Chọn và khảo sát vài đặc tính của vi khuẩn Lactic 5

Chọn và khảo sát vài đặc tính của vi khuẩn Lactic để muối chua nấm rơm, măng , đậu

Nước mang chua,

Nước dưa cải chua

Nước dưa gia

Men tiêu hóa sống (L.acidophilus)

2.1.2 Nguyên liệu dùng để muối chua:

2.1.3 Các môi trường dùng đỂ thí nghiệm:

* Môi trường A4RS :[16, 35]

- Cao nấm men 5g

- Tween 80

- K,HPO,

- Natni acetat (CH,;,COONAa)

iml 2g

{000ml

10g 10g

10g

- Nước chiết giá đậu — 50% so với thể tích của môi trường

(Nấu 300g gid dau trong 1000ml nước cất)

* Môi trường nước chiết củ cải trắng :[ 17]

- Nước chiết củ cải trắng 20% so với thể tích của môi trường

(Nấu 300g củ cải trắng trong 1000ml nước cất)

* Môi trường đông khô giống :[26]

e Thuốc thử Phenol đó 1%

® NaOH 0,IN, Phenoiphtalemn 1%

@ Acid lactic

e Acid oxalic IN

e Thuốc nhuộm Gram

øe Các hóa chất dùng để xác định NHơ Tổng sd, Nito Formol và

Nito Amoniac

2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Phân lập và chọn giống

2.2.1.1 Phân lập và sơ chọn giống :[3$ ]

> Nguyên tắc: dựa vào đặc tính sinh acid của các chẳng, Giống phân lập trên môi trường Carbonat agar, CaCOxs sẽ bi tan khi tác dụngvới acid tạo nên vòng

trong suốt quanh khuẩn lạc

> Thực hiện :

v“ Pha loãng mẫu trong nước cất vô trùng với các độ pha loãng khác nhau

*s Trãi đều 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng lên môi trường MRS agar Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện ky khí và theo đõi sự phát triển của các khuẩn lạc sau 24 giờ

¥ Chon những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trường Carbonalt agar Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện ky khí Sau 72 giờ, chọn các

ching sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuất hiện quanh khuẩn lạc Vòng trong

suốt càng lớn, chứng tỏ lượng acid sinh ra càng nhiều

* Thuần khiết giống :[ L0, 39 ]

Từ mỗi dạng khuẩn lạc có xuất hiện vòng trong suốt xung quanh, ding que

cấy trích ly vi khuẩn và cấy ria trên môi trường MRS agar Nuôi cấy ở nhiệt độ

phòng trong điều kiện ky khí, Sau 48 giờ, quan sát và chọn những khuẩn lạc tiếp

tục cấy ria cho đến khi các khuẩn lạc mọc thuần nhất trên môi trường MRS agar

Kiểm tra độ thuần khiết bằng cách quan sát trạng thái sống, nhuộm gram

2.2.1.2 Chọn giống có kha ndng sinh acid lactic -[22, 43]

Nguyên tắc: thuốc thử Uphenmen khi tác dung véi acid lactic sé chuyén màu từ xanh dương đậm sang vàng Sự chuyển màu càng rõ khi lượng acid

»> Thực hiện:

w Cấy vi khuẩn đã phân lập được vào ống nghiệm chứa lÖÔmi môi

trường MRS dịch thể Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 72 giờ

v Cho vào dịch nuôi cấy vi khuẩn 1ml thuốc thử Uphenmen ly tâm thu

dich trong

4 Lấy 5ml dịch cho vào ống nghiệm, thêm 3ml thuộc thi’ Uphenmen

| Quan sát sự đổi màu của thuộc thử và chọn vi khuẩn

Tiến hành đồng thời 2 ống đối chứng :

v Ống 1: 5ml môi trường MRS (không nuôi vi khuẩn) thêm 3ml thuốc

⁄ Ống 2: 5ml acid lactic tỉnh khiét,thém 3ml thude tht Uphenmen 2.2.2 Khảo sát một số đặc điểm phân loại

2.2.2.1 Đặc điểm nuôi cấy và hình thái vì khuẩn:

A Đặc điểm nuôi cấy:

