Phân lập và xác định cấu trúc một số alkaloid từ bột mã tiền chế

Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu lý thuyết Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng quan về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, một số công dụng của bột Mã tiền chế, các

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

LÊ THỊ BẢO QUYÊN

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT

SỐ ALKALOID TỪ BỘT MÃ TIỀN CHẾ

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS NGUYỄN CHÍ BẢO

PGS.TS NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH

Thừa Thiên Huế, Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Họ tên tác giả

Lê Thị Bảo Quyên

Luận văn được hoàn thành tại phòng thí nghiệm Nghiên cứu các Hợp chất tự

nhiên, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô PGS.TS Nguyễn Thị Hoàng

Anh và Thầy giáo TS Nguyễn Chí Bảo, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ

tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin cám ơn dự án “Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất cao khô bán thành phẩm và thuốc Phong tê thấp Bà Giằng”, mã số CNHD.DASXTN 024

thuộc Chương trình nghiên cứu KHCN trọng điểm quốc gia phát triển công

nghiệp Hóa dược đến năm 2020 do Doanh nghiệp tư nhân Sản xuất thuộc Y học

cổ truyền chủ trì, phối hợp với Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam thực hiện

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Hóa nói chung và tổ Hóa

hữu cơ nói riêng đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu về chuyên môn giúp tôi hoàn

thành luận văn

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học trường

Đại học Sư phạm Huế, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn

Huế, tháng 10 năm 2018

Học viên

Lê Thị Bảo Quyên

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Đối tượng và mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Cấu trúc luận văn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Sơ lược về chi Strychnos 4

1.1.1 Đặc điểm thực vật của chi Strychnos 4

1.1.2 Giá trị sử dụng của chi Strychnos 4

1.2 Tổng quan về cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica) 5

1.2.1 Nguồn gốc 5

1.2.2 Đặc điểm thực vật 5

1.2.3 Phân bố sinh thái của cây Mã tiền 7

1.2.4 Bộ phận dùng- Hạt Mã tiền 7

1.2.5 Một số phương pháp chế biến Mã tiền tạo thành Mã tiền chế 7

1.2.6 Thành phần hóa học 8

1.2.7 Tác dụng của Mã tiền chế 16

1.3 Tổng quan về alkaloid 17

1.3.1 Giới thiệu chung 17

1.3.2 Tác dụng của alkaloid 20

1.3.3 Các phương pháp chiết- tách alkaloid 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp chiết mẫu 25

2.3.2 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Hàm lượng các cao chiết 30

3.2 Phân lập các hợp chất 30

3.3 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập 31

3.3.1 Hợp chất MTC1 31

3.3.2 Hợp chất MTC2 36

KẾT LUẬN 43

KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ, HÌNH

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng

biểu

1.1 Các alkaloid từ Strychnos nux-vomica 9 3.1 Hàm lượng các cao chiết trong bột Mã tiền chế 30 3.2 Độ chuyển dịch hóa học của MTC1 (CDCl3) và brucine (CDCl3) 35

3.3 Độ chuyển dịch hóa học của MTC2 (CDCl3) và strychnine

(CDCl3)

42

DANH MỤC SƠ ĐỒ

2.2 Sơ đồ phân lập chất từ cao chiết điclometan 29

3.3 Phổ HSQC của hợp chất MTC1 34 3.4 Phổ 1H-NMR của hợp chất MTC2 37 3.5 Phổ 13C-NMR của hợp chất MTC2 38

3.7 Phổ HSQC giãn rộng của hợp chất MTC2 40

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài [1], [16], [27]

Cây Mã tiền có tên khoa học là Strychnos nux-vomica, thuộc họ Mã tiền

(Loganiaceae), là loài cây gỗ thường xanh có nhiều ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới Trong

y học dân gian của người Trung Quốc và Ấn Độ đã biết sử dụng hạt Mã tiền dùng điều trị các bệnh như viêm khớp dạng thấp, triệu chứng dị ứng và điều trị các bệnh thần kinh Ngoài ra, còn dùng thuốc xoa bóp dưới dạng rượu, chữa bệnh tê liệt nửa người, chó dại cắn và trị ghẻ rất công dụng

Ngày nay, con người còn biết được thêm nhiều lợi ích khác của hạt Mã tiền Y học hiện đại đã chứng minh Mã tiền chế có nhiều dược lý trong đông y và tây y Tuy nhiên do độc tính của hạt rất cao nên không được phép sử dụng trực tiếp mà phải qua chế biến

