Định lượng acid chlorogenic trong dược liệu ké đầu ngựa (fructus xanthii strumarii) thu hái tại việt nam bằng phương pháp HPLC

Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa...32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .... Về kết quả áp dụng phương pháp HPLC định lượng acid chlorogenic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG

ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA

(Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI

VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HƯƠNG TRANG

ĐỊNH LƯỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG DƯỢC LIỆU KÉ ĐẦU NGỰA

(Fructus Xanthii strumarii) THU HÁI TẠI

VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2015.Y

Người hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ PHƯƠNG

TS NGUYỄN THỊ THANH BÌNH

LỜI CẢM ƠN

Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại Khoa Hóa phân tích - Tiêuchuẩn, Viện Dược Liệu với sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Phương và TS.Nguyễn Thị Thanh Bình

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phương (Khoa Hóaphân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) và TS Nguyễn Thị Thanh Bình (Bộ mônHóa dược và kiểm nghiệm, Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội) là nhữngngười thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, chu đáo, luôn chỉ bảo, góp ý, đưa ranhững ý kiến quý báu và động viên em hoàn thiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dược liệu, PGS.TS PhươngThiện Thương (Trưởng khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) cùng cácanh chị, cán bộ nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã nhiệttình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô trong Khoa Y – Dược, nhữngngười thầy đã luôn tận tâm dạy dỗ, trang bị cho em những kiến thức quý giá trongnhững năm tháng theo học tại trường

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên cạnh độngviên, ủng hộ và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thànhkhóa luận

Sau cùng, em xin kính chúc các thầy cô luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thànhcông trong công việc cũng như trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Hương Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT, CÁC KÝ HIỆU

Ký hiệu Tên tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt

ACN Acetonitrile Acetonitril

AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà Hóa phân

CGA Acid chlorogenic Axit clorogenic

HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ChromatographyHPLC- High performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography-Diod array

detectorHPLC-UV High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography-Ultraviolet ghép nối đầu dò tử ngoại

MEX Methanol extracts of fruits Chiết xuất methanol quả của

of Xanthium strumarium Xanthium strumarium

MEXL Methanol extracts of leaves Chiết xuất methanol của lá cây

of Xanthium strumarium Xanthium strumarium

MEXS Methanol extracts of stems Chiết xuất methanol phần thân

of Xanthium strumarium cây Xanthium strumarium

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đốiRP-HPLC- Reversed phase High performance Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha

Liquid Chromatography-Diod array đảo ghép nối đầu dò mảngDAD

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh cây Ké đầu ngựa Xanthium strumarium L. 3

Hình 1.2 Hợp chất axit caffeic (22) và xanthiumnolic A (23) 6

Hình 1.3 Các hợp chất coumarin được phân lập từ Xanthium strumarium L. 8

Hình 1.4 Các hợp chất liganolid được phân lập từ Xanthium strumarium L. 8

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của acid chlorogenic 15

Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Ké đầu ngựa lưu trữ tại Viện Dược liệu 20

Hình 3.1 Sắc ký đồ HPLC phân tích acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa 27

Hình 3.2 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc của phương pháp 28

Hình 3.3 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ CGA và diện tích pic 30

DANH MỤC CÁC BẢNG

strumarium L 4

Bảng 1.2 Cấu trúc các dẫn xuất của axit caffeoylquinic được phân lập từ Xanthium strumarium L 7

Bảng 1.3 Cấu trúc của các hợp chất steroid và glycosid đã được phân lập từ Xanthium strumarium L 9

Bảng 1.4 Một số phương pháp xác định acid chlorogenic 17

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu thập 20

Bảng 3.1 Các thông số đánh giá đối với acid chlorogenic 27

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá tính thích hợp hệ thống 29

Bảng 3.3 Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích của pic CGA 29

Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ lặp lại 31

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 32

Bảng 3.6 Hàm lượng acid chlorogenic trong mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam 32

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.3 Bộ phận dùng 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Một số tác dụng dược lý của cây Ké đầu ngựa 11

1.2 Tổng quan về acid chlorogenic 15

1.2.1 Công thức hóa học 15

1.2.2 Tính chất vật lý 15

1.2.3 Tác dụng dược lý 15

1.2.4 Một số phương pháp xác định acid chlorogenic 16

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Chất chuẩn, hóa chất và thiết bị 21

