của β-caroten [33]

Hình 1.6 Hình dạng tồn tại của β-caroten

Khi đưa vào cơ thể động vật thì caroten chuyển thành vitamin A nhờ hệ vi sinh đặc trưng Trong cơ thể động vật sự chuyển hóa caroten thành vitamin A có thể xảy ra ở tuyến giáp trạng nhờ sự tham gia của chất tireogbulin (có tính chất của enzim carotenase)

1.3.3.8 Chức năng [13] [58]

Tham gia chức năng cảm nhận thị giác: Đây là chức năng được xác định rõ nhất của vitamin A, đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm quang của mắt Dạng andehit của vitamin A kết hợp opsin (protein) tạo nên sắc tố thị giác gọi là

rodopsin, chất này đảm bảo tính nhạy cảm của mắt đối với ánh sáng

Dưới tác dụng của ánh sáng, rodopsin sẽ bị phân giải thành opsin và andehit của vitamin A là retinal (trans), ngược lại trong bóng tối lại xảy ra quá trình tổng

hợp rodop (để tổng hợp được rodopsin, retinal phải tồn tại ở dạng cis)

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp và chuyển hóa vitamin A

Các mô: Vitamin A kích thích quá trình phát triển của các biểu mô như mô sừng, ruột và các con đường hô hấp Nó cũng ảnh hưởng đặc biệt đến da, kích thích

sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của da như trứng cá

Sự sinh trưởng: do vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con người nên vitamin A là yếu tố không thể thiếu đối với sự phát triển của phôi thai và trẻ em Vitamin A còn có vai trò đối với sự phát triển của xương, thiếu vitamin A làm xương mềm và mảnh hơn bình thường, quá trình vôi hoá bị rối loạn

Hệ thống miễn dịch: Vitamin A cần thiết cho quá trình chức năng bình thường của hệ miễn dịch và do đó giúp bảo vệ chống lại các bệnh do nhiễm trùng

Nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính toàn vẹn và chức năng của da và màng nhầy tế bào, đồng thời cũng là rào cản bảo vệ cơ thể chống nhiễn trùng Thiếu vitamin A, kích thước của tổ chức lympho thay đổi β-caroten làm tăng hoạt động của tế bào diệt, tăng sự nhân lên của tế bào lympho B và T Vitamin A cũng là nhân

tố trung tâm trong quá trình phát triển và biệt hóa của tế bào bạch huyết như tế bào lympho, thực bào và bạch huyết cầu giúp cơ thể chống lại các mầm bệnh

Chống lão hoá: Vitamin A kéo dài quá trình lão hoá do làm ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự do

Chống ung thư: hoạt động kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng giúp ngăn chặn được một số bệnh ung thư [49]

1.3.3.9 Ảnh hưởng của vitamin A đến sức khỏe con người

 Thiếu vitamin A [8] [49]

Một trong những biểu thị đầu tiên của sự thiếu hụt vitamin A là thị lực suy giảm, cụ thể là suy giảm nhẹ thị lực, còn được gọi là quáng gà (khả năng nhìn giảm khi độ chiếu sáng thấp) Thiếu hụt liên tục sẽ sinh ra một loạt các thay đổi, có tính chất hủy hoại nhiều nhất diễn ra ở mắt Các thay đổi về thị giác được gọi chung là bệnh khô mắt

Đầu tiên là sự khô đi của màng kết do biểu mô của tuyến tiết nước mắt và nước nhầy bị thay thế bằng biểu mô keratin hóa Tiếp theo là sự tích tụ các mảnh vụn keratin thành các mảng trong mờ nhỏ (đốm biot) và cuối cùng là sự ăn mòn bề mặt màng sừng thô ráp với sự thoái hóa và phá hủy các giác mạc và mù toàn phần Các thay đổi khác còn có suy giảm miễn dịch, giảm chiều dày lớp vảy ở da (các bướu nhỏ màu trắng ở nan tóc), bệnh da gà (Keratosis pilaris) và Squamous metaplasia của biểu mô ở bề mặt của lối vào phía trên của hệ hô hấp và bàng quang với lớp biểu mô bị keratin hóa

 Thừa vitamin A [8] [49]