Thành phần chính thể hiện hoạt tính sinh học của loài Strychnos nux-vomica được biết là

các alkaloid như strychnine, brucine và vomicine Trong đó strychnine và brucine là hai alkaloid có nhiều nhất trong hạt Mã tiền và có ảnh hưởng quan trọng đến tác dụng cũng như độc tính của hạt Một mặt, strychnine và brucine có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống ung thư nhưng bên cạnh đó chúng có thể gây các rối loạn vận động, tăng trưởng lực cơ, tăng hoạt động cảm giác, ở liều cao có thể gây co giật hệ thống thần kinh trung ương và dẫn đến tử vong do liệt hô hấp, liệt cột sống hoặc ngừng tim Ngoài ra, strychnine còn được sử dụng làm thuốc diệt chuột và một số loài động vật gặm nhấm Nó cũng được biết đến là một trong những chất đầu tiên được sử dụng làm chất kích thích trong thể thao Strychnine tác dụng chọn lọc và đối kháng cạnh tranh với glycin ở tủy sống Liều cao tác động cả lên glycin ở não Ngộ độc strychnine có thể gây tử vong cho người và động vật

Brucine cũng là một alkaloid mà từ lâu được sử dụng như một loại thuốc truyền thống để điều trị ung thư biểu mô tế bào gan Nó ức chế đáng kể việc di chuyển tế bào

ung thư gan (HCC Hep-G2, SMMC-7721) trong ống nghiệm và di căn phổi in vivo Độ

độc của brucine thấp hơn strychnine nhưng cũng có thể gây co giật hệ thống thần kinh ngoại biên

Hai alkaloid trên có độc tính rất mạnh, chỉ với một liều lượng nhỏ có thể gây tử vong nếu uống và tiêm không đúng Vì vậy việc xác định hai alkaloid này là vô cùng quan trọng trong giám định độc chất của bài thuốc phong tê thấp Bà Giằng

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Phân lập và xác định

cấu trúc một số alkaloid từ bột Mã tiền chế”

2 Đối tượng và mục đích nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Bột Mã tiền chế do cơ sở thuốc phong tê thấp Bà Giằng

cung cấp

Mục đích nghiên cứu:

- Phân lập được một số alkaloid trong bột Mã tiền chế

- Xác định cấu trúc các alkaloid phân lập từ bột Mã tiền chế

3 Nội dung nghiên cứu

- Điều chế cặn chiết giàu alkaloid bằng phương pháp tách alkaloid tổng

- Phân lập các alkaloid bằng các phương pháp sắc ký cột, sử dụng các chất nhồi cột khác nhau như silicagel, Sephadex LH-20

- Xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại IR, MS, NMR,…

4 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu lý thuyết

Phương pháp nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng quan về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học, một số công dụng của bột Mã tiền chế, các phương pháp tách và phân lập các hợp chất hữu cơ

Nghiên cứu thực nghiệm

- Tách, chiết các alkaloid tổng có trong bột Mã tiền chế

- Sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký cột (SKC), sắc ký bản mỏng (SKBM), để phân lập một số hợp chất từ cao chiết và xác định cấu trúc của các cấu tử tách được bằng các phương pháp phổ như: phổ IR, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT

5 Cấu trúc luận văn

Luận văn bao gồm: 56 trang

Mục lục: 2 trang

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt: 1 trang

Danh mục các bảng biểu, sơ đồ, hình: 2 trang

Phần mở đầu: 3 trang

Phần nội dung: 42 trang

Chương 1 Tổng quan: 25 trang

Chương 2 Thực nghiệm: 6 trang

Chương 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận: 11 trang

Phần kết luận và kiến nghị: 2 trang

Phần tài liệu tham khảo: 4 trang

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về chi Strychnos [13], [23], [31]

Chi Strychnos thuộc họ Mã tiền (Loganiaceae), là một họ thực vật hai lá mầm, có

hoa, thuộc loại cây gỗ, cây bụi hay cây dây leo, thường có 2 móc đối xứng, thuộc về bộ Long đởm (Gentianales) Nó có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhiều

ở phía Nam và Đông Nam Á, với khoảng 100 – 200 loài được chấp nhận tùy theo hệ

thống phân loại Một số loài thuộc chi Strychnos như Strychnos benthami, Strychnos

chromatoxylon, Strychnos elaeocarpa, Strychnos ignatii, Strychnos madagascariensis, Strychnos mellodora, Strychnos milepunctata, Strychnos nux-vomica, Strychnos potatorum, Strychnos psilosperma, Strychnos pungens, Strychnos spinosa, Strychnos staudtil, Strychnos tetragona, Strychnos asambarenis,

1.1.1 Đặc điểm thực vật của chi Strychnos [28]