2.2.1 Chất chuẩn 21

2.2.2 Hóa chất 21

2.2.3 Thiết bị 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Chuẩn bị dung dịch thử 21

2.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 22

2.3.3 Xây dựng phương pháp định lượng acid cholorogenic trong Ké đầu ngựa 22 2.3.4 Áp dụng trên một số mẫu dược liệu Ké đầu ngựa 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 26

3.1 Khảo sát điều kiện phân tích và quy trình xử lý mẫu 26

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 28

3.2.1 Tính chọn lọc của phương pháp 28

3.2.2 Tính thích hợp của hệ thống 28

3.2.3 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 29

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 30

3.2.5 Độ lặp lại 30

3.2.6 Độ đúng 31

3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá hàm lượng acid chlorogenic trong các mẫu dược liệu Ké đầu ngựa 32

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 34

4.1 Về thu thập mẫu dược liệu 34

4.2 Về xây dựng phương pháp định lượng 34

4.3 Về thẩm định phương pháp định lượng 35

4.4 Về kết quả áp dụng phương pháp HPLC định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại Việt Nam 35

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự tiến bộ của nền cách mạng khoa học – kỹ thuật, con người dần

có xu hướng “trở về với thiên nhiên”, nền Y học cổ truyền ngày càng được quantâm, nghiên cứu và phát triển Trong đó, việc tập trung tìm kiếm, phân lập các hoạtchất chữa bệnh từ các loài dược liệu tự nhiên đã mang lại giá trị to lớn và có ý nghĩa

vô cùng thiết thực cho công cuộc chăm sóc sức khỏe con người

Ké đầu ngựa có tên khoa học Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc

Asteraceae, là một trong những vị thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong nền Y họctruyền thống Việt Nam và Trung Quốc với nhiều công dụng như tiêu độc, sát trùng,tán phong, trừ thấp Ké đầu ngựa thường được dùng để chữa phong hàn đau đầu, taychân đau co rút, phong tê thấp, đau khớp, bướu cổ, mày đay, lở ngứa, mụn nhọt [3].Bên cạnh đó, đây còn là loại dược liệu có nhiều tác dụng dược lý quan trọng như ứcchế khối u, kháng viêm, kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống đái tháo đường

Trong Ké đầu ngựa có chứa các nhóm chất mang hoạt tính sinh học, trong đóphải kể đến acid chlorogenic – một hợp chất hóa học thuộc nhóm axit phenolic, cócông dụng chống oxy hóa, chống đột biến gen, ngăn chặn sự phát triển tế bào ungthư, chống vi rút và kháng khuẩn Acid chlorogenic là hoạt chất được yêu cầu địnhlượng trong nhiều loài dược liệu như Kim ngân hoa theo Dược điển Trung Quốc

2015 [51]; các chuyên luận trong Dược điển Mỹ 38 [54] Tuy nhiên, Dược điển ViệtNam V chưa đề cập tới định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa,mới chỉ có các công trình nghiên cứu định lượng acid chlorogenic trong dược liệubằng các phương pháp HPLC tại Việt Nam [2]

Từ thực tiễn trên, để góp phần xây dựng một phương pháp kiểm nghiệmdược liệu chính xác, đơn giản và có thể ứng dụng rộng rãi, tôi đã tiến hành đề tài

“Định lượng acid chlorogenic trong dược liệu Ké đầu ngựa (Fructus Xanthii

strumarii) thu hái tại Việt Nam bằng phương pháp HPLC” với 2 mục tiêu:

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic trongdược liệu Ké đầu ngựa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC)

- Ứng dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để định lượng acid chlorogenictrong một số mẫu dược liệu Ké đầu ngựa thu hái tại các vùng khác nhau củaViệt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.)

1.1.1 Vị trí phân loại

Ké đầu ngựa có tên khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc

Asteraceae, hay còn gọi là Thương nhĩ (tên Trung Quốc), Phát ma (tên Thổ) Ở

Trung Quốc, gọi quả ké là Thương nhĩ tử (Fructus Xanthii strumarii) [4].