* Trên môi trường đặc :

Ở các loài vi sinh vật khi phát triển trên bề mặt các môi trường thạch khác nhau sẽ hình thành các dạng khuẩn lạc đặc trưng cho loài đó Vì vậy việc miêu tả

các khuẩn lạc là một trong các việc cần thiết đối với công tác định danh các loài

vị sinh vật nghiên cứu.| L6]

Thực hiện: Cấy vi khuẩn phân lập được lên bề mặt môi trường MRS agar sao cho tạo được những khuẩn lạc tách rời Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong điều kiện ky khí Sau 72 giờ, quan sát và mô tả đặc điểm của khuẩn lạc.[4, 16]

* Trong môi trường lông :

Cấy vị khuẩn vào ống nghiệm chứa 1Ôml môi trường MRS dịch thể Nuôi

cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng Ghi nhận các đặc điểm sinh trưởng (mức độ sinh trưởng, độ đục môi trường, tạo váng hay cặn tủa ) trong 72 gi6.[16, 39]

B.Hình thái vì khuẩn: |

Khả năng đi động, hình dang và sự liên kết của tế bào được xác định bằng cách quan sát tiêu bản sống bằng kính hiển vi và các tiêu bản nhuộm Gram.[39]

* Quan sát trạng thái sống :

Quan sát vị sinh vật ở trạng thái sống là một phương pháp đơn giản giúp ta

_ biết được khả năng di động của chúng,

Thực hiện:

Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MRS dịch thể từ 15 - 18 gid, lam tiêu

bản giọt ép, quan sát trạng thái sống của vi khuẩn dưới vật kính x 40 [38]

màu tím, vi khuẩn Gram (-) có màu hồng [22, 38]

2.2.2.2 Một số đặc diém sinh lý sinh hóa:

A Quan hệ với oxy:

Cấy vi khuẩn theo kiểu cấy thắng sâu vào môi trường MRS agar chứa

trong ống nghiệm sâu đến khoảng phân nửa chiều cao mỗi ống Nuôi cấy ở nhiệt

độ phòng Sau 72 giờ, nhận xét sự sinh trưởng và mức độ phát triển dọc theo vết cấy Căn cứ vào đó mà xác định quan hệ của vi khuẩn với oxy [4, 39]

B Quan hệ với nồng độ NaCL:

Phần lớn vi khuẩn mẫn cảm với nồng độ NaCl trong môi trường Khả năng

chịu đựng các nồng độ NaC] khác nhau đối với từng loài vi khuẩn, Do vậy, đây

cũng là một tiêu chuẩn quan trọng trong việc định danh vi khuẩn

Điều chế môi trường MRS agar và MRS dịch thể có bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 2%, 4%, 5%, 6%, 6.5% được phân phối vào các ống nghiệm Cấy vi khuẩn vào 2 môi trường lông và thạch nghiêng chứa các nồng độ muối

trên Nhận xét sự sinh trưởng vi khuẩn sau 3 ngày nuôi cấy.[17, 39]

C Quan hệ với nhiệt độ -

Cấy vi khuẩn vào 2 môi trường MRS thạch nghiêng và MRS lỏng Đem

nuôi cấy ở nhiệt độ 10°C, 20°C, 250C, 30C, 35°C, 40°C, 45°C Sau 3 ngay, quan

sát thô đại sự sinh trưởng của các vi khuẩn.[4, 16]

Ð Quan hệ với pH :

Điều chỉnh pH của môi trường MRS dịch thể bằng CH;COOH 1N và

NaOH 1N về các giá trị pH ban đầu như sau: 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 9.2, 9.6

(pH sau khi hấp khử trùng)

Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa 1Öml môi trường tương ứng với các

giá trị pH nêu trên Sau 3 ngày quan sát thô đại sự sinh trưởng của các vì khuẩn.[16, 33]

E Khảo sắt khả năng lên men một số nguồn hydratcarbon:

Khả năng đồng hóa và lên men các nguồn hydratcarbon của các vi khuẩn thường không giống nhau Đây là một trong những đặc tính quan trọng dùng để

