Bước đầu xây dựng mô hình đánh giá hoạt tính đông cầm máu của công thức dược liệu định hướng tác dụng điều trị trĩ trên mô hình in vitro

DANH MỤC CÁC HÌNHHình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo 3 Hình 1.6 Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu 16Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đí

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

LƯƠNG PHÚ HƯNG

KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT

CÂY DONG RIỀNG ĐỎ

Canna warszewiczii A Dietr

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: LƯƠNG PHÚ HƯNG

KHẢO SÁT CƠ CHẾ CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU VỚI CHẤT KÍCH TẬP ADP CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT

CÂY DONG RIỀNG ĐỎ

Canna warszewiczii A Dietr

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

LỜI CẢM ƠN

Khi nhận được đề tài khóa luận này, tôi cảm thấy bản thân rất may mắnkhi được học tập và nghiên cứu về lĩnh vực mà tôi yêu thích Tôi không chỉ họchỏi thêm được nhiều kiến thức mà còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ của cácthầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin gửi cảm ơn đến toàn thể Ban chủ nhiệm Khoa Y dược,Đại học Quốc gia Hà Nội và Bộ môn Y dược học cơ sở cùng các thầy cô giáotrong khoa đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp và giúp đỡ tôihoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS Vũ Thị Thơm và

TS Nguyễn Thị Vân Anh Các cô là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạođiều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận Không chỉtruyền đạt kiến thức khoa học cùng những kinh nghiệm quý báu của mình, các côcòn truyền cho tôi lòng yêu nghề, nhiệt huyết và tận tâm với công việc

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Hồng Luyến và nhóm sinh viên đến từĐại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trìnhthực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến cácbác sĩ và nhân viên Khoa Huyết học, Bệnh viện Bạch Mai đã giúp đỡ, tạo điềukiện cho tôi thực hiện đề tài một cách thuận lợi nhất

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn và tình yêu thương sâu sắc tới gia đình,người thân và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, khuyến khích, động viên vàtạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận

Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm

2020Sinh viên

Lương Phú Hưng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Adenosine diphosphateThời gian thromboplastin một phần hoạt hóa (Activatedpartial thromboplastin time)

Arginylglycylaspartic acidAdenosine triphosphateMức độ ngưng tập tiểu cầu (Area Under the aggregationCurve)

Ion CanxiYếu tố trao đổi guanine điều hòa bởi canxi và DAG – 1Cyclic adenosine monophosphate

Cyclooxygenase 1

Canna warszewiczii A Dietr

DichloromethaneMức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation)Dimethyl sulfoxide

Ethyl acetatePhần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final PlateletAggregation)

Guanine diphosphateGlycoprotein

Guanine triphosphateMonomer actin

Inositol (1,4,5) trisphosphateIon Kali

Phương pháp đo độ ngưng tập tiểu cầu thông qua độ dẫntruyền ánh sáng (Light Transmission Aggregometry)Ion Magie

PhosphatidylcholinePhosphatidylethanolaminePhosphatidylinositol 4,5-bisphosphatePhosphoinositide 3-kinase

Serine-threonine protein kinase B/AktPhospholipase C

Phospholipase CγPyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acidHuyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet-poor plasma)Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet-rich plasma)Phosphatidylserine

Thời gian prothrombin (Prothrombin time)Phần thân rễ (Rhizome)

Tốc độ ngưng tập tiểu cầuThromboxane A2

Protein liên kết màng bào tươngUridine diphosphate

Uridine triphosphateYếu tố von WillebrandProtein liên kết màng hạt tiểu cầu

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các nhóm tiến hành đo ngưng tập tiểu cầu 26

Bảng 3.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) 30

Bảng 3.4 Giá trị P của sai khác giữa AUC của các nhóm 32

Bảng 3.6 Đánh giá sự phối hợp của PPADS và phân đoạn dịch chiết 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo 3