Dạng cây: Các loài thuộc chi Strychnos là cây bụi trườn, dây leo gỗ và chỉ có ít loài

là cây gỗ, trong đó có cây Mã tiền

Lá: lá rộng hình trứng hay hình bầu dục, mọc đối, lá kèm ít rõ nhưng có khi biến

thành móc câu, thường có dạng gân chân vịt ở gốc

Hoa: cụm hoa ngủ với các hoa đều, mẫu 5, bao hoa hợp Tràng hợp thành ống, các

chùy xếp van hay lợp Bộ nhụy gồm 3-2 lá noãn hợp syncarp (hợp nguyên lá noãn) Bầu

thượng 3-2 ô, mỗi ô thường nhiều (đôi khi 1) noãn

Chuỳ hoa mọc ở nách lá và ngọn cành

Quả và hạt: Quả hình cầu, có cơm trắng với hạt nhiều, hình đĩa phủ lông dày lấp

lánh Quả nang cắt vách (septicide) hoặc mở bằng khe tròn ngang, đôi khi quả mọng Hạt

đôi khi có cánh Đường kính khoảng 1,5cm-5cm

1.1.2 Giá trị sử dụng của chi Strychnos [3], [7], [32]

Làm thuốc chữa bệnh: Trong chi Strychnos có rất nhiều loài có giá trị cao về mặt

kinh tế Ngày xưa, người Trung Quốc sử dụng hạt Mã tiền như một loại thuốc truyền

thống chống viêm và giảm đau khớp, nhức mỏi và chó dại cắn,…

Làm sạch nước: các hạt chín của loài Strychnos potatorum ở Ấn Độ và Myanmar

được nghiền và được dùng lọc nước để uống; hoặc chúng có thể được cọ xát vào các bức tường bên trong của các thùng chứa nước bằng đất nung

Làm thức ăn: các quả chín của loài Strychnos pungens chứa nhiều acid citric nhưng

hạt có độc tố nhẹ và người Nam Phi, dân bản địa Ấn Độ đã dùng làm thức ăn

1.2 Tổng quan về cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica)

Cây Mã tiền (Strychnos nux-vomica) có nguồn gốc Đông Nam Á và Úc, thường gặp

ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Người ta tìm thấy trong những rừng dầy lá ở Ấn Độ

1.2.2 Đặc điểm thực vật [3], [7], [9], [29], [31]

Tên khoa học: Strychnos nux-vomica L

Tên đồng nghĩa: Strychnos colubrina, Strychnos lucida, Strychnos spireana,

Strychnos vomica

Tên Việt Nam : Mã tiền

Mã tiền là cây gỗ kích thước trung bình, có thể cao tới 25 m, mọc tại các môi trường sinh sống thưa cây cối tới độ cao 1.200 m Vỏ thân màu xám trắng, hơi nhăn dọc Thịt vỏ màu trắng vàng hơi ròn Cành non, đôi khi có gai ở nách lá

Lá có hình trứng, kích thước 5 x 9 cm Lá đơn nguyên mọc đối, đầu hình nêm, tù, hoặc gần tròn thường có một mũi ngắn, gốc hình tim men theo cuống Gân lá hình cung, với đôi gân giữa lớn gần bằng gân chính

Cụm hoa nhỏ, hình phễu, mọc ở kẽ lá đầu cành Hoa màu vàng nhạt có mùi thơm

Lá bắc nhỏ có lông, 5 cánh đài hợp thành ống ngắn, có 5 răng phía trên, màu xanh, 5 cánh tràng màu vàng nhạt, trắng hoặc xanh nhạt hợp phía dưới thành ống, thùy tràng dày nên ở đầu, 5 nhị không cuống, đính trên ống tràng Bầu hình trứng, có nhiều noãn

Quả mọng hình cầu, đường kính 2,5 – 4 cm, nhẵn, non màu xanh sang màu vàng, khi khô màu nâu, quả bì cứng rắn, cơm quả màu trắng Nhiều hạt dẹt phủ lông mịn màu trắng bạc

Hoa có vào tháng 3 - 4 Quả tháng 5 – 8

Cây ưa sáng, sống ở hầu khắp các sinh cảnh từ vùng duyên hải đến vùng núi cao hay nơi đồng bằng, thung lũng, khe suối, đất ẩm và chịu nhiều loại địa hình, các loại đất khác nhau từ khô hạn đến thường xanh hoặc nửa rụng lá

Hình 1.1 Cây Mã tiền

Hình 1.2 Quả và hạt cây Mã tiền 1.2.3 Phân bố sinh thái của cây Mã tiền [3], [28]