Do vitamin A hòa tan trong chất béo, việc thải lượng dư thừa đã hấp thụ vào từ

ăn uống là khó khăn hơn so với các vitamin hòa tan trong nước như vitamin B và C (các vitamin tan trong nước khi dư thừa thì được cơ thể tự đào thải qua bài tiết hoặc tiêu hóa)

Do vậy, nếu quá liều có thể dẫn đến ngộ độc vitamin A Nó có thể gây buồn nôn, vàng da, dị ứng, chứng biếng ăn, nôn mửa, nhìn mờ, đau đầu, tổn thương cơ và bụng, uể oải và thay đổi tính tình

Ngộ độc cấp tính nói chung xảy ra ở liều 25000 IU/kg và ngộ độc kinh niên diễn ra ở 4000 IU/kg mỗi ngày trong thời gian 6-15 tháng Tuy nhiên, ngộ độc ở gan có thể diễn ra các mức thấp từ 15000 IU/kg đến 1,4 triệu IU/kg, với liều gây ngộ độc trung bình ngày là 120000 IU/ngày

Ở những người có chức năng thận suy giảm thì 4000 IU cũng có thể gây ra tổn thương đáng kể Việc uống nhiều rượu cũng có thể làm gia tăng độc tính Trong các trường hợp kinh niên, rụng tóc, khô màng nhầy, sốt, mất ngủ, mệt mỏi, giảm cân, gãy xương, thiếu máu và tiêu chảy có thể là các triệu chứng hàng đầu gắn liền với ngộ độc ít nghiêm trọng

Thiếu hụt hay dư thừa vitamin A đều đem đến những vấn đề không tốt cho sức khỏe của con người Vì thế, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành, và kết quả của chúng là những quy định và khuyến cáo về hàm lượng vitamin A cho phép được bổ sung vào thực phẩm cũng như lượng vitamin A giới hạn cao nhất cung cấp cho từng đối tượng sử dụng trong 1 ngày

Hàm lượng vitamin A trong thực phẩm thường được biểu thị dưới dạng đương lượng retinol (RE) hoặc IU Tỷ lệ chuyển đổi giữa μg retinol và IU; giữa RE và IU [58]

1 IU retinol = 0,3 μg retinol = 1,8 μg β – caroten

= 3,6 μg các carotenoid khác có hoạt tính vitamin A

1 RE = 3,3 IU

Bảng 1.3 Lượng vitamin A cần cung cấp trong 1 ngày [58]

Lượng vitamin A cần thiết cung cấp cho cơ thể con người hàng ngày khoảng 75% retinol, còn lại là 25% là β-caroten và các loại vitamin A khác

Đối với trẻ đã uống vitamin A trong chương trình bổ sung vi chất dinh dưỡng thì không cần dùng thêm bất cứ loại thuốc chứa vitamin A nào nữa

Đối với người già bị loãng xương thì không nên bổ sung thường xuyên vitamin A

1.3.3.10 Nguồn cung cấp vitamin A [8] [55]

Trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, dạng chính của vitamin A là retinol, chủ yếu có trong: gan, cá biển, bơ, sữa, trứng

Các tiền chất của vitamin tồn tại trong thực phẩm nguồn gốc thực vật gồm 3 loại là α, β, γ - caroten có trong một vài loài cây trong họ Hoa tán, một số thực phẩm rau trái như: rau dền, cà rốt, cải broc-coli, bí rợ, cà chua, đu đủ, gấc, dưa hấu, khoai tây Tiền vitamin A là thành phần làm trái cây có màu vàng cam, rau cải có màu xanh thẫm

Nhu cầu về tiền vitamin A của cơ thể trung bình vào khoảng 25.000 IU, trong khi:

- Một củ cà rốt loại trung có thể cung cấp tối thiểu 20.000 IU tiền vitamin A

- 100g khoai lang ta cung cấp khoảng 27.000 IU tiền vitamin A

- 100g rau dền cung cấp không dưới 7.000 IU tiền vitamin A

Vitamin A được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm Sau đây, là các nguồn

có chứa vitamin A trong thực phẩm, các số liệu được lấy trong cơ sở dữ liệu quốc gia Hoa Kỳ và tham khảo tiêu chuẩn dinh dưỡng, dịch vụ nghiên cứu nông nghiệp của bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ [58]

