Nghiên cứu xác định nano curcumin trong một số loại thực phẩm chức năng bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM …… NGUYỄN THỊ QUỲNH CHI NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NANO CURCUMIN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CHUYÊN

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

……

NGUYỄN THỊ QUỲNH CHI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NANO CURCUMIN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Thừa Thiên Huế, năm 2016

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

……

NGUYỄN THỊ QUỲNH CHI

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NANO CURCUMIN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu ghi trong luận văn là trung thực, đƣợc các đồng tác giả cho phép sử dụng

và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Thị Quỳnh Chi

và kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học

Xin chân thành cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo Trường Đại học

Sư phạm Huế, phòng Đào tạo Sau đại học đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học Cao học và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến các anh chị tại Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thừa Thiên Huế đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt luận văn này

Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động viên, giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành bản luận văn này

Cuối cùng, tôi xin được kính chúc quý thầy cô, gia đình, các anh chị và các bạn sức khỏe, thành công và hạnh phúc

Chân thành cảm ơn!

Tác giả

Nguyễn Thị Quỳnh Chi

MỤC LỤC

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cám ơn iii

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG 5

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH 6

MỞ ĐẦU 8

NỘI DUNG 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 11

1.1.Tổng quan về thực phẩm chức năng 11

1.1.1 Khái niệm 11

1.1.2 Phân loại 13

1.1.2.1 Phân loại theo phương thức chế biến 13

1.1.2.2 Phân loại theo dạng sản phẩm 13

1.1.2.3 Phân loại theo chức năng tác dụng 14

1.1.2.4 Phân loại theo phương thức quản lý 14

1.1.2.5 Phân loại theo Nhật Bản 14

1.1.3 Vai trò và ứng dụng 15

1.1.3.1 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống 16

1.1.3.2 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc 17

1.1.4 Nhu cầu 18

1.1.5 Một số loại thực phẩm chức năng chứa Curcumin 19

1.2 Tổng quan về Curcumin 21

1.2.1 Lịch sử phát hiện 21

1.2.2 Cấu trúc hóa học 21

1.2.3 Tính chất 21

1.2.3.1 Tính chất vật lí 21

1.2.3.2 Tính chất hóa học 22

1.2.4 Tác dụng dược lí 23

1.2.5 Nguồn cung cấp Curcumin 23

1.2.6 NanoCurcumin 24

1.3 Một số nghiên cứu về định lượng Curcumin 27

1.4 Giới thiệu về phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC 28

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC 28

1.4.2 Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC 29

1.4.2.1 Giai đoạn tách 29

1.4.2.2 Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích 30

1.4.3 Detector trong HPLC 30

1.4.4 Phương pháp định lượng trong HPLC 31

1.4.4.1 Diện tích và chiều cao peak 32

1.4.4.2 Định lượng 32

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Nội dung nghiên cứu 34

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 34

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 34

2.2.2 Hóa chất 35

2.3 Phương pháp nghiên cứu 35

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản 35

2.3.2 Xây dựng qui trình phân tích Curcumin 35

2.3.2.1 Xử lý mẫu phân tích 35

2.3.2.2 Khảo sát các điều kiện HPLC 35

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 36

2.3.3.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống HPLC 36

2.3.3.2 Tính đặc hiệu 36

2.3.3.3 Khảo sát khoảng tuyến tính 37

2.3.3.4 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 37

2.3.3.5 Độ lặp lại 39

2.3.3.6 Độ đúng 39

2.3.4 Áp dụng phân tích Curcumin trong một số mẫu thực phẩm chức năng

được bán trên thị trường Thừa Thiên Huế 40

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm 41

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 42

3.1 Xây dựng qui trình phân tích Curcumin 42

3.1.1 Xử lý mẫu phân tích 42

3.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc kí 42

3.1.2.1 Chuẩn bị dung dịch phân tích 42

3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH của dung dịch đệm 43

3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của pha động 45

3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng 48

3.2 Thẩm định qui trình phân tích Curcumin 50

3.2.1 Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký 50

3.2.2 Tính đặc hiệu của phương pháp 51

3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng 52

3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 53

3.2.5 Xác định độ lặp lại của phương pháp 54

3.2.6 Xác định độ đúng của phương pháp xây dựng 56

3.3 Xây dựng quy trình phân tích 58

3.4 Áp dụng qui trình phân tích 59

3.4.1 Áp dụng qui trình phân tích hàm lượng Nano Curcumin trong một số loại thực phẩm chức năng được bán trên thị trường Thừa Thiên Huế 59

3.4.2 Đánh giá kết quả phân tích hàm lượng NanoCurcumin trong một số loại thực phẩm chức năng được bán trên thị trường Thừa Thiên Huế 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 PHỤ LỤC P1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên tiếng anh Tên tiếng việt

3 CAS Chemical Abstracts Service Hiệp hội hóa chất Hoa Kỳ

5 ĐKSK Chromatographic conditions Điều kiện sắc ký

6

HPLC High performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

7 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

8 LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng

10 PDA Detector photodiode array Detector mảng điot phát

quang

13 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

14 TPCN Functional food Thực phẩm chức năng

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG

1 Bảng 1.1 Các nhóm sản phẩm phân loại theo phương thức chế

2 Bảng 1.2 Phân biệt TPCN và thực phẩm truyền thống 16

4 Bảng 1.4

Một số nghiên cứu định lượng Curcumin bằng phương pháp HPLCsử dụng detector PDA và UV-VIS