Cây Mã tiền (Strychnos nux- vomica) có nhiều ở Ấn Độ, Sri lanka, Malaysia, Thái

Lan, Bắc Australia Ở nước ta hiện nay mới thấy mọc hoang ở vùng rừng núi các tỉnh phía Nam

Các loài Mã tiền khác như Strychnosnitida- Mã tiền Láng, Strychnos ignati- Mã tiền

Lông,… được phân bố ở các tỉnh vùng núi nước ta: Cao Bằng, Lạng Sơn, Tuyên Quang,

Hoà Bình, Bắc Giang, Sơn La, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị… đặc biệt có nhiều ở các

tỉnh Tây Nguyên, Tây Ninh, Đồng Nai, Long An, Kiên Giang Riêng loài Strychnos

cathayensis Merr mới gặp ở tỉnh Quảng Ninh

1.2.4 Bộ phận dùng- Hạt Mã tiền [5]

Hạt Mã tiền thu hoạch từ hạt chín Sau đó được làm sạch, phơi, sấy khô và lưu trữ Hạt có hình dĩa phẳng hoàn toàn được bao phủ bởi lớp lông từ trung tâm ra, cả 2 bên Cấu tạo này cho phép hạt có một màu sáng đặc trưng cho hạt Mã tiền Hạt rất cứng với một nội nhũ màu xám tối nơi có chứa phôi nhỏ không mùi, nhưng cho ra vị rất đắng

1.2.5 Một số phương pháp chế biến Mã tiền tạo thành Mã tiền chế [3], [21]

Trong y học dân gian, hạt Mã tiền chỉ được sử dụng sau khi chế biến và được gọi là

Mã tiền chế

- Ngâm hạt trong nước vo gạo một ngày đêm cho tới khi mềm, lấy ra bóc vỏ, thái mỏng, sấy khô tán nhỏ, tẩm dầu vừng một đêm, sao vàng đậm, cho vào lọ kín

- Cho hạt Mã tiền vào dầu vừng đun sôi cho tới khi hạt Mã tiền nổi lên thì vớt ra ngay, thái nhỏ, sấy khô

- Ngâm hạt Mã tiền trong nước thường hay nước vo gạo cho đến mềm Lấy ra bóc

vỏ và lông để riêng, nhân để riêng Sao vỏ và lông riêng, nhân riêng rồi tán nhỏ riêng từng thứ Phương pháp này thường dùng chữa bệnh chó dại

1.2.6 Thành phần hóa học

1.2.6.1 Alkaloid [6], [7], [13], [14], [17]

Trong hạt Mã tiền, người ta tìm thấy thành phần hóa học chính là các alkaloid, trong đó

hai alkaloid chiếm hàm lượng chủ yếu và có độc tính cao là strychnine (1) và brucine (2)

Bên cạnh đó còn có khoảng 18 alkaloid khác và hai alkaloid bisindole mới như

β-colubrine (3), vomicine (8),

Hạt Mã tiền chứa khoảng 2,6-3% alkaloid tổng, trong đó strychnine (1,25-1,5%) và

brucine (1,7%)

Cấu trúc của strychnine được xác định vào năm 1946 bởi Robert Robinson; vào năm

1954, alkaloid này được tổng hợp trong phòng thí nghiệm bởi Robert W Woodward

Strychnine là alkaloid đầu tiên được tìm thấy trong thực vật thuộc chi Strychnos và

là thành phần alkaloid có hàm lượng lớn nhất của S nux vomica (40-50%), có độc tính,

không màu, có vị đắng

Strychnine (1) được lấy từ hạt Mã tiền được y học cổ truyền Ấn Độ sử dụng để điều

trị bệnh tiểu đường, thiếu máu, viêm phế quản, tê liệt, chất kích thích hệ thần kinh, tủy sống,… Nó được chứng minh có hoạt tính chống oxi hóa, làm thuốc trừ sâu, tiêu diệt các động vật có xương sống nhỏ như chim và động vật gặm nhấm Trong y học cổ truyền

Trung Quốc, strychnine đã được sử dụng để điều trị ung thư gan

Strychnine là một chất độc chết người Liều gây chết đối với con người nằm trong

khoảng từ 30 đến 120 mg Strychnine cạnh tranh ngăn chặn hoạt động của glycin, tác động lên tủy sống làm tê liệt, co thắt ở các chi và cơ bắp hàm Nguyên nhân gây tử vong thông thường là suy hô hấp, cơ ngực và co thắt cơ hoành

Brucine (2) là thành phần alkaloid có hàm lượng lớn thứ hai của S nux vomica

(20-30%), có tác dụng giảm đau và chống viêm đáng kể Tính chất độc của brucine (2) tương

tự như của strychnine (1) Tuy nhiên, hiệu lực độc hại của nó chỉ 0,022–0,028 lần so với strychnine (1)