định danh vi khuẩn Sự khác nhau về khả năng sử dụng các nguồn thức ăn này

phản ánh sự khác nhau về vật liệu di truyền của vi khuẩn qua việc tạo thành

enzyme giúp cho quá trình đồng hóa thức ăn.[6, 16, 39]

Pha chế môi trường chứa các nguồn hydratcarbon khac nhau: glucose,

lactose, saccharose, dextrin, sorbHol với chỉ thị mầu là do phenol

Cay từng loại vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa những môi trường có các

nguồn hydratcarbon này Nuôi cấy 4 ngày ở nhiệt độ phòng Môi trường trước khi cấy có màu đó Sau khi nuôi cấy môi trường ngả sang vàng tức là pH thay đổi

_nghiêng về phía acid, chứng tổ sự lên men bởi vị khuẩn lactic đã xảy ra.[39]

È,Khả năng phân giải protein:

> Nguyên tắc: Xác định khả năng phân giải protein với nguồn cơ chất sử dụng

là casein.Loại protein này sẽ bị tủa khi có sự hiện diện của dung địch Tricloracec Acid CTCA ) 10%.Nếu protein bị phân giải, môi trường sẽ trong suốt sau khi bổ sung dung dịch TCA 10% vào 5-10 phut.{38]

> Thực biện: Cấy điểm các chủng vi khuẩn lactic lên môi trường casein Nuôi

cấy ở nhiệt độ phòng Sau 5 ngày, cho hiện vòng phân giải với dung dịch TCA

2.2.3 Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự tạo acid cho

quá trình lên men

Phân lập vi khuẩn lactic Lactobacillus acidophilus từ men tiêu hóa sống, kết hợp cùng với các chủng chon được để khảo sát

2.2.3.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy:|10, 40]

Dùng 5 loại môi trường khác nhau để khảo sát :

$ Môi trường MRS

t› Môi trường cà chua

$ Môi trường nước chiết giá đậu

$ Môi trường Yeast Extract Trypion

&% Môi trường nước chiết củ cải trắng

Giống được cấy vào môi trường MRS dịch thể, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng

trong 2 ngày

Lấy 0.2 mi giống cho vào ống nghiệm chứa 1Oml môi trường nuôi cấy

khác nhau (5 loại môi trường trên) Nuôi ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày

Lấy mẫu định phân Xác định hàm lượng acid tổng tích lũy trong các môi trường, chọn môi trường tối ưu (lượng acid tổng tích lũy được cao) để khảo sát các

đặc tính tiếp theo

Thực hiện mỗi thí nghiệm 3 mẫu, thí nghiệm lặp lại 3 lần

* Phương pháp xác định hàm lượng acid tổng :[14, 22]

> Nguyên tắc: Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định được bằng

một dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi mầu của dung dịch thuốc thử phenolphtalein

> Thực hiện: Lấy 5ml dịch lên men cho vào bình tam giác có sẵn 10ml nước cất trung tính Nhỏ 2 giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng NaOH

N/10 cho đến khi xuất hiện mầu hồng nhạt bền vững

Thực hiện mẫu thử không là môi trường chưa nuôi cấy vi khuẩn

Ghi lại thể tích NaOH N/10 đã dùng

- Hiệu số A V =(WV,- Vạ) ml là lượng NaOH N/10 cần thiết để

trung hòa hết lượng acid có trong dịch lên men do vi khuẩn

lactic sinh ra

Hàm lượng acid tổng được tính là:

a(g/1) = AV x.0,009 1000

5 Trong đó:

x > hé s6 hiéu chinh cla NaOH N/10

0,009 : sd gram acid lactic tuong ting v6i Iml NaOH N/10 (xem nh acid lactic 14 acid chi yếu tích luỹ được trong dịch lên men)

2.2.3.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon:[23, 40]

Chọn môi trường tối ưu ở mục 2.2.3.1 sau đó thay đổi các nguồn carbon là:

glucose, saccharose, lactose, dextrin để khảo sát

Lay 0.2 ml giếng cho vào ống nghiệm chứa 10 mÌ môi trường với 4 nguồn

carbon trên Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Sau 2 ngày, xác định hàm lượng acid

tổng tích lãy trong môi trường chứa các nguồn carbon khác nhau

Chọn môi trường có nguồn carbon thích hợp để khảo sát tiếp

2.2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt đệ:|23, 40]

