Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scobolamin của cao chiết giàu alcaloid từ cây thạch tùng răng cưa (HUPERZIA SERRATA (THUNB ) TREVIS )

Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin.. K ết quả đánh giá tác dụng tăng cường

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC NGUY ỄN THỊ THÙY

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ

(HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.)

Khóa: QH.2015.Y

Hà N ội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện:

NGUY ỄN THỊ THÙY

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ

(HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.)

KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2015.Y

2 ThS Bùi Sơn Nhật

Hà N ội – 2020

L ỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới hai giảng

viên hướng dẫn là ThS Đặng Kim Thu và Th.S Bùi Sơn Nhật - giảng viên Bộ môn

Dược lý và Dược lâm sàng, Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra những lời khuyên hữu ích, luôn lắng nghe, động viên và dẫn dắt tôi từng bước chân trên con đường thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Bùi Thanh Tùng và các

th ầy cô thuộc bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia

Hà Nội đã chia sẻ những bài học kinh nghiệm quý báu, nhiệt tình giúp đỡ và động

viên tôi

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới DS Nguyễn Thị Thu Hoài – Học viên

cao học khóa 22, đại học Dược Hà Nội đã cùng ở bên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới các th ầy cô của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, quan tâm và truyền

dạy cho tôi những kiến thức quí báu trong suốt 5 năm học tập tại khoa cũng như tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được thực hiện trọn vẹn đề tài này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và sát cánh bên tôi vượt qua những khó khăn trong quãng thời gian còn

ngồi trên ghế nhà trường

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Thùy

DANH M ỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

A Độ hấp thụ (Absorbance)

A Amyloid beta

ACh Acetylcholin

AChE Enzym Acetylcholinesterase

ACTI Acetylthiocholin iodid

APP Protein tiền thân amyloid (Amyloid Precursor Protein)

DL-30 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cân nặng DL-60 Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 60 mg/kg cân nặng FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug

Administration)

HFD Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet)

Hup A Huperzin A

IC50 Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)

IU Đơn vị quốc tế (International Unit)

MDA Malondialdehyd

NMDA Thụ thể N-methyl-D-aspartat

LD50 Liều dùng gây chết 50% số động vật thử nghiệm

OBX Chuột mất vùng khứu giác (Olfactory bulbectomized)

SAM Chuột tăng tốc lão hóa

SAMP Chuột tăng tốc lão hóa nhạy cảm

SE Sai số chuẩn (Standard errror)

UV-Vis Quang phổ tử ngoại khả kiến

DANH M ỤC CÁC BẢNG

B ảng 1.2.1 Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa 8

B ảng 2.4.1 Thành phần của hỗn hợp phản ứng 28

Bảng 3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết

giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn donepezil 29

B ảng 3.1.2 Giá trị IC50 của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn quercetin 30

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.2.1 Cấu trúc hóa học của Hup A 8

Hình 2.1.1 Cây Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis 17

Hình 2.1.2 Phương pháp chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm 18

Hình 2.3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 20

Hình 2.4.1 Phản ứng giữa các chất trong hỗn hợp phản ứng Ellman 21

Hình 2.4.2 Sơ đồ triển khai mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo 24

Hình 3.2.1 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến tỷ lệ chuyển tiếp giữa các cánh 31

Hình 3.2.2 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến thời gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập có bến đỗ 32

Hình 3.2.3 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tới thời gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ ở bài tập không có bến đỗ 34

Hình 3.2.4 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt

độ AChE trên thể đồng nhất não chuột 35

Hình 3.2.5 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não 36

M ỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH M ỤC CÁC BẢNG

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

M ỤC LỤC

M Ở ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 T ổng quan về bệnh 3

1.1.1 Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ 3

1.1.2 Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh 4

1.1.3 Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ 6

1.2 T ổng quan về cây Thạch tùng răng cưa 7

1.2.1 Đặc điểm thực vật 7

1.2.2 Phân bố 7

1.2.3 Thành phần hóa học 7

1.2.4 Tác dụng dược lý 9

1.2.5 Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng răng cưa 9

1.3 M ột số mô hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ 11

1.3.1 Các mô hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm 11

1.3.2 Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo 13 1.3.3 Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE 14

1.3.4 Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa 15

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 17

2.1.2 Mẫu nghiên cứu 17

2.2 Phương tiện nghiên cứu 18

2.2.1 Động vật thí nghiệm 18

1.2.2 Hóa chất, dung môi 18

1.2.3 Thiết bị, dụng cụ 19

2.3 N ội dung nghiên cứu 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa in vitro 20

2.4.2 Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin 23

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương 3 – KẾT QUẢ 29 3.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa 29

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro 293.1.2 Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro 30

3.2 K ết quả đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid

t ừ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin 31

3.2.1 Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê

lộ Y 313.2.2 Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thông qua thử nghiệm mê

lộ nước Morris 323.2.3 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ AChE trong não 343.2.4 Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não 36

Chương 4 – BÀN LUẬN 38 4.1 Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AchE và chống oxy hóa in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa 38

4.1.1 Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro 38

4.1.2 Về kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro 39

4.2 V ề kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nh ớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa 40