Ngoài ra, các alkaloid phụ gồm có vomicine (8), igasurine, 16- colubrine (5), β-colubrine (3), N-oxystrychnine (7), isostrychnine (12), pseudostrychnine

hydroxyl-α-(10), novacine (9)

Trong hoa khô chứa khoảng 1,023% strychnine (1) Trong lá chiếm khoảng 2% và

trong vỏ thân, rễ chiếm khoảng 8% alkaloid đã được phân lập nhưng chủ yếu là brucine

Bảng 1.1 Các alkaloid từ Strychnos nux-vomica

1.2.6.2 Iridoid [13]

Iridoid là một loại monoterpenoid có cấu dạng chung của xiclopentanopyran, được thực vật sản xuất ra như một cơ chế phòng chống nhiễm khuẩn Ngoài ra, các iridoid có các tác dụng sinh học quan trọng như: bảo vệ tế bào thần kinh, chống ung thư, chống viêm,…

Loganin (23) là một trong những loại iridoidglycosid đặc trưng nhất Trong hạt Mã

tiền loganin chiếm khoảng 1,5%

Từ hạt cây Mã tiền, người ta đã phân lập được ba iridoid: acid 6’-O-acetylloganic

(24), acid 4’-O-acetylloganic (25), acid 3’-O-acetylloganic (26) và hai glucosid iridoid: acid loganic (27) và acid 7-O-acetylloganic (28)

Tất cả các acid loganic trên đều là chất rắn vô định hình, màu trắng, có tác dụng trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh béo phì

1.2.6.3 Chất béo [33]

Bên cạnh thành phần chính là các alkaloid thì trong hạt Mã tiền có chiếm một phần nhỏ chất béo, khoảng 4-5%

1.2.6.4 Các hợp chất khác [1]

Ngoài các alkaloid là thành phần chính và tạo hoạt tính sinh học quan trọng của cây

Mã tiền thì trong hạt còn chứa acid igasuric (acid clorogenic) (29), cycloarterol,

stigmasterin

Acid clorogenic (29)

1.2.7 Tác dụng của Mã tiền chế [3], [16], [25], [31]

- Đối với thần kinh trung ương và ngoại vi: Có tác dụng kích thích với liều nhỏ và

tác dụng co giật ở liều cao

- Đối với tim và tuần hoàn: Có tác dụng tăng huyết áp, do các mạch máu ngoại vi bị

co nhỏ

- Đối với dạ dày và bộ máy tiêu hóa: Có tác dụng tăng bài tiết dịch vị, tăng tốc độ

chuyển của thức ăn sang ruột Tuy nhiên nếu dùng thường xuyên thì sẽ gây rối loạn tiêu

hóa, biến loạn co bóp dạ dày

- Độc tính: Mã tiền rất độc Khi bị ngộ độc thường ngáp, nước dãi chảy nhiều, nôn

mửa, sợ ánh sáng, mạch nhanh và yếu, tứ chi cứng đờ, co giật nhẹ rồi đột nhiên có triệu chứng như uốn ván nặng với hiện tượng rút gân hàm, lồi mắt, đồng tử mở rộng, bắp thịt

tứ chi và thân bị co Cơ bắp thịt ngực co gây khó thở và ngạt, sau 5 phút đến 5 giờ sẽ chết

vì ngạt

Với các tác dụng dược lý như nêu trên, Mã tiền được dùng cả trong Đông y và Tây

y

- Trong Tây y: dùng làm thuốc kích thích thần kinh trung ương, tăng phản xạ của

tủy, tăng cường dinh dưỡng và cường tráng cho cơ bắp, dùng chữa tê liệt, cơ tim mệt, giảm cường kiện của ruột, đái dầm và yếu sinh lý Mã tiền còn là nguyên liệu để tách strychnine Trong Tây y, Mã tiền được dùng dưới các dạng sau:

+ Cồn Mã tiền: Mỗi lần uống 8 đến 10 giọt, tối đa 30 giọt

+ Cao Mã tiền: Mỗi lần uống 10 đến 15 mg, tối đa 50 mg Nitrat strychnine uống mỗi lần 0,5 đến 1 mg, hoặc tiêm 1mL dung dịch 0.1%

- Trong Đông y: Mã tiền được dùng chữa ghẻ và những bệnh ngoài da khó chữa

Hạt Mã tiền được sao vàng, tán nhỏ trộn với dầu vừng mà bôi lên nơi ghẻ, nơi lở loét, hủi Ngoài ra,Mã tiền còn dùng dưới dạng uống để chữa bệnh tê thấp, bại liệt bán thân bất toại, chó dại cắn Mã tiền dùng trong Đông y phải ở dạng Mã tiền chế