28

7 Bảng 3.2 Hệ số đối xứng peak của các tỷ lệ hệ dung môi pha

8 Bảng 3.3 Các thông số cơ bản ở tốc độ dòng khác nhau (n=3) 49

9 Bảng 3.4 Các thông số sắc ký của peak Curcumin 50

10 Bảng 3.5 Sự tương quan giữa diện tích peak và nồng độ chất

11 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu TPCN 55

12 Bảng 3.7 Độ lặp lại của phương pháp phân tích 55

13 Bảng 3.8 Kết quả diện tích peak khảo sát độ đúng 57

14 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu TPCN (n=3) 58

16 Bảng 3.11 Kết quả phân tích hàm lượng Nano Curcumin trong

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

1 Hình 1.1 Thực phẩm chức năng đƣợc sử dụng rộng rãi trên TG 11

2 Hình 1.2 Mối quan hệ giữa thực phẩm, TPCN và thuốc 15

3 Hình 1.3 Minh họa các dạng sản phẩm TPCN chứa Curcumin 19

4 Hình 1.4 Một số loại TPCN chỉ chứa Curcumin 20

5 Hình 1.5 Một số loại TPCN chỉ chứa NanoCurcumin 20

6 Hình 1.6 Một số loại TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin

7 Hình 1.7 Một số TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin và các

9 Hình 1.9 Dạng keto và enol của Curcumin 22

10 Hình 1.10 Tác dụng phòng và chống ung thƣ của Curcumin 23

11 Hình 1.11 Một số loại củ nghệ

(từ trái sang: nghệ đỏ, nghệ vàng, nghệ đen ) 23

12 Hình 1.12 Nano Curcumin điều trị hiệu quả hầu hết các bệnh

15 Hình 1.15 Minh họa độ hấp thu tốt của Nano Curcumin 26

16 Hình 1.16 Quy trình sản xuất Cumar Gold Nano Curcumin đầu

MỞ ĐẦU

Từ lâu con người đã biết sử dụng các thành phần của cây nghệ như một loại gia vị, chất nhuộm truyền thống Đặc biệt, nghệ được dùng như một loại thuốc gia truyền trong gia đình, chữa được nhiều bệnh khác nhau như: trị tụ huyết; máu cam; làm cao dán nhọt; thoa chống vết thương tụ máu; làm mau lành sẹo; trị viêm gan; vàng da; bệnh loét dạ dày; loét ngoài da; bệnh hen suyễn; chữa bỏng…[16]

Ngày nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy nghệ còn có thể dùng

để hỗ trợ điều trị và ngăn ngừa nguy cơ ung thư Nghệ có nhiều đặc tính quý giá như vậy là nhờ thành phần hóa học của nó có chứa Curcumin[42], [43], [47]

Curcumin là thành phần chính của Curcuminoit – một chất trong củ nghệ Nó

là chất tạo màu vàng cho củ nghệ Curcumin là một trong những chất chống viêm, chống oxi hóa, chống lão hóa điển hình Nó cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn như virut HP, viêm gan B, C… rất cao Đặc biệt, nó là chất có khả năng ngăn chặn ung thư và loại bỏ các loại men gây ung thư trong thức ăn và nước uống [45],[47]

Với những tác dụng sinh học quý giá, lại có nguồn gốc tự nhiên, an toàn nên Curcumin ngày càng được quan tâm và sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, theo Kawanishi et al (2005), Curcumin cũng giống như các chất chống oxy hóa khác, là con dao hai lưỡi Các nghiên cứu lâm sàng trên người với 2-12g Curcumin cho thấy các tác dụng phụ như buồn nôn, tiêu chảy, rối loạn chuyển hóa sắt và chặn protein hepcidin, có khả năng gây ra thiếu sắt ở các bệnh nhân mẫn cảm[43].Trong khi đó,Curcumin chỉ chiếm 0,3-1% về khối lượng của củ nghệ Để chữa được bệnh thì bệnh nhân phải uống liên tục tới 12-20g Curcumin, tương đương với 4-6 lạng bột nghệ Đây là liều rất cao, Curcumin lại có hương vị hơi cay nóng, hơi đắng, có mùi

mù tạc nên gây khó chịu và kích ứng đường tiêu hóa Bên cạnh đó, độ tan và độ hấp

thu của Curcumin rất thấp.GS TS Đào Văn Phan cho biết: “Curcumin tuy uống với

liều cao nhưng hàm lượng trong máu và nơi tác dụng lại vẫn thấp Do Curcumin không tan trong nước, dễ bị phá hủy ở ruột, dễ bị chuyển hóa và thải trừ ở gan, nên chỉ hấp thu vào máu được 2 đến 5%”[42] Cho nên, để đạt được nồng độ trong máu

đủ để phát huy hiệu quả thì bệnh nhân phải sử dụng liều cao Curcumin hoặc phải sử

dụng các dạng bào chế công nghệ cao để tăng độ hấp thu vào máu Điều này đã dẫn đến sự ra đời và phát triển mạnh mẽ của các loại thực phẩm chức năng chứa Curcumin ở dạng nano

Thực phẩm chức năng chứa Curcumin là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm Curcumin Nó được chế tạo ở dạng viên, chứa hàm lượng Curcumin cao, dễ uống, không gây khó chịu và dễ hấp thu hơn Hiện nay, trên thị trường có nhiều loại thực phẩm chức năng chứa Curcumin như: CumarGold, Curcumin with Piperine; Curcucaroten, Viên Curcumin, Viên nang nghệ vàng Curcumin…do các doanh nghiệp có thương hiệu và uy tín trên thị trường; được Bộ Y tế cấp phép đầy đủ

Thế nhưng, vẫn tồn tại nhiều loại thức phẩm chức năng chứa Curcuminchưa được kiểm định chất lượng, thậm chí là làm giả được quảng cáo rầm rộ và bán trên thị trường, gây nguy hiểm cho sức khỏe của người dùng

Vì vậy, phân tích và đánh giá hàm lượng Curcumin trong các loại thực phẩm chức năng rất quan trọng.Người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp trắc quang, sắc ký, hóa học,… Trong đó, phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có độ chính xác và độ nhạy cao, phân tích được nhiều đối tượng phức tạp và dễ thực hiện

Trên thế giớiđã có nhiều công trình nghiên cứu về Curcuminbằng nhiều phương pháp, đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho kết quả phân tích tốt và áp dụng trên nhiều đối tượng như:nghệ, trong sữa tươi, thuốc tự nhuộm

tự nhiên, gia vị, rượu nghệ, thuốc cổ truyền Trung Quốc trong huyết thanh của người Ở Việt Nam thì việc nghiên cứu xác định hàm lượng Curcumin còn hạn chế, chưa được quan tâm rộng rãi và chủ yếu mới áp dụng trên đối tượng nghệ và phẩm màu

Xuất phát từ những lí do trên, nhằm xác định hàm lượng Nano Curcumin để góp phần hiệu quả vào công tác kiểm tra chất lượng một số loại thực phẩm chức

năng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định NanoCurcumin trong một

số loại thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”với

mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình phân tích định lượng NanoCurcumin trong một số loại thực

phẩm chức năng bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao, là phương pháp hiện đại, có độ chính xác và độ nhạy cao

2 Phân tích Nano Curcumin trong một số loại thực phẩm chức năng chứa

Curcumin được bán trên thị trường Thừa Thiên Huế

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1.1 Tổng quan về thực phẩm chức năng