5 Bơ thực vật, 80% chất béo, có muối

6 Cải xoăn đông lạnh, nấu chín, luộc thoát nước

7 Bơ, muối

8 Xoài tươi

9 Quả anh đào tươi

10 Quả mơ tươi

11 Ngũ cốc ăn liền

12 Ngũ cốc, sữa tổng hợp ăn liền

13 Ngũ cốc, sữa tổng hợp

14 Rau bina tươi

15 Củ cải xanh nấu chín

16 Rau diếp lá xanh tươi

17 Các loại rau mùa đông nấu chín mà không có muối

18 Quả nho tươi

19 Bắp cải, nấu chín, đun sôi, để ráo nước

20 Trứng toàn bộ, nấu chín, rán

21 Các loại dưa, dưa đỏ tươi

22 Rau diếp, bơ

23 Trứng tươi nguyên

24 Phomat, cocktai, toàn bộ sữa

25 Sữa, chất béo, trái cây có thêm vitamin A

26 Sữa đậu nành, nước trái cây

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN A

1.4.1 Phương pháp quang phổ [7] [12] [31]

Phương pháp quang phổ được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích các vitamin

A trước khi phương pháp HPLC ra đời Phương pháp này dùng để phân tích vitamin

A trong thực phẩm dựa trên sự hình thành phức chất màu xanh giữa triclorua antimony hoặc axit trifluoroaxetic với retinol trong cloroform, được đo ở 620 nm Phương pháp so màu có nhược điểm: độ chọn lọc thấp, màu sắc không ổn định đòi hỏi phải thao tác nhanh chóng và thời gian đo lường phải phù hợp, các bước tiến hành phải được kiểm soát cẩn thận

Ngoài ra để mô tả và định lượng caroten còn có các phương pháp phổ cộng hưởng Raman, 1H-quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân, quang phổ cận hồng ngoại và quang phổ nguyên tử Quang phổ Raman được ứng dụng rộng rãi nhất để đo lường caroten thông qua kỹ thuật không phá hủy mẫu

Quang phổ raman sử dụng nguồn năng lượng laser xác định chính xác hàm lượng từng mức năng lượng của các phân tử retinol hoặc este của nó trong các đối tượng mẫu Các phương pháp quang phổ khác có quy trình phân tích phức tạp hơn, trừ khi mẫu phân tích là một nguồn tương đối tập trung của tất cả các retinol hoặc este của nó

1.4.1.1 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV-VIS trực tiếp [12] [31]

Có thể áp dụng đối với các nguyên liệu este vitamin A (retinyl axetat, retinyl propionat hoặc retinyl panmitat…) và các dạng dầu hoặc dạng nang mềm chứa este vitamin A với hàm lượng lớn (5000 IU/g)

Cân chính xác khoảng từ 25 mg đến 100 mg chế phẩm và đem hoà tan trong

5 mL pentan rồi pha loãng trong isopropanol để được dung dịch chứa chính xác khoảng 10 IU đến 15 IU vitamin A trong 1 mL Xác định bước sóng có hấp thụ cực đại và đo độ hấp thụ của dung dịch tại các bước sóng 300 nm, 326 nm, 350 nm và

370 nm trong cốc đo dày 1 cm, dùng isopropanol làm mẫu trắng

Tính tỷ lệ độ hấp thụ tại các bước sóng 300 nm, 350 nm và 370 nm so với độ hấp thụ tại các bước sóng 326 nm (A/A326) Nếu cực đại hấp thụ nằm trong dãy sóng từ 300 nm đến 370 nm và tỷ lệ A/A326 không lớn hơn các giá tri ghi dưới đây:

0,593 ở =300 nm 0,537 ở = 350 nm 0,142 ở = 370 nm Kết quả hàm lượng vitamin A trong mẫu thử (IU/g) tính theo công thức:

m 100

V 1900

A326 là độ hấp thụ tại bước sóng 326 nm

M là lượng chế phẩm đem phân tích (g)

V là thể tích dung dịch thu được sau khi pha loãng để đem đo (mL)

1900 là hệ số chuyển đổi độ hấp thụ riêng của este retinyl thành IU/g

1.4.1.2 Phương pháp đo phổ UV-VIS sau khi chiết tách vitamin A [42]

Có thể áp dụng cho các nguyên liệu vitamin A có nguồn gốc tự nhiên và đa

số các dạng thuốc chứa vitamin A: thuốc nang, viên nén, thuốc bột, thuốc mỡ, dầu gan…