Từ các điều kiện chọn được ở mục 2.2.3.1 và 2.2.3.2 tiếp tục khảo sát sự

nuôi cấy vi khuẩn ở các nhiệt độ: 20°C, 25°C, 30C, 35°C, 40C

Lấy 0.2 ml giống cho vào 10 ml môi trường Nuôi cấy ở các nhiệt độ trên

Sau 2 ngày, xác định hàm lượng acid tổng tích lũy được ở các nhiệt độ khác nhau Chọn nhiệt độ thích hợp cho quá trình phát triển tích lãy acid của các chúng

2.2.3.4 Ảnh hung của pH ban đầu:[11, 33]

Điều chỉnh pH môi trường bằng CH;COOH và NaOH sao cho pH ban đầu

là: 5, 6, 7, 8 (pH sau khi hấp khử trùng) Lấy 0.2ml giống cho vào mỗi trường đã chọn được ở các mục trên Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng

Sau 2 ngày, xác định hàm lượng aicd tổng tích lũy được trong dịch nuôi cấy tưởng ứng với các độ pH khác nhau Chọn môi trường có pH thích hợp cho sự,

tích lũy acid của các chúng

2.2.3.5 Khảo sát động học tăng tưởng của các chúng vì khuẩn lactlc ở

môi trường nước chiết giá đậu

2.2.3.5.1 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm trên phòng đểm hồng cầu.[17, 22]

Sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic biểu thị bằng mật độ tế bào (số tế bào/ml địch nuôi cấy) theo thời gian trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

Phòng đếm hồng cầu có các vạch tạo thành những ô vuông :

- _ Ô vuông lớn nhất có điện tích là 1mm”

Mỗi ô lớn lại được chia thành 16 ô vuông nhỏ, có điện tích là 1/4000

mm’

- Chiéu sâu của phòng đếm là 1/10 mm

Số lượng tế bào trong 1ml mầu được tính bằng công thức :

3 a.4000.19 x10"

Trong đó:

a_ : số tế bào con trong 5 ô lớn (80 ô con)

- b : số ô con trong 5 ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô con)

- _ 10”: số chuyến mm thành ml (1000 mmÌ= 1ml)

a 10°: d6 pha lodng mẫu

2.2.3.5.2 Thiết lập mỗi tương quan giữa mật độ tế bào va OD ;¡a của dịch

huyền phù tế bào :[10, 22, 33]

> Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong môi trường

nuôi cấy có thể vừa hấp thu hoặc phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt

bị giảm Như vậy, số lượng ánh sáng được hấp thu hoặc phân tấn có quan hệ tỷ lệ

thuận với số lượng vì sinh vật trong dịch nuôi cấy

> Tương quan giữa mật độ tế bào và OD¿¡o: Để hạn chế thao tác đếm

số tế bào mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ được suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng cách dựa vào đồ thị tương quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch

_ huyền phù ở các ƠD khác nhau khi đo ở bước sóng 610mm

> Thực hiện :

- Pha loãng địch nuôi cấy vi khuẩn sau 24 giờ sao cho thu được dịch huyền phù có các giá trị OD=0.1;0.2;0.3;0.4;0.5

- Đếm số lượng tế bào bằng phòng đếm hồng cầu tương ứng với 5 giá trị

OD=0.1;0.2;0.3;0.4; 0.5 Suy ra mật độ tế bào trong 1ml dịch huyền phù

- Đựng đồ thị tương quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục X)

2.2.3.5.3 Xác định động học tăng trưởng của các chúng vì khuẩn lactic.[10, 40]

Lấy 0.1ml giéng cho vào bình tam giác chứa 30 mi môi trường nuớc chiết

giá đậu dịch thể sao cho khi đo ODa¡s lúc đầu có giá trị nhỏ hơn 0.05 Nuôi cấy

tĩnh ở nhiệt độ phòng

Tiến hành đo OD,is vào các thời điểm: 0, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28,

