Bước đầu xây dựng mô hình đánh giá hoạt tính đông cầm máu của công thức dược liệu định hướng tác dụng điều trị trĩ trên mô hình in vitro

DANH M ỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo 3 Hình 1.6 Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu 16 Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

L ỜI CẢM ƠN

Khi nhận được đề tài khóa luận này, tôi cảm thấy bản thân rất may mắn khi được học tập và nghiên cứu về lĩnh vực mà tôi yêu thích Tôi không chỉ học hỏi thêm được nhiều kiến thức mà còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy

cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin gửi cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y dược, Đại

học Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Y dược học cơ sở cùng các thầy cô giáo trong khoa đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp và giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Thơm và

TS Nguyễn Thị Vân Anh Các cô là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận Không chỉ truyền đạt kiến thức khoa học cùng những kinh nghiệm quý báu của mình, các cô còn truyền cho tôi lòng yêu nghề, nhiệt huyết và tận tâm với công việc

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Hồng Luyến và nhóm sinh viên đến từ Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình

thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ và nhân viên Khoa Huyết học, Bệnh viện Bạch Mai đã giúp đỡ, tạo điều

kiện cho tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn và tình yêu thương sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, khuyến khích, động viên và

tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận

Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Lương Phú Hưng

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

A Phần trên mặt đất (Aerial)

APTT Thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (Activated

partial thromboplastin time) Arg-Gly-Asp Arginylglycylaspartic acid

ATP Adenosine triphosphate

AUC Mức độ ngưng tập tiểu cầu (Area Under the aggregation

DEA Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation)

DMSO Dimethyl sulfoxide

LTA Phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu thông qua độ dẫn

truyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry)

MPA Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximal Platelet

Aggregation)

NTTC Ngưng tập tiểu cầu

PAR Thụ thể hoạt hóa bởi protease (Protease – activated

t-SNARE Protein liên kết màng bào tương

UTP Uridine triphosphate

vWF Yếu tố von Willebrand

v-SNARE Protein liên kết màng hạt tiểu cầu

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các nhóm tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu 26

Bảng 3.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) 29

Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) 30

Bảng 3.4 Giá trị P của sai khác giữa AUC của các nhóm 32

Bảng 3.6 Đánh giá sự phối hợp của PPADS và phân đoạn dịch chiết 39

DANH M ỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo 3

Hình 1.6 Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu 16 Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các

thuốc kháng tiểu cầu

M ỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Sinh lý học tiểu cầu 3

1.1.1 Cấu trúc tiểu cầu 3

1.1.2 Chức năng tiểu cầu 7

1.1.2.1 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu 7

1.1.2.2 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương 10

1.2. Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP 10

1.2.1 Thụ thể purinergic 10

1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP 12

1.2.2.1 Pha ngưng tập nguyên phát 12

1.2.2.2 Pha ngưng tập thứ phát 15

1.3 Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu 16

1.3.1 Nhóm ức chế Cyclooxygenase 1 (COX-1) 17

1.3.2 Nhóm ức chế thụ thể P2Y12 18

1.3.3 Nhóm ức chế thụ thể của thrombin 18

1.3.4 Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa 19

1.3.5 Nhóm ức chế phosphodiesterase 19

1.4 Tổng quan về cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr 19

1.4.1 Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng 19

1.4.2 Các nghiên cứu trước đây về Canna warszewiczii A Dietr 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng 22

2.1.2 Thu thập mẫu máu 23

2.1.3 Dụng cụ nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp pha các phân đoạn dịch chiết và hóa chất 24

2.2.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm 24

2.2.3 Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu 24

2.2.4 Phân tích và xử lý số liệu 27

2.2.5 Đạo đức nghiên cứu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 K ết quả 29

3.1.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) 29

3.1.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) 30

3.1.3 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) 31

3.1.4 Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA) 33

3.1.5 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu 33

3.2 Bàn lu ận 35

3.2.1 Thiết kế nghiên cứu 35

3.2.2 Kết quả nghiên cứu 35

3.2.3 Hạn chế của nghiên cứu 40

K ẾT LUẬN 41

KI ẾN NGHỊ 42

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 43

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bệnh lý về tim mạch hiện đang là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Phần lớn trong số đó có liên quan đến các cơn đau tim và đột quỵ Đây là những triệu chứng cấp tính gây ra bởi sự tắc nghẽn lưu thông máu đến tim

hoặc não bộ mà tác nhân chính là sự xuất hiện của huyết khối [32, 48] Những nghiên cứu về sinh lý học đã chứng minh vai trò quan trọng của tiểu cầu trong hình thành cục máu đông Nằm trong chuỗi các biến đổi xảy ra kể từ khi tiểu cầu được hoạt hóa, ngưng tập tiểu cầu, sự kết tập của các tiểu cầu tạo thành đám tiểu

cầu, được xem là tiền đề để hình thành huyết khối

Để ngăn ngừa và điều trị các bệnh lý có liên quan đến huyết khối, nhiều thuốc kháng tiểu cầu đã được nghiên cứu và ra đời Bên cạnh những lợi ích mang

lại trong điều trị, các thuốc kháng tiểu cầu cũng gây ra nhiều tác dụng không mong

muốn như làm tăng nguy cơ chảy máu hay loét dạ dày Do đó, xu hướng nghiên

cứu các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng được quan tâm với mong

muốn phát triển các thuốc kháng tiểu cầu có tác dụng tốt hơn và quan trọng là gây

