Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia virus CIAV) lưu hành tại miền bắc việt nam

LỜI CAM ĐOANDữ liệu trong luận án là một phần của đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà chicken infectious anemia viru

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐÀO ĐOAN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY BỆNH THIẾU

MÁU TRUYỀN NHIỄM

Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS- CIAV)

LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

H C VI N NÔNG NGHI P VI T NAM Ọ Ệ Ệ Ệ

- 

-ĐÀO ĐOAN TRANG

Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS-

CIAV) L U HÀNH T I MI N B C VI T Ư Ạ Ề Ắ Ệ NAM

Chuyên ngành: D ch t h c thú y ị ễ ọ

Ng ườ ướ i h ng d n khoa h c: PGS.TS Huỳnh Th Mỹ ẫ ọ ị

L TS Nguy n Văn Giáp ệ ễ

HÀ NỘI, NĂM 2020

LỜI CAM ĐOAN

Dữ liệu trong luận án là một phần của đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà (chicken infectious anemia virus, CIAV) lưu hành ở miền Bắc Việt Nam”, mã số 04/DAVB, được tài trợ bởi

Dự án Việt- Bỉ, giai đoạn 2014-2019

Tôi xin cam đoan: (1) tất cả các kết quả thu được trong luận án này do bản thân tôi

và nhóm nghiên cứu thực hiện và được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm đềtài và các thành viên tham gia thực hiện; (2) các kết quả được trình bày trong luận án làtrung thực, khách quan và không trùng lặp với bất kỳ một luận án tiến sĩ nào đã công bốtrước đây; (3) mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tintrích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận án

Đào Đoan Trang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rấtnhiều cá nhân, đơn vị và tổ chức

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ và

TS Nguyễn Văn Giáp, những người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình, giúp đỡtôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án Bên cạnh đó, tôi muốn gửi lờicảm ơn đến dự án Việt- Bỉ tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã cấp kinh phí đề tài đểtôi có thể thực hiện được nội dung nghiên cứu của luận án

Đồng thời, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp ViệtNam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyềnnhiễm, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệpViệt Nam, đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình học tập, trang bị cho tôi những kiếnthức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Nhân dịp hoàn thành luận án, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thểLãnh đạo và toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn Vậtnuôi (Viện Chăn nuôi), các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã luôn tạo điều kiện vềthời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập,nghiên cứu và hoàn thành luận án

Nghiên cứu sinh

Đào Đoan Trang

2.2.10 Biện pháp phòng bệnh 19

4.1.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà nhiễm CIAV trong tự nhiên 37

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

nhiễm ở gà

serotype 4

quang gián tiếp

quản truyền nhiễm

Marek’s

ORF Open Reading Frame Khung đọc mở

gia cầm

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

4.17 Trình tự gen ORF1 của CIAV (nucleotide 1-582) 61

TRÍCH YẾU LUẬN ÁNTên tác giả: Đào Đoan Trang

Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền

nhiễm ở gà (Chicken Infectious Anemia Virus - CIAV) lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu

Hai nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) kỹthuật PCR dùng để phát hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm và giải trình tự gen virus (ii)Ứng dụng tin sinh học, với các phần mềm như MEGA, Weblogo, BEAST, PastML v.v

để phân tích đặc điểm sinh học phân tử và dịch tễ học phân tử của CIAV

Kết quả chính và kết luận

Có 2 nhóm kết quả nghiên cứu chính đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm: (1.1)

Đã chứng minh được sự có mặt phổ biến của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở

10 tỉnh miền Bắc Gà ở mọi lứa tuổi, mục đích chăn nuôi, quy mô và phương thức chăn

nuôi đều nhiễm CIAV, với tỷ lệ trung bình là 62,2% (1.2) Đã xác định được có bệnh

thiếu máu truyền nhiễm gà nuôi với các biến đổi bệnh lý đại thể điển hình ở: teo cơ

quan lympho và tủy xương nhạt màu (1.3) Bằng gây bệnh thực nghiệm, đã chứng minh

virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở miền Bắc có độc lực, gây ra các biến đổi bệnh

lý điển hình của bệnh như giảm tỷ khối huyết cầu, teo tuyến ức, teotúi Fabricius và tủy xương nhạt màu

(2) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV ở miền Bắc Việt Nam đã được làm rõ thông qua việc (2.1) xác định được hai nhóm di truyền là genogroup G2 và G3 lưu

hành, với 100% số chủng CIAV không nằm cùng nhánh với các chủng virus vacxin

(2.2) Kết quả phân tích còn cho thấy CIAV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam có nguồn

gốc đa dạng: virus thuộc genogroup G2 có nguồn gốc từ các chủng virus lưu hành ởArgentina và Mỹ Trong khi đó virus thuộc genogroup G3 có nguồn gốc từ chủng viruslưu hành ở Trung Quốc, Đài Loan và Ba Lan Sau khi xâm nhập, các chủng CIAV cókhả năng đã tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và tiếp tục lây lan

THESIS ABSTRACTPhD candidate: Dao, Doan Trang

Thesis title: Molecular epidemiological study of chicken infectious anemia virus

(CIAV) in Northern of Vietnam

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives

This study firstly investigated the prevalence of CIAV in ten northern provinces ofVietnam Based on the identification of CIAV, compatible clinical and gross lesions ofchicken infectious anemia, the molecular epidemiology of CIAV was analyzed underdifferent aspects in order to revealed genetic, phylogenetic characterizations and spatial-temporal distributions of CIAV in northern provinces

Materials and Methods

Two major groups of methods were used, including: (i) PCR based method forviral detection and Sanger’s sequencing (ii) Applied bioinformatics for genetic,phylogenetic and molecular epidemiological Several tools were utilized, such as:BioEdit, MEGA, WebLogo, BEAST, PastML, etc

Main findings and conclusions

Two findings were obtained from this study, as following:

(1.1) The wide prevalence of CIAV in ten northern provinces were proven The

virus was detected in chickens of all ages, scales and production types, with an average

positive rates of 62.2% (1.2) The clinical disease of chicken infectious anemia readily

existed with the typical pathological changes were detected in naturally infected birds,

such as: atrophy of lymphoid tissues, and pale of bone marrow (1.3) Being able to

induce compatible gross lesions of chicken infectious anemia under experimentconditions, the pathogenicity of a CIAV strain circulating in the North was proven

(2) The molecular epidemiological characterisation of CIAV in Northern Vietnam were elucidated through (2.1) the identification of two circulating genogroups of G2 and

G3 All of detected CIAV strains was proven not belonging to vaccine strain and did not

display significant motifs of attenuated viruses (2.2) The analysis also showed that