4.2.1 Về kết quả của thử nghiệm hành vi 404.2.2 Về kết quả định lượng các marker sinh học 42

Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45 TÀI LI ỆU THAM KHẢO

PH Ụ LỤC

M Ở ĐẦU

Xã hội ngày càng phát triển, những áp lực của cuộc sống cũng ngày càng tăng cao Con người bị ảnh hưởng bởi môi trường và xuất hiện những vấn đề về sức khỏe Ngoài những nhóm bệnh phổ biến như bệnh tim mạch và ung thư, sa sút trí nhớ cũng

là một bệnh lý mà nhiều người mắc phải

Sa sút trí nhớ là một nhóm các rối loạn đặc trưng bởi sự suy giảm trí nhớ và nhận thức, có ảnh hưởng đến các hoạt động sống hàng ngày và hoạt động xã hội của người bệnh Trên thế giới, số lượng người mắc sa sút trí nhớ ngày càng tăng cao với khoảng 50 triệu người mắc và có gần 10 triệu ca mắc mới mỗi năm [47] Sa sút trí nhớ là căn bệnh có tác động rất lớn đến nền kinh tế Chi phí dành cho chăm sóc và điều trị cho bệnh nhân sa sút trí nhớ hàng năm trên thế giới ước tính khoảng 800 tỷ USD (tương đương 1% GDP toàn cầu) và sẽ đạt tới 2000 tỷ USD vào năm 2030 [47]

Sa sút trí nhớ là bệnh lý phổ biến thường gặp ở người cao tuổi Bệnh diễn biến

từ từ tăng dần, suy giảm dần khả năng nhận thức, trí tuệ, dẫn đến mất dần khả năng sinh hoạt độc lập và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm trùng, tiết niệu Mặc dù sa sút trí nhớ có tác động rất lớn đến sức khỏe người cao tuổi và đang có xu hướng ngày càng gia tăng nhưng việc điều trị lại gặp nhiều khó khăn do hiểu biết về bệnh còn hạn chế và việc lựa chọn thuốc điều trị bị giới hạn Những thuốc dùng điều trị sa sút trí nhớ gồm 2 nhóm thuốc ức chế cholinesterase và thuốc đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartat (NMDA) Các thuốc kể trên cho thấy tác dụng kiểm soát triệu chứng tốt nhưng không làm thay đổi diễn tiến bệnh Ngoài ra, giá thành tương đối cao và các tác dụng phụ không mong muốn là nhược điểm của các thuốc này Do đó, việc tiếp tục nghiên cứu tìm ra loại thuốc hiệu quả và an toàn hơn trong điều trị sa sút trí nhớ và Alzheimer là rất cần thiết

Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) là một dược liệu đã được dùng để điều trị bệnh sa sút trí nhớ tại Trung Quốc Trong dược liệu, Huperzin

A (Hup A) là hợp chất alcaloid nổi bật có tác dụng cải thiện trí nhớ [50,61] Tuy nhiên, ở nước ta mới chỉ có một số nghiên cứu dược lý về cao chiết cồn của Thạch tùng răng cưa trong khi chưa có nghiên cứu nào thực hiện trên đối tượng nghiên cứu

là cao chiết alcaloid Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa theo

2 mục tiêu sau:

1 Đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE và khả năng dọn gốc tự do

DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

2 Đánh giá được tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

C hương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh

1.1.1 Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ

Bệnh sa sút trí nhớ được định nghĩa bởi Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm

1992 như sau: Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh của não, có tính chất mạn tính

và tiến triển, có sự xáo trộn nhiều chức năng của não liên quan đến trí nhớ, suy nghĩ, định hướng, học tập, ngôn ngữ và phán đoán Song, ý thức không bị suy giảm Sự suy giảm trong kiểm soát cảm xúc, hành vi xã hội hoặc động lực thường đi kèm, đôi khi xuất hiện trước sự suy giảm chức năng nhận thức Hội chứng xảy ra trong bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não và trong các điều kiện nguyên phát hoặc thứ phát khác ảnh hưởng đến não [66]

Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh lý phổ biến ở người cao tuổi Mặc dù

bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến người già nhưng không phải là một phần bình thường của quá trình lão hóa Đa số các bệnh nhân rối loạn chức năng nhận thức đều do tổn thương không hồi phục các neuron thần kinh hai bên bán cầu (đặc biệt ở vùng vỏ não phối hợp) và/hoặc các cấu trúc dưới vỏ Bệnh diễn biến từ từ tăng dần, suy giảm dần khả năng nhận thức, trí tuệ, cuối cùng mất hết khả năng sinh hoạt độc lập, phải

lệ thuộc hoàn toàn vào người khác và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm trùng, tiết niệu [1]

Theo báo cáo của hiệp hội Alzhiemer năm 2018, trên thế giới có khoảng 50 triệu người mắc sa sút trí nhớ (chiếm khoảng 5% tổng số người trên 60 tuổi của thế giới) Ước tính cứ mỗi 3 giây sẽ có thêm 1 người mắc sa sút trí nhớ và số người mắc bệnh dự kiến tăng lên đến 152 triệu người vào năm 2050 [47] Trong đó, số ca mắc mới ở châu Á chiếm gần 50% số ca trên thế giới và tập trung chủ yếu ở các nước thu

thập thấp – trung bình Nguy cơ mắc sa sút trí nhớ tăng theo tuổi Tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ của một người tăng gấp đôi sau mỗi 6,3 năm [49]

Việt Nam có xu hướng già hóa dân số nhanh Số người cao tuổi (trên 65 tuổi) chiếm hơn 10% tổng dân số [10] Tuy nhiên, số người mắc sa sút trí nhớ trong nước chưa được đánh giá trên nghiên cứu quy mô lớn Một số nghiên cứu được thực hiện với quy mô nhỏ tại địa phương từ năm 2009 – 2015 ước tính tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ chiếm khoảng 4,5 – 5% tổng số người cao tuổi (trên 60 tuổi) [4,9,12]

 Giả thuyết về cholinergic

Trong não, các tế bào thần kinh hệ cholinergic có mặt nhiều ở vùng vỏ não

và đồi hải mãi, chịu trách nghiệm về trí nhớ và học tập Acetylcholin là chất dẫn truyền thần kinh quan trọng của hệ cholinergic, có vai trò hoạt hóa thụ thể nicotinic

và muscarinic Giả thuyết cholinergic là giả thuyết được đưa ra bởi hai nhà khoa học Davies và Maloney vào năm 1976 [22] Giả thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh Alzheimer có thể do giảm số lượng acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền thần kinh Giả thuyết là cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển thuốc hướng tăng cường hoạt động của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin

 Giả thuyết về amyloid  (A) và protein tau

Hardy John và cộng sự đã đưa ra giả thuyết về A để giải thích cho cơ chế

bệnh Alzheimer năm 1991 [31] Những A là kết quả của quá trình biến đổi bất thường của APP – một protein xuyên màng chưa rõ chức năng cụ thể APP là protein nằm trong màng, được phân cắt bởi 3 loại enzym -, - và -secretase Một trong những sản phẩm của quá trình phân cắt APP là một loại protein không tan tự kết tụ (A40 và A42 ) từ đoạn cắt -- Dưới tác động của Apolipoprotein E (APOE) - protein vận chuyển giúp phân bố cholesterol trong mô não, những peptid này kết tụ

với nhau hình thành các mảng amyloid Những mảng amyloid gây suy giảm trí nhớ

và nhận thức nhờ can thiệp vào sự giao tiếp của các nơ-ron tại synap Các A kích

thích quá trình phosphoryl hóa protein tau và phát triển các đám rối tơ thần kinh NFT

Protein Tau là thành phần quan trọng của tế bào thần kinh có vai trò cố định

và ổn định cấu trúc của vi ống ở sợi trục Trong Alzheimer, protein tau bị phosphoryl hóa, tách ra và tích lũy thành các đám rối tơ thần kinh NFT, ngăn sự di chuyển của dưỡng chất và các phân tử thiết yếu bên trong tế bào, gây chết tế bào thần kinh Sự tích lũy A góp phần khởi động quá trình phosphoryl hóa protein tau Ngược lại, một nghiên cứu khác cho thấy protein tau độc có thể tăng cường sản xuất A [33]

Sự hiện diện của A và tau độc kích hoạt các tế bào miễn dịch ở não (tế bào thần kinh đệm) Các tế bào này có nhiệm vụ loại bỏ các protein độc, song cũng làm chết

tế bào thần kinh Viêm mạn tính được cho là xảy ra khi các tế bào thần kinh đệm không còn đảm nhận được nhiệm vụ của chúng Khi viêm xảy ra, các yếu tố miễn dịch được kích hoạt kéo theo sự hình thành các gốc tự do phá hủy màng tế bào Teo não là kết quả do chết các tế bào thần kinh Ngoài ra, A và tau độc cũng làm giảm khả năng sử dụng glucose ở não gây suy yếu các chức năng bình thường [15]

 Giả thuyết về Glutamat

Glutamat là chất dẫn truyền thần kinh kích thích nhanh ở não đóng vai trò quan trọng trong học tập, trí nhớ và vận động Glutamat hoạt hóa ba loại thụ thể chính là Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoazolepropionic acid (AMPA), N-methyl-D-aspartat (NMDA) và thụ thể hướng chuyển hóa Trong đó, thụ thể NMDA cho phép ion Na+ và Ca2+ đi vào tế bào Quá trình exitotoxicity xảy ra khi kích thích quá mức các thụ thể NMDA bởi glutamat hoặc các acid amin có cấu trúc tương tự, làm nồng độ các ion Ca2+ trong tế bào tăng cao, gây tổn thương và chết tế bào [24]

1.1.2.2 Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu

Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu là thể bệnh phổ biến đứng thứ hai sau bệnh Alzheimer, chiếm 10 – 20% các trường hợp mắc bệnh Sa sút trí nhớ do nguyên nhân mạch máu làm giảm lượng máu tới não, gây tổn thương tế bào thần kinh và ít hồi phục Biểu hiện của bệnh thường đột ngột, nhanh (nếu bị tai biến mạch máu mới) hoặc tiến triển theo từng nấc (trong trường hợp tái phát tai biến nhiều lần) [57]

1.1.2.3 Các thể sa sút trí nhớ khác

Sa sút trí nhớ còn do các nguyên nhân hiếm gặp khác gây ra, có thể kể đến như sa sút trí nhớ thể Lewy, sa sút trí nhớ thể thái dương, sa sút trí nhớ trong bệnh Parkinson, Huntington, Creutzfeldt-Jakob (CJD), sa sút trí nhớ trong bệnh suy giảm

miễn dịch ở người (ví dụ HIV), các bệnh chuyển hóa và nội tiết (ví dụ suy giáp, lupus ban đỏ hệ thống, tăng calci huyết, thiếu vitamin B12) [66]

1.1.3 Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ

Hiện nay chưa có thuốc nào có thể làm chậm hoặc dừng quá trình diễn tiến của bệnh sa sút trí nhớ Tổ chức FDA đã chấp nhận 6 thuốc trong điều trị sa sút trí nhớ bao gồm: tacrin, rivastigmin, galantamin, donepezil, memantin và memantin phối hợp donepezil [15]

1.1.3.1 Nhóm thuốc ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE)

Giả thuyết cholinergic được lấy làm trung tâm để phát triển các thuốc Giả thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh Alzheimer có thể do giảm số lượng acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền thần kinh [17] Nhóm thuốc có tác dụng ức chế AChE có phục hồi, tăng thời gian tồn tại các chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin từ đó cải thiện trí nhớ và nhận

thức

Nhóm ức chế AChE gồm 4 thuốc đã được tổ chức FDA cấp phép sử dụng (Tacrin, Donepezil, Rivastigmin và Galantamin) Tacrin ức chế không cạnh tranh với enzym acetylcholinesterase nhưng gây độc cho gan nên hiện nay hiếm khi được

sử dụng [64] Các thuốc thế hệ sau (Donepezil, Rivastigmin và Galantamin) được sử dụng để thay thế cho Tacrin Ngoài khả năng ức chế AChE, Rivastigmin có thể ức

chế cả BuChE, trong khi galantamin có tác dụng trong việc điều biến các thụ thể nicotinic Cả hai được sử dụng để điều trị Alzheimer mức độ nhẹ - trung bình Donepezil chỉ ức chế chọn lọc AChE nên ít có độc tính ngoại biên hơn, được sử dụng