Vị trí phân loại của Xanthium strumarium L.:

cm, có lông cứng [3]

Cụm hoa mọc ở đầu cành hoặc kẽ lá, màu lục nhạt, gồm hai loại đầu, cùnggốc, nhưng đầu trên nhỏ mang hoa lưỡng tính, đầu khác mang hoa cái Lá bắc xếpthành hai hàng, có lông Hoa lưỡng tính hình ống, không có mào lông, tràng có 5thùy, nhị 5, hoa cái không có tràng và mào lông Quả bế đôi, hình trứng, có hai sừngnhọn ở đầu và phủ dày gai móc, dài 12 - 15 mm, rộng 7 mm [3]

Chi Xanthium L chỉ có một loài Ké đầu ngựa ở Việt Nam Cây có nguồn gốc

ở châu Mỹ, sau lan ra khắp các vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới châu Á, châu Phi và

cả ở châu Âu Ở Việt Nam, Ké đầu ngựa có ở hầu hết các tỉnh miền núi, trung du vàđồng bằng, nhất là các tỉnh phía Bắc, từ Nghệ An trở ra [3]

Ké đầu ngựa ưa sáng và ưa ẩm, thường mọc tương đối tập trung thành đámlớn ở các bãi trống, ven đường đi hoặc trên các ruộng trồng hoa màu mới, bỏ hoang.Cây mọc từ hạt vào khoảng tháng 4 - 5, sinh trưởng nhanh trong mùa hè, mùa hoaquả tháng 5 - 8, sau khi có quả sẽ tàn lụi vào khoảng giữa mùa thu [3].

Hình 1.1 Hình ảnh cây Ké đầu ngựa Xanthium strumarium L [64]

vi khuẩn, chống vi rút, chống khối u và chống viêm [45, 55]

Năm 2015, 8 sesquiterpene đã được phân lập từ quả của X strumarium, bao

gồm sibirolid A (1), sibirolid B (2) và norxanthantolid A – F (3 - 8) [46] Năm 2008,

Han Ting và các cộng sự cũng phân lập được

1β-hydroxyl-5α-chloro-8-pei-xanthatin (9) và 11α,13-dihydro-8-epi-1β-hydroxyl-5α-chloro-8-pei-xanthatin (10) từ phần trên mặt đất của X.

strumarium [13] Hai xanthanolid mới là 6β,9β-dihydroxy-8-epi-xanthatin (11) và

2-hydroxytomentosin-1β,5β-epoxid (12) sau đó cũng được tìm thấy trong chiết xuất

từ lá cây Xanthium strumarium L [35]

Bên cạnh đó, dịch chiết lá X strumarium cũng cho thấy sự có mặt của các

hợp chất xanthinin (13), xanthumin (14), xanthanol (15), xanthatin (16), xanthinosin

(17) [36, 59] Ngoài ra, vào năm 1998, Ahmed A Mahmoud đã phân lập được 3

loại xanthanolid mới từ phần trên mặt đất của X strumarium bằng phương pháp phổ

1D, 2D NMR độ phân giải cao là 11α,13-dihydroxanthatin (18),

4β,5β-epoxyxanthatin-1α,4α-endoperoxid (19) và axit

1.1.4.2 Các Phenylpropenoid

Phenylpropenoid là một trong những nhóm chất quan trọng được tìm thấy

trong X strumarium, tính đến hiện nay, có khoảng 45 loại phenylpropenoid đã được

tìm thấy trong loại cây này Trong đó, các phenolic axit, đặc biệt là axit clorogenic

(21) phân lập được từ quả X strumarium được xem là chất mang tác dụng chống

viêm, giảm đau chính của cây [15]

Năm 2012, D P Pandey và M A Rather đã phân lập được trong dịch chiết

methanol cây X strumarium hợp chất axit caffeic (22) bằng các phương pháp phổ

[39] Năm 2017, từ chiết xuất quả X strumarium đã xác định được năm hợp chất

phenylpropanoid mới là xanthiumnolic A (23) và xanthiumnolic B-E [23]

Hình 1.2 Hợp chất axit caffeic (22) và xanthiumnolic A (23)

Trong khoảng thời gian từ năm 1993 - 2016, 10 dẫn xuất của axit

caffeoylquinic (CQA) cũng được tìm thấy trong các bộ phận của X strumarium, bao

gồm: Axit 1,3,5-tri-O-CQA (24), axit 3,5-di-O-CQA (25) [7], axit CQA (26), axit 1,5-di-O-CQA (27), axit 1,3-di-O-CQA (28) [20], axit 5-O-CQA

3,5-dimethyl-(29), axit 1,4-di-O-CQA (30), axit 4,5-di-O-CQA (31) [14], axit 4-O-CQA methyl

este (32), axit chlorogenic (21) [9].