CIAV circulating in Northern Vietnam has diverse origins: the genogroup G2 virus was

derived from the strains circulating in Argentina Meanwhile, the viruses of genogroupG3 were originated from the strains circulating in China, Taiwan and Poland Uponintroduction, CIAV seemed to diversify locally and started to diffuse spatial-temporallyinto different geographic areas.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chăn nuôi là một bộ phận quan trọng của nền nông nghiệp Việt Nam Bêncạnh nhiều cơ hội và thuận lợi, ngành chăn nuôi gia cầm đã và đang phải đối mặtvới không ít thách thức và khó khăn; trong đó, dịch bệnh được xem là trở ngạilớn, gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi Hiện nay, một trong những bệnh ởgia cầm ít được quan tâm nghiên cứu ở nước ta là tình trạng suy giảm miễn dịch,với vai trò lớn thuộc về các virus tác động trực tiếp tới hệ miễn dịch của vật nuôi.Virus gây ức chế miễn dịch đã và đang đe dọa ngành chăn nuôi gia cầm bởithiệt hại kinh tế trong sản xuất với tỷ lệ tử vong cao do gà dễ bị nhiễm trùng thứcấp (Dohms & Saif, 1984) và có đáp ứng miễn dịch thấp đối với vacxin phòngbệnh (Lutticken, 1997) Trong số đó, CIAV (chicken infectious anemia virus)-nguyên nhân gây bệnh bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectiousanemia- CIA) (Yuasa & cs., 1979) được xem là một trong các bệnh có ảnh hưởnglớn về kinh tế trên phạm vi thế giới (Balamurugan & Kataria, 2006) Bệnh trở lênphổ biến, được thông báo xuất hiện ở hầu hết các nước chăn nuôi gà trên thế giới(Toro & cs., 2006; Bougiouklis & cs., 2007; Oluwayelu, 2010) do virus có khảnăng lây lan, đề kháng mạnh với các yếu tố sát trùng và gây ức chế đơn thuầnhoặc kết hợp với các tác nhân truyền nhiễm khác

Từ khi CIAV được phát hiện đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu vềCIAV và bệnh do virus gây ra trên phạm vi toàn cầu với kết quả thu được từ nhiềukhía cạnh: đặc tính sinh học, cơ chế sinh bệnh, cơ chế gây ức chế miễn dịch củavirus; đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng, bệnh tích của bệnh và biện pháp can thiệp.Đáng chú ý là cơ chế gây ức chế miễn dịch của virus bởi khả năng tấn công vào các

cơ quan miễn dịch, làm cạn kiệt các tế bào lympho của tuyến ức, túi Fabricius và tếbào tạo máu tiền thân (hemocytoblast) ở tủy xương (Adair, 2000; Dhama & cs.,2008) Ngày nay, sinh học phân tử phát triển đã tạo thuận lợi cho các nghiên cứuchuyên sâu về CIAV Cấu trúc bộ gen virus đã được giải mã cùng với các đặc điểm

về di truyền đã giúp cho việc xác định chủng, phân loại virus và sản xuất vacxinphòng bệnh, từ đó góp phần hạn chế thiệt hại do virus gây ra

Đến nay, vacxin phòng CIA đã được sử dụng phổ biến trên thế giới, đặc biệt ở cácnước có ngành chăn nuôi gà phát triển Tuy nhiên, thông tin về CIA cũng như sự hiểubiết về CIAV tại Việt Nam có phần hạn chế Tính đến thời điểm hiện tại, công bố

về sự có mặt của kháng thể kháng CIAV trong huyết thanh gà vào năm 2013 (Trinh

& cs., 2015b) cũng như kết quả phân loại phát sinh gen của các chủng CIAV tạimiền Bắc Việt Nam (Van Dong & cs., 2019) là hai nghiên cứu về CIAV với các mẫubệnh phẩm lấy tại Việt Nam nhưng được thực hiện ở nước ngoài Bên cạnh đó, theothông tư 10/2016/TT-BNNPTNT, hiện có 2 loại vacxin phòng bệnh thiếu máu truyềnnhiễm được phép lưu hành: Nobilis CAV P4 (Intervet) và AviPro Thymovac(Lohmann Animal Health GmbH) tuy nhiên việc sử dụng vacxin cũng như hiểu biếtcủa người chăn nuôi ở Việt Nam về CIAV và CIA rất khiêm tốn Vì vậy, chúng tôinhận thấy rằng nghiên cứu các đặc điểm sinh học phân tử của các chủng CIAV lưuhành ở một số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam rất cần thiết, là cơ sở khoa học củaviệc sử dụng các vacxin hiện có trên thị trường để phòng CIA Kết quả thu được sẽ

là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về CIAV tại Việt Nam, góp phần tiến tớikiểm soát và hạn chế ảnh hưởng của bệnh do CIAV gây ra đối với ngành chăn nuôi

gà của Việt Nam, giai đoạn hiện nay và trong tương lai

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

* Mục tiêu tổng quát: trả lời câu hỏi có hay không có sự lưu hành gây bệnhcủa CIAV ở đàn gà nuôi tại Việt Nam và nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tửcủa virus làm cơ sở để đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả giúp nâng caonăng suất, chất lượng đàn gà

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đã xác định được có sự lưu hànhcủa CIAV ở đàn gà trên địa bàn của 10 tỉnh/thành phố ở miền Bắc Việt Nam: HòaBình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định,Hải Phòng và Quảng Ninh;

- Kết quả nghiên cứu đã giải mã được 3 trình tự gen hoàn chỉnh và 52 trình

tự gen ORF1 của các chủng CIAV lưu hành tại thực địa; cho thấy virus thuộc 2nhóm di truyền G2 và G3; có độc lực và không cùng nguồn gốc với các chủngvacxin đang được sử dụng

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu đã khẳng định sự lưu hành của CIAV cũng như sự có mặt củaCIA trong các đàn gà nuôi ở một số tỉnh phía Bắc của Việt Nam Biểu hiện lâmsàng, biến đổi bệnh lý của gà trong tự nhiên được khẳng định bởi kết quả PCRđối với các mẫu bệnh phẩm và kết quả gây bệnh thực nghiệm bởi chính cácchủng CIAV lưu hành đã nhấn mạnh sự cần thiết phải xem xét đến vai trò và ảnhhưởng của CIAV và CIA đối với ngành chăn nuôi gà hiện nay

các chủng CIAV đã và đang lưu hành ở đàn gà nuôi tại 10 tỉnh/thành phố thuộc miềnBắc Việt Nam: các chủng thuộc về 2 nhóm di truyền G2, G3; là các chủng có độclực và không cùng nhánh với các chủng virus vacxin Từ thực tế trên, việc sử dụngvacxin trở nên cần thiết để bảo vệ các đàn gà đối với bệnh do CIAV gây ra

- Kết quả là nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu về bệnh(CIA) và virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm (CIAV); cũng như cho công tácgiảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi- Thú y tại Việt Nam

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

2.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại virus gây bệnh

Virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemiavirus- CIAV) lần đầu tiên được phát hiện từ đàn gà thương phẩm bị bệnh ở NhậtBản (Yuasa & cs., 1979) với tên ban đầu là CAA (chicken anemia agent- yếu tốgây thiếu máu ở gà) Tên gọi CAA bắt nguồn từ đặc điểm tác nhân gây bệnhkhông nhân lên trên một số môi trường nuôi cấy tế bào (Yuasa, 1983) Về sau,CAA được chứng minh là một virus khi phát hiện ra tác nhân này nhân lên trênmột số dòng tế bào lymphoblastoid của gà (Yuasa & cs., 1983) Sau khi đượcchứng minh là virus, tên gọi CAV hoặc CIAV được dùng thay cho CAA(Mcnulty, 1991; Noteborn & cs., 1991; Meehan & cs., 1992)

Về phân loại, trước đây, CIAV được xếp vào giống Gyrovirus và họ

Circoviridae (Meehan & cs., 1992; Pringle, 1999) Năm 2017, trên cơ sở phân

tích lại một cách có hệ thống các bằng chứng về sự khác biệt rõ rệt của CIAV với

virus thuộc họ Circoviridae, ủy ban quốc tế về phân loại virus (ICTV), đã chuyển CIAV và giống Gyrovirus vào họ Anelloviridae (Rosario & cs., 2017).