Lấy chính xác một lượng chế phẩm không ít hơn 500 IU vitamin A và không nhiều hơn 1 gam chất béo cho vào bình nút mài, thêm 30 mL etanol, 3 mL dung dịch KOH bão hòa, vài viên đá mầm sôi, đun sôi 30 phút trên bếp cách thủy có lắp ống sinh hàn hồi lưu, dưới dòng khí N2 không có O2 Làm nguội nhanh rồi dùng 30

mL nước cất chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn, thêm 4 gam Na2SO4 đã nghiền mịn Chiết vitamin A với 150 mL ete và lắc 2 phút (nếu tạo thành nhũ tương thì chiết thêm 3 lần nữa, mỗi lần với 25 mL ete Tập trung dịch chiết lại rồi rửa sạch và chiết 4 lần, mỗi lần 50 mL nước cất, chú ý lắc rất nhẹ nhàng ở 2 lần đầu để tránh tạo thành nhũ tương Làm bay hơi dịch chiết ete trên bếp cách thủy dưới dòng khí N2không có O2 hoặc cô cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 300C đến hết dung môi Hòa tan cặn trong một lượng isopropanol vừa đủ để thu được dung dịch chứa

10 IU đến 15 IU vitamin A trong 1 mL) Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở các bước sóng 300 nm, 310 nm, 325 nm, 334 nm trong cốc dày 1 cm với mẫu trắng là isopropanol, sau đó xác định bước sóng có hấp thụ cực đại

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [28] [32] [34] [36]

Đối với các vitamin A hoạt động và đặc tính của retinol và caroten trong các mẫu sinh học, độ phân giải LC rõ ràng, độ chính xác và độ tin cậy cao, khả năng áp dụng rộng rãi trên nhiều loại chế phẩm

1.4.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng trực tiếp [32] [34]

Có thể áp dụng đối với các nguyên liệu vitamin A tổng hợp, các thành phần chứa vitamin A tổng hợp mà trong thành phần chỉ chứa vitamin A ở dạng este, dạng retinol

Tiến hành theo phương pháp sắc ký lỏng:

- Pha động: Metanol – etyl axetat– nước (90: 7: 3)

- Dung dịch phân tích:

Lấy chính xác một lượng chế phẩm có chứa khoảng 4000 IU vitamin A cho vào bình định mức dung tích 100 mL, thêm etanol, lắc kỹ rồi thêm etanol đến vạch, lắc đều, lọc

- Dung dịch chuẩn:

Pha chất chuẩn vitamin A (dạng giống với dung dịch thử: retinol, retinyl axetat, retinyl panmitat… trong etanol để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ vitamin A chính xác khoảng 40 IU/mL)

8 lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn (RSD) không được lớn hơn 2,0%

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch phân tích

1.4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng sau khi thủy phân [32] [36] [40]

Có thể áp dụng đới với nguyên liệu vitamin A tổng hợp dạng bột, dạng dầu

mL isopropanol Làm nóng trên bếp cách thủy ở 600C đến 650C trong thời gian từ 2 đến 5 phút Làm lạnh tới 300C rồi thêm 20 mL dung dịch tetrabutylamoni hydroxit 0,1 M trong isopropanol Lắc siêu âm 5 phút Thêm isopropanol đến vạch, lắc đều (lắc xoay tròn, tránh tạo bọt khí)

Đối với nguyên liệu dầu hoặc nhũ tương: Lấy chính xác một lượng chế phẩm

có chứa khoảng 120000 IU vitamin A cho vào bình định mức dung tích 50 mL, hòa tan ngay trong 5 mL pentan Thêm khoảng 20 mg đến 30 mg BHT và 20 mL dung dịch tetrabutylamoni hydroxit 0,1 M trong isopropanol Lắc siêu âm 5 phút Thêm isopropanol đến vạch, lắc đều (lắc xoay tròn, tránh tạo bột khí)

- Dung dịch chuẩn:

Cân chính xác một lượng chất chuẩn retinyl panmitat tương đương với

120000 IU vitamin A cho vào bình định mức dung tích 50 mL Thêm ngay 5 mL pentan, thêm khoảng 20 mg đến 30 mg BHT và 20 mL dung dịch tetrabutylamoni hydroxit 0,1 M trong isopropanol Lắc siêu âm 5 phút Thêm isopropanol đến vạch, lắc đều (lắc xoay tròn, tránh tạo bọt)