Bảng 1.2 Cấu trúc các dẫn xuất của axit caffeoylquinic được phân lập từ

24 Axit 1,3,5-tri- Caffeoyl Caffeoyl H Caffeoyl H

1.1.4.3 Các Coumarin và Lignanoid

Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu đã phân lập được các hợp chất

lignanoid và coumarin trong X strumarium Cụ thể, năm 2011, Suqin Kan và những cộng sự đã tách chiết được từ rễ cây X strumarium 4 loại coumarin là scopoletin

(33), jatrocin B (34), cleomiscosin A (35) và cleomiscosin C (36) bằng phương pháp

phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phương pháp khối phổ MS [26]

Hình 1.3 Các hợp chất coumarin được phân lập từ Xanthium strumarium L

Năm 2018, trong một nghiên cứu về nhóm chất lignan trong quả khô Ké đầu

ngựa (Fructus Xanthii strumarii) của H Jiang và cộng sự đã phân lập được nhiều hợp chất lignanoid khác, ví dụ như: (-)-1-O-β-D-glucopyranosyl-2-{2-methoxy-4-

1.1.4.4 Các hợp chất khác

Ngoài những nhóm chất chính nêu trên, trong cây X strumarium còn chứa

rất nhiều nhóm chất hóa học khác Trong nghiên cứu về các thành phần hóa học từ

rễ cây Xanthium sibiricum của Suqin Kan và cộng sự năm 2011 không chỉ phân lập

được 4 coumarin nêu trên mà còn phân lập được năm hợp chất steroid, bao gồm:

β-sitostenon (41), β-sitosterol (42), daucosterol (43), stigmast-4-en-β-ol-3-on (44) và

5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3β-ol (45) [26]

Các nhóm chất glycosid cũng được chứng minh sự có mặt của chúng trong

X strumarium, năm 1975, JC Craig và các cộng sự đã xác định được tác nhân hạ

đường huyết – carboxyatractylosid (46) từ X strumarium [10]

Năm 2013, 4 hợp chất glycosid mới đã được phân lập từ chiết xuất ethanol

của Fructus Xanthii là

3β-norpinan-2-on-3-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosid (47), glucopyranosid (48), (6E)-3-hydroxymethyl-7-methylocta-1,6-dien-3-ol-8-O-β-D- glucopyranosid(49) và 7-[(β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl)

dimethyl-4,8-thiazin-3,5-dionNgoài ra, tại Việt Nam, trong hai năm 1969 và 1970, Đỗ Tất Lợi, Phạm KimLoan và Nguyễn Văn Cát (Trường Đại học Dược Hà Nội) cũng đã định tính và địnhlượng iod trong cây Ké đầu ngựa Việt Nam Kết quả cho thấy rằng, dù cây ké mọc

ở miền núi hay đồng bằng, gần biển hay xa biển đều có chứa iod với hàm lượng khácao, 1 gam lá hoặc thân chứa trung bình 200 μg, 1g quả chứa 220 - 230 μg, nướcsắc 15 phút cô thành cao chứa 300 μg trong 1g cao [4]

1.1.5 Một số tác dụng dược lý của cây Ké đầu ngựa

1.1.5.1 Tác dụng chống khối u

Tác dụng chống khối u được xem là tác dụng dược lý chính của X.

strumarium và đã được nghiên cứu rộng rãi qua nhiều công trình khoa học, bao gồm

ung thư phổi, ung thư vú, ung thư gan, ung thư ruột kết và một số dòng tế bào ungthư khác

Năm 1995, Ahn và cộng sự báo cáo rằng xanthatin và 8-epi-xanthatin phân

lập được từ lá của X strumarium có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể đối với dòng

tế bào HCT-15 gây ung thư ruột kết với giá trị ED50 (Effective Dose) lần lượt là 1,1

và 0,1 μg/mL [60]