Thực phẩm không chỉ giúp duy trì sự sống, mà còn có khả năng tăng cường sức khỏe và giảm thiểu các bệnh mãn tính do mất cân bằng dinh dưỡng Do đó vấn

đề tìm hiểu và chế biến các loại thực phẩm có thành phần cấu tạo tác dụng tích cực vào những nhiệm vụ khác nhau của cơ thể là rất quan trọng

Hình 1.1 Thực phẩm chức năng được sử dụng rộng rãi trên thế giới

1.1.1 Khái niệm

Thực phẩm chức năng (TPCN) tên tiếng anh là Functional Foods Đây là

loại thực phẩm có nguồn gốc chiết xuất từ tự nhiên, trong quá trình chế biến có bổ sung thêm một số chất chức năng TPCN rất tốt cho cơ thể, nó là sản phẩm giao

thoa giữa thực phẩm và thuốc nên nhiều khi người ta còn gọi là thực phẩm thuốc

Năm 1991, TPCN được đưa ra với ý nghĩ ban đầu là “những thực phẩm chế

biến chứa các hoạt chất có thể giúp một vài chức năng cơ thể hoàn thành nhiệm vụ khả quan hơn ngoài công dụng dinh dưỡng”

Cho đến nay, chưa có một tổ chức quốc tế nào đưa ra định nghĩa đầy đủ về TPCN, đã có nhiều hội nghị quốc tế và khu vực về TPCN Mặc dù chưa được định nghĩa thống nhất, nhưng thuật ngữ “Thực phẩm chức năng” đã được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới

- Theo viện Y học Hoa Kỳ[45]:

“Thực phẩm chức năng là nhữnng thực phẩm có chứa các chất có khả năng tốt cho sức khỏe Các thực phẩm này bao gồm bất cứ thực phẩm chế biến hoặc thành phần nào có thể cung cấp lợi ích cho sức khỏe ngoài giá trị dinh dưỡng cố hữu của thực phẩm”

- Theo tổ chức y tế Canada [45]:

“Thực phẩm chức năng có hình dáng bên ngoài tương tự như thực phẩm thông thường Ngoài khả năng dinh dưỡng cố hữu, các thực phẩm này còn phải đượcchứng minh một cách khoa học là có thể cung cấp những lợi ích sinh học và có khả năng giảm thiểu rủi ro mắc các bệnh mãn tính”

- Theo tổ chức y tế Hàn Quốc[39]:

“ Thực phẩm chức năng là các thực phẩm chứa các chất dinh dưỡng và các chất khác dưới dạng cô đặc, có tác dụng nuôi sống hoặc sinh học với mục đích phụ thêm cho thực phẩm tự nhiên”

- Theo hiệp hội thực phẩm sức khỏe và dinh dưỡng bộ y tế Nhật Bản [39]:

“Thực phẩm chức năng là thực phẩm bổ sung một số thành phần có lợi hoặc loại bỏ một số thành phần bất lợi, việc bổ sung hay loại bỏ phải được cân nhắc và chứng minh một cách khoa học và đượcBộ Y tế cho phép xác định hiệu quả của thực phẩm đối với sức khỏe”

- Tại Việt Nam, theo thông tư số 08/TT-BYT ngày 23-08-2004 của Bộ Y Tế[45]:

“Thực phẩm chức năng là thực phẩm để hổ trợ các chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh”

* Một số tên thường gọi của thực phẩm chức năng:

- Ở các nước Châu Á (Việt Nam, Hàn Quốc, Nhật Bản ) phổ biến sử dụng các tên gọi như TPCN (Functional foods), thực phẩm bổ sung (Food Supplement), sản phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Product), thực phẩm đặc biệt (Food for Special use), sản phẩm dinh dưỡng y học (Medical Supplement)[41]

- Tại Mỹ, Châu Âu và cả Trung Quốc gần giống nhau khi chia thành thực phẩm bổ sung (Dietary Supplement), thực phẩm y học/điều trị (Medical Supplement – tại Mỹ và Trung Quốc) hay thực phẩm thuốc (Nutraceuticals – tại Châu Âu)[41]

1.1.2 Phân loại

Theo PGS.TS Trần Đáng– Chủ tịch Hiệp hội Thực phẩm chức năng Việt

Nam: hiện nay, ở Việt Nam có 5 cách phân loại phân loại TPCN

1.1.2.1 Phân loại theo phương thức chế biến [41]

Trong phương pháp phân loại này, TPCN được chia thành bốn loại nhỏ hơn

là nhóm sản phẩm bổ sung vitamin, bổ sung khoáng chất, bổ sung hoạt chất sinh học và nhóm sản phẩm được bào chế từ thảo dược

Bảng 1.1 Các nhóm sản phẩm phân loại theo phương thức chế biến

Bổ sung vitamin - Các loại nước trái cây với những hương vị khác nhau cung

cấp nhu cầu vitamin C, E, β - caroten ở Anh

-Các dạng viên uống tiện dụng như One a day, Centrum

cardio…

Bổ sung khoáng

chất

- Muối bổ sung iot

- Các loại bánh kẹo được bổ sung canxi, vitamin

- Sữa bột được tăng thêm axit folic, vitamin, khoáng chất …

- Nước tăng lực bổ sung vitamin và khoáng chất

- Các viên như canxi, magie, kẽm, sắt…

Bổ sung sinh học - Sữa hoặc thức ăn trẻ em có bổ sung DHA, EPA,…

Bào chế từ thảo

dược

- Viên tảo, linh chi, nhân sâm, đông trùng hạ thảo, trà Hà Thủ

ô, trà Hoàn Ngọc,…

1.1.2.2 Phân loại theo dạng sản phẩm [41]

Theo cách phân loại này có 2 dạng:

+ Thực phẩm – thuốc (Food – Drug): có dạng viên (viên nén, viên nhộng, viên sủi, viên hoàn…), dạng nước, dạng bột, dạng trà, dạng rượu, dạng cao, dạng kẹo, dạng thực phẩm cho mục đích đặc biệt

+ Thức ăn – thuốc (thức ăn bổ dưỡng, món ăn thuốc, món ăn chữa bệnh…) gồm: cháo thuốc, món ăn thuốc, món ăn bổ dưỡng, canh thuốc, nước uống thuốc…