ít tác dụng không mong muốn hơn đối với người sử dụng

Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật vô cùng phong phú Hơn nữa, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ làm thuốc chữa bệnh của người dân cũng rất dồi dào Điều này giúp cho Việt Nam có một nguồn tài nguyên cây thuốc quý giá Theo kinh nghiệm dân gian của một số địa phương, cây Dong

riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr đã được sử dụng để điều trị một số triệu

chứng trong bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, cơn đau tim [6, 35] Theo đó,

một vài nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu

cầu, chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết của Canna warszewiczii A

Dietr Tổng hợp kết quả các nghiên cứu cho thấy các phân đoạn dịch chiết ethyl acetate, dichloromethane, n-hexan đều có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu gây

ra bởi các chất kích tập ADP, collagen, ristocetin [13, 31] Do đó, đề tài “Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP của phân đoạn

dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr” được thực hiện với

mục tiêu:

2

Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr với chất kích tập ADP và chất ức chế

nhóm thụ thể P2 là PPADS

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu

Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, hình đĩa, không có nhân, đường kính trung bình 2 đến 5 m, dày 0,5 m [2, 20] Số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi ở người

khỏe mạnh khoảng 150 – 400 x 109/L [5, 47] Trong quá trình tạo máu, tiểu cầu được tách ra từ mẫu tiểu cầu trong tủy xương, mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo ra 3000

tiểu cầu [5, 7] Đời sống của tiểu cầu ngắn, trung bình khoảng 10 ngày, bị tiêu hủy

bởi đại thực bào ở gan và lách [2, 47]

1.1.1 Cấu trúc tiểu cầu

Cấu trúc tiểu cầu được chia thành 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel, khu bào quan và khu màng

Hình 1.1 C ấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo [51]

 Khu ngoại vi

Glycoprotein C ấu trúc Ch ất liên kết

GPIIb/IIIa Integrin αIIbβ3 Fibrinogen, vWF,

fibronectin, vitronectin

và thrombospondin GPIa/IIa Integrin α2β1 Collagen

GPIb/IX/V Thụ thể nhiều đoạn acid

amin giàu leucine lặp lại

và cholesterol Các phospholipid này phân bố không đều PC cấu trúc nên lớp ngoài; ngược lại, PE và PS cấu trúc nên lớp trong của màng Sự phân bố này được

kiểm soát bởi các enzyme phụ thuộc ATP là flipase và flopase [47]

Nằm ngay dưới màng bào tương, vùng dưới màng là nơi vùng nội bào của các thụ thể xuyên màng tương tác với các protein phụ trách quá trình truyền tin trong tiểu cầu Vùng dưới màng còn có một cấu trúc đặc biệt dính vào màng bào tương giúp ổn định hình dạng bình thường của tiểu cầu, gọi là hệ khung màng spectrin Hệ thống này là một chuỗi polymer xoắn được tạo ra bởi từ các tiểu đơn

vị α và  của spectrin Cấu trúc này tồn tại những vị trí gắn với các protein giúp liên kết hệ thống màng spectrin với hệ thống các vi sợi, tạo nên một mạng lưới liên tục [47]

5

 Khu sol – gel

Thành phần chính của khu sol – gel là hệ thống vi ống và hệ thống vi sợi Hai hệ thống này cùng với hệ thống màng spectrin cấu thành hệ khung nâng đỡ

tiểu cầu Hệ thống vi ống nằm ngay dưới hệ thống màng spectrin, là tập hợp của

3 – 24 vi ống, bao quanh chu vi tiểu cầu, nằm trên mặt phẳng xích đạo của tiểu

cầu Mỗi vi ống được tạo nên từ các chuỗi polymer của heterodimer tubulin, hình thành những ống rỗng, cứng, đường kính mỗi ống khoảng 25 nm Chức năng của

hệ thống vi ống là duy trì kích thước, hình dạng bình thường của tiểu cầu và tham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích [5, 47]

Các vi sợi là các chuỗi polymer được hình thành từ các monomer actin actin) Đây là những sợi mỏng, dẻo, có ái lực với ATP khác nhau ở mỗi đầu 98% đầu có ái lực cao với ATP gắn với các protein CapZ và adducin, trong khi phần