Năm 2013, một nghiên cứu về tác dụng ức chế glycogen synthase kinase 3β

(GSK3β) của xanthatin - một sesquiterpen lacton được phân lập từ X strumarium đã

được tiến hành bởi Tao và những người cộng sự Nghiên cứu cho thấy, xanthatin ứcchế sự tăng sinh của các tế bào ung thư phổi NSCLC (non-small cell lung cacer)dòng tế bào A549, H1975, H1299, H1650 và HCC827 của con người Các nghiêncứu khác của Tao và cộng sự sau đó cũng phát hiện ra rằng xanthatin có khả năng

ức chế STAT3, GSK3β và β-catenin Ngoài ra, xanthatin còn có thể kích hoạt phảnứng phá hủy ADN qua trung gian Chk1 và làm mất ổn định gen Cdc25C thông qua

sự thoái hóa lysosomal trong các tế bào ung thư phổi [48, 49, 50]

Năm 2007, bằng phương pháp xét nghiệm CellTiter 96 in vitro,

Ramı'rez-Erosa và các cộng sự phát hiện ra rằng xanthatin và xanthinosin, hai loại

sesquiterpen lacton có trong X strumarium cho thấy hoạt động gây độc tế bào in

vitro với các dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm tế bào ung thư đại tràng WiDr

ATCC, tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và tế bào ung thư phổi NCl-417 Các chiết

xuất chloroform phần trên mặt đất của X strumarium cho thấy độc tính cao nhất với

tất cả các dòng tế bào thử nghiệm, giá trị nồng độ ức chế 50% đối tượng thử IC50

thu được từ những thử nghiệm đa liều nằm trong khoảng 0,1 – 6,2 μg/mL [43]

Năm 2016, trong một nghiên cứu về các hợp chất gây độc tế bào từ phần trên

mặt đất của X strumarium của Janet và cộng sự đã cho thấy hợp chất (-) spathulenol

có trong X strumarium mang hoạt tính chống khối u với một số dòng tế bào ung thư

như CACO-2 (ung thư đại trực tràng), Hep-G2 (ung thư gan tế bào gan nguyênphát), HeLa và A2780 (ung thư biểu mô buồng trứng) [12]

Tác dụng chống khối u của X strumarium đối với bệnh ung thư gan cũng đã

được báo cáo trong những năm gần đây Liu và cộng sự đã chứng minh rằngxanthatin (5 – 40 μM) có thể gây ra sự chết tế bào Hep-G2 và HeLa bằng cách ứcchế thioredoxin reductase và gây căng thẳng oxy hóa [33]

1.1.5.2 Tác dụng chống viêm mũi dị ứng

X strumarium là một loại thuốc truyền thống được sử dụng rộng rãi trong

điều trị các bệnh về mũi, đặc biệt là viêm mũi dị ứng (AR) Trong nghiên cứu dược

lý hiện đại, cơ chế của X strumarium trong điều trị AR đã được nghiên cứu rộng

rãi

Năm 2008, Zhao và cộng sự phát hiện ra rằng chiết xuất methanol từ quả của

X strumarium (MEX) (0,251 mg/mL) có thể điều chỉnh các tế bào mast trung gian

(HMC-mediated), tế bào đơn nhân máu ngoại vi trung gian (PBMNC-mediated) dễ

bị viêm và các phản ứng miễn dịch được gây ra bởi các cytokin tiền viêm, bao gồm:Interleukin (IL)-4, IL-6, IL-8, GM-CSF và TNF-α [63]

Năm 2010, một nghiên cứu của G.H Yang và cộng sự đã cho thấy tác dụng

ức chế đáng kể của MEX trên hợp chất 40/80 gây ra sự hoạt hóa tế bào mast và sựgiảm 2+ cAMP (cyclic adenosine monophosphate) trong tế bào mast ở màng bụngchuột RPMCs (rat peritoneal mast cell) Cơ chế chống dị ứng của MEX có thể liênquan tới sự ức chế hấp thu Ca2+, sự giải phóng histamin và sự tăng cAMP trongRPMCs [61]

Ngoài ra, vào năm 2014, W Peng và cộng sự đã chứng minh rằng

caffeoylxanthiazonosid được phân lập từ quả của X strumarium có tác dụng cải

thiện các triệu chứng của AR trên chuột thí nghiệm thông qua các đặc tính chống dịứng, chống viêm và giảm đau hiệu quả [42]