1.1.2.3 Phân loại theo chức năng tác dụng [41]

Theo cách phân loại này chia TPCN thành 26 dạng khác nhau

Đó là các nhóm sản phẩm hỗ trợ chống lão hóa; hỗ trợ tiêu hóa; hỗ trợ giảm huyết áp; hỗ trợ giảm đái tháo đường; tăng cường sinh lực; bổ sung chất xơ; phòng ngừa rối loạn tuần hoàn não; hỗ trợ thần kinh; bổ dưỡng; tăng cường miễn dịch; giảm béo; bổ sung canxi, ngăn ngừa loãng xương; phòng ngừa thoái hóa khớp; hỗ trợ làm đẹp; bổ mắt; giảm cholesterol; hỗ trợ điều trị ung thư; phòng chống bệnh Gout; giảm mệt mỏi, stress; hỗ trợ phòng và giải độc; hỗ trợ an thần, ngăn ngừa mất ngủ; hỗ trợ phòng ngừa bệnh răng miệng; hỗ trợ phòng ngừa bệnh nội tiết; hỗ trợ tăng cường trí nhớ và khả năng tư duy; hỗ trợ phòng chống bệnh tai, mũi, họng và

hỗ trợ phòng chống bệnh về da

1.1.2.4 Phân loại theo phương thức quản lý [41]

Cách phân loại này tùy thuộc sản phẩm có phải đăng ký hay không:

+ Các sản phẩm TPCN không phải đăng ký thì do cơ quan quản lý thực phẩm ban hành

+ Các sản phẩm TPCN phải đăng ký và Cục An toàn vệ sinh thực phẩm (Bộ

Y tế) chứng nhận và cấp phép lưu hành thì do cơ quan quản lý thực phẩm trung ương chịu trách nhiệm

1.1.2.5 Phân loại theo Nhật Bản [41]

Theo cách phân loại phổ biến tại Nhật Bản thì TPCN được chia làm 2 nhóm: + Nhóm các sản phẩm công bố về sức khỏe, gồm:

▪ Loại 1 là hệ thống Foshu (food for special health use) – thực phẩm dùng cho mục đích đặc biệt

▪ Loại thứ 2 là sản phẩm có khuyến cáo chức năng dinh dưỡng (FNFC) – nhóm sản phẩm nhằm cung cấp các chất dinh dưỡng (vitamin, khoáng chất) cần thiết cho sự tăng trưởng lành mạnh và phát triển, duy trì sức khỏe

+ Nhóm thực phẩm đặc biệt, bao gồm: thực phẩm cho người ốm; sữa bột trẻ em; sữa bột cho phụ nữ có thai và cho con bú; thực phẩm cho người già nhai nuốt khó

* Ngoài ra, tùy theo hàm lượng chất dinh dưỡng được đưa vào mà TPCN có

thể được phân chia ra làm các loại cơ bản sau đây[45]:

- Thực phẩm chức năng bổ sungvitamin và khoáng chất

- Thực phẩm chức năng bổ sung chất xơ

- Thực phẩm chức năng giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường tiêu hóa

- Thực phẩm chức năng bổ sung các chất dinh dưỡng đặc biệt khác

- Thực phẩm chức năng loại bỏ bớt một số thành phần

- Các thực phẩm cho nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt

- Thực phẩm chức năng giảm cân

1.1.3 Vai trò và ứng dụng

Các loại TPCN có tác dụng chung là bổ sung dinh dưỡng, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể và làm giảm bớt nguy cơ mắc các loại bệnh tật cho con người Ngoài ra, các sản phẩm này còn có thể bổ sung các loại vi chất cần thiết rất tốt cho

cơ thể

Tuy nhiên, TPCN không phải là thuốc, không thể thay thế thuốc chữa trị bệnh Thực phẩm chức năng được hiểu như là khoảng giao thoa giữa thực phẩm và thuốc, nên còn gọi là thực phẩm thuốc (Food- Drug) Cho nên cần phải phân biệt TPCN và thực phẩm truyền thống; TPCN và thuốc

Hình 1.2 Mối quan hệ giữa thực phẩm, thực phẩm chức năng và thuốc

Thực phẩm chức năng là sự kết hợp giữa thuốc và thực phẩm bổ sung

1.1.3.1 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống

Hiệp hội Thực phẩm Chức năng Việt Nam có các tiêu chí so sánh cụ thể theo bảng 1.2

Bảng 1.2 Phân biệt thực phẩm chức năng và thực phẩm truyền thống[39]

TT Tiêu chí Thực phẩm truyền thống Thực phẩm chức năng

1 Chức năng 1 Cung cấp các chất dinh

2 Chế biến Chế biến theo công thức

thô (không loại bỏ đƣợc chất bất lợi)

Chế biến theo công thức tinh (bổ sung thành phần có lợi, loại bỏ thành phần bất lợi) đƣợc chứng minh khoa học và cho phép của cơ quan có thẩm quyền

Hoạt chất, chất chiết từ thực vật, động vật (nguồn gốc tự nhiên)

1.1.3.2 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc

Hiệp hội Thực phẩm chức năng Việt Nam cũng đã có những so sách hết sức

cụ thể giữa thực phẩm chức năng và thuốc, thể hiện ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Phân biệt thực phẩm chức năng và thuốc [39]

TT Tiêu chí Thực phẩm chức năng Thuốc

1 Dựa vào

định nghĩa

Là sản phẩm dùng để hỗ trợ (phục hồi, tăng cường và duy trì) các chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng cường đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật

Là chất hoặc hỗn hợp chất dùng cho người nhằm mục đích phòng bệnh, chữa bệnh, chuẩn đoán bệnh hoặc điều chỉnh chức năng sinh lý cơ thể, bao gồm thuốc thành phẩm, nguyên liệu làm thuốc, vắc - xin, sinh phẩm y tế trừ TPCN

- Là thuốc;

- Có chỉ định, liều dùng, chống chỉ định

TT Tiêu chí Thực phẩm chức năng Thuốc

Theo báo cáo “Nghiên cứu thị trường toàn cầu về TPCN: Thực phẩm bổ sung

hoạt chất từ thảo dược sẽ trở thành thị trường lớn nhất trong năm 2020” do

Persistence công bố mới đây, thị trường TPCN toàn cầu đã đạt 109,8 tỷ USD trong năm 2013 Với tốc độ tăng trưởng dự kiến 7,4%/năm, đến năm 2020, thị trường TPCN toàn cầu sẽ đạt giá trị dự kiến khoảng 180 tỷ USD