Hình 2.1 Cây phát sinh chủng loại của giống Gyrovirus

Nguồn: Truchado & cs (2019)

Trước năm 2011, CIAV là thành viên duy nhất của giống Gyrovirus được

biết đến Hiện tại, đã xác định được 12 virus, bao gồm GyV2 -GyV10, HGyV1

(Human Gyrovirus), ASPaGyV (Ashy storm petrel Gyrovirus) và GyV11

(Truchado & cs., 2019) Mối liên hệ giữa các thành viên được trình bày ở hình2.1 Dựa vào đặc điểm phân nhánh, CIAV (đóng khung, hình 2.1) là một nhánh

độc lập trong giống Gyrovirus, có quan hệ gần gũi với GyV6 và GyV7.

2.1.2 Hình thái, cấu trúc CIAV

CIAV là một virus không có vỏ bọc, đường kính trung bình từ 19,1 26,5 nm (Gelderblom & cs., 1989) Cấu trúc bề mặt capsid có 60 tiểu đơn vị đượcsắp xếp theo 12 vòng hình loa kèn (King & cs., 2011)

nm-Hình 2.2 Hạt virus dưới kính hiển vi điện tử

Nguồn: Todd & cs (1990)

Dưới kính hiển vi điện tử, hình ảnh nhuộm âm bản CIAV tinh khiết chothấy hạt virus có dạng hình cầu, với khoảng 10 gai nhô lên rõ ràng trên bề mặt(Todd & cs., 1990) Về vật chất di truyền, bộ gen CIAV là sợi ADN đơn, dạngvòng, dài khoảng 2,3 kb Bộ gen CIAV có 3 khung đọc mở (ORF) lồng một phầnvào nhau, theo thứ tự ORF2- ORF3- ORF1 Trong đó ORF2, ORF3 và ORF1 mãhóa lần lượt cho 3 protein là: VP2 (24 kDa), VP3 (14 kDa) và VP1 (52 kDa)(Noteborn & cs., 1991; Schat & Van Santen, 2008)

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen CIAV

Nguồn: Rosario & cs (2017)

Hình 2.3 so sánh cấu trúc gen giữa thành viên của họ Circoviridae và

Anelloviridae Virus thuộc họ Anelloviridae có đặc điểm (i) gen mã hóa protein

lồng nhau và cùng chiều, (ii) không có cấu trúc stem-loop với 9 nucleotide đặc

trưng Hai đặc điểm cơ bản trên thấy ở các thành viên của họ Circoviridae Trong

số 3 protein virus, VP1 là protein cấu trúc duy nhất được biết đến có vai trò tạothành capsid, có thể được phát hiện trong các hạt virus có độ tinh khiết cao (Todd

& cs., 1990) Nó đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra kháng thể trung hòa ở

gà bị nhiễm bệnh VP2 là protein không cấu trúc, có thể hoạt động như mộtprotein làm khung (scaffold) trong quá trình lắp ráp virion (Noteborn & cs.,1998) VP2 còn có hoạt tính của phosphatase (dual-specificity phosphatase) nhậnbiết đặc hiệu đồng thời phân tử tyrosine, serine hoặc threonine ở vị trí cắt (Peters

& cs., 2002) VP3 là protein không cấu trúc hay là 1 apoptin gây ra cơ chế chếtchương trình hóa (apoptosis) cho các tế bào tiền thân ở vùng tủy của tuyến ức vàcác tế bào hemocytoblasts trong tủy xương (Noteborn & cs., 1994)

2.1.3 Sức đề kháng của CIAV

CIAV mang các đặc điểm đề kháng cao với nhiệt độ, chloroform của một virus không có vỏ bọc (Yuasa, 1992) Nhìn chung, virus có sức đề kháng cao

trong điều kiện tự nhiên CIAV chịu được nhiệt độ 56oC hoặc 70oC trong 1 giờ và

80oC trong 15 phút (Natesan & cs., 2006) Virus bị bất hoạt một phần sau khi đun

ở 80oC trong 30 phút và bất hoạt hoàn toàn sau 15 phút ở 100oC Vì vậy, sảnphẩm gà bệnh yêu cầu xử lý ở 95oC trong vòng 30 phút hoặc ở 100o trong 10phút (Urlings & cs., 1993) Đối với các hóa chất dùng sát trùng chuồng trại,CIAV trong huyễn dịch bệnh phẩm bị bất hoạt hoàn toàn bởi iodine hoặc sodiumhypochlorite ở nồng độ 10% ở 37oC trong vòng 2 giờ (Yuasa, 1992)

2.1.4 Tính kháng nguyên và sự biến đổi chủng của CIAV

Sử dụng kháng thể đa dòng, các nhà khoa học trên thế giới không pháthiện sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên giữa các chủng CIAV phân lập được

ở Nhật Bản, châu Âu và châu Mỹ (Yuasa & Imai, 1986; Mcnulty & cs., 1990).Với kháng thể đơn dòng, sự khác biệt nhỏ về đặc tính kháng nguyên giữa cácchủng CIAV đã được tìm thấy (Trinh & cs., 2015a) Trên capsid protein củaCIAV tồn tại vùng “siêu biến đổi” từ amino acid 139 đến 151 (Renshaw & cs.,1996), nhưng mới chỉ có bằng chứng về sự thay đổi amino acid của vùng này đến

đặc tính nhân lên của CIAV in vitro (Renshaw & cs., 1996).

Dựa vào phản ứng huyết thanh học, nhìn chung các chủng CIAV đượcxem thuộc về một type huyết thanh đơn (Schat & Van Santen, 2008) Năm 2002,một nhóm nhà khoa học ở Mỹ công bố phát hiện CIAV-7 phân lập từ gà 17 tuầntuổi có bệnh tích của bệnh thiếu máu truyền nhiễm (Spackman & cs., 2002a).Trong điều kiện thí nghiệm, CIAV-7 gây ra tình trạng bệnh giống bệnh thiếu máutruyền nhiễm, nhưng CIAV-7 lại có đặc tính kháng nguyên khác với chủng CIAVtham chiếu (không bị trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu kháng CIAV chủng Del-Ros) (Spackman & cs., 2002b) Do đó, chủng CIAV-7 được giả định là một typehuyết thanh học thứ 2 của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm (Spackman &cs., 2002b) Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có thêm nghiên cứu về CIAV-7được công bố

2.2 BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

2.2.1 Giới thiệu chung

Bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (CIA) được đặc trưng bởi tình trạngthiếu máu không tái tạo (aplastic anemia) do sự phá hủy các tế bào tạo máu(hematopoietic stem cell) ở tủy xương và thoái hóa các mô lympho (lymphoiddepletion) (Mcnulty, 1991) Bên cạnh đó, do tình trạng ức chế miễn dịch(immunosuppression), gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm dễ mắc các bệnh kế

phát, giảm đáp ứng với các loại vacxin phòng bệnh (Hagood & cs., 2000) Sựxuất hiện của CIA là được đánh giá là một trong những mối đe dọa nghiêm trọngcho ngành chăn nuôi gà ở các nước trên thế giới (Mcnulty, 1991; Balamurugan &Kataria, 2006).