Thuốc Phong tê thấp Bà Giằng là một bài thuốc chữa tê thấp, đau nhức xương khớp dùng Mã tiền chế trong y học dân gian Việt Nam lâu đời và hiệu quả, được nhân dân tin dùng Bài thuốc này gồm có 50g bột Mã tiền chế, bột hương phụ tử chế 13g, bột mộc hương 8g, bột địa liền 6g, bột thương truật 20g, bột quế chi 3g, tá dược vừa đủ cho 1000 viên hoàn Mỗi ngày uống 4 viên, tối đa 8 viên Mỗi đợt uống 50 viên thì nghỉ

Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh học rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh

Với một lượng nhỏ, alkaloid có thể là chất độc gây chết người nhưng đôi khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu

- Nhóm pyrrolidin: hygrin, cuscohygrin, nicotin

- Nhóm tropan: atropin, cocain, ecgonin, scopolamin

- Nhóm quinolin: quinin, quinidin, dihydroquinin, dihydroquinidin, strychnine,

brucine, veratrin, cevadin

- Nhóm isoquinolin: morphin, codein, thebain, papaverin, narcotin, saguinarin,

berbein

- Nhóm phenethylamin: mescalin, ephedrin, dopamin, amphetamin

- Nhóm indol:

 Các tryptamin: DMT, N-metyltryptamin, psilocybin, serotonin

 Các ergolin: Các ancaloit từ ngũ cốc/cỏ như ergin, ergotamin, acid lysergic v.v

 Các beta-cacbolin: harmin, harmalin, yohimbin, reserpin, emetin

 Các alkaloid từ chi Ba gạc (Rauwolfia): reserpin

 Các steroit: solanin, samandari (các hợp chất amoni bậc bốn): muscarin, cholin, neurin

1.3.1.3 Phân bố [1]

Alkaloid phân bố ở trong thực vật và cả động vật nhưng phần lớn có trong thực vật

- Trong thực vật bậc cao có: Cà phê, Mã tiền, Trúc đào,…

Phân tử lượng: khoảng 100-900

Đa số các alkaloid đều không mùi, có vị đắngvà một số ít có vị cay như capcaixin, piperin…

Hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một số alkaloid có màu như berberin màu vàng; palmatin, chelidonin và betanidin màu đỏ

Phần lớn alkaloid trong thiên nhiên trong cấu tạo có chứa C, H, N, O, thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường

Ví dụ: Morphine, codein, strychnine, quinin, reserpin

Những alkaloid thành phần cấu tạo không có chứa nguyên tố O thường ở thể lỏng Nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ

Ví dụ: Coniin, nicotin, spartein

Các alkaloid ở dạng bazơ tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan tốt trong dung môi hữu cơ như cloroform, đietyl ete, ancol bậc thấp

Các muối của alkaloid tan trong nước, ancol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực như cloroform, đietyl ete, benzen

Một số alkaloid trong công thức có chứa nhóm phân cực như –OH tan được một phần trong nước hoặc trong kiềm (morphin, cephalin)

Alkaloid có N bậc 4 và N-oxit khác tan trong nước và trong kiềm, rất ít tan trong dung môi hữu cơ

Tính chất hóa học:

Alkaloid có tính bazơ yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ Tính bazơ của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R gắn trên nguyên tử nitơ

Đa số làm xanh quỳ tím

Muối của alkaloid rất bền, nhưng chúng bị phân hủy bởi tia sáng mặt trời hoặc tia tử ngoại

Các alkaloid có tính bazơ yếu thì phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối tan trong nước

1.3.2 Tác dụng của alkaloid [13], [29]

1.3.2.1 Đối với sinh vật

- Là những chất chuyển hóa thứ cấp, chất bài tiết hoặc là sản phẩm cuối trong quá trình chuyển hóa của thực vật

- Là những chất dự trữ nitơ, tham gia vào chu trình nitơ trong thực vật

- Đôi khi là những chất tích lũy dẫn từ thức ăn (kiến lấy alkaloid từ lá cây, ếch, cóc

ăn kiến→ ếch, cóc có alkaloid)

- Là những chất bảo vệ, chống các sinh vật ăn thực vật

- Là vũ khí hóa học trong tự vệ, cần trong quá trình sinh tồn nhất là ở động vật (cóc,

kỳ nhông)

1.3.2.2 Đối với con người

- Alkaloid thường có hoạt tính sinh học mạnh đến rất mạnh, khá nhiều chất được sử dụng trong y học, nhưng chú ý đến liều lượng sử dụng, một lượng nhỏ có thể là một loại thuốc đặc hiệu, nhưng liều tương đối lớn nó là chất độc gây chết người