để điều trị trong cả trường hợp nặng Các tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hóa (mệt mỏi, buồn nôn và tiêu chảy), hệ thần kinh (lo lắng, khó chịu) và hệ tim mạch (nhịp tim chậm) [41]

1.1.3.2 Nhóm thuốc ức chế thụ thể NMDA

Thuốc duy nhất trong nhóm này được tổ chức FDA phê duyệt là Memantin Memantin là chất ức chế thụ thể NMDA không cạnh tranh, có tác dụng bảo vệ thần kinh, ngăn cản việc mất tế bào thần kinh Memantin dung nạp tốt hơn vào cơ thể [40] Tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hóa (buồn nôn, tiêu chảy hoặc táo bón)

và hệ thần kinh (lú lẫn và hưng phấn) [41] Memantin phối hợp donepezil cho thấy

sự cải thiện lớn về chức năng nhận thức và ghi nhớ ở bệnh nhân sa sút trí nhớ [20]

Ngoài ra, người ta còn sử dụng các chất chống oxy hóa như vitamin E, vitamin

C, các dược liệu (bạch quả, đinh lăng, ), thuốc giảm đau không steroid để hỗ trợ điều trị sa sút trí nhớ

1.2 Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis

hay còn được biết đến là Lycopodium serratum thuộc họ Thông đất (Lycopodiaceae)

Tên khác là Thạch tùng răng hoặc Chân sói

Mô tả

Cây thân thảo, thường mọc thành đám nhỏ trên đất hay trên gốc cây có nhiều rêu trong rừng rậm thường xanh, trên đất ẩm có tầng dày và nhiều mùn, ở độ cao 300 – 1800m

Thân đứng cao 15 – 40 cm, đơn hay lưỡng thân 1 – 2 lần, đường kính khoảng

2 mm, hình trụ Lá hình bầu dục – mũi mác, dài 15mm, rộng 3mm, tương đối mỏng, gân giữa rõ, mép có răng Túi bao tử ở nách nhánh lá giống lá thường; túi bào tử hình thận, màu vàng tươi [5,8,11]

Trong đó, Huperzin A (Hup A) được coi là thành phẩn hóa học nổi bật được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất Theo tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự (2015), hàm lượng Hup A trong lá Thạch tùng răng cưa ở Đà Lạt vào mùa thu và mùa xuân lần lượt là 75,4 và 92,5 (g.g-1 mẫu khô) [13] Theo tác giả Takuya Ohba và cộng sự

(2015), Hup A là alcaloid chính trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa với hàm lượng đạt 0,5  0,003% [45]

Ngoài ra, Thạch tùng răng cưa còn chứa saponin, glycosid, flavonoid, tanin, đường khử, acid amin, polysaccharid, steroid và carotenoid [5]

B ảng 1.2.1 Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa

4α,6α-O, 12-deoxyhuperzin 4α,6α-O, Lycodolin, 12-epilycodolin N-oxid, 4α,6α-dihydroxylycopodin, 6α-hydroxylycopodin, 7-hydroxylycopodin, lycoposseramin G, lycoposseramin L, lycoposseramin M, lycoposseramin N, Serratezomin C, Lucidiolin, lycoposerramin F lycoposerramin H lycoposerramin

2α,11α-Hình 1.2.1 C ấu trúc hóa học của Hup A

Neohuperzinin, Serratanidin, Serratezomin B, Serratinin, Serratin, 8-deoxyserratinin, 8-deoxy-13-dehydroserratinin,

Huperserratinin

Nhóm các

alcaloid

khác

Huperzin J, Huperzin K, Huperzin L, Huperzin V, Huperzinin B,

Phlegmariurin N, Serratanin A, Serratanin B

Các tác dụng khác của loài cây này như kháng khuẩn [39] và chữa lành vết thương [18] cũng đã được chứng minh Bên cạnh đó, tác dụng chống nhược cơ, giải độc organophosphat cũng được ghi nhận ở Hup A [28,38]

1.2.5 Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng

răng cưa

1.2.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Ở Nhật Bản, tác giả Takuya Ohba và cộng sự đã xác định hàm lượng Hup A trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa là 0,5  0,003% Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế chọn lọc AChE với IC50 là 5,96 µg/ml và không ức chế BuChE ở cùng dải nồng độ ức chế AChE Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở chuột nhắt trắng thông qua các thử nghiệm hành vi (thử nghiệm mê lộ chữ Y và mê lộ nước Morris) [45]

Hup A là hợp chất được phân lập từ cao chiết của Thạch tùng răng cưa lần đầu tiên vào năm 1986 bởi tác giả Liu JS và cộng sự [37] Năm 1996, Cheng Dong Hang và cộng sự cho thấy Hup A là một chất ức chế chọn lọc AChE theo cơ chế đảo

ngược với IC50 là 82 nM và tỷ lệ ức chế BuChE/AChE là 884,57 Đồng thời, dùng Hup A liều 0,1 – 0,4 mg/kg giúp cải thiện trí nhớ của chuột gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin [21] Năm 2011, trong thử nghiệm lâm sàng pha 2, Hup A liều 400 g thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở bệnh nhân mắc sa sút trí nhớ mức độ nhẹ đến trung bình [50]

1.2.5.2 Các tác dụng lý được báo cáo tại Việt Nam

Năm 2013, tác giả Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự báo cáo kết quả đánh giá tác dụng của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa trên mô hình gây sa sút trí nhớ

ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin Kết quả cho thấy cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa liều 0,533 g/kg có tác dụng tăng cường trí nhớ trên chuột gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin và LD50 của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa là 5,33g/kg [3]

Năm 2016, tác giả Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự đã chứng minh cao chiết cồn và các phân đoạn của cao chiết cồn từ lá và thân của Thạch tùng răng cưa thu hái tại Sapa, Lào Cai có tác dụng ức chế AChE in vitro Phân đoạn dịch chiết EtOAc cho thấy hoạt tính ức chế AChE mạnh nhất với IC50 = 89,96 ± 3,42 µg/ml [6]

Cũng năm 2016, tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự đã đánh giá sự có mặt của Hup A trong mẫu cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào mùa Xuân và mùa Thu bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao Kết quả cho thấy, hàm lượng Hup A trong 2 mẫu lần lượt là 0,0925 mg/g mẫu khô (mẫu mùa Thu) và 0,0171 mg/g mẫu khô (mẫu mùa Xuân) Hàm lượng Hup A được nhận định có sự thay đổi giữa các thời điểm trong năm, với hàm lượng cao nhất vào giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [13]

Tại Việt Nam có rất ít tài liệu nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa và chưa có nghiên cứu trên đối tượng cao chiết giàu alcaloid từ loài cây này Vì vậy, trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa của Việt Nam để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin

1.3 Một số mô hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ

1.3.1 Các mô hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm

1.3.1.1 Mô hình gây sa sút trí nhớ tự phát

 Mô hình lão hóa tự nhiên

Suy giảm trí nhớ là đặc trưng đầu tiên và phổ biến của tuổi già Vì vậy, những động vật già có tiềm năng được dùng như những mô hình tự phát gây suy giảm trí nhớ Chuột là động vật thường được sử dụng trong các nghiên cứu do chi phí thấp,

sẵn có, dễ thao tác và hành vi đặc trưng Do không gây xâm lấn và không chịu tác động của chất hóa học thần kinh nên những mô hình này được coi là công cụ hữu ích để phản ánh sinh lý bệnh tự nhiên của bệnh Alzheimer

 Mô hình tăng tốc độ lão hóa

Chuột tăng tốc độ lão hóa (SAM) là một mô hình lão hóa cấp tốc được hình thành thông qua việc lựa chọn kiểu hình từ chủng chuột AKP/J, bao gồm 9 chủng tăng tốc độ lão hóa nhạy cảm (SAMP) và 3 chủng tăng tốc độ lão hóa đề kháng (SAMR) Trong đó, chủng SAMP8 là mô hình gây sa sút trí nhớ đáng tin cậy cho thấy sự suy giảm khả năng học tập và trí nhớ liên quan đến lão hóa [59]

1.3.1.2 Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng tác nhân hóa học

 Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin

Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin là một trong những mô hình động

vật được sử dụng nhiều nhất do quy trình đơn giản và khả năng sống sót cao Scopolamin là một chất đối vận muscarinic có cấu trúc tương tự chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin Do có ái lực cao, scopolamin gắn với các thụ thể muscarinic và ngăn không cho acetylcholin gắn vào Kết quả, nồng độ những chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin tự do tăng quá mức gây tổn thương các dây thần kinh dẫn đến suy giảm khả năng học tập và trí nhớ [65]

 Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng streptozotocin

Streptozotocin gây tổn hại tế bào thần kinh thông qua stress oxy hóa, tăng tích lũy các A trong não, kích thích sự phosphoryl hóa protein tau Chuột tiêm streptozotocin liều 3 mg/kg, 2 lần trong 48 giờ được báo cáo gây ra suy giảm trí nhớ giống bệnh Alzheimer [52] Hạn chế của mô hình này là tỷ lệ tử vong cao, yêu cầu

số lượng động vật thử nghiệm lớn

 Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng Trimethyltin (TMT) clorid

TMT là một chất độc thần kinh mạnh, gây chết các tế bào thần kinh ở vùng đồi thị của động vật TMT gây mất tế bào thần kinh, suy giảm trí nhớ, co giật ở chuột nhờ gây được stress oxy hóa, kích thích các yếu tố tiền viêm [16] Tuy nhiên, hiệu quả của TMT có khác biệt giữa các loài và tùy từng nhóm sản xuất [43]

Ngoài ra, các tác nhân như L-methiomin, Colchicin, acid Okadaic, Benzodiazepin, các kim loại nặng (Fe, Cu, Cr, Co, ) cũng được sử dụng để gây sa sút trí nhớ trên động vật thí nghiệm [43]

1.3.1.3 Mô hình gây tổn thương não

Mô hình gây sa sút trí nhớ trên chuột mất vùng khứu giác cũng là một trong những mô hình được sử dụng nhiều để gây sa sút trí nhớ ở động vật thí nghiệm Chuột được tiến hành phá hủy vùng khứu giác và cầm máu bằng miếng bọt cầm máu gelatin Các nghiên cứu chỉ ra rằng chức năng học tập và ghi nhớ đã suy giảm đáng

kể sau khi cắt bỏ vùng khứu giác của chuột, làm giảm sự tăng sinh tế bào trong đồi hải mã và cholin acetyltransferase (ChAT) ở võ não và đồi hải mã [32,42]

1.3.1.4 Mô hình sử dụng động vật chuyển gen

Động vật được biến đổi gen để biểu hiện các protein tiền chất amyloid (APP) tạo thành các đám rối A và gây sa sút trí nhớ Các mô hình thường sử dụng như chuột Tg2576, chuột APP23, JNLP3, ApoE… Ngoài ra còn có các mô hình chuyển gen khác bằng cách gây đột biến trong presenilin, đột biến -symelein, mô hình chuột biểu hiện quá mức eyelooxygenase-2, đột biến yếu tố chống tăng trưởng thần kinh (NGF) [55]