(G-lớn đầu có ái lực thấp với ATP gắn với phức hợp Arp2/3 Trong khi CapZ ức chế

phản ứng trùng ngưng, Arp2/3 có thể kéo dài sợi acin và bảo vệ sợi khỏi sự khử trùng ngưng (depolymerization) Hệ thống vi sợi được hình thành chủ yếu nhờ filamin và α-actinin Filamin là protein có hình dạng giống chữ V, đầu chụm vào tương tác với phần nội bào của GPIb và các -integrin, hai đầu còn lại gắn với hai

sợi actin α-actinin giữ các vi sợi gần nhau hơn [47] Hệ thống vi sợi trong tế bào

chất, giữ các bào quan cách xa nhau và tham gia tạo chân giả của tiểu cầu [5, 20] Khi bị kích thích, hệ thống vi sợi trong tế bào chất làm co hệ thống vi ống lại, đẩy các hạt α và các hạt đặc vào trung tâm tiểu cầu Các hạt này giải phóng các chất ra bên ngoài qua hệ thống các kênh mở Ngoài ra, khu sol – gel còn bao gồm một lượng lớn glycogen và một vài túi trơn hoặc được bọc clathrin [20]

 Khu bào quan

Khu bào quan chứa hệ thống các hạt đặc hiệu và các thành phần tế bào như lysosome, ty thể, bộ máy Golgi… Các bào quan này thực hiện các quá trình chuyển hóa của tiểu cầu, dự trữ enzyme và một lượng lớn cơ chất cần thiết cho hoạt động

của tiểu cầu [51]

6

Hệ thống hạt đặc hiệu được chia thành 3 nhóm: hạt α, hạt đặc và túi lysosome [7] Có mặt ít nhất trong tiểu cầu là túi lysosome (< 3 hạt/tiểu cầu) Thành phần trong túi lysosome là các enzyme phân giải protein (cathepsins, elastase, collagenase, carboxypeptidase); enzyme phân giải carbohydrate (glucosidase, galactosidase, mannosidase) và enzyme cắt cầu ester (acid phosphatase)

Mỗi tiểu cầu có thể chứa 3 đến 8 hạt đặc với kích thước khoảng 150 nm

Hạt đặc chứa một lượng lớn các nucleotide (ADP, ATP, UTP, GTP); cation (Ca++,

Mg++, K+); các amin (serotonin, histamine) và pyrophosphate Các chất này tham gia vào quá trình cầm máu và quá trình đáp ứng viêm

Trong các loại hạt, hạt α có số lượng nhiều nhất với 50 đến 80 hạt/tiểu cầu, kích thước lớn nhất từ 200 đến 500 nm và cũng đa dạng nhất về thành phần chứa trong hạt Thành phần của hạt α được trình bày ở Bảng 1.2

B ảng 1.2 Thành phần của hạt α [20]

Protein kết hợp màng αIIbβ3, GPIb/IX/V, GPVI, P-selectin

Chất tham gia quá trình

đông máu

Yếu tố V, IX, XIII, antithrombin, protein

S, plasminogen, α2-macroglobulin Protein dính Fibrinogen, vWF, thrombospondin

Hóa chất CXCL1, CXCL4, CXCL5, CXCL8, CCL2

Yếu tố tăng trưởng Yếu tố tăng trưởng biểu bì, yếu tố tăng

trưởng tế bào gan

Chất ức chế Angiostatin, endostatin

Chất điều hòa miễn dịch Complement C4 precursor, IgG

Protein vi sinh Thymosin-β4, thrombocidins1 và 2

 Khu màng

7

Khu màng chứa hệ thống các ống dày đặc và hệ thống các kênh mở Hệ

thống các ống dày đặc là khối vật chất không định hình, dày đặc điện tử, là nơi dự

trữ Ca++, tổng hợp prostaglandin và chứa nhiều enzyme cyclooxygenase tham gia vào con đường chuyển hóa prostaglandin [5, 51] Hệ thống các kênh mở là các ống mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu Các hạt tiểu cầu giải phóng các chất cũng như các chất ngoại bào có thể thâm nhập vào tổ chức bên trong tiểu cầu qua hệ thống kênh này (như sự hấp thu fibrinogen vào hạt α) [5, 43, 47]

1.1.2 Chức năng tiểu cầu

Ở điều kiện sinh lý bình thường, tiểu cầu lưu hành trong máu ở trạng thái nghỉ Khi xuất hiện tổn thương ở thành mạch, tiểu cầu lập tức bị thu hút và trải qua một loạt các sự kiện diễn biến liên tục Nhìn chung, quá trình này gồm các bước quan trọng là bám dính, hoạt hóa, chế tiết và ngưng tập