2.2.2 Địa dư bệnh

Lịch sử phát hiện CIA gắn với sự phát hiện CIAV (chủng Gifu-1) lần đầutiên năm 1979 ở Nhật Bản (Yuasa, 1983) Tiếp sau đó, CIAV đã được phân lập ởnhiều nước: chủng ConnB được phân lập từ gà bị bệnh Marek’s (Goryo & cs.,1987b); chủng CIA-1 được phân lập năm 1988 tại một trang trại ở Delaware(Mỹ) (Lucio & cs., 1990); chủng Cux-1 (C) được phân lập ở Cuxhaven (Đức)vào năm 1991 (Chandratilleke & cs., 1991); chủng L-028 được phân lập vào năm

1992 tại một trang trại ở New York (Mỹ) (Renshaw & cs., 1996), v.v Bằng phảnứng huyết thanh học, CIAV được xác định có mặt ở khắp các nước, ví dụ như ởNhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, Úc, NewZealand và Nam Phi, v.v Nghiên cứu hồicứu các mẫu huyết thanh thu thập từ 1959- 2005 cho biết nhiều khả năng virus đãhiện diện từ trước những năm 1970 (Toro & cs., 2006)

Ghi chú: dựa vào thông tin được công bố qua các bài báo khoa học, trình tự gen được công bố trên

GenBank, đã xác định được các quốc gia có sự hiện diện của CIAV (đánh dấu)

Hình 2.4 Bản đồ phân bố của CIAV ở các nước trên thế giới

Cho đến nay CIAV và bệnh thiếu máu truyền nhiễm đã có mặt ở nhiều nướcthuộc tất cả các châu lục (hình 2.4) Ở khu vực Đông Nam Á, CIAV đã được xácđịnh ở Thái Lan, Campuchia, Lào, Malaysia, Indonesia và Việt Nam (Hailemariam

& cs., 2008; Kye & cs., 2013; Wanasawaeng & cs., 2013; Trinh & cs., 2015b)

2.2.3 Thiệt hại do bệnh thiếu máu truyền nhiễm gây ra

Nghiên cứu tại Israel (Davidson & cs., 2004) khi quan sát 6 đàn gà thịt chothấy nhiễm CIAV làm giảm sức sản xuất, ví dụ như tăng trưởng kém hơn, tỷ lệ tửvong cao hoặc tăng cường các triệu chứng của các bệnh trong trường hợp nhiễmghép Cụ thể, nghiên cứu đã chỉ ra dấu hiệu giảm tổng tăng trưởng ở mức 35.000

kg của một đàn so với hai đàn khác cùng với dấu hiệu của bệnh thiếu máu truyềnnhiễm (viêm da, xuất huyết cơ, tủy xương nhạt màu, tỷ lệ tử vong cao) Bên cạnh

đó, tỷ lệ tử vong tăng cao ở các đàn nhiễm CIAV (gấp 4 lần so với đàn bìnhthường) Tuy nhiên, hậu quả cuối cùng và phổ biến là sự cộng gộp ảnh hưởng từnhiều yếu tố: quản lý yếu kém, các stress trong đàn, yếu tố di truyền của giống vàcác mầm bệnh ghép

Đối với gà thịt, nhiễm IBDV làm chậm sự phục hồi tuyến ức sau khi CIAVgây teo tuyến ức ở gia cầm (Hoerr, 2010); nhiễm CIAV làm tăng cường khả nănggây bệnh của MDV (Jeurissen & De Boer, 1993) hoặc CIAV có liên quan đếnnhiễm trùng tụ cầu khuẩn và viêm da hoại tử Khi gà bị nhiễm nhiều loại mầmbênh, ví dụ như CIAV với MDV, REV hoặc IBDV, v.v… sẽ làm cho tỷ lệ ốm và

tỷ lệ chết tăng cao Bệnh thường xảy ra với đàn gà từ 2 - 4 tuần tuổi khiến cho gàchậm phát triển, tỷ lệ chết dao động từ 10 - 20%, có trường hợp lên đến 60% Với

gà trên 6 tuần tuổi, bệnh thường liên quan đến hội chứng thiếu máu - xuất huyết

(aplastic anemia - hemorrhagic syndrome).

Bệnh thiếu máu truyền nhiễm gây thiệt hại kinh tế, giảm lợi nhuận khoảng18,5% do giảm tăng trọng, tăng tỷ lệ chết của gà từ 3- 15 tuần tuổi (Mcilroy &cs., 1992) Tuy nhiên, đối với ngành sản xuất trứng gà sạch, bệnh thường gây ranhững khó khăn và ảnh hưởng lớn nhất bởi Ủy ban châu Âu yêu cầu trứng dùng

để sản xuất vacxin dùng cho gà dưới 7 ngày tuổi không được tạp CIAV Ngoài ra,tại Úc, châu Âu và Mỹ, chỉ những trứng sạch CIAV mới được dùng để sản xuấtvacxin phòng bệnh quai bị và sởi cho người Bên cạnh đó, chi phí bỏ ra để đảmbảo và duy trì các biện pháp an toàn sinh học là không nhỏ bởi virus có sức đềkháng mạnh với các hóa chất sát trùng (Toro & cs., 2006) Đứng ở khía cạnh này,CIAV gián tiếp gây ra các thiệt hại về kinh tế do phải áp dụng các biện pháp antoàn sinh học nghiêm ngặt trong quá trình nuôi

2.2.4 Loài vật mắc bệnh

Gà là vật chủ chính của CIAV mặc dù gà tây và chim cút ở Nhật Bản cóthể nhiễm CIAV (Schat & Van Santen, 2008) CIAV không chỉ được phát hiện ở

các đàn gà thịt mà ở cả các đàn gà SPF (Cardona & cs., 2000) Gà trống và máiđều mẫn cảm; gà giống thịt được cho rằng mẫn cảm hơn với bệnh Gà ở các lứatuổi đều cảm nhiễm với CIAV nhưng giai đoạn sau 2 tuần tuổi sự mẫn cảm vớibệnh giảm nhanh do sự hoàn thiện của hệ miễn dịch (immuno competency) (Hu

& cs., 1993b), trong đó gà 1 ngày tuổi mẫn cảm nhất (Rosenberger & Cloud,1989) Từ 2012 trở lại đây, bằng phương pháp PCR, tại Trung Quốc đã phát hiệnđược CIAV từ phân của người (Zhang & cs., 2012), chuột, chó hoang (Fang &cs., 2017) và mèo (Niu & cs., 2019) Mặc dù vậy, các loài này chưa được chứngminh là vật chủ của CIAV (Fang & cs., 2017)

2.2.5 Phương thức truyền lây

Có 2 phương thức làm lây truyền CIAV, truyền dọc và truyền ngang.Phương thức lây truyền ngang hay dọc đều dẫn đến sự lây lan của CIAV trongcác đàn gà (Yuasa, 1983; Mcnulty, 1991) Một lượng lớn CIAV được bài thải quaphân từ các gà nhiễm bệnh (Imai & cs., 1999) Vì vậy, phân gà được xem là mộtnguồn lây nhiễm quan trọng Theo nghiên cứu trên, lây truyền ngang thông quatiếp xúc trực tiếp/ gián tiếp với virus qua đường miệng Cách lây nhiễm này chủyếu xảy ra ở gà không có kháng thể mẹ truyền trong giai đoạn từ 2- 4 tuần tuổi.Chuyển dương tính huyết thanh học xảy ra ở giai đoạn 8- 12 tuần tuổi và sự lâynhiễm ngang gây bệnh phần lớn ở thể cận lâm sàng (Mcnulty & cs., 1988)