1.4.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng sau khi chiết tách vitamin A [32]

Có thể áp dụng đối với các chế phẩm phức tạp và có chức vitamin A với hàm lượng thấp không thực hiện được theo 1 trong 2 phương pháp trên

Lấy chính xác một lượng chế phẩm có chứa khoảng 2000 IU vitamin A đem

xà phòng hóa: cho lượng chính xác chế phẩm vào bình tam giác dung tích 250 mL; thêm khoảng 50 mg axit ascorbic vào chế phẩm để chống oxi hóa, thêm tiếp tục 40

mL dung dịch etanol 95% và 10 mL KOH 50%; tiến hành đun hồi lưu 45 phút rồi làm lạnh, sau đó chiết và bay hơi dịch chiết đến cặn Hòa tan chất rắn thu được và chuyển hỗn hợp sang bình định mức 50 mL với isopropanol

- Dung dịch chuẩn gốc:

Hòa tan chất chuẩn retinyl panmitat trong isopropanol để thu dược dung dịch

có nồng độ chính xác khoảng 1000 IU vitamin A trong 1 mL Xác định nồng độ chính xác của dung dịch chuẩn gốc bằng cách pha loãng trong isopropanol tới nồng

độ 10 đến 15 IU trong 1 mL bằng phương pháp HPLC

1.5 GIỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.5.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC [11] [12]

Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha tĩnh để mang chất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động Do các chất phân tích có ái lực khác nhau

với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau 1.5.2 Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC [11] [12]

 Giai đoạn tách:

Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất cao (200500 atm) Vì vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch

(thường là hòa tan trong dung môi làm pha động) Phương pháp này thích hợp cho tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường)

Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách  chất phân tích được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh

Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi) để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau)

Kỹ thuật chạy sắc ký:

+ Kỹ thuật cố định pha động (giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi) + Kỹ thuật građient pha động (biến đổi pha động liên tục) Građient có thể là từng bậc hoặc liên tục tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho

quá trình tách sắc ký xảy ra hoàn toàn

 Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích:

Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi

là detector

Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết như: thời gian lưu, diện tích và chiều cao peak, hệ số phân giải, hệ số đối xứng…

+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ vào tính chất này để phân tích định tính

+ Độ lớn peak được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này

tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để định lượng chất phân tích

Hình 1.8 Giới thiệu hệ thống HPLC

1.5.3 Detector trong HPLC [11]

Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp, là

bộ phận dùng để phát hiện chất phân tích, cũng như pha động, pha tĩnh Có nhiều loại detector thường được sử dụng trong HPLC như detector hấp thụ tử ngoại – khả kiến UV – Vis, điện hóa, huỳnh quang,… Sau đây tìm hiểu rõ hơn về dectector huỳnh quang RF :

Detector huỳnh quang có ưu điểm là độ nhạy cao vì bức xạ phát ra được đo đối với nền tối, nhưng được sử dụng ít hơn detector UV - VIS vì chất phát huỳnh quang không nhiều

Độ chọn lọc của việc phát hiện dựa trên tính chất huỳnh quang được đặt ra

do phải dùng đến hai bước sóng trong quá trình đo: Bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ và đặc biệt là các hợp chất phải có cấu trúc nhất định để có khả năng phát huỳnh quang

Detector sử dụng cho các chất có khả năng phát huỳnh quang bao gồm bản thân các chất chúng phát huỳnh quang và trong cả trường hợp chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang Nguồn kích thích có bước sóng ngắn, thường dùng đèn dơteri 190 - 400 nm

Hình 1.9 Detector huỳnh quang

1: Nguồn sáng kích thích 2,5: Các bộ đơn sắc 3: Bán gương

4: Flowcell 6,7: Các tế bào quang điện 8: Bộ phân xử lý tín hiệu

Khi chất phân tích đi vào flowcell nhờ có ánh sáng kích thích chúng phát ra ánh sáng thứ cấp, qua bộ đơn sắc 5 và tới tế bào quang điện 6 để biến đổi thành dòng điện Tín hiệu này được khuếch đại và so sánh với tín hiệu từ tế bào quang điện 7, ghi lại peak nhờ bộ xử lý 8