1.1.5.3 Tác dụng chống viêm và giảm đau

Vào năm 2005, Kim và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tác

dụng chống viêm từ chiết xuất methanol phần thân cây X strumarium (MEXS) trong cả in vitro và in vivo Kết quả nghiên cứu cho thấy MEXS nồng độ 30, 60 và

90 mg/mL có khả năng ức chế sản xuất nitric oxit (NO), prostaglandin E2 (PGE2) vàyếu tố hoại tử u TNF-α Ngoài ra, MEXS còn ức chế hoạt động gắn kết ADN củayếu tố nhân kappa B (NF-kB), ngăn cản quá trình sao mã sớm bằng cách ngăn chặn

sự giảm dần các chất ức chế kappa B-α (IkB- α) [30]

Năm 2016, Hossen và cộng sự đã thực hiện các phương pháp phân tích miễndịch toàn diện, phân tích mARN để nghiên cứu hoạt động chống viêm của MEXS

và cho ra kết luận: Vai trò chống viêm mạnh mẽ của MEXS trong bệnh viêm gan vàmột số bệnh lý viêm khác có thể là do cơ chế ức chế tín hiệu viêm của MAPK(mitogen-activated protein kinase) và AP-1 (activator protein-1) [17]

Trong một nghiên cứu khác, Hossen và cộng sự cũng nhận thấy hoạt tínhchống viêm tiềm tàng của MEXS trên các đại thực bào được điều trị bằng LPS(lipopolysaccharide) và mô hình chuột viêm dạ dày do HCl/Etanol gây ra bằng cách

ức chế sản xuất NO, PGE2 và ngăn chặn hoạt động của enzym PDK1(phosphoinositide dependent kinase 1) [16]

1.1.5.4 Tác dụng chống oxy hóa

Năm 2011, Huang và các cộng sự đánh giá hoạt tính chống oxy hóa từ chiết

xuất quả X strumarium cho thấy khả năng loại gốc 2,2′-azino-bis

(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic axit (ABTS) và 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) ở nồng độ 0,05 mg/mL một cách đáng kể [19]

Năm 2015, ba hợp chất là axit hexadecanoic, α-amyrin và

14-methyl-12,13-dehydro-sitosterol-heptadeconat đã được phân lập từ lá của X strumarium và tiềm

năng chống oxy hóa của chúng cũng được đánh giá Ba thành phần hóa học chothấy hoạt động chống oxy hóa một cách đáng kể phụ thuộc vào liều [28]

Ngoài ra, Kamboj và cộng sự đã báo cáo rằng, trong số tất cả các bộ phận

của X strumarium thì chiết xuất từ lá có hàm lượng phenolic và flavonoid cao nhất,

cho thấy hoạt động chống oxy hóa mạnh nhất, đó là một công dụng tiềm năng trongphòng ngừa và điều trị các bệnh liên quan đến stress oxy hóa [25]

1.1.5.5 Tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm

Một nghiên cứu của Sato và cộng sự năm 1997 đã chỉ ra rằng hợp chất xanthatinđược phân lập từ lá của X.strumarium cho thấy tiềm năng chống lại mạnh mẽ các loài

Staphylococcus aureus, bao gồm cả S aureus kháng methicillin (MRSA) và một số vi

khuẩn khác như Staphyloc Focus cholermidis, Bacillus cereus , Klebsiella pneumoniae , Pseudomonas aeruginosa và Salmonella fyphi [44]

Sau đó, A Devkota và RK Das đã tiến hành một nghiên cứu về hoạt tính

kháng khuẩn của X strumarium trong phòng thí nghiệm Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng chiết xuất methanol của lá cây X strumarium (MEXL) có khả năng kháng sáu loại vi khuẩn gây bệnh, ba gram âm: Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis,

Escherichia coli và ba gram dương: Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus ở các nồng độ khác nhau (50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml,

200 mg/ml, 250 mg/ml) Những phát hiện này cho thấy MEXL có tiềm năng pháttriển thành thuốc kháng khuẩn [11]

Tương tự như tiềm năng kháng khuẩn, tác dụng chống nấm của X.