CIAV có thể lây lan theo đường truyền dọc và truyền ngang nhưngphương thức truyền dọc là quan trọng nhất, virus được truyền từ bố mẹ qua trứng(Dhama & cs., 2002) Sự lây nhiễm qua trứng đã được Yuasa và cộng sự khẳngđịnh (Yuasa & Yoshida, 1983) và từ đó việc ngăn chặn bệnh xảy ra trong môitrường chăn nuôi gà trở nên khó khăn CIAV từ các đàn gà giống âm tính khikiểm tra kháng thể do có sự lây nhiễm ngang hoặc qua tinh dịch con trống có thểlây nhiễm bệnh cho đời con (Yuasa & cs., 1987; Hoop, 1993) Trong tự nhiên, sựlây truyền dọc thường xuất hiện ở giai đoạn 3- 9 tuần tuổi sau khi gà tiếp xúc vớiCIAV, thậm chí xảy ra sớm hơn ở giai đoạn gà từ 1- 3 tuần tuổi và đáp ứng miễndịch phát triển ở các gà giống lây nhiễm có thể bảo vệ đàn con khỏi sự lây nhiễmdọc (Schat & Van Santen, 2008) Ngoài ra, các yếu tố gây stress trong quá trìnhsản xuất và vận chuyển có thể làm tăng sự lây nhiễm CIAV hoặc kéo dài thờigian nhiễm CIAV bởi sự thay đổi nội tiết tố dẫn đến sự lây truyền dọc và chuyểndương tính huyết thanh học khi gà ở giai đoạn gần thành thục về tính biệt(Cardona & cs., 2000)

2.2.6 Cơ chế sinh bệnh

CIAV tấn công và phá hủy các tế bào tạo máu tiền thân (hemocytoblast),làm cạn kiệt các tế bào tiền lympho ở tuyến ức với biểu hiện teo tuyến ức, từ đóxuất huyết ở các mô dưới da, trong cơ và gây suy giảm miễn dịch (Adair, 2000;Todd, 2000; Dhama & cs., 2002; Miller & Schat, 2004; Van Santen & cs., 2004).Đích tấn công chủ yếu của CIAV vào tế bào lympho tiền thân của tuyến ức(CD4+/CD8+, T-cells) và tiền tế bào máu, sau đó chúng tái tạo chủ yếu trong cáctiền tế bào máu ở tủy xương và tế bào tuyến ức tiền thân ở vùng vỏ của tuyến ức,nơi diễn ra sự nhiễm trùng gây teo và gây chết tế bào bởi cơ chế apoptosis (cơchế chết tự nhiên) (Jeurissen & cs., 1992; Smyth & cs., 1993; Noteborn & Koch,1995) Sự tạo máu, tạo tủy và sản xuất tế bào lympho bị ảnh hưởng nghiêm trọngdẫn đến biểu hiện lâm sàng của sự thiếu máu do giảm hồng cầu, tiểu cầu và bạchcầu; ngoài ra, các tế bào lympho nhiễm virus còn bị phá hủy bởi cơ chếapoptosis, kích hoạt bởi protein VP3 (Dhama, 2002)

Cho đến nay, các nghiên cứu về khả năng gây bệnh của CIAV cho thấykhả năng gây thiếu máu của CIAV phụ thuộc trực tiếp vào liều virus nhiễm, tuổigia cầm nhiễm và sự kế phát của các yếu tố gây bệnh khác (Yuasa & cs., 1988;Dhama, 2002) Ngoài ra, các tác nhân gây ức chế miễn dịch có tác dụng hiệpđồng với CIAV làm bệnh tiến triển ở thể nặng Bằng thực nghiệm, người ta đãchứng minh rằng IBDV ức chế và làm giảm cường độ sự sản sinh kháng thểtrung hòa chống lại CIAV, dẫn tới lượng CIAV huyết cao, trong khoảng 102,5 đến

105,5 TCID50/0,1 ml (Imai & cs., 1999) Nhiễm ghép IBDV còn kéo dài độ tuổimẫn cảm của gà đối với CIAV (Rosenberger & Cloud, 1989)

2.2.7 Triệu chứng bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Triệu chứng lâm sàng của bệnh thiếu máu truyền nhiễm phụ thuộc vàonhiều yếu tố như: lứa tuổi, tình trạng miễn dịch; liều lượng và đường xâm nhậpcủa virus Hình 2.5 trình bày tóm tắt mối tương quan giữa biểu hiện bệnh, lứatuổi và tình trạng miễn dịch Gà ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với CIAV (virus gây

ra tình trạng nhiễm trùng) (Kaffashi & cs., 2006), tuy nhiên, gà càng lớn khảnăng mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm càng giảm (age resistance) (Mcnulty,1991) Gà trên 3 tuần tuổi sau khi nhiễm CIAV thường sản sinh đáp ứng miễndịch có khả năng bảo hộ, ngăn cản tiến triển thành thể bệnh lâm sàng Mặc dùvậy, đặc tính đề kháng theo lứa tuổi có thể bị phá vỡ nếu trong giai đoạn này gà

bị nhiễm các virus gây ức chế miễn dịch (ví dụ như IBDV) làm cho khả năng sảnsinh đáp ứng miễn dịch chống lại CIAV bị giảm sút, dẫn tới tiến triển bệnh ở thểlâm sàng (vùng E, hình 2.5) (Mcnulty, 1991; Hu & cs., 1993a) Gà dưới 3 tuầntuổi nhiễm CIAV thường mắc bệnh rất điển hình (Yuasa & cs., 1979; Goodwin

& cs., 1989; Buscaglia & cs., 1994) Trường hợp có kháng thể thụ động ởngưỡng bảo hộ, hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 40 (vùng A, hình 2.5), gà con dù ởlứa tuổi mẫn cảm vẫn không mắc bệnh ở thể lâm sàng (Otaki & cs., 1992)

Hình 2.5 Tương quan giữa biểu hiện bệnh, lứa tuổi và tình trạng miễn dịch

trong bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Biểu hiện bệnh thiếu máu truyền nhiễm được trình bày ở phần dưới đây.Khi bệnh xảy ra ở thể cấp tính, thời gian ủ bệnh từ 1- 14 ngày Ngoài các triệuchứng không điển hình (ủ rũ, xù lông, giảm ăn), gà bệnh có biểu hiện thiếu máu

như mào yếm nhợt nhạt (Yuasa & cs., 1979; Adair, 2000) Tỷ lệ chết thường từ 10% (trong 2- 4 tuần sau khi nhiễm) nhưng có thể lên tới 60% trong trường hợp

5-kế phát bệnh khác (Bulow, 1991; Dhama, 2002; Dhama & cs., 2002; Dhama

& cs., 2004; Balamurugan & Kataria, 2006) Nếu sống sót qua giai đoạn này, các

gà sẽ dần hồi phục sau 4- 5 tuần nhiễm bệnh Thông thường, các triệu chứng sẽbiểu hiện nặng nề khi có sự kế phát các mầm bệnh khác, đặc biệt là virus gây suygiảm miễn dịch (Adair, 2000) Điển hình là các trường hợp nhiễm kế phát vớiMDV (Miles & cs., 1999), với IBDV (Imai & cs., 1999), FAV (Toro & cs., 2001),reovirus (Mcneilly & cs., 1995) và NDV (De Boer & cs., 1994)

Hình 2.6 Triệu chứng của gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Nguồn: Gowthaman (2019)

Chỉ tiêu phi lâm sàng của tình trạng thiếu máu là tỷ khối huyết cầu giảm,dao động từ 6 - 27% (Balamurugan & Kataria, 2006) Ở gà khỏe mạnh, tỷ khốihuyết cầu thường lớn hơn 27% mặc dù chỉ số này cũng thay đổi tùy theo từnggiống gà Ví dụ gà giống trứng có chỉ số PCV thấp hơn gà giống thịt; gà càng lớnthì chỉ số này càng giảm Khi gà bị bệnh thiếu máu truyền nhiễm, máu gà có thể

bị đặc hoặc loãng hơn, thời gian đông máu tăng, tương bào nhạt hơn bình thường.Chỉ số hematocrit xuống dưới 27% sau khi gây nhiễm 8 - 10 ngày, dao động từ