1.1.2.1 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu

 Giai đoạn bám dính ban đầu

Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị phã vỡ, một số protein

ở tổ chức dưới nội mô được bộc lộ và tương tác với tiểu cầu, bao gồm: yếu tố von Willebrand (vWF), collagen, fibronectin, laminin và thrombospodin-1 [7, 40] Trong đó, collagen và vWF có vai trò quan trọng nhất vWF bám vào collagen, dãn thẳng và bộc lộ nhiều vị trí liên kết (vùng A1) với phức hợp glycoprotein (GP) Ib/IX/V trên màng tiểu cầu Dưới tốc độ dòng máu cao, sự bám dính của tiểu cầu

phụ thuộc chủ yếu vào liên kết giữa GPIb và vWF Liên kết này được hình thành nhanh và chịu áp lực đẩy của dòng máu nhưng tồn tại không lâu Tuy nhiên, nó lại quan trọng do giúp tiểu cầu “lăn” gần về bề mặt bám dính, tạo điều kiện để collagen liên kết với GPVI và tương tác này lại hoạt hóa GPIa/IIa gắn với collagen [1, 32, 40]

8

Hình 1.2 Giai đoạn bám dính [40]

Sự phối hợp giữa những tín hiệu sinh ra bởi các tương tác vWF – GPIb, collagen – GPVI, collagen – GPIa/IIa thúc đẩy một chuỗi các biến đổi phức tạp bên trong tiểu cầu dẫn đến hoạt hóa phospholipase Cγ (PLCγ) và tạo ra inositol (1,4,5) trisphosphate (IP3) từ sự thủy phân màng phospholipid IP3 gắn với thụ thể

của nó trên hệ thống các ống dày đặc để huy động Ca++ từ kho dự trữ này Nồng

độ Ca++ nội bào tăng kích hoạt một loạt các biến đổi quan trọng của tiểu cầu có ý nghĩa trong giai đoạn ngưng tập sau đó như thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành hình cầu gai, hoạt hóa GPIIb/IIIa, giải phóng chất từ các hạt và tổng hợp TXA2

9

GPIIb/IIIa được hoạt hóa, liên kết với vùng C1 của vWF đảm bảo tiểu cầu bám dính chặt vào vị trí tổn thương của thành mạch [40]

 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu

Hình 1.3 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu [40]

Ngưng tập tiểu cầu (NTTC) là hiện tượng các tiểu cầu liên kết với nhau để

tạo thành nút tiểu cầu và là giai đoạn tiếp theo của quá trình cầm máu ban đầu

Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao, kích hoạt tiểu cầu biến đổi từ hình đĩa thành hình

cầu gai Đây được cho tín hiệu đầu tiên của sự NTTC [44] GPIIb/IIIa bộc lộ trên

bề mặt tiểu cầu và được hoạt hóa từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có ái

lực cao, liên kết được với các protein hòa tan trong huyết tương như vWF, fibronectin, fibrinogen [32] Đồng thời, sự giải phóng chất từ hệ thống các hạt đặc

hiệu thông qua hệ thống các kênh mở cũng diễn ra Các chất chủ vận được giải phóng hay hình thành trong quá trình bám dính như ADP, thrombin, TXA2 gắn

với thụ thể của chúng trên màng tiểu cầu, hoạt hóa tiểu cầu theo những cơ chế

10

khác nhau Các tiểu cầu này cũng trải qua một loạt biến đổi như thay đổi hình

dạng, giải phóng chất từ các hạt và ngưng tập với nhau thông qua liên kết GPIIb/IIIa – fibrinogen – GPIIb/IIIa, GPIIb/IIIa – vWF, GPIb – vWF Cứ như vậy, quá trình hoạt hóa và ngưng tập diễn ra làm bền nút tiểu cầu và chuẩn bị cho giai đoạn tạo cục máu đông [40]

1.1.2.2 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương

Quá trình đông máu là một chuỗi phản ứng hoạt hóa các yếu tố đông máu hay còn gọi là dòng thác đông máu và kết quả cuối cùng là hình thành cục máu đông từ mạng lưới fibrin Trong đó, có hai con đường khởi động quá trình đông máu Con đường đông máu ngoại sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với mô tổn thương, trong khi con đường đông máu nội sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với bề mặt lạ [2]

Tiểu cầu có vai trò quan trọng trong cả hai con đường này

Màng tiểu cầu có chứa các phospholipid tích điện âm, phosphatidylserine (PS) và phosphatidylethanolamin (PE) Các aminophospholipid này chỉ được bộ

lộ ra khi hoạt hóa tiểu cầu Nhờ đó, các yếu tố đông máu gắn có hồi phục với màng

tiểu cầu Phức hợp TF-VIIa có thể hoạt hóa yếu tố IX và X một cách hiệu quả

Yếu tố XII tự động hoạt hóa trên bề mặt tích điện âm, khởi động con đường đông máu nội sinh theo nguyên lý khuếch tán diễn tiến cùng với prekallikrein và kinninogen trọng lượng phân tử cao [7, 45] Tiểu cầu hoạt hóa còn giải phóng hàng

loạt chất tham gia quá trình đông máu như yếu tố V, IX, XIII, fibrinogen

1.2 Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP

ADP là phân tử trọng lượng thấp gây NTTC được biết đến đầu tiên Tuy là

một chất chủ vận yếu, ADP đóng vai trò quan trọng trong chức năng tiểu cầu bởi

vì khi được tiết ra từ hạt đặc, nó khuếch đại đáp ứng của tiểu cầu với các chất chủ

vận khác [34] Trong huyết tương giàu tiểu cầu đã chống đông bằng citrate, ADP gây NTTC thông qua tương tác các thụ thể purinergic của nó