Không nằm ngoài xu thế chung của thế giới, thị trường TPCN Việt Nam đã

có bước tăng trưởng mạnh mẽ trong những năm gần đây Từ chỗ chỉ có vài sản phẩm cuối thế kỷ XX, đến nay số lượng TPCN trên thị trường đã đạt trên 7.000 sản phẩm với sự tham gia của khoảng 3500 doanh nghiệp sản xuất và kinh doanh TPCN

Hiệp hội thực phẩm chức năng Việt Nam xác định, thị trường TPCN Việt Nam hoàn toàn có cơ hội để phát triển thành một ngành kinh tế - y tế mũi nhọn với

những sản phẩm chất lượng, đảm bảo an toàn và hiệu quả cao trong việc phòng ngừa, hỗ trợ điều trị bệnh tật cho người dân Việt Nam[38]

Từ đó, Hiệp hội đã đặt ra các mục tiêu đến năm 2020 và tầm nhìn chiến lược đến năm 2030 Trong các mục tiêu đến năm 2020, Hiệp hội xác định, chỉ tiêu quan trọng nhất được đưa ra là nâng số người trưởng thành sử dụng TPCN thường xuyên

từ 43% như hiện nay lên khoảng 60% Về sản xuất, Hiệp hội sẽ phối hợp với các

bộ, ban, ngành và các doanh nghiệp liên quan để hình thành thêm nhiều vùng nguyên liệu chuyên canh 100% áp dụng GAP - TPCN Hiệp hội cũng đặt ra nhiều mục tiêu cho sự phát triển của ngành TPCN Việt Nam đến năm 2020

Tầm nhìn đến năm 2030, sẽ có trên 90% các nhóm đối tượng liên quan “Hiểu đúng - Làm đúng - Dùng đúng” TPCN Tỷ lệ số người trưởng thành sử dụng TPCN thường xuyên lên 70% Sản xuất TPCN trong nước chiếm 75%, trong đó, tự túc nguyên liệu đạt 60%và xuất khẩu TPCN đạt 5 tỷ USD [38]

Để đạt được mục tiêu 2020 và tầm nhìn 2030, Hiệp hội TPCN Việt Nam đã xác định việc nghiên cứu khoa học công nghệ mới để áp dụng vào sản xuất, quản lý ngành sẽ là hướng đi mũi nhọn Các nghiên cứu về về quy hoạch nuôi trồng, di thực, bảo tồn gen các loại dược thảo có sẵn trong nước cũng là những nội dung quan trọng của nghiên cứu nguyên liệu của TPCN

1.1.5 Một số loại thực phẩm chức năng chứa Curcumin

Dựa vào dạng sản phẩm, TPCN chứa Curcumincó thể chia thành dạng viên (nén, nang, nhộng, ); dạng nước; dạng bột

Trong đó, phổ biến là dạng viên nang (cứng hoặc mềm)

Hình 1.3 Minh họa một số dạng sản phẩm TPCN chứa Curcumin

Hạn chế của Curcumin là ít tan trong nước nên khó hấp thu được vào máu,

để nâng cao độ hòa tan và tăng nhanh được độ hấp thu của Curcumin vào máu bằng

cách kết hợp Curcumin với các chất khác hoặc sử dụng công nghệ nano Do đó, dựa vào thành phần các chất có trong TPCN chứa Curcumin có thể chia thành:

- TPCN chỉ chứa Curcumin (tinh bột nghệ)

Hình 1.4 Một số loại TPCN chỉ chứa Curcumin

- TPCN chỉ chứa NanoCurcumin

Hình 1.5 Một số loại TPCN chỉ chứa NanoCurcumin

- TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin và piperin theo tỉ lệ 1%: giúp tăng

độ hấp thu của Curcumin lên tới hơn 20 lần

Hình 1.6 Một số loại TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin với piperin

- TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin với các loại hợp chất khác

Hình 1.7 Một số TPCN chứa Curcumin/NanoCurcumin và các hóa chất khác

1.2 Tổng quan về Curcumin

1.2.1 Lịch sử phát hiện[16]

Curcumin là hợp chất tự nhiên, đƣợc chiết tách từ củ nghệ vàng, có hoạt tính sinh hoạt cao Từ năm 1910, Lamp đã chiết tách, phân lập, xác định cấu trúc nhóm hoạt chất mang màu vàng của nghệ

- Khi đun Curcumin với kiềm tạo thành axit vanilicvà axit ferulic

- Curcumin nóng chảy với kiềm cho axit protocatechuic ((OH)2C6H3COOH)

- Oxy hóa bằng pemanganat tạo thành vanilin

- Tác dụng với hiđroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol

- Hydro hóa dẫn xuất điaxetyl của Curcumin cho hỗn hợp dẫn xuất hexahiđro vàtetrahiđro

Từ những phản ứng trên, cấu trúc của Curcumin đƣợc xác định là diferuloylmethane

Hình 1.8 Cấu trúc hóa học của Curcumin

Tên IUPAC: l,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-hepta-l,6-diene-3,5-dione Tên CAS:Diferuloylmethane

1.2.3 Tính chất

1.2.3.1 Tính chất vật lí[11],[16]

- Curcumin dạng bột màu vàng, dạng tinh thể nâu đỏ, ánh tím, không mùi

- Nhiệt độ nóng chảy: 179-1830C; khối lƣợng riêng 0,93 g/cm3

- Curcumin là chất gây nên màu vàng đặc trưng cho nghệ, có bước sóng trong vùng khả kiến λ: 420 – 430 nm

- Curcumin không tan trong nước

+ Tan trong dung môi hữu cơ như rượu, ete, clorofom tạo ra dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục

+ Tan trong dung dịch axit (do có nhóm metoxyl-OCH3) tạo ra dung dịch có màu đỏ cam

+Tan trong dung dịch kiềm (do có nhóm hiđroxyl -OH trên nhân thơm) tạo

ra dung dịch màu đỏ máu ngả dần sang màu tím lục

+ Tan trong chất béo (dùng để nhuộm các chất béo) pH = 7,4 - 8,6

- Màu của Curcumin bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng và khi có sự hiện diện của SO2 với nồng độ > 10 ppm

1.2.3.2 Tính chất hóa học[11],[16]

Curcumin có 2 nhóm C=O hoạt động hóa học mạnh, H của nhóm -CH2- giữa

2 nhóm cacbonyl này có thể dễ dàng tham gia các phản ứng, kể cả phản ứng nội phân tử tạo thành các dạng thù hình khác nhau

Trong khi đó nhóm C=O trong môi trường kiềm có thể biến đổi thành C-OH

Hình 1.9.Dạng keto và enol của Curcumin

Do đó, Curcumin có những tính chất hóa học sau:

- Phản ứng phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng hoặc trong môi trường pH thích hợp

- Phản ứng cộng với H2

- Phản ứng tạo phức với kim loại

-Phản ứng của nhóm OH trên vòng benzen

- Phản ứng isoxozol

1.2.4 Tác dụng dược lí[16],[40],[42], [43], [44], [47]

Curcumin có vai trò chống oxi hóa, khả năng phòng và chống ung thư Curcumin hiện là một trong những chất phòng hóachống khối u đang được đặc biệt quan tâm nghiên cứu Curcumin hoạt động như một chất tìm diệt gốc tự do gây ung thư, có khả năng giải độc gan, phòng chống xơ gan cổ trướng bảo vệ hồng cầu, ngăn cản vi trùng lao phát triển kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm và khả năng kháng HIV mới được khám phá gần đây [42], [43]

Hình 1.10 Tác dụng phòng và chống ung thư của Curcumin

1.2.5 Nguồn cung cấp Curcumin

Củ nghệ có hàm lượng Curcumin cao nhất trong các loại dược liệu

Nghệ - curcuma là một chi thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Ở Việt Nam có chừng 18 loài nghệ: nghệ vàng, nghệ đen,nghệ trắng, nghệ xanh, nghệ rừng, nghệ mảnh, nghệ Quảng Tây, nghệ sen, nghệ nếp, nghệ tẻ,…

Hình 1.11 Một số loại củ nghệ (từ trái sang: nghệ đỏ, nghệ vàng, nghệ đen )

Trong đó củ nghệ vàng chứa nhiều Curcumin và được sử dụng rộng rãi nhất Ngày nay ngoài nghệ tươi, Curcumin còn được cung cấp thông qua các sản phẩm chế biến từ nghệ như: tinh bột nghệ hay các loại thực phẩm chức năng được bào chế dưới dạng thuốc

1.2.6 NanoCurcumin [42],[43]

NanoCurcumin là dạng bào chế của tinh chất Curcumin chiết xuất từ củ nghệ vàng theo công nghệ Nano hiện đại, giúp cải thiện các vấn đề khó khăn, là rào

cản hạn chế hiệu quả hỗ trợ điều trị của Curcumin

Các phân tử Curcumin được cố định trong polymer, tạo thành các hạt NanoCurcumin siêu nhỏ, mịn với kích thước chỉ khoảng 30 – 100 nm (Nano mét) Bột đó được gọi là NanoCurcumin (hay gọi tắt là bào chế Curcumin bằng công nghệ Nano…)

Bản chất hóa học và tác dụng sinh học hoàn toàn đồng nhất với Curcumin:

nó có thể điều trị hầu hết các loại bênh mạn tính, bao gồm cả ung thư

Hình 1.12 NanoCurcumin điều trị hiệu quả hầu hết các bệnh mãn tính

(Nguồn: The Centre for Knowledge Manangment of Nanoscience & Technology)

Hình 1.13 Tác dụng phòng và chống ung thư của NanoCurcumin

Nhưng NanoCurcumin có điểm vượt trội:

- Với kích thước siêu nhỏ từ 30nm-100nm giúp NanoCurcumin phân tán tốt trong nước, độ tan 7,5%, tăng gấp 7.500 lần so với Curcumin (0,001%)

Hình 1.14 Tính tan trong nước của NanoCurcumin và Curcumin

- Các phân tử Curcumin được cố định trong chất liệu polymer để tạo thành các hạt tiểu phân Nano, nên giúp NanoCurcumin bền vững, không bị phá hủy bởi dịch vị dạ dày

- Kích thước Nano siêu nhỏ giúp NanoCurcumin thẩm thấu vào máu nhanh chóng để phát huy hiệu quả hỗ trợ điều trị tại hầu hết các cơ quan khác nhau trong

cơ thể Độ hấp thu của NanoCurcumin đạt tới 95%, hiệu quả vượt trội so với Curcumin thông thường (Theo kết quả nghiên cứu của nhóm chuyên gia của trường Đại học Dược, bang Ohio, Hoa kỳ, thực hiện năm 2012 đăng trên Pubmed)

- Với độ hấp thu qua đường uống lên tới 95%, theo tính toán của các chuyên gia thì liều sử dụng hàng ngày để đạt hiệu quả hỗ trợ điều trị là 2-4viên nang

NanoCurcumin thay vì phải ăn 4kg nghệ tươi, uống 120g (hơn 1 lạng) tinh bột nghệ hay uống tới 24 viên nang Curcumin

Hình 1.15.Minh họa độ hấp thu tốt của NanoCurcumin

Hiện tại, các nhà khoa học trên thế giới cũng thử nghiệm nhiều công nghệ tạo Curcumin kích thước nano để tăng sinh khả dụng và giảm độc tính của Curcumin Các công nghệ này bao gồm các phân tử nano lipid-rắn, huyền phù nano, nhũ tương nano, Curcumin xyclodextrin tự phân tách, hạt nano hydrogel, phức hệ Curcumin phospholipid và Curcumin kết hợp trong các phân tử nano của polymer

Công nghệ nano hiện nay đang được ứng dụng ngày càng nhiều không chỉ đối với Curcumin mà đối với nhiều dược chất hóa học khác với mục đích là nâng cao hiệu quả hấp thu dược chất vào máu Tuy nhiên giá thành lại rất đắt

Hình 1.16 Quy trình sản xuất CumarGold NanoCurcumin đầu tiên tại VN

Với những ưu điểm tuyệt vời như vậy, xu hướng sử dụng tinh nghệ NanoCurcumin trong ngừa và điều trị bệnh tăng cao.Trên thị trường hiện nay chủ yếu bày bán loại sản phẩm này nên chúng tôi chọn đối tượng phân tích là TPCN chứa NanoCurcumin, dạng viên nang (cứng hoặc mềm) để phân tích hàm lượng

1.3 Một số nghiên cứu về định lượng Curcumin

Trên thế giới, nhiều phương pháp đã được xây dựng để định tính và định lượng Curcumin được tổng hợp ở bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số nghiên cứu định lượng Curcumin bằng phương pháp HPLC sử

dụng detector PDA và UV-VIS

1 Hạt Curcumin có

kích thước Nano

- A là dung dịch đệm amoni axetat(pH 4,5)

và B là ACN

- Điều kiện gradient:

Ban đầu 95%A, tiến tới 55%A ở 20 phút, cuối cùng là 5%A ở

33 phút

- Bước sóng: 420 nm

- Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

- Bước sóng: 254 nm

- Cột Agilent RP C18 XDB

- Bước sóng: 420nm

- Cột C18 (250 X 4,6 mm, 5 µm)

- Tốc độ dòng: 1,5 mL/p

[28]

4 Curcuminoid Dung dịch axit axetic - Bước sóng: 420 nm [18]

trong mẫu

thực phẩm ở Hàn

Quốc

2% trong nước (A) và dung dịch CH3COOH 2% trong ACN (B)

• Gradient khai triển:

- Cột X Terra MS C18 (250 x 4,6 m, 5 µm)

-Bước sóng: 340 nm

- Cột C18 (pha đảo) (250x4,6 mm, 5µm)

[22]

1.4 Giới thiệu về phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC[15]

Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha tĩnh để mang chất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động

Quá trình tách sắc ký gồm những cân bằng động xảy ra và diễn biến liên tục trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động trong những điều kiện nhất định Nó là

sự vận chuyển và phân bố lặp đi lặp lại nhiều lần liên tục của các chất tan Xi (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đàu cột đến cuối cột tách Trong quá trình đó, chất tan Xi luôn luôn được phân bố lại giữa 2 pha, trong khi pha động luôn luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định

Cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất phân tích là khác nhau,do đó chúng có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên các chất phân tích di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau

Hình 1.17 Minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký

1.4.2 Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC [15]

1.4.2.1 Giai đoạn tách

Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất cao (200  500 atm) Vì vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch (thường là hòa tan trong dung môi làm pha động) Phương pháp này thích hợp cho

tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường)

Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách  chất phân tích được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh

Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi) để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau)

1.4.2.2 Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích

Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi

là detector

Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết như: Thời gian lưu, diện tích và chiều cao peak, hệ số phân giải, hệ số đối xứng…

+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ vào tính chất này để phân tích định tính

+ Độ lớn peak được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này

tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để định lượng chất phân tích

Hình 1.18 Hệ thống HPLC

1.4.3 Detector trong HPLC[9], [15]

Trong kĩ thuật phân tích HPLC, việc tách các chất xảy ra liên tục trong cột tách, các chất tan được nạp vào đầu cột và đi ra khỏi cột tách nhờ pha động Vì thế

detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động đi ra từ cột sắc ký với dòng chảy liên tục

Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp, là

bộ phận dùng để thu nhận và phát hiện các chất hoặc hợp chất phân tích dựa theo tính chất hóa học, hóa lý hay tính chất vật lý của chất phân tích

Có nhiều loại detector khác nhau cho kĩ thuật HPLC như detector phổ hấp thụ quang phân tử UV – Vis, detector mảng diot phát quang (PDA), detector phổ huỳnh quang (RF), detector phổ khối phân tử (MMS),

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng detector mảng diot phát quang (PDA):

Loại detector này dựa trên sự phát quang của một diot đặc biệt, khi nó bị chùm sáng tác động vào Loại này mới ra đời (sau 1990), về nguyên tắc nó cũng hoạt động tương tự như dectector phổ hấp thu quang vùng phổ UV-Vis Mỗi detector thường

có hàng trăm diot phát quang, tạo thành một mảng diot, nên nó cũng có vùng làm việc từ 190 – 1100 nm và có tính không gian ba chiều Vì vậy loại này thu nhận được hình không gian của peak hấp thụ của chất và nhiều peak đồng thời Mỗi peak như một đỉnh núi Loại detector này có độ nhạy và chọn lọc rất cao, tốc độ đo cao hơn và có thể đo được từ 2 đến 42 kênh (mỗi kênh 1 ở riêng), chọn sóng đo hấp thụ cho từng chất là dễ dàng, hạn chế sự chen lấn và trùng sóng hấp thụ Hiện nay nó được dùng khá phổ biến trong các hệ máy HPLC (từ năm 2000) Song muốn dùng

nó có hiệu quả thì phải có máy tính và bộ phần mềm chuyên dụng

Hình 1.19 Detector mảng Diot phát quang của Agilent

(1) – Nguồn sáng; (2) – Bộ lọc chùm sáng nguồn; (3) – Hệ thấu kính; (4) – FowCell HQ; (5) – Thấu kính; (6) – Khe sáng; (7) – Cách từ lõm; (8) – Mảng diot

Mảng diot phát quang hiện có hai loại: 512 và 1024 Byte

1.4.4.1 Diện tích và chiều cao peak

Tín hiệu đo là diện tích của peak hay chiều cao của peak Để tiến hành định lượng chất phân tích, người ta sử dụng các chất chuẩn là chất phân tích có độ tinh khiết cao Tiến hành khảo sát chất chuẩn để tìm điều kiện đo của chất chuẩn, mẫu

giả và cuối cùng mới đo trên mẫu thực tế

Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã lựa chọn thì diện tích

hoặc chiều cao của peak tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích:

S = K.C (S: diện tích của peak); h = K.C (h: chiều cao của peak)

Các phương trình này dùng để định lượng chất phân tích bằng HPLC, thường người ta dùng diện tích của peak để độ chính xác cao hơn

Để tính diện tích peak, ta dùng tích phân kế hoặc dùng máy tính đã cài sẵn chương trình, phương pháp có thể dùng cho cả những peak bị trôi đường nền Để có

độ chính xác cao thì hệ số đối xứng nằm trong khoảng 0.80 1.20 Việc tính toán diện tích peak sẽ gặp khó khăn khi peak có cường độ quá cao, bị doãn, không đối xứng hoặc detector bị nhiễu

Nếu đánh giá dựa vào chiều cao peak (khoảng cách từ đường nền đến đỉnh peak) thì không cần xét đến hệ số đối xứng

1.4.4.2 Định lượng

Trong phân tích sắc ký, thường dùng các phương pháp định lượng:

 Phương pháp ngoại chuẩn (phương pháp đường chuẩn):tiến hành xây

dựng phương trình đường chuẩn (bằng phương pháp hồi quy tuyến tính) biểu diễn

sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích (hoặc chiều cao) peak vào nồng độ các dung dịch chuẩn của chất phân tích Sau đó, từ diện tích (hoặc chiều cao) peak của chất phân tích trong mẫu, xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu từ phương trình đường chuẩn

 Phương pháp thêm chuẩn: phương pháp này thường sử dụng khi có ảnh

hưởng của các chất trong môi trường mẫu (matrix)