10 - 20% ở ngày 14 - 20 và thậm chí có thể xuống dưới 6% ở những gà gần chết

Ở những gà hồi phục, sau 6 - 21 ngày chỉ số PCV bắt đầu tăng trở lại, về mứcbình thường (29 - 35%) sau khi nhiễm 28 - 35 ngày (Dhama & cs., 2008) (hình2.7)

Hình 2.7 Biến động tỷ khối huyết cầu ở gà mắc bệnh

Nguồn: Wani & cs (2014)

Bằng gây bệnh thực nghiệm, tỷ khối huyết cầu của nhóm gây nhiễm(đường nét đứt, hình 2.7) giảm so với nhóm đối chứng Sự giảm này rõ nhất saugây nhiễm 14 ngày với tỷ khối huyết cầu trung bình ở nhóm gây nhiễm là 18,22

± 2,22 trong khi đó của nhóm đối chứng là 34,12 ± 4,72 (Wani & cs., 2014).Nguyên nhân dẫn đến chỉ số hematocrit giảm là do hiện tượng giảm tế bào máu,bao gồm giảm số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu - hậu quả khi các tiền tếbào máu bị dung giải rất sớm (3 - 4 ngày sau khi gây nhiễm) Khi gà qua khỏi,công thức máu sẽ trở lại bình thường sau 40 ngày

2.2.8 Bệnh tích bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Teo cơ quan lympho nói chung, đặc biệt là tuyến ức và biểu hiện tủy xươngnhạt màu (hình 2.8) được xem là bệnh tích đại thể đặc trưng nhất (Yuasa & cs.,1979; Mcnulty, 1991; Pope, 1991; Smyth & cs., 1993; Dhama & cs., 2002).Ngoài ra, có một số biến đổi khác như: xuất huyết, tụ máu ở tổ chức liên kết dướida; gan sưng, nhạt màu hoặc vàng nhạt (Yuasa & cs., 1979; Dhama, 2002)

Hình 2.8 Bệnh tích đại thể ở gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Nguồn: Yuasa & cs (1979)

Có một vấn đề cần chú ý là: khi gà nhiễm CIAV gây ra tình trạng suy giảmmiễn dịch nghiêm trọng và gà dễ mẫn cảm với các mầm bệnh là virus như MDV(Miles & cs., 1999); IBDV (Imai & cs., 1999); FadV4 (Toro & cs., 2001);reovirus (Mcneilly & cs., 1995) và NDV (De Boer & cs., 1994) dẫn tới nhữngảnh hưởng hiệp đồng của các yếu tố (Pope, 1991) Chính vì vậy, bệnh tích ở gàmắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm khi bị nhiễm ghép có sự thay đổi, khác vớitrường hợp nhiễm đơn

2.2.9 Chẩn đoán bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà

2.2.9.1 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán lâm sàng CIA có thể dựa vào lịch sử đàn giống, tình trạng hoặcdấu hiệu lâm sàng, kết luận về huyết học và bệnh lý mổ khám (Goodwin & cs.,1992a) Chẩn đoán lâm sàng dựa vào các dấu hiệu điển hình ở gà bệnh trong giaiđoạn mẫn cảm và các bệnh tích phản ánh hiện tượng thiếu máu, ví dụ như: mào,tích nhợt nhạt, gan sưng và nhạt màu, thận nhạt màu, tủy xương nhạt màu và môlympho tập trung bị teo (túi Fabricius, tuyến ức)

2.2.9.2 Chẩn đoán phi lâm sàng

- Phương pháp phân lập virus:

CIAV có khả năng nhân lên và được phân lập ở gà SPF mẫn cảm, trongphôi gà và trong nuôi cấy tế bào (Yuasa & cs., 1979; Mcnulty, 1991; Dhama &cs., 2002; Balamurugan & Kataria, 2006); trong khi đó thời điểm 12 - 16 ngàysau khi gây nhiễm CIAV cho gà lớn thấy có biểu hiện bệnh tích Trong phôi gà,CIAV nhân lên ở túi lòng đỏ nhưng hiệu giá virus không đủ cao để gây chết phôihoặc gây ra các tổn thương điển hình của bệnh Tuy nhiên, gà con mới nở mangcác dấu hiệu của bệnh CIAV không nhân lên được trong các môi trường nuôi cấy

tế bào thông thường nhưng phát triển được trong một số dòng tế bào lympho hìnhthành trong bệnh Marek’s (Marek’s disease virus- MDV) và bệnh gây khối ulympho (Yuasa, 1983; Renshaw & cs., 1996) Cho đến nay, dòng tế bào được sửdụng phổ biến cho việc phân lập CIAV là dòng tế bào MDCC-MSB1 lấy từ khối

u lympho ở lách của gà bị bệnh Marek’s Các chủng virus có thể gây nhiễm khácnhau cho các dòng tế bào phụ như MDCC-CU147, khi đó dòng tế bào T (lấy từtổn thương cục bộ của MD) được báo cáo nhạy cảm nhất để phân lập virus, cóthể sản xuất ra một lượng virus gấp từ 10- 100 lần so với dòng MSB1

- Kỹ thuật PCR:

PCR được ứng dụng từ rất sớm để phát hiện CIAV, mồi đặc hiệu được thiết

kế phát hiện trình tự gen bảo thủ mã hóa protein VP2 (Noteborn & cs., 1992b) Ởnhững vùng đã sử dụng vacxin nhược độc phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm,việc sử dụng cặp mồi kể trên không cho phép phân biệt giữa chủng virus vacxin

và chủng virus gây bệnh Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng cặp mồi nhân lên toàn

bộ gen mã hóa protein VP1 của virus, sau đó cắt bằng enzyme cắt giới hạn (VanSanten & cs., 2001; Natesan & cs., 2006; Mohamed, 2010; Nayabian & Mardani,2013) Ví dụ cụ thể trình bày ở hình 2.9

Tác giả Mohamed đã dùng cặp mồi đặc hiệu nhân lên toàn bộ gen mã hóaprotein VP1 (VP1-1: 5’-ATGGCAAGACGAACTCGCAGACCGAGAGGC-3’,VP1-R: 5’-TCAGGGCTGCGTCCCCCAGTACATGGTGCT-3’) Tinh sạch sản

phẩm PCR và cắt bởi enzyme MboI (Mohamed, 2010) Hình 2.9 cho thấy, sản

phẩm cắt là khác nhau giữa các chủng thực địa (3- 5 sản phẩm cắt) với chủngvirus vacxin (6 sản phẩm) Đáng chú ý, các đoạn sản phẩm cắt cũng khác nhaugiữa các chủng thực địa và cho phép phân biệt các chủng CIAV giữa các mẫu xétnghiệm Hiện có nhiều loại enzyme được dùng trong phản ứng RFLP-PCR để

phân biệt các chủng, ví dụ như: BamHI, BgM, SstI và XbaI (Noteborn & cs., 1992b), HinfI (Nayabian & Mardani, 2013) Để tăng khả năng phân biệt, có thể

kết hợp một số enzym cắt giới hạn để phân biệt các chủng CIAV, ví dụ như:

HhaI, DdeI và HaeIII (Natesan & cs., 2006).