1.3.1.5 Mô hình gây sa sút trí nhớ do não thiếu oxy

Tình trạng thiếu oxy (hypoxia), tăng natri máu và thiếu máu cục bộ được báo cáo làm giảm lượng máu cung cấp cho não và gây giảm trí nhớ ở loài gặm nhấm Có thể gây thiếu oxy bằng cách cho chuột phơi nhiễm với khí CO2 tinh khiết, CO NaNO2 cũng được dùng để gây suy giảm khả năng học tâp và ghi nhớ nhờ làm giảm khả năng mang oxy Ngoài ra, người ta sử dụng mô hình gây sa sút trí nhớ do thiếu máu não cục bộ bằng cách thắt động mạch cảnh đồng thời chích máu đuôi chuột gây

hạ huyết áp [55]

1.3.1.6 Mô hình gây sa sút trí nhớ bằng chế ăn giàu chất béo (HFD)

Trong mô hình này, chuột được cho ăn chế độ ăn giàu chất béo (30-60% chất béo) trong 2-4 tháng HFD làm tăng nồng độ cholesterol trong não Vì cholesterol ảnh hưởng đến việc thanh thải và lắng đọng A nên việc tăng nồng độ cholesterol trong não thúc đẩy sự lắng đọng của peptit này và hình thành mảng bám A ở ngoài

tế bào thần kinh HFD gây ra sự lắng đọng của peptid A, tăng các phản ứng viêm, giảm tế bào thần kinh và tăng tốc độ suy giảm nhận thức thông qua căng thẳng oxy hóa và đẩy nhanh quá trình apoptosis thần kinh [51] Mô hình có một hạn chế là quá trình xây dựng mô hình tốn nhiều thời gian

1.3.2 Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo

 Thử nghiệm nhận diện đồ vật (ORT)

Test nhận diện đồ vật ORT được thực hiện theo phương pháp của Yamada và cộng sự (2011) để đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ ngắn hạn không liên quan đến

vị trí không gian của chuột [67] Chuột có xu hướng khám phá vật thể lạ lâu hơn để thu thập thông tin mới của môi trường, qua đó đảm bảo sự an toàn cho bản thân động vật Đánh giá thời gian chuột khám phá vật thể lạ so với thời gian khám phá vật thể

cũ cho biết khả năng nhớ của chuột Chuột được coi là cải thiện trí nhớ nếu thời gian khám phá vật thể mới của chuột lâu hơn so với thời gian khảm phá vật thể cũ

 Thử nghiệm mê lộ chữ Y

Thử nghiệm mê lộ chữ Y được thực hiện nhằm đánh giá trí nhớ không gian ngắn hạn của chuột Thử nghiệm này được tiến hành dựa vào hành vi thích khám phá của động vật gặm nhấm Hành vi này giúp chúng thu thập thông tin về môi trường mới, từ đó đảm bảo an toàn cho bản thân Trong thử nghiệm mê lộ chữ Y, chuột có xu hướng tìm đến cánh mà chúng chưa khám phá (hay có xu hướng khám phá lần lượng ba cánh tay liên tiếp) Chuột có trí nhớ tốt sẽ di chuyển thay đổi luân phiên giữa các cánh và ngược lại [36]

 Thử nghiệm mê lộ nước Morris (Morris Water Maze – MWM)

Test mê lộ nước Morris để đánh giá khả năng học tập và trí nhớ không gian của chuột, dựa vào bản năng sinh tồn và khả năng nhớ vị trí không gian của chuột, khi cho vào nước chuột sẽ bơi để tìm bến đỗ và nhớ vị trí của bến đỗ ở các lần tiếp theo Thử nghiệm dựa vào bản năng sinh tồn của động vật sống trên cạn: khi chuột

bị đưa vào môi trường nước, chúng sẽ cố gắng bơi để tìm cách trốn thoát nhằm đảm bảo an toàn cho bản thân Đánh giá kết quả dựa trên các thông số: thời gian tìm thấy bến đỗ, quãng đường tìm thấy bến đỗ, vận tốc bơi trung bình, thời gian lưu lại góc

có bến đỗ [60]

 Thử nghiệm né tránh thụ động

Test né tránh thụ động được sử dụng để đánh giá trí nhớ dài hạn của động vật thử nghiệm, dựa trên sự mâu thuẫn giữa bản năng sợ hãi vùng không gian mở, có ánh sáng của các loài gặm nhấm với phản xạ trốn tránh có điều kiện vùng không gian nguy hiểm đã được nhận diện trước đó Dựa trên đặc điểm sinh học này, người ta thiết kế buồng tối (khu vực ưa thích của chuột) trở thành vị trí nguy hiểm (bị điện giật), trong khi buồng sáng lại là vị trí an toàn (không bị điện giật) [34] Trong thử nghiệm, chuột được đưa vào buồng sáng, nếu chuột đi vào buồng tối sẽ bị điện giật Sau một số lần tập luyện, chuột sẽ hạn chế vào buồng tối Đánh giá kết quả dựa trên thông số thời gian từ khi cho chuột vào buồng sáng đến khi chuột sang buồng tối Ngoài ra, còn có một số thử nghiệm hành vi khác như thử nghiệm sợ hãi có điều kiện, thử nghiệm vận động tự nhiên, bài tập tìm thức ăn trong mê lộ, mê lộ hình chữ thập, vận động trong rotarod…

1.3.3 Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE

Acetylcholin là một chất dẫn truyền thần kinh thuộc hệ cholinergic, được tổng

hợp từ Ac-coenzym A và cholin dưới tác dụng của acetyltransferase Sau khi được giải phóng, acetylcholin tồn tại ở mô trong vài giây, sau đó bị AChE ở mô liên kết tại chỗ phân giải thành ion acetat và cholin AChE giữ vai trò quan trọng trong kiểm soát biểu hiện của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin

 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Phương pháp đánh giá hoạt tính của AChE dựa trên nguyên tắc: cơ chất ATCI

bị thủy phân nhờ sự xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin Thiocholin phản ứng với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic màu vàng Hợp chất này có độ hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 412 nm Lượng hợp chất này được tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được áp dụng phổ biến trong đánh giá hoạt độ của enzym do có ưu điểm là hợp chất được tạo thành có độ bền cao, độ nhạy và đơn giản của phương pháp [25]

 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

Phương pháp đánh giá hoạt tính của AChE sử dụng thuốc thử muối Fast Blue

B được công bố sau phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman nhưng ít được sử dụng hơn Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất -naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym esterase giải phóng chất -naphthol Chất này phản ứng với thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm mà diazo Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm [29]

1.3.4 Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa

1.3.4.1 Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro

 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH

Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH là phương pháp được

sử dụng nhiều nhất để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một hợp chất hoặc hồn hợp các chất Nguyên tắc của phản ứng là dựa vào phản ứng giữ các gốc tự do DPPH với chất chống oxy hóa tạo thành sản phẩm có màu vàng không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm Phương pháp có nhiều ưu điểm như đơn giản, ít tốn kém, độ nhạy cao và phạm vi ứng dụng lớn [14]

 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do ABTS +

Khả năng dọn gốc tự do được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS+ (2,2-azino-bis(2-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonic acid)) ABTS+ phản ứng với chất chống oxy hóa tạo thành sản phẩm không màu, làm dung dịch mất màu xanh Độ hấp thụ quang được đo ở bước sóng 750 nm và được tính toán dựa vào đường chuẩn của chất chuẩn Trolox [48]

Ngoài ra, còn nhiều phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro khác được áp dụng trên thế giới như phương pháp dọn gốc tự do HO, nitric oxid, peroxynitrit, superoxid,

1.3.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vivo

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều phương pháp được đưa ra để đánh giá khả năng chống oxy hóa trong mô hình thực nghiệm như phương pháp đánh giá khả năng làm giảm sắt trong huyết tương, phương pháp đánh giá khả năng làm giảm glutathion, Trong đó, phương pháp định lượng hàm lượng peroxid hóa lipid màng

tế bào được sử dụng nhiều nhất do đơn giản và tiết kiệm chi phí Khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid của các chất được đánh giá thông qua việc xác định hàm

lượng malonyldialdehyde (MDA) - sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng tế bào

 Định lượng MDA theo phương pháp của Wojciech Wasowicz

Phương pháp định lượng MDA theo Wojciech Wasowicz dựa trên phản ứng của malondialdehyd (MDA) với acid thiobarbituric (TBA) trong môi trường acid, tạo ra hợp chất trimethin màu hồng có cực đại hấp thụ tại 532nm Do đó, có thể định lượng MDA thông qua mật độ quang của phức hợp tạo thành Sử dụng 1,1,3,3-tetramethoxypropan (TMP) để xây dựng đường chuẩn [63]

 Định lượng MDA theo phương pháp của Gérard-Monnier

Phương pháp định lượng MDA theo Gérard-Monnier dựa trên phản ứng của malonaldehyd (MDA) với 2 phân tử 1-methyl-2-phenylindol ở 450C Sản phẩm tạo thành có cực đại hấp thụ ở bước sóng 586 nm [27] Do đó, có thể định lượng MDA thông qua đo độ hấp thụ quang của phức hợp tạo thành Sử dụng 1,1,3,3-tetramethoxypropan (TMP) để xây dựng đường chuẩn

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu

Thạch tùng răng cưa được thu hái vào

tháng 9 năm 2019 tại Đà Lạt, Lâm Đồng Mẫu

cây được giám định thực vật học bởi Khoa Tài

nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Theo kết

quả giám định, mẫu Thạch tùng răng cưa thu

hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng có tên khoa học là

Huperzia serrata (Thunb.) Trevis (Phụ lục

01) Mẫu tiêu bản số 7104, 8575,

TB-8919 được lưu trữ tại Phòng tiêu bản của Khoa

tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Mẫu

nghiên cứu sau đó được chiết theo phương

pháp chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ

trong môi trường kiềm để thu cao chiết giàu

alcaloid từ Thạch tùng răng cưa

2.1.2 Mẫu nghiên cứu

 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Dược liệu sau khi thu mua được làm sạch, sấy khô và tán thành bột thô Cân bột dược liệu vào cốc, làm ẩm bằng amoniac đậm đặc Thêm dung môi Cloroform, siêu âm, lọc, thu được dịch chiết cloroform Dịch chiết sau đó được làm bay hơi một phần để thu hồi dung môi dùng cho lần chiết tiếp theo Tinh sạch chất bằng cách chiết với dung dịch axit sulfuric 2% và dung dịch cloroform Cô quay thu hồi dung môi đến khi thu được cắn Quy trình chiết được trình bày ở Hình 2.1.2 Cao khô định chuẩn đạt độ ẩm 3,96% và tỷ lệ cao chiết: dược liệu là 0,23% Hàm lượng Hup A trong cao khô được định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPLC cho kết quả 9,7% [7]

Hình 2.1.1 Cây Thạch tùng

răng cưa Huperzia serrata

(Thunb.) Trevis

Hình 2.1.2 Phương pháp chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ

trong môi trường kiềm

2.2 Phương tiện nghiên cứu

do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp, nước sạch được cho uống tự do

1.2.2 Hóa chất, dung môi

- Enzym acetylcholinesterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore)