1.2.1 Thụ thể purinergic

11

Khái niệm về thụ thể purinergic lần đầu được mô tả bởi Burnstock vào năm

1972 để chỉ những thụ thể của các nucleotide trên màng tế bào Ban đầu, các thụ

thể purinergic được phân loại dựa trên ái lực của các chất chủ vận Tuy nhiên, hệ

thống sắp xếp đã được thay đổi dựa trên không chỉ những thông tin dược lý mà còn cả những thông tin hóa sinh [38] Theo đó, các thụ thể được phân loại thành hai nhóm lớn: P1, các thụ thể được hoạt hóa bởi adenosine và P2, các thụ thể được

hoạt hóa bởi purine và pyrimidine nucleotide (ATP, ADP, UTP và UDP) [41]

là các kênh ion điều hòa sự vận chuyển Na+, K+ và Ca++ dẫn đến sự khử cực tế bào

và hoạt hóa các enzyme nội bào [9]

Bốn thụ thể purinergic xuất hiện trên màng tiểu cầu là P2X1, P2Y1, P2Y12

và A2A P2X1được hoạt hóa bởi ATP, trong khi P2Y1 và P2Y12 là hai thụ thể của ADP [33] P2Y1 là thụ thể được tìm ra trước và mỗi tiểu cầu chỉ có khoảng 150

thụ thể này P2Y1 là thụ thể bắt cặp với protein Gq Hoạt hóa thụ thể này bởi ADP

dẫn đến kết quả là nồng độ Ca++ nội bào tăng cao Do đó, P2Y1 điều khiển quá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu và khởi động quá trình ngưng tập [9, 17, 27] P2Y12 là thụ thể có vai trò trung tâm trong ngưng tập tiểu cầu do ADP và là đích tác dụng của nhiều thuốc kháng tiểu cầu P2Y12 bắt cặp với protein Gi, khuếch đại

và ổn định ngưng tập thông qua tác dụng ức chế AC và tham gia quá trình giải phóng chất từ hạt Sự phối hợp của hai thụ thể này là cần thiết để quá trình NTTC

do ADP diễn ra trọn vẹn [9, 27, 42]

12

 Chất ức chế thụ thể purinergic

Nhiều chất ức chế hay đối vận các thụ thể purinergic đã được phát hiện hoặc

tổng hợp trong quá trình nghiên cứu cơ chế của các thụ thể này cũng như quá trình phát triển thuốc mới Nhóm thụ thể của adenosine P1 bị ức chế không chọn lọc

bởi caffeine, trong khi các dẫn xuất của xanthine được tổng hợp và tối ưu để ức

chế đặc hiệu các thụ thể P1 Phần lớn các chất đối vận nhóm thụ thể P2X đều gắn vào vị trí dị lập thể, không cạnh tranh vào vị trí gắn của ATP Tác dụng của những

chất đối vận này đã và đang được đánh giá lâm sàng Các chất ức chế thụ thể P2Y

đa dạng về cấu trúc, một số cạnh tranh vị trí gắn của các chất chủ vận, một số gắn vào vị trí dị lập thể của thụ thể Trong đó, thụ thể P2Y12là đích tác dụng của nhiều thuốc kháng tiểu cầu [33]

Một trong những chất ức chế nhóm thụ thể P2Y được sử dụng nhiều trong nghiên cứu là pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid (PPADS)

Ban đầu được mô tả là chất ức chế chọn lọc thụ thể P2X1, tuy nhiên PPADS đã được chứng minh có tác dụng không đặc hiệu nhóm thụ thể P2 Nồng độ ức chế

tối đa 50% (IC50) của PPADS với thụ thể P2Y12 là 100 M Ái lực của PPADS với P2Y1 là KB = 4 – 12 M [30]

1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP

Born là người đầu tiên chỉ ra ADP gây ngưng tập tiểu cầu in vitro vào năm

1962 [8] Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP gồm hai pha Pha ngưng

tập nguyên phát, có hồi phục, nghĩa là tiểu cầu ngưng tập rồi sau đó giải ngưng

tập và pha ngưng tập thứ phát, không hồi phục, liên quan chặt chẽ đến phản ứng

giải phóng chất từ các hạt tiểu cầu [19]