Ghi chú: giếng 1: chủng virus Cux-1 từ vacxin Thymovac; giếng 2-5: các chủng CIAV thực địa

Hình 2.9 Kết quả RFLP-PCR phân biệt các chủng CIAV

Nguồn: Mohamed (2010)

Ý nghĩa của RFLP-PCR không chỉ dừng lại ở khả năng phân biệt giữa cácchủng, mà còn có thể cho phép phát hiện đồng nhiễm nhiều chủng CIAV khácnhau ở cùng một trang trại Ở cấp độ cá thể, việc phát hiện đồng nhiễm CIAV cầnphải sử dụng đến công cụ giải trình tự gen (hình 2.10)

Ghi chú: mũi tên biểu thị các vị trí có 2 đỉnh tín hiệu (đa hình nucleotide)

Hình 2.10 Kết quả giải trình tự gen phát hiện đồng nhiễm các chủng CIAV

Nguồn: Ducatez & cs (2006)

Việc phát hiện ra các đỉnh tín hiệu kép (mũi tên, hình 2.10) ở một vài vị trínucleotide là minh chứng cho sự tồn tại các chủng CIAV mang các đột biến khácnhau (đồng nhiễm) Hiện tượng đồng nhiễm CIAV thuộc hai cụm di truyền khácnhau đã được phát hiện ở mẫu bệnh phẩm gà bệnh tại Trung Phi và Cameroon(Snoeck & cs., 2012)

Nói tóm lại, PCR được xem là kỹ thuật có độ nhạy và độ chính xác cao,phù hợp cho sự phát hiện ADN của CIAV trong các mẫu bệnh phẩm (Miller &cs., 2003) PCR với độ nhạy và chính xác cao giúp phát hiện CIAV ngay cả trongcác ca bệnh biểu hiện ở thể cận lâm sàng (Balamurugan & Kataria, 2006;Simionatto & cs., 2006) Sử dụng kỹ thuật PCR cạnh tranh; hoặc realtime PCR

có thể định lượng virus (Dhama & cs., 2002; Markowski-Grimsrud & cs., 2002;Caterina & cs., 2004; Van Santen & cs., 2004) Ngày nay, giải trình tự gen là mộtcông cụ cho chẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ học phân tử của CIAV (Todd & cs.,1990; Dhama & cs., 2002; Dhama & cs., 2004; Natesan & cs., 2006; Simionatto

& cs., 2006)

- Phương pháp phát hiện gián tiếp

Đối với việc phát hiện huyết thanh: ELISA, VNT và IFA là những kỹ thuậtđược sử dụng phổ biến nhất (Dhama & cs., 2002; Tannock & cs., 2003) bởikháng thể kháng CIAV là dấu hiệu tồn tại trước đó của CIAV, trong đó phản ứngmiễn dịch huỳnh quang gián tiếp và các test ELISA có thể được áp dụng để pháthiện kháng thể kháng CIAV (Rosenberger & Cloud, 1989) Hiện nay, các kitELISA được sử dụng phổ biến để sàng lọc các đàn giống nghi nhiễm virus trướckhi vào giai đoạn đẻ trứng (Miller & Schat, 2004) Kỹ thuật ngưng kết gián tiếpbằng hạt nhựa (blocking latex agglutination test) cũng đã được phát triển và chokết quả tương đồng 93,6% so với phản ứng trung hòa (Trinh & cs., 2015b)

2.2.9.3 Chẩn đoán phân biệt

Cần tiến hành các chẩn đoán phân biệt với các bệnh Marek’s, Gumboro,bệnh do FAdV4 gây ra, bệnh do các độc tố nấm mốc (mycotoxin), v.v (Dhama,2002) Do đặc điểm giống nhau về lứa tuổi và bệnh tích ở cơ quan có thẩm quyềnmiễn dịch, cần chẩn đoán phân biệt giữa bệnh Gumboro và bệnh thiếu máutruyền nhiễm Cụ thể: gà dưới 13 tuần tuổi khi mắc Gumboro và bệnh thiếu máutruyền nhiễm đều có biểu hiện ủ rũ khá giống nhau (Wang & cs., 2011;Gowthaman, 2019) Tuy nhiên, bệnh thiếu máu truyền nhiễm thường có các biểuhiện bên ngoài như xuất huyết ở da cánh Bệnh tích mổ khám có nhiều điểmchung, ví dụ như hiện tượng teo túi Fabricius Tuy nhiên, bệnh tích sưng và xuấthuyết túi Fabricius chỉ gặp ở bệnh Gumboro (Wang & cs., 2011) mà không có ởbệnh thiếu máu truyền nhiễm (Bahmaninejad & cs., 2012) Một số bệnh tích điểnhình chỉ gặp trong bệnh thiếu máu truyền nhiễm, ví dụ như tủy xương nhạt màu

2.2.10 Biện pháp phòng bệnh

* Vệ sinh phòng bệnh: công tác chăm sóc, quản lý tốt đàn giống và vệ sinhphòng bệnh, tăng cường biện pháp đảm bảo an toàn sinh học là những biện pháptổng hợp giúp ngăn chặn bệnh xảy ra (Engstrom, 1999)

* Phòng bệnh bằng vacxin: biện pháp kiểm soát trực tiếp nhất và hạn chếđược sự lây truyền dọc của bệnh là sử dụng vacxin cho đàn bố mẹ trước khi vàogiai đoạn khai thác trứng khoảng vài tuần Vacxin được sử dụng vào thời điểm 13

- 15 tuần tuổi, không được muộn quá 3 tuần trước khi gà bắt đầu đẻ bói để tạođáp ứng miễn dịch ở ngưỡng cao (hiệu giá trung hòa > 8 log2) giúp ngăn chặn sựtruyền virus qua trứng (Vielitz & cs., 1987; Mcnulty, 1991) Vacxin nhược độcđược sử dụng bằng cách cho uống, vacxin vô hoạt được sử dụng theo đườngtiêm Tại Việt Nam hiện đang lưu hành vacxin phòng bệnh cho đàn gà gồm:

- Nobilis CAV P4 của hãng Intervet (Hà Lan): vacxin nhược độc đông khô,mỗi liều có ít nhất 2,3 log10 TCID50 virus vacxin CIAV được nuôi cấy trên phôi

gà Vacxin dùng để tiêm cho gà khỏe mạnh từ 6 tuần trở lên Gà đẻ được phòng ítnhất 6 tuần trước khi bắt đầu đẻ Nên tiêm vacxin cho tất cả những con gà dễ mắcbệnh trong trang trại cùng một lúc Trong mọi trường hợp, không được dùngvacxin cho gà nhỏ hơn 6 tuần tuổi Virus vacxin mặc dù không có khả năng gâybệnh thể lâm sàng, vẫn có thể tồn tại lâu dài trong tuyến ức, lách và tạo đáp ứngmiễn dịch dịch thể ở mức thấp (Vaziry & cs., 2011)

- AviPro Thymovac (Lohmann Animal Health GmbH): vacxin nhược độcđông khô chủng Cux-1 phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà Vacxin đượcdùng bằng cách pha nước uống cho gà từ 12 - 14 tuần tuổi nhưng không đượcmuộn hơn 6 tuần trước khi đẻ (nếu dùng trong giai đoạn 6 tuần trước khi đẻ virus

có thể truyền qua trứng)

2.3 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CIAV

2.3.1 Mối quan hệ di truyền giữa các chủng CIAV

Bộ gen của CIAV có tính bảo thủ tương đối cao (Schat, 2009) nên sự khácbiệt giữa các chủng virus là thấp Gen mã hóa protein VP1 có vùng mang nhiềubiến đổi (amino acid 139 - 151) (Renshaw & cs., 1996)

Bảng 2.1 Đối chiếu cách phân loại nhóm di truyền của CIAV

Do đó, từ trước đến nay, trình tự gen mã hóa capsid protein của CIAV thườngđược dùng để nghiên cứu mối liên hệ di truyền giữa các chủng virus (Islam