- Nhiều alkaloid có độc tính rất cao, chỉ với liều vài miligam là có thể gây tử vong cho con người Một số chất làm chất độc dùng trong săn bắn (tubocurarin)

- Nhiều chất có thêm tác động nguy hại đến xã hội (ma túy, ảo giác) như nicotin, morphin, đặc biệt là heroin và cocain, có thể gây nghiện khi sử dụng một vài lần và gây hại cho cơ thể con người

1.3.2.3 Đối với y dược

* Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

- Làm chất kích thích: strychnine, cafein, lobelin

- Làm chất ức chế: morphin, codein scopolanin, resrpin

* Làm thuốc:

- Điều trị bệnh tim: quinidin, aimalin

- Điều trị bệnh cao huyết áp: reserpin, aimalixin

- Chống co thắt: papaverin

- Thuốc hen suyễn: atropin, theophylin,

- Chống ung thư: vinblastin, vincristin,

1.3.3 Các phương pháp chiết- tách alkaloid [4], [13], [15], [30]

Phương pháp chung để chiết, tách các alkaloid từ mẫu thực vật phải theo các bước sau:

- Tách các hợp chất alkaloid ra khỏi lượng lớn các hợp chất không alkaloid

- Hầu hết các cây có chứa alkaloid thường có một dãy các hợp chất alkaloid có cấu trúc rất gần nhau Hầu như không tồn tại loài thực vật nào mà chỉ chứa một alkaloid

- Việc phân lập từng chất alkaloid từ hỗn hợp alkaloid tách ra từ thực vật phải sử dụng các kỹ thuật mới như sắc ký cột, bản mỏng điều chế, sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC),

Tuy nhiên các phương pháp chung để phân lập alkaloid phụ thuộc chủ yếu vào một

số yếu tố quan trọng như:

+ Tính kiềm của các alkaloid

+ Khả năng tạo muối với acid của các alkaloid

+ Tính tan tương đối của các muối của alkaloid trong các dung môi hữu cơ phân cực như etanol, cloroform, isopropanol hay môi trường nước

Việc chiết tách alkaloid còn phụ thuộc vào mục đích và qui mô (qui mô pilot hay thương mại) Cho mục đích nghiên cứu, sắc ký cột trao đổi ion là phương pháp hiệu quả

để tách các hợp chất alkaloid từ nguồn thực vật Tuy nhiên, ở qui mô thương mại, một lượng lớn dịch chiết nước nguyên liệu thực vật thường được bơm qua cột nhồi với nhựa cation để tách các cấu tử có tính bazơ Sau đó, các alkaloid (tức là các cấu tử có tính bazơ) được rửa sạch bằng cách dội cột với acid có độ mạnh vừa phải Cột chứa nhựa cation có thể được dùng lại

Năm bước quan trọng sau đây được tổng kết từ các kỹ thuật chiết tách mới cùng với rất nhiều thông tin về việc phân lập hàng trăm alkaloid từ nguồn thực vật:

(i) Chuẩn bị mẫu

(ii) Giải phóng alkaloid tự do có tính kiềm

(iii) Chiết alkaloid có tính kiềm với dung môi hữu cơ

(iv) Tinh chế cặn chiết alkaloid tổng

(v) Phân đoạn hóa cặn alkaloid tổng

Tất cả 5 bước này sẽ được thảo luận chi tiết dưới đây:

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Mẫu thực vật được xay nhỏ thành bột thô để quá trình chiết được hiệu quả Trong trường hợp các mẫu thực vật chứa nhiều dầu và chất béo như hạt thì các thành phần

không alkaloid cần được loại hoàn toàn bằng cách chiết với các dung môi hữu cơ kém

phân cực như n-hexan, ete dầu hỏa

Bước 2: Giải phóng alkaloid tự do có tính kiềm

Alkaloid thường tồn tại trong thực vật dưới dạng muối như muối oxalate, tannat,

Vì vậy, khi ở trong môi trường kiềm, muối alkaloid được chuyển thành các alkaloid kiềm tương ứng

Việc lựa chọn các bazơ vô cơ thích hợp để dễ giải phóng các alkaloid tự do từ muối

không chỉ rất quan trọng mà còn phụ thuộc vào các yếu tố sau:

(a) Trạng thái tự nhiên của alkaloid: Muối của các alkaloid có tính kiềm mạnh với

acid vô cơ thường được giải phóng khi có mặt bazơ mạnh Tương tự muối của các alkaloid có tính kiềm yếu với acid vô cơ sẽ giải phóng bằng bazơ yếu