1.2.2.1 Pha ngưng tập nguyên phát

P2Y1 chịu trách nhiệm chính cho sự xuất hiện của pha ngưng tập nguyên phát do đáp ứng làm tăng nồng độ Ca++ nội bào của nó, dẫn đến sự thay đổi hình

dạng của tiểu cầu Lý do tại sao tiểu cầu phải thay đổi hình dạng trước khi ngưng

tập có thể là do hình dạng mới làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa hai tiểu cầu Nhìn

13

chung, quá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu được chia thành hai bước Đầu tiên, tiểu cầu từ hình đĩa trở thành hình cầu do các sợi actin bị phân mảnh, kéo theo là sự phá hủy của hệ khung màng spectrin Sau đó, màng tiểu cầu lồi lên, hình thành các chân giả và phần mở rộng (lamellipodia) do sự tổng hợp của các sợi actin mới Mỗi bước của quá trình thay đổi hình dạng đều có sự tham gia của rất nhiều protein gắn với actin [44]

Hình 1.4 Hi ện tượng thay đổi hình dạng [47]

ADP gắn vào thụ thể P2Y1, phát ra tín hiệu hoạt hóa phospholipase C (PLC), kéo theo sự tổng hợp phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) và inositol (1,4,5) trisphosphate (IP3) IP3 gắn với thụ thể của nó trên hệ thống các ống dày đặc và huy động Ca++ từ đây Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao hoạt hóa gelsolin, cho phép protein này cắt và gắn luôn vào đầu các sợi actin vừa cắt Cofilin cũng được kích hoạt để giải phóng các G-actin đơn lẻ ra khỏi chuỗi polymer

Những G-actin sau đó này gắn với β-thymosin hoặc profilin Sự xuất hiện của PIP2

cắt đứt liên kết giữa hệ khung màng spectrin với màng bào tương Đồng thời, hệ

thống vi ống bị mất cân bằng, các vi ống xoắn lại và chuyển động rộng Điều này làm cho tiểu cầu phồng lên thành hình cầu Khi nồng độ Ca++ giảm xuống, các

14

protein gelsolin, CapZ, cofilin gắn với PIP2, cùng với hoạt động của Arp2/3 và Formin đã tạo điều kiện để các sợi actin tiếp tục phản ứng trùng ngưng kéo dài chuỗi Chính sự tổng hợp này đã tạo ra lực đẩy để hình thành chân giả và phần mở

rộng Các vi ống lúc này co lại vào trung tâm tiểu cầu, bị phân mảng và phân bố

rải rác Cuối cùng, các protein gắn trở lại đầu các sợi actin và hình thành hình dạng

cuối cùng của tiểu cầu sau khi được hoạt hóa: hình cầu gai với những chân giả dài vài micromet [44, 47]

Song song với quá trình thay đổi hình dạng, nồng độ Ca++ cao cũng hoạt hóa phospholipase A2, khởi đầu một chuỗi phản ứng để cuối cùng hình thành thromboxane A2 (TXA2), một chất kích tập, giúp khuếch đại và củng cố ngưng tập gây ra bởi ADP Sự phối hợp giữa P2Y1 và P2Y12 là cần thiết để giải phóng TXA2

[25] Ca++ cũng hoạt hóa yếu tố trao đổi guanine điều hòa bởi canxi và DAG – 1 (CalDAG-GEFI) xúc tác chuyển Rap1-GDP thành Rap1-GTP Quá trình biến đổi ngược lại được xúc tác bởi RASA3 đã bị ức chế do phosphoinositide 3-kinase (PI 3-K) được hoạt hóa bởi tương tác P2Y12 – ADP Điều này cho thấy sự phối hợp

giữa thụ thể P2Y1 và P2Y12 là rất quan trọng để ổn định sự ngưng tập giữa các tiểu

cầu [9]

Hình 1.5 Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa [9]

15

RAP1-GTP kích thích talin và kindlin 3 gắn vào miền nội bào của GPIIb/IIIa, hoạt hóa thụ thể này từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có ái

lực cao và liên kết được với fibrinogen hòa tan trong huyết tương Nhờ đó, tiểu

cầu ngưng tập với nhau thông qua cầu fibrinogen, hình thành sự ngưng tập nguyên phát Tuy nhiên, sự ngưng tập nguyên phát có thể hồi phục nếu phản ứng giải phóng chất từ các hạt không diễn ra do liên kết giữa các tiểu cầu không được củng

cố

1.2.2.2 Pha ngưng tập thứ phát

Ngưng tập thứ phát xảy ra khi có phản ứng giải phóng các chất từ hạt Phản ứng này giúp bài tiết các thành phần chứa trong hạt α và hạt đặc giúp khuếch đại quá trình ngưng tập và tạo điều kiện cho quá trình hình thành cục máu đông P2Y12