- Acetylthiocholine iodide (ATCI) (Sigma, Singapore)

- 5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore)

- Acid ascorbic 99% (Sigma, Singapore)

- Donepezil 5 mg biệt dược Alzepil (Egis Pharma, Hungary)

- Scopolamin (Sigma, Singapore)

- Một số hóa chất phòng thí nghiệm: HCl, NaCl, NH3, NaCMC, H2SO4,

- Dung môi: Cloroform (CHCl3), MeOH, nước cất

1.2.3 Thiết bị, dụng cụ

- Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

- Máy đo quan UV Aligenttechnologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ

- Máy cô quay chân không Rovapor R-210 (Buchi-Đức)

- Máy đo pH Mettler Toledo (Thụy Sỹ)

- Giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc

- Mê lộ nước Morris

2.3 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau:

 Nội dung 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE và dọn gốc tự do in vitro

của cao chiết giàu alcaloid từ cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.)

 Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa

 Đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa

 Nội dung 2: Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ

bằng scopolamin in vivo của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa thông qua các thử nghiệm:

 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng

scopolamin in vivo thông qua các thử nghiệm:

- Thử nghiệm hành vi: thử nghiệm mê lộ chữ Y và thử nghiệm mê lộ nước Morris

- Đánh giá các marker sinh học: định lượng hoạt độ AChE và hàm lượng MDA trong mô não của chuột nhắt trắng

Nội dung nghiên cứu được sơ đồ hóa ở Hình 2.3.1 dưới đây:

Hình 2.3.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa in vitro 2.4.1.1 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro

Tác dụng ức chế enzym AChE của cao chiết giàu alcaloid từ cây Thạch tùng răng cưa được đánh giá theo phương pháp của Ellman và cộng sự (1961) [25]

Nguyên t ắc

Cơ chất acetylcholin iodid (ACTI) bị thủy phân nhờ xúc tác của enzym acetylcholinesterase tạo ra thiocholin Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) để tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitrobenzoic có màu vàng Lượng hợp chất màu được tạo thành trong một đơn vị

Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alkaloid từ Thạch tùng răng cưa

Đánh giá tác dụng ức chế AChE

và chống oxy hóa in vitro

Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin

Đánh giá tác

dụng ức chế

AChE

Đánh giá dọn gốc tự do

•- Test mê lộ chữ Y

•- Test mê lộ nước Morris

• - Định lượng AChE trong

mô não

• - Định lượng MDA trong

mô nãoCác test

hành vi sinh họcMarker

thời gian tỷ lệ thuận với hoạt tính AChE Phản ứng xảy ra được thể hiện ở Hình 2.4.1 Dựa vào xác định độ hấp thụ quang của mẫu thử ở bước sóng 412 nm để đánh giá hoạt tính của AChE

Hình 2.4.1 Ph ản ứng giữa các chất trong hỗn hợp phản ứng Ellman

Cách ti ến hành

Cao chiết Thạch tùng răng cưa và chứng dương được hoà tan trong dung dịch đệm phosphat pH = 7,5 có chứa 1% DMSO thành dung dịch gốc nồng độ 10.000 µg/ml Từ các dung dịch gốc nồng độ 10.000 µg/ml pha loãng ra thành các nồng độ thấp hơn bằng dung dịch đệm phosphat pH = 7,5 Phản ứng định lượng được thực hiện trên đĩa 96 giếng ở nhiệt độ phòng (25oC)

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 120 µl dung dịch đệm natri phosphat (pH 7,5),

20 µl dung dịch thử ở các nồng độ khác nhau và 20 µl dung dịch AChE 0,25 IU/ml Trộn đều và đem ủ trong bóng tối 15 phút tại 25oC Sau đó, thêm 20 µl DTNB 1,25

mM và 20 µl ACTI 1,25 mM, trộn đều

Động học của phản ứng được theo dõi bằng cách đo mật độ quang của các giếng tại bước sóng 412 nm với tần suất 1 phút/lần trong thời gian 10 phút Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần Donepezil được sử dụng làm chứng dương

Đánh giá kết quả

Đánh giá tác dụng ức chế AChE qua giá trị I% được tính theo công thức:

I% = ∆ODo/phút -∆ODt/phút ∆ODo/phút × 100%

Thiocholin

Thuốc thử DTNB

Cơ chất ATCI

Màu vàng

Trong đó:

ΔODo/phút: thay đổi mật độ quang mỗi phút của giếng trắng

ΔODt/phút: thay đổi mật độ quang mỗi phút của giếng có mẫu thử/chứng dương

IC50: Nồng độ ức chế 50% hoạt độ của enzym cholinesterase

2.4.1.2 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro

Nguyên t ắc

Thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Kumar [54] Hợp chất diphenyl-2-picryhydrazin (DPPH) có khả năng tạo ra gốc tự do, bền trong dung dịch MeOH bão hòa Dung dịch có màu tím đỏ, khi phản ứng với chất chống oxy hóa sẽ tạo thành phức hợp màu vàng Phức hợp này không hấp thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm

2,2-Cách ti ến hành

Dung dịch DPPH 0,1 mM: hòa tan 2,19 mg DPPH trong 50ml methanol Mẫu thử là cao chiết alcaloid của Thạch tùng răng cưa được pha trong dung môi MeOH thành các nồng độ khác nhau Chất đối chứng là quercetin pha loãng tương tự

Cho vào giếng hỗn hợp gồm: 20 µl dung dịch mẫu thử hoặc chất đối chứng

Hoạt tính quét gốc tự do DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức

chế I%, được tính theo công thức:

I% = ODtr -ODth ODtr × 100%

Trong đó:

+ I (%): phần trăm dọn gốc tự do DPPH

+ ODtr: Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch mẫu trắng

+ ODth: Độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch mẫu thử/mẫu đối chứng