32, 36, 40, 44, 48 giờ

Suy ra mật độ tế bào từ đồ thị đường tương quan tuyến tính với giá trị OD

đo được ở các thời điểm trên,

Trường hợp có pha loãng thì mật độ tế bào cần tìm là mật độ tế bào suy ra

từ đồ thị nhân với hệ số pha loãng

Vẽ đồ thị đường cong tăng trưởng theo logarit số lượng tế bào trong 1mi

dịch vi khuẩn theo thời gian - Sự sinh trưởng của quần thể vi sinh vật nuôi trong

hệ kín được chia làm 4 pha:

+ Pha lag: pha mở đầu

+ Pha log: pha cấp số (pha lũy thừa)

+ Pha cân bằng

+ Pha suy vong

— Một số biểu hiện đặc trưng của từng pha như sau :

+ Pha lag:

Bao gồmkhoảng thời gian từ khi bắt đầu nuôi cấy cho đến khi tốc độ sinh

trưởng cực đại Thời kỳ này đài hay ngắn phụ thuộc chủ yếu vào sự nuôi cấy, tuổi

của giống cấy vào cũng như môi trường nuôi cấy ( có thể xem đây là khoảng thời gian cần thiết để vị sinh vật thích nghỉ với môi trường)

+ Pha log:

Được đặc trưng bởi tếc độ phân chia tế bào cực đại không đối Tốc độ này

phụ thuộc vào loài vi khuẩn và môi trường nuôi cấy

+ Pha cân bằng :

Bắt đầu từ lúc số lượng tế bào trong quần thể ở trạng thái cố định động (số

tế bào mới sinh ra bằng đúng số tế bào cũ chết đi )

+ Pha suy vong :

Tế bào có thể tự phân giải do tác dụng của các loại enzym của chính nó ( đối với vi khuẩn lactic thì có thể do sự tích lãy acid trong môi trường nuôi

cấy )

- Để đưa giếng vào trong ứng dụng lên men, thông thường cấy giống vào

cuối pha log

2.2.4 Sử dụng giống vỉ khuẩn lacdc để muối chua nấm rơm: [27, 28, 40]

2.2.4.1 Sử dụng giống vi khuẩn lactc riêng lễ:

> Các giai đoạn muối chua nấm rơm:

* Nhân giống vì khudn lactic:

- Giếng đang giữ trên thạch nghiêng được cấy vào môi trường chiết giá

đậu, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 16 giờ

- Lấy 0.1 ml cho vào ống nghiệm chứa 10 mi môi trường nước chiết giá

đậu để nhân giống tiếp tục Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 16 gid

- - Ngâm nấm trong dung dịch xử lý sơ bộ trước khi muối chua

- _ Nén lại cho nấm ngập trong dung dịch xử lý

- - Để vên trong 30 phút

- Rita lai bang nước đun sôi để nguội,

* Chân nấm -

Mục đích :

- Lam bay hơi lượng SƠ; trong nấm (khí SỐ; có hại cho sức khoẻ)

- Lam giảm số lượng vi sinh vật hoại sinh

Theo đối quá trình lên men, xác định hàm lượng acid tổng tích lũy được

trong dịch muối chua theo thời gian, đánh giá cẩm quan nấm rơm sau khi muối chua,

*Sơ đồ quá trình muối chua -

Lấy 0.2m] giống nhân trong môi trường

nước chiết giá đậu

Địch muối chua ——————Ừp Nấm + địch muối chua

Lên men

Sản phẩm

Giống vi khuẩn lactc được bổ sung 1% vào dịch muối chua từng chủng

riêng lẻ

Thực hiện mẫu đối chứng: không bổ sung vi khuẩn trong dịch muối chua

Xác định hầm lượng acid tổng tích lũy trong dịch lên men ở thời điểm 1, 2,3,6,9, 12, 15 ngày

Sơ bộ đánh giá câm quan chất lượng nấm rơm theo các thời điểm trên

Chọn 2 chủng thích hợp để phối giống (một chủng cho hàm lượng acid tổng cao

và một chủng cho chất lượng cảm quan cao) để khảo sát các bước kế tiếp

Thực hiện mỗi thí nghiệm 3 mẫu, thí nghiệm lặp lại 3 lần