được chứng minh có vai trò trung tâm trong ngưng tập thứ phát Điều này được

chứng minh ở sự vắng mặt của sóng ngưng tập thứ phát ở những bệnh nhân mắc

bệnh thiếu hụt P2Y12 [10, 22] Một trong những tác động của thụ thể P2Y12 giúp

ổn định sự ngưng tập một cách gián tiếp là ức chế adenylyl cyclase (AC), dẫn đến ngăn cản sự thoái hóa của ATP thành cAMP cAMP làm giảm NTTC bằng cách

hoạt hóa protein kinase A (PKA), dẫn đến phosphoryl hóa và ức chế thụ thể của

IP3, do đó làm giảm huy động Ca++ nội bào [29] Sự hoạt hóa PI 3-K ngoài tham gia vào cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa như đã trình bày ở trên, còn dẫn đến sự phosphoryl hóa serine-threonine protein kinase B/Akt (PKB/Akt) Con đường tín

hiệu này đóng vai trò quan trọng trong phản ứng giải phóng chất từ các hạt Tuy nhiên, cơ chế hoạt hóa các protein tham gia phản ứng giải phóng chưa được làm

rõ [9, 14]

Hòa màng là cơ chế chính của phản ứng giải phóng chất từ các hạt Trong quá trình thay đổi hình dạng, các hạt được kéo vào trung tâm tiểu cầu do chuyển động của hệ thống vi sợi Các hạt này có thể hòa màng với nhau để tạo thành hạt

lớn hơn Sau đó, các hạt này hòa màng với hệ thống các kênh mở hoặc màng bào tương, giải phóng các chất ra môi trường ngoại bào Các protein liên kết màng hạt (v-SNARE) và màng bào tương (t-SNARE) có vai trò quan trọng trong quá trình

16

hòa màng và được điều hòa chặt chẽ bởi các protein Sec1/Munc, Rab [20] Nhìn chung, quá trình giải phóng chất từ các hạt diễn ra theo ba bước chính: gắn màng (docking), chuẩn bị (priming) và hòa màng Rab27 trên màng hạt đặc (hoặc Rab4 trên màng hạt α) cùng với protein giống syntaptotagmin (SLPs) và Munc13-4 là

cần thiết cho sự gắn với màng bào tương Sự hoạt hóa tiểu cầu dẫn đến sự thay đổi hình dạng của syntaxin, vốn bị cô lập bởi Munc18b ở trạng thái nghỉ Sau đó, một

phức hợp liên kết các SNARE được hình thành trong đó có một v-SNARE (VAMP) và hai t-SNARE (syntaxin và SNAP-23) Sự kết hợp chặt chẽ của các SNARE cung cấp năng lượng cần thiết cho quá trình hòa màng [16, 39]

Hình 1.6 Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu [16]

Hạt đặc giải phóng một lượng lớn ADP, ATP, serotonin và các cation ATP

hoạt hóa kênh ion P2X1, làm tăng nồng độ Ca++, khuếch đại tín hiệu của thụ thể P2Y1, đóng góp vào sự giải phóng TXA2 và bắt đầu quá trình ngưng tập gây ra bởi TXA2 [23] Serotonin làm tăng trương lực mạch máu trong khi Ca++ và polyphosphate giúp hình thành cục máu đông Hạt α giải phóng fibrinogen và vWF, thúc đẩy hình thành liên kết giữa các tiểu cầu [16, 20] Nhờ đó, pha ngưng

tập thứ phát là không hồi phục và quá trình NTTC in vitro do ADP diễn ra trọn

vẹn

1.3 Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu

17

Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các

thu ốc kháng ngưng tập tiểu cầu [37]

Thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu là những thuốc ức chế hoạt hóa tiểu cầu [5] Do đó, chúng có vai trò quan trọng trong kiểm soát và ngăn ngừa các bệnh

mạch vành và mạch máu não liên quan đến huyết khối [37] Nhìn chung, hoạt động

của tiểu cầu được vận hành bởi ba nhóm chất Nhóm thứ nhất gồm các chất được

tổng hợp bên ngoài tiểu cầu và tương tác với các thụ thể trên màng tiểu cầu: collagen, thrombin Nhóm thứ hai gồm các chất được tổng hợp bên trong tiểu cầu

và tương tác với các thụ thể trên màng: ADP, serotonin, prostaglandin D2 Nhóm

thứ ba gồm các chất được tổng hợp và hoạt động bên trong tiểu cầu: cAMP, cGMP

Dựa vào cách phân loại trên, các đích tác dụng của thuốc kháng tiểu cầu được xác định và làm cơ sở để phát triển thuốc mới [26]