strumarium cũng đã được các nhà khoa học tiến hành nghiên cứu chuyên sâu Năm

2002, Kim và cộng sự đã tìm thấy một thành phần chống nấm từ X strumarium,

được đặt tên là deacetylxanthumin Đây là hoạt chất có thể ức chế sự phát triển của

sợi nấm và sự nảy mầm của loài Phytophthora drechsleri với giá trị MIC là 12,5

μg/mL [29]

Ngoài ra, vào năm 2016, Parveen và các cộng sự đã thực hiện phân tách các

thành phần từ lá X strumarium bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ và thu được các hợp chất có khả năng chống nấm như: β-caryophyllen (17.53%), α-cadinol

(6.66%), spathulenol (6.09%), limonen (5.66%) và 1,3,5-trimethyl-2[2-nitroallyl]benzen (3.29%) Các chất này cho thấy tác dụng ức chế tăng trưởng đáng chú ý với

một số chủng nấm như: A Niger, Aspergillus flavus, F oxysporum, Fusarium

solani, Alternaria alternata và Penicillium digitatum với giá trị nồng độ kiềm khuẩn

tối thiểu MIC và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC là 8 μg/mL [41]

1.1.5.6 Tác dụng dược lý khác

Ngoài những tác dụng dược lý nêu trên, X strumarium còn có nhiều tác dụng

dược lý khác cũng đã được nghiên cứu rộng rãi Năm 2000, Hsu và cộng sự đã tiếnhành đánh giá tác dụng hạ đường huyết của axit caffeic – một hợp chất phenolic có

trong quả X strumarium Kết quả cho thấy, sau khi tiêm tĩnh mạch axit caffeic liều

0,5 – 3,0 mg/kg vào hai mô hình chuột bị tiểu đường kháng streptozotocin và khánginsulin thì xuất hiện sự giảm glucose huyết tương phụ thuộc vào liều do tăng sửdụng glucose [18]

Năm 2015, một nghiên cứu khác cũng chứng minh được rằng thành phần hóa

học caffeoylxanthiazonosid (CYXD) được phân lập từ quả của X strumarium cho tác dụng bảo vệ chống nhiễm trùng trên mô hình chuột nhiễm trùng huyết in vitro

và in vivo bằng cách tiêm CYXD vào trong màng bụng chuột với các nồng độ lần

lượt là 10, 20 và 40 mg/kg/ngày [57]

Ngoài ra, X strumarium còn có khả năng chống huyết khối trong sỏi tiết niệu

gây ra bởi ethylen glycol thông qua việc ức chế sự hình thành các tinh thể canxi

oxalat ở thận [40], tiềm năng chống loét, bảo vệ dạ dày nhờ sự sửa chữa ADN,chống gốc tự do, giảm stress [27], chống co giật, giảm thời gian trung bình của giaiđoạn co thắt và khởi phát cơn co thắt tim [31].

1.2 Tổng quan về acid chlorogenic

1.2.1 Công thức hóa học

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của acid chlorogenic [66]

Công thức phân tử: C16H18O9

Trọng lượng phân tử: 354, 31 g/mol

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:

(1S,3R,4R,5R)-3-[(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy-1,4,5-trihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid

Tên khác: 3- O -Caffeoylquinic acid

3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl) quinic acid3-Caffeoylquinic acid

(E)-chlorogenic acid [66]

1.2.2 Tính chất vật lý

Acid chlorogenic (CGA) là chất rắn, dạng bột màu trắng hoặc hơi ngả vàng,tan được trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethylsulfoxyd, dimethylformamid Đây là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốtnhất là 4°C [6]

Nhiệt độ nóng chảy: 205 – 209°C; Độ hòa tan: 40 mg/mL ở 25°C [66]

1.2.3 Tác dụng dược lý

CGA là một trong những hợp chất axit phenolic có thể tìm thấy nhiều trong

tự nhiên, đặc biệt là chiết xuất cà phê và trà xanh Đây là một hợp chất hoá họcmang hoạt tính sinh học quan trọng, đóng vai trò như chất chống oxy hóa, khángkhuẩn, chống viêm, quét gốc tự do cũng như bảo vệ một số cơ quan của cơ thể

CGA có khả năng bảo vệ gan bằng cách bảo vệ cơ thể khỏi các tổn thương do hóachất hoặc lipopolysacarid gây ra [37].