& cs., 2002; Ducatez & cs., 2006; Eltahir & cs., 2011; Olszewska-Tomczyk &cs., 2016; Ou & cs., 2018) Từ 2002 cho đến nay có nhiều hơn 30 công bố về mốiliên hệ di truyền giữa các chủng CIAV (Chowdhury & cs., 2002; Ducatez & cs.,2006; Hailemariam & cs., 2008; Eltahir & cs., 2011; Snoeck & cs., 2012; Kye &cs., 2013; Wanasawaeng & cs., 2013; Olszewska-Tomczyk & cs., 2016; Li & cs.,2017a; Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019) Tuy nhiên, do phân tích với sốlượng trình tự gen khác nhau, tiêu chí phân loại không thống nhất đã dẫn tới tồntại đồng thời nhiều phân loại nhóm di truyền của CIAV (bảng 2.1)

Nhìn chung, cách phân loại CIAV thành 3 genogroup (I, II, III) được nhiềunhà khoa học trên thế giới sử dụng (Ducatez & cs., 2006; Olszewska-Tomczyk &cs., 2016; Ou & cs., 2018), minh họa ở hình 2.13

Ghi chú: cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide và trình tự amino acid được mã hóa của gen ORF1 được biểu diễn cạnh nhau Đường nét đứt nối vị trí các chủng ở hai cây phát sinh chủng loại

Hình 2.11 Cây phát sinh chủng loại CIAV

Nguồn: Ducatez & cs (2006)

Kết quả trên cho thấy, genogroup II và III của CIAV chiếm đa số, trongkhi đó genogroup I chỉ có 2 trình tự gen thu thập được ở Australia Đáng chú ý,

có sự thay đổi về phân nhóm giữa cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tựnucleotide và trình tự amino acid (đường nét đứt, hình 2.13) Đặc điểm phânnhánh khác nhau kể trên có thể gặp ở nhiều công bố khác (Olszewska-Tomczyk

& cs., 2016; Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019) Bên cạnh hệ thống phânloại kể trên, gần đây có một số nghiên cứu đề xuất thêm 2 genogroup IV và V củaCIAV (Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019) Do không đưa ra tiêu chí phânloại rõ ràng, chủ yếu dựa vào đặc điểm phân nhánh của cây phát sinh chủng loại,nên cách phân chia CIAV thành 5 genogroup cần được kiểm chứng

2.3.2 Sự lưu hành CIAV theo nhóm di truyền ở một số quốc gia

Ở khu vực châu Á, với tổng số 25 chủng CIAV có genome hoàn chỉnh thuthập từ các trang trại khác nhau tại Trung Quốc, nghiên cứu (Eltahir & cs., 2011)

đã phân tích và xây dựng cây phát sinh loài của CIAV Theo đó, cùng với sự sosánh với các chủng CIAV trên thế giới có trong GenBank, nghiên cứu đã chứngminh có 4 nhóm di truyền (A- D) với giá trị boostrap cao Gần đây tại TrungQuốc (Li & cs., 2017b) đã phát hiện sự tái tổ hợp trong cấu trúc gen của chủngCIAV-F10, với khả năng cao đã xảy ra sự tái tổ hợp gen giữa 2 trình tự có mã sốGenBank là JQ690762 và KJ728816 Một số tác giả còn phân chia CIAV lưuhành ở Trung Quốc thành các đơn vị dưới nhóm (subgroup) bao gồm: subgroupA1- A3, D1- D4 và E1- E3 (Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013)

Phân tích phát chủng loại dựa vào gen mã hóa cho việc tổng hợp VP1,nghiên cứu tại Hàn Quốc (Kim & cs., 2010) chỉ ra các chủng CIAV lưu hànhthuộc nhóm di truyền genogroup II, IIIa và IIIb CIAV lưu hành trong các đàn gàgiống dù được phòng vacxin hay không đều có sự tương đồng với các chủngvirus vacxin được sử dụng (Kim & cs., 2010)

Tại Thái Lan, khi phân tích cây phát sinh loài từ cơ sở dữ liệu gồm 13 trình

tự nucleotide của Thái Lan và trình tự CIAV trên thế giới, đã xác định có 3 cụm

di truyền (cluster I, cluster II, cluster III) với giá trị bootstrap cao, lần lượt là91%, 100% và 96% Trong đó, các chủng CIAV của Thái Lan thuộc về cluster I

và cluster III; đồng thời gần gũi với CIAV lưu hành ở Trung Quốc và Nhật Bản(Wanasawaeng & cs., 2013)

Nghiên cứu tại Ấn Độ (Gowthaman & cs., 2014) khi xây dựng cây phátsinh chủng loại bằng chương trình MEGA 5 với 29 chủng CIAV có sẵn trong

GenBank đã chỉ ra các chủng thực địa thuộc nhánh với các chủng virus từ TrungQuốc, Brazil, Mỹ, Malaysia, Bangladesh và Australia Ở một báo cáo khác, 11chủng CIAV thu thập ở tỉnh Nagpur (Ấn Độ) từ 2012 - 2015 được xếp vào nhóm

di truyền group A (Ganar & cs., 2017)

Ở châu Âu, một số kết quả về nguồn gốc phát sinh loài của CIAV đã đượccông bố Tại Slovenia, CIAV phân lập từ 2000 - 2003 nằm cùng nhánh và có mứcmức tương đồng gen cao với các chủng virus của Bangladesh, Nhật Bản và Mỹ(Krapez & cs., 2006) Ở Ba Lan, đã xác định được cụ thể hơn sự lưu hành của 2genogroup II và III của CIAV Hơn nữa, các chủng virus thực địa này khác biệt rõvới chủng virus vacxin (Olszewska-Tomczyk & cs., 2016)

Ở châu Phi, nhiều nhóm di truyền của CIAV (group A - D; genogroup II,III) đã được phát hiện ở một số quốc gia, ví dụ như: Nam Phi, Ai Cập, Trung Phi,Cameroon, Nigeria, v.v (Oluwayelu, 2010; Snoeck & cs., 2012; Erfan & cs.,2018) Ở Trung Phi và Cameroon, có 9 cụm di truyền khác biệt (phylogeneticcluster) được xác định CIAV (Snoeck & cs., 2012) Đáng chú ý, các cụm ditruyền này (CAF1 - CAF4, CMR1 - CMR5) không bao gồm các chủng virus lưuhành ở các nước khác trên thế giới (Snoeck & cs., 2012)

Từ các tổng hợp về sự có mặt và nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV

ở các nước trên thế giới, có thể nhận xét rằng: có sự lưu hành của nhiều nhóm di truyền của CIAV phạm vi quốc gia và trên phạm vi châu lục

2.3.3 Khác biệt di truyền của CIAV

Các kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy: ít có sự khác biệt trình tựgen của CIAV phân lập từ các vùng địa lý khác nhau (Ducatez & cs., 2006;Ducatez & cs., 2008; Hailemariam & cs., 2008) Mức tương đồng trình tựnucleotide giữa các chủng phân lập ở mỗi nước mặc dù có khác nhau, nhưngthường ở mức tương đồng cao, ví dụ như 93% (CIAV phân lập tại Alabama, Mỹ)(Van Santen & cs., 2001) hoặc 94,7% - 99,8% (CIAV phân lập tại Ba Lan)(Olszewska-Tomczyk & cs., 2016) Nhìn chung, sự sai khác di truyền giữa cácchuỗi nucleotide của CIAV thường dưới 5% và là khoảng cách lớn nhất được tìmthấy giữa các chủng CIAV trên thế giới (Ducatez & cs., 2006; Eltahir & cs., 2011;Zhang & cs., 2013) Bảng 2.2 trình bày kết quả so sánh mức tương đồng giữa cácchủng CIAV (Ducatez & cs., 2008)