18

dụng [32] Aspirin ức chế không hồi phục COX-1 bằng cách acetyl hóa enzyme này, ngăn cản sự tổng hợp TXA2, một chất gây ngưng tập rất mạnh Sự ức chế rất

mạnh và kéo dài suốt đời sống của tiểu cầu [7, 26] Liều 75 – 100 mg/ngày là đủ

để ức chế hoàn toàn sự tổng hợp TXA2 ở tiểu cầu [18] Ngoài ra, aspirin còn ức

chế tổng hợp prostaglandin I2 (PGI2), có tác dụng chống đông, do ức chế prostacyclin synthetase Tuy nhiên, sự ức chế này không mạnh bằng tác dụng ức

chế COX-1 và cũng không kéo dài [7]

Các thuốc khác thuộc nhóm chống viêm không steroid (NSAID) như mobic, apo – piroxicam cũng có tác dụng chống NTTC với cơ chế tương tự aspirin nhưng tác dụng không dài bởi chúng không acetyl hóa được COX-1 [7, 26]

1.3.2 Nhóm ức chế thụ thể P2Y 12

Nhóm Thienopyridin gồm ticlodipin, clopidogrel và prasugrel là các tiền thuốc (prodrug), dùng đường uống Sau khi hấp thu vào cơ thể, chúng chuyển hóa thành các chất có hoạt tính, ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 của ADP [37]

Nhóm dẫn chất nucleotide gồm ticagrelor và cangrelor Ticagrelor dùng đường uống, gắn vào vị trí dị lập thể của P2Y12, không cạnh tranh vị trí gắn của ADP, ức chế chọn lọc có hồi phục P2Y12 Sản phẩm chuyển hóa của ticagrelor cũng có hoạt tính tương đương [18, 37, 46] Cangrelor dùng đường tiêm tĩnh mạch,

thời gian bán hủy của thuốc rất ngắn (3 – 6 phút), thời gian bắt đầu cho tác dụng nhanh (2 phút) và duy trì tác dụng trong khoảng 1 – 2 giờ [37] Vì các đặc tính đặc

biệt, cangrelor được sử dụng cho những tình huống khẩn cấp, cho bệnh nhân đang

chờ phẫu thuật hay không thể sử dụng thuốc đường uống [18, 32]

1.3.3 Nhóm ức chế thụ thể của thrombin

Thrombin là một serine protease, hoạt hóa tiểu cầu chủ yếu thông qua hai

thụ thể bắt cặp protein G, PAR1 và PAR4, trong đó PAR1 có ái lực với thrombin

mạnh nhất Hiện nay, nhóm này mới chỉ có vorapaxar đang được sử dụng Vorapaxar ức chế chọn lọc có hồi phục PAR1, dẫn đến ức chế NTTC gây ra bởi

19

thrombin nhưng không ảnh hưởng đến cầm máu ban đầu Do lo ngại về độ an toàn,

việc sử dụng vorapaxar trên lâm sàng còn hạn chế [21, 32]

1.3.4 Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa

Nhóm thuốc ức chế phức hợp GPIIb/IIIa là những phân tử bắt chước phối

tử của GPIIb/IIIa, ngăn fibrinogen gắn với các tiểu cầu hoạt hóa, do đó ức chế sự ngưng tập của chúng Các thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa được sử dụng trong hội

chứng mạch vành cấp tính Ba thuốc hiện đang được sử dụng: abciximab, một kháng thể đơn dòng; eptifibatid, một heptapeptid vòng có nguồn gốc từ nọc độc

rắn chuông chứa chuỗi Arg-Gly-Asp giống với trình tự của fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa và tirofiban, một phân tử nhỏ cũng chứa chuỗi Arg-Gly-Asp Do có

nửa đời thuốc ngắn, các thuốc này phải được tiêm truyền liên tục [18, 32]

1.3.5 Nhóm ức chế phosphodiesterase

Dipyridamol là thuốc ức chế phosphodiesterase, do đó làm tăng nồng độ cAMP dẫn đến làm ức chế tổng hợp TXA2 và gián tiếp tăng nồng độ adenosine Ngoài ra, dipyridamol còn có tác dụng giãn mạch vành [7] Nếu chỉ sử dụng một mình dipyridamol thì hầu như không có tác dụng nên dipyridamol thường được sử

dụng phối hợp với aspirin hoặc warfarin [26]

Cilostazol là một thuốc ức chế phosphodiesterase mới, có tác dụng giãn

mạch và ức chế NTTC Cilostazol được sử dụng để điều trị đau cách hồi ở chân [26]

1.4 Tổng quan về cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr

1.4.1 Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng

Họ Dong riềng (hay Ngải hoa) Cannaceae là họ thực vật một lá mầm, trong

đó chi Canna là chi duy nhất của họ này với khoảng 10 – 20 loài trên thế giới

Hiện nay, ở Việt Nam, các nhà khoa học đã phát hiện 6 loài thực vật thuộc họ

Cannaceae Đó là Canna edulis Ker., C generalis Bail., C glauca L., C indica L., C sylvestris Rosc và C warszewiczii A Dietr mới được phát hiện và định danh

gần đây [3, 6] C warszewiczii là một loài cây chịu bóng râm, thường mọc dưới