Năm 2017, Tajik và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng quan về tácdụng tiềm năng của CGA đối với các dấu ấn sinh học của bệnh lý mãn tính trên

động vật và người in vivo Nghiên cứu cho thấy CGA đóng vai trò quan trọng trong

việc điều hòa chuyển hóa chuyển hóa glucose và lipid cũng như các rối loạn liênquan khác CGA còn cho thấy tiềm năng trong việc chống tiểu đường, chống béophì và chống ung thư [47]

Tác dụng chống oxy hóa của CGA đã được nghiên cứu bởi Zhang và cộng sựnăm 2003, kết quả chứng minh rằng CGA có khả năng dọn gốc hydroxyl (·OH) phụthuộc vào liều với hằng số tốc độ dọn gốc tự do là 7,73 x 109 M−1 sec−1[62] Ngoài

ra, tác dụng bảo vệ của CGA trong tình trạng oxy hóa bệnh lý gây ra bởi paraquat đãđược kiểm chứng trên chuột Hoạt động của hồng cầu, glutathion peroxidase vàcatalase ở gan tăng lên khi sử dụng paraquat, trong khi đó CGA có tác dụng làmgiảm những phản ứng này [53]

Năm 2013, Ong và cộng sự đã thực hiện đánh giá sự ảnh hưởng của CGAđến sự dung nạp glucose, độ nhạy insulin, quá trình chuyển hóa lipid và hấp thụ

glucse cơ xương trong mô hình chuột Leprdb/db Nghiên cứu chỉ ra rằng CGA hoạthóa sự phosphoryl hóa AMPK gây tăng tổng hợp GLUT4, giảm sự hình thànhG6Pase, dẫn tới sự ức chế tổng hợp axit béo và tân tạo đường, đồng thời tăng vậnchuyển glucose ở cơ [38]

Một nghiên cứu khác cũng nhận định rằng CGA có khả năng kích thích bàitiết insulin từ dòng tế bào tiết insulin INS-1E và tăng hấp thu glucose trong tế bào

cơ L6 [52] CGA trong chiết xuất hạt cà phê còn được chứng minh mang lại tácdụng giảm huyết áp ở chuột và người bị tăng huyết áp một cách tự nhiên thông quacác thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, có đối chứng [56]

1.2.4 Một số phương pháp xác định acid chlorogenic

CGA là thành phần hợp chất hóa học quan trọng được tiến hành định tính,định lượng trong nhiều mẫu dược liệu khác nhau, tại những đất nước khác nhau.Hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệunăng cao (HPLC) để đánh giá hàm lượng CGA với những điều kiện sắc ký riêng,một số nghiên cứu được tổng kết theo bảng 1.4 dưới đây

Bảng 1.4 Một số phương pháp xác định acid chlorogenic

+ Cột: Agilent SB-C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm)Xác định protocatechuic, + Cột bảo vệ: C18 (5 μm)

syringin, axit chlorogenic, + Pha động: Axit phosphoric 0,05% : ACN

1 axit caffeic, liriodendrin HPLC-DAD (0,01 phút – tỷ lệ 94 : 6 tt/tt, 50 phút – tỷ lệ 65 : 35 tt/tt) [32]

và isofraxidin trong bột + Nhiệt độ cột: 35°C

dược liệu Acanthopanax + Tốc độ dòng: 0,9 ml/phút

+ Kết quả: Thời gian lưu pic CGA khoảng 15,5 phút+ Cột sắc ký: Inertsil ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm)+ Cột bảo vệ: ReproSil-Pur ODS-3 C18 (4 mm x 10 mm)+ Pha động: Nước chứa 0,2% axit phosphoric, pH 1,46 (dungmôi A) và methanol (dung môi B)

Định lượng CGA trong RP-HPLC- + Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút

một số dược liệu Thái DAD

+ Nhiệt độ cột: 30°C+ Bước sóng phát hiện: 325 nm+ Kết quả: Hàm lượng CGA cao nhất được tìm thấy trong nụ

hoa Lonicera japonica, lá Melissa officinalisa và hạt Coffea

canephora ở nồng độ tương ứng là 9,900 ± 0,004; 19,88 ±