1.5.4 Cách đánh giá peak, phương pháp định lượng trong phương pháp HPLC [11] [22] [27]

1.5.4.1 Cách đánh giá peak [11] [22]

Tín hiệu đo là diện tích của peak hay chiều cao của peak Để tiến hành định lượng chất phân tích, người ta sử dụng các chất chuẩn là chất phân tích có độ tinh khiết cao Tiến hành khảo sát chất chuẩn để tìm điều kiện đo của chất chuẩn, mẫu

giả và cuối cùng mới đo trên mẫu thực tế

Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã lựa chọn thì diện tích

hoặc chiều cao của peak tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích:

S = K.C (S: diện tích của peak)

h = K.C (h: chiều cao của peak)

Các phương trình này dùng để định lượng chất phân tích bằng HPLC, thường người ta dùng diện tích của peak để độ chính xác cao hơn

Để tính diện tích peak, ta dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài sẵn chương trình, phương pháp này có thể dùng cho cả những peak bị trôi đường nền Phương pháp này đòi hỏi hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0,80  1,20 Việc tính toán diện tích peak sẽ gặp khó khăn khi peak có cường độ quá cao, bị doãn, không đối xứng hoặc detector bị nhiễu

Nếu đánh giá dựa vào chiều cao peak (khoảng cách từ đường nền đến đỉnh peak) thì không cần xét đến hệ số đối xứng

1.5.4.2 Phương pháp định lượng [11] [22] [27]

 Phương pháp ngoại chuẩn

 Chuẩn hoá một điểm

- Nguyên tắc: chuẩn hoá một điểm là sử dụng một phép đo của chất chuẩn đã biết trước nồng độ, đo độc lập và song song với phép đo chất cần phân tích

- Phương pháp: Sử dụng hai phép đo độc lập

+ Phép thứ nhất: Chạy sắc ký chất chuẩn trong điều kiện tương tự chất phân tích (nền và các thông số khác giống nhau)

+ Phép thứ hai: Chạy sắc ký chất phân tích

- Kết quả tính như sau:

Hình 1.10 Chuẩn hoá một điểm

 Chuẩn hoá nhiều điểm (phương pháp đường chuẩn)

- Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau trong điều kiện tương tự mẫu phân tích

Tiến hành phép sắc ký và tính diện tích của peak đối với dãy chất chất chuẩn Sau đó dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tính biễu diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tích) của peak vào nồng độ chất phân tích

Để xác định nồng độ chất phân tích Cx ta cũng thực hiện phép đo đối với chất phân tích, được Sx (hx) nhất định, đối chiếu với đường chuẩn ta có nồng độ chất phân tích trong mẫu Hoặc xử lý số liệu thực nghiệm đưa về phương trình hồi quy

có dạng Sx = a + bCx

Hình 1.11 Đồ thị của phương pháp đường chuẩn

 Phương pháp thêm chuẩn

 Thêm chuẩn 1 điểm: Tiến hành chạy 2 phép sắc ký

- Thứ nhất là phép sắc ký với dung dịch phân tích, ghi diện tích peak Sx

Sx = k.Cx

- Thứ hai là thêm vào chất phân tích 1 lượng chất phân tích chính xác và ghi lại sắc ký đồ

Sx,T = k.(C’x +C’T)

Ta có:

T x

T T x x T

x,

T x

T T x x '

T ' x

T x ' T T T

T x ' x x x

V+V

CV+VCk

=S

V+V

CV+VCCC

)V+(VC

=VC

)V+(VC

=.VC









Từ 2 thí nghiệm này ta rút ra được Cx là nồng độ chất phân tích

 Thêm chuẩn đường chuẩn:

Chuẩn bị 1 dãy dung dịch phân tích trong những điều kiện hoàn toàn như nhau Thêm vào dãy dung dịch trên những lượng chất chính xác khác nhau theo bảng sau:

Bảng 1.5 Diện tích peak và nồng độ

C Cx Cx + C1 Cx + C2 Cx + C3

Xây dựng phương trình đường hồi quy tuyến tính biễu diễn sự phụ thuộc của

A vào nồng độ thêm chuẩn, được phương trình có dạng: Sx = a + bCx Cx = a