- Thêm chuẩn 1 điểm: Tiến hành chạy 2 phép sắc kí

+ Thứ nhất là phép sắc kí với dung dịch phân tích, ghi diện tích peak Sx:

Sx = k.Cx

+ Thứ hai là thêm vào chất phân tích 1 lượng chất phân tích chính xác và ghi lại sắc kí đồ: Sx,T = k.(Cx +CT)

Từ 2 thí nghiệm này ta rút ra được Cx là nồng độ chất phân tích

- Thêm chuẩn đường chuẩn:

+ Chuẩn bị 1 dãy dung dịch phân tích trong các điều kiện hoàn toàn như nhau + Thêm vào dãy dung dịch trên những lượng chất chính xác khác nhau theo bảng 1.6:

Bảng 1.5 Diện tích peak và nồng độ

C Cx Cx + C1 Cx + C2 Cx + C3

+ Xây dựng phương trình đường hồi quy tuyến tính biễu diễn sự phụ thuộc của

S vào nồng độ thêm chuẩn, được phương trình có dạng: S = a + bC Từ đó: Cx = a/b

Hình 1.20 Đường chuẩn của phương pháp thêm chuẩn

 Phương pháp nội chuẩn: trong mẫu, các chất phân tích có thể bị ảnh

hưởng bởi nhiều yếu tố như: nền, các điều kiện khác gây sai số hệ thống Để loại trừ ảnh hưởng này người ta thêm vào mẫu chất nội chuẩn có tính chất gần giống tính chất của chất phân tích, có nồng độ cũng gần bằng nồng độ của chất phân tích (CX),

có thời gian lưu gần thời gian lưu của chất phân tích, đỉnh peak tách khỏi đỉnh peak của chất phân tích ở cùng điều kiện sắc ký Tiến hành 3 phép đo sắc ký:

- Thứ nhất là phép sắc ký của chất chuẩn nội, nhận được Hi tương ứng với Ci

- Thứ hai là phép sắc ký của chất chuẩn có nồng độ CC ứng với HC, từ đó rút ra được hệ số ảnh hưởng FX – là đại lượng đưa vào để loại trừ ảnh hưởng của nền cũng như các điều kiện đo khác

- Phép thứ ba là chất phân tích chưa biết Cx ứng với chiều cao Hx, từ đó tính ra nồng độ của nó

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Mục đích của luận văn là nghiên cứu xác định NanoCurcumin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao dùng detector PDA

Những nội dung nghiên cứu cụ thể như sau:

1) Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố để tìm điều kiện thích hợp cho phép xác định NanoCurcumin bằng phương pháp HPLC dùng detector PDA:

- Khảo sát ảnh hưởng pH của dung dịch đệm

- Khảo sát ảnh hưởng của pha động

- Khảo sát tốc độ dòng

2) Thẩm định phương pháp phân tích

- Khảo sát tính tương thích của hệ thống sắc ký

- Khoảng tuyến tính

- Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Xác định độ lặp lại và độ đúng của phương pháp

3) Xây dựng quy trình và áp dụng quy trình phân tích vào thực tế:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Series 20A của hãng Shimazdu, Nhật Bản:

4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc

ký Symmetry C18 (150mm x 4,6 mm, 5 μm) của hãng GL Sciences Inc, Nhật Bản

- Cân phân tích Sartorius; thiết bị lọc nước siêu sạch của hãng Barnstead International, USA; tủ sấy của hãng Memmert; màng lọc 0,45 μm của hãng Sartorius Stedim, Đức;máy lắc siêu âm, máy đo pH, các dụng cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ chính xác phù hợp

2.2.2 Hóa chất

- Chất chuẩn: Curcumin chuẩn (99%, India)

- Mẫu thử: chế phẩm chứa NanoCurcumin (loại viên nang)

- Metanol, axetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC (Merck)

- Dung môi, hóa chất khác: KH2PO4, H3PO4, nước cất, đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản

Lấy mẫu ngẫu nhiên các mẫu TPCN chứa NanoCurcumin trên thị trường thành phố Huế, bảo quản theo quy định ghi trên nhãn sản phẩm

2.3.2 Xây dựng qui trình phân tích Curcumin

2.3.2.1 Xử lý mẫu phân tích

Quá trình xử lý mẫu được tiến hành theo tài liệu[22],[24],[36],[37]

2.3.2.2 Khảo sát các điều kiện HPLC

Dựa vào tài liệu[22],[24],[36],[37], tôi tiến hành khảo sát mẫu chuẩn trên máy HPLC với cột C18, nhiệt độ phòng, thể tích tiêm 20µL, detector mảng diot phát quang (PDA) ở bước sóng 424 nm

- Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đệm

Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng dung dịch đệm kali đihiđrophotphat

KH2PO450mM Tiến hành khảo sát lựa chọn pH thích hợp

- Khảo sát ảnh hưởng của pha động

Hệ pha động có thể sử dụng là hỗn hợp dung môi phân cực, pha động chính

là cơ sở để khảo sát tốc độ dòng Tiến hành khảo sát lựa chọn tỉ lệ dung môi pha

động cho thời gian lưu vừa phải, peak của chất phân tích cân đối, sắc nét, chất tách hoàn toàn, hệ số đối xứng phù hợp mà áp suất cột không quá cao

- Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng

Dựa trên pha động và tỉ lệ đã được chọn, khảo sát các tốc độ dòng từ 0,5 mL/ph đến 1 mL/ph, nhằm xác định tốc độ dòng tốt nhất cho phép phân tích NanoCurcumin (yêu cầu tương tự như pha động)

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

2.3.3.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống HPLC

Với mục đích kiểm tra hệ thống thiết bị và hóa chất phải đạt chuẩn tinh khiết trước khi sử dụng Tiến hành tiêm lặp lại với dung dịch chuẩn phân tích Curcumin vào hệ thống sắc ký ở điều kiện đã khảo sát

Độ ổn định của hệ thống sắc ký được biểu thị bằng sai số tương đối RSD%, yêu cầu đặt ra là RSD% < 2, thời gian lưu không quá dài

bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác

Tính đặc hiệu của phương pháp sắc ký lỏng thường được tiến hành thông qua hai phép thử sau:

- Thứ nhất, phân tích mẫu trắng: kết quả thu được là không cho tín hiệu phân tích Nếu mẫu trắng xuất hiện tín hiệu thì cần phải thay đổi phương pháp để loại trừ các ảnh hưởng

- Thứ hai, phân tích mẫu trắng thêm chuẩn: kết quả phải cho tín hiệu đối với chất phân tích