(b) Đặc tính hóa học của alkaloid: Việc sử dụng kiềm mạnh như NaOH, KOH phải

tránh khả năng một số alkaloid sẽ bị thủy phân

Bước 3: Chiết các alkaloid có tính kiềm

Chiết các alkaloid có tính kiềm có thể được thực hiện bởi ba loại dung môi như trình bày dưới đây:

 Chiết với dung môi hòa tan trong nước

Các hợp chất alkaloid và các muối của chúng tan trong các dung môi như metanol, etanol, isopropanol; các loại dung môi này cũng được sử dụng để chiết các hợp chất ở trong cây

 Chiết với dung môi không hòa tan trong nước

Các dung môi không tan trong nước thường được sử dụng cho việc chiết alkaloid là: cloroform, đietyl ete và isopropyl ete

 Chiết với nước

Bột thực vật thô được chiết với dung dịch acid loãng của các acid HCl, H2SO4 hay

CH3COOH, sau đó được kiềm hóa tốt nhất với dung dịch NH4OH loãng và cuối cùng chiết với dung môi không tan trong nước

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bột Mã tiền chế do Doanh nghiệp tư nhân Sản xuất thuốc Y học cổ truyền Bà Giằng cung cấp

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

 Hóa chất

- Dung môi hữu cơ: n-Hexan, điclometan, EtOAc, MeOH, EtOH, axeton,

CH3COOH

- Thuốc thử: vanilin/acid sunfuric, thuốc thử Dragendorff

-Chất hấp thụ trong sắc ký cột: Sephadex LH – 20; Silica gel pha thường Merck 60

Máy cô đuổi dung môi Buchi Rotavapor R-134, đèn UV ở hai bước sóng 254 nm và

365 nm của công ty Shanghai Jingle Industrial, máy chiết siêu âm Amsco Reliance sonic

550, cân phân tích chính xác 0,001 gam, tủ sấy, thiết bị chiết soxhlet, bếp điện, thiết bị chưng cách thủy, máy li tâm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết mẫu

Mẫu bột Mã tiền chế có khối lượng 200 g đem ngâm với 600 mL metanol trong bình thủy tinh, lượng dung môi ngập quá lượng mẫu Đậy kín bình để hạn chế dung môi bay hơi, sau đó dùng chiết siêu âm trong vòng 60 phút, khoảng 30 phút khuấy đều mẫu một lần để dung môi hòa lẫn vào mẫu Sau thời gian trên, tiến hành lọc để tách lấy phần dịch chiết, tiếp tục ngâm với dung môi metanol thêm ba lần nữa với thời gian mỗi lần là 1 giờ để chiết kiệt các hợp chất trong mẫu thô ban đầu

Gộp các phần dịch chiết thu được, tiến hành cô đuổi dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất thấp Nhiệt độ cô đuổi dung môi không được lớn hơn 600C vì ở nhiệt độ này

có thể làm hư hại một số hợp chất kém bền nhiệt có trong dịch chiết

Sau khi cô đuổi dung môi, thu được cao chiết metanol có khối lượng 13,97 g

Cho 200 mL nước cất vào cao metanol vừa thu được, khuấy liên tục trong vòng 10

phút, sau đó chuyển mẫu vào phễu chiết 500 mL Thêm 100 mL n-hexan vào phễu chiết, đậy nắp phễu và lắc phễu trong 10 phút, để yên phân ly thành 2 lớp, dịch chiết n-hexan

và dịch chiếc nước, n- hexan nhẹ hơn nước nên ở lớp trên và có màu đậm hơn

Mở khóa phễu chiết để thu dịch nước vào lọ đựng, ta thu được dịch n-hexan

Chuyển lớp nước trong lọ vào lại phễu chiết, cho tiếp dung môi n-hexan, đậy nắp và lắc đều phễu tương tự như trên cho đến khi dịch chiết n-hexan trong phễu nhạt màu Tiến hành cô đuổi dung môi thu được cao chiết n-hexan có khối lượng 3,64 g

Cho dịch nước còn lại trong lọ vào trong phễu chiết, thêm 100 mL dung môi điclometan, đậy nắp và lắc đều phễu trong 10 phút, để yên, phân ly thành 2 lớp, dịch chiết điclometan và dịch nước, điclometan nặng hơn nước nên nằm ở phía dưới

Mở khóa phễu chiết thu được dịch điclometan Lặp lại cách làm như trên cho đến khi dịch chiết điclometan trong phễu nhạt màu hẳn Tiến hành cô đuổi dung môi thu được cao chiết điclometan có khối lượng 5,2 g