Hình 1.6 Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu 16Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các 17

thuốc kháng tiểu cầu

Hình 2.1 Mẫu cây Dong riềng đỏ C warszewiczii A Dietr 22

Hình 2.2 Sơ đồ tách chiết các phân đoạn dịch chiết C warszewiczii 23

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Sinh lý học tiểu cầu 3

1.1.1 Cấu trúc tiểu cầu 3

1.1.2 Chức năng tiểu cầu 7

1.1.2.1 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu 7

1.1.2.2 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương 10

1.2 Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP 10

1.2.1 Thụ thể purinergic 10

1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP 12

1.2.2.1 Pha ngưng tập nguyên phát 12

1.2.2.2 Pha ngưng tập thứ phát 15

1.3 Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu 16

1.3.1 Nhóm ức chế Cyclooxygenase 1 (COX-1) 17

1.3.2 Nhóm ức chế thụ thể P2Y12 18

1.3.3 Nhóm ức chế thụ thể của thrombin 18

1.3.4 Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa 19

1.3.5 Nhóm ức chế phosphodiesterase 19

1.4 Tổng quan về cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr 19

1.4.1 Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng 19

1.4.2 Các nghiên cứu trước đây về Canna warszewiczii A Dietr 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng 22

2.1.2 Thu thập mẫu máu 23

2.1.3 Dụng cụ nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp pha các phân đoạn dịch chiết và hóa chất 24

2.2.2 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm 24

2.2.3 Phương pháp phân tích ngưng tập tiểu cầu 24

2.2.4 Phân tích và xử lý số liệu 27

2.2.5 Đạo đức nghiên cứu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Kết quả 29

3.1.1 Tốc độ ngưng tập tiểu cầu (Slope) 29

3.1.2 Phần trăm ngưng tập tiểu cầu tối đa (MPA) 30

3.1.3 Mức độ ngưng tập tiểu cầu (AUC) 31

3.1.4 Mức độ phân rã ngưng tập (Deaggregation – DEA) 33

3.1.5 Đồ thị ngưng tập tiểu cầu 33

3.2 Bàn luận 35

3.2.1 Thiết kế nghiên cứu 35

3.2.2 Kết quả nghiên cứu 35

3.2.3 Hạn chế của nghiên cứu 40

KẾT LUẬN 41

KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các bệnh lý về tim mạch hiện đang là nguyên nhân gây tử vong hàng đầutrên thế giới Phần lớn trong số đó có liên quan đến các cơn đau tim và đột quỵ.Đây là những triệu chứng cấp tính gây ra bởi sự tắc nghẽn lưu thông máu đến timhoặc não bộ mà tác nhân chính là sự xuất hiện của huyết khối [32, 48] Nhữngnghiên cứu về sinh lý học đã chứng minh vai trò quan trọng của tiểu cầu tronghình thành cục máu đông Nằm trong chuỗi các biến đổi xảy ra kể từ khi tiểu cầuđược hoạt hóa, ngưng tập tiểu cầu, sự kết tập của các tiểu cầu tạo thành đám tiểucầu, được xem là tiền đề để hình thành huyết khối

Để ngăn ngừa và điều trị các bệnh lý có liên quan đến huyết khối, nhiềuthuốc kháng tiểu cầu đã được nghiên cứu và ra đời Bên cạnh những lợi ích manglại trong điều trị, các thuốc kháng tiểu cầu cũng gây ra nhiều tác dụng khôngmong muốn như làm tăng nguy cơ chảy máu hay loét dạ dày Do đó, xu hướngnghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng được quan tâmvới mong muốn phát triển các thuốc kháng tiểu cầu có tác dụng tốt hơn và quantrọng là gây ít tác dụng không mong muốn hơn đối với người sử dụng

Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật vôcùng phong phú Hơn nữa, kinh nghiệm sử dụng cây cỏ làm thuốc chữa bệnh củangười dân cũng rất dồi dào Điều này giúp cho Việt Nam có một nguồn tàinguyên cây thuốc quý giá Theo kinh nghiệm dân gian của một số địa phương,

cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr đã được sử dụng để điều trị một

số triệu chứng trong bệnh lý tim mạch như đau thắt ngực, cơn đau tim [6, 35].Theo đó, một vài nghiên cứu đã được tiến hành để đánh giá tác dụng chống

ngưng tập tiểu cầu, chống đông máu của các phân đoạn dịch chiết của Canna

warszewiczii A Dietr Tổng hợp kết quả các nghiên cứu cho thấy các phân đoạn

dịch chiết ethyl acetate, dichloromethane, n-hexan đều có tác dụng ức chế ngưngtập tiểu cầu gây ra bởi các chất kích tập ADP, collagen, ristocetin [13, 31] Do

đó, đề tài “Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu với chất kích tập ADP

của phân đoạn dịch chiết cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr”

được thực hiện với mục tiêu:

Khảo sát cơ chế chống ngưng tập tiểu cầu của phân đoạn dịch chiết cây

Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr với chất kích tập ADP và chất ức

chế nhóm thụ thể P2 là PPADS

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Sinh lý học tiểu cầu

Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, hình đĩa, không có nhân, đường kínhtrung bình 2 đến 5 m, dày 0,5 m [2, 20] Số lượng tiểu cầu trong máu ngoại vi

ở người khỏe mạnh khoảng 150 – 400 x 109/L [5, 47] Trong quá trình tạo máu,tiểu cầu được tách ra từ mẫu tiểu cầu trong tủy xương, mỗi mẫu tiểu cầu có thểtạo ra 3000 tiểu cầu [5, 7] Đời sống của tiểu cầu ngắn, trung bình khoảng 10ngày, bị tiêu hủy bởi đại thực bào ở gan và lách [2, 47]

1.1.1 Cấu trúc tiểu cầu

Cấu trúc tiểu cầu được chia thành 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel,khu bào quan và khu màng

Hình 1.1 Cấu trúc tiểu cầu khi cắt theo mặt phẳng xích đạo [51]

 Khu ngoại vi

Khu ngoại vi gồm lớp áo ngoài glycocalyx, màng bào tương và vùng dướimàng Glycocalyx được cấu thành từ rất nhiều loại glycoprotein (GP) Các GPnày hoạt động như các receptor bề mặt, có vai trò vô cùng quan trọng trong sựbám dính, hoạt hóa và ngưng tập tiểu cầu [20, 51].

Bảng 1.1 Đặc điểm của một số GP chính [51]

GPIIb/IIIa Integrin αIIbβ3 Fibrinogen, vWF,

fibronectin, vitronectin

và thrombospondinGPIa/IIa Integrin α2β1 Collagen

GPIb/IX/V Thụ thể nhiều đoạn acid vWF

amin giàu leucine lặp lạiGPVI Thụ thể thuộc siêu họ Collagen

globulin miễn dịch

Màng bào tương là màng lipid kép với thành phần chính là các phospholipidnhư phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine(PS) cùng với một lượng đáng kể sphingolipid, sphingomyelin và cholesterol Cácphospholipid này phân bố không đều PC cấu trúc nên lớp ngoài; ngược lại, PE và

PS cấu trúc nên lớp trong của màng Sự phân bố này được kiểm soát bởi cácenzyme phụ thuộc ATP là flipase và flopase [47]

Nằm ngay dưới màng bào tương, vùng dưới màng là nơi vùng nội bào củacác thụ thể xuyên màng tương tác với các protein phụ trách quá trình truyền tintrong tiểu cầu Vùng dưới màng còn có một cấu trúc đặc biệt dính vào màng bàotương giúp ổn định hình dạng bình thường của tiểu cầu, gọi là hệ khung màngspectrin Hệ thống này là một chuỗi polymer xoắn được tạo ra bởi từ các tiểuđơn vị α và  của spectrin Cấu trúc này tồn tại những vị trí gắn với các proteingiúp liên kết hệ thống màng spectrin với hệ thống các vi sợi, tạo nên một mạnglưới liên tục [47]

 Khu sol – gel

Thành phần chính của khu sol – gel là hệ thống vi ống và hệ thống vi sợi.Hai hệ thống này cùng với hệ thống màng spectrin cấu thành hệ khung nâng đỡtiểu cầu Hệ thống vi ống nằm ngay dưới hệ thống màng spectrin, là tập hợp của

3 – 24 vi ống, bao quanh chu vi tiểu cầu, nằm trên mặt phẳng xích đạo của tiểucầu Mỗi vi ống được tạo nên từ các chuỗi polymer của heterodimer tubulin, hìnhthành những ống rỗng, cứng, đường kính mỗi ống khoảng 25 nm Chức năng của

hệ thống vi ống là duy trì kích thước, hình dạng bình thường của tiểu cầu vàtham gia vào hiện tượng co rút khi tiểu cầu bị kích thích [5, 47]

Các vi sợi là các chuỗi polymer được hình thành từ các monomer actin actin) Đây là những sợi mỏng, dẻo, có ái lực với ATP khác nhau ở mỗi đầu 98%đầu có ái lực cao với ATP gắn với các protein CapZ và adducin, trong khi phần lớnđầu có ái lực thấp với ATP gắn với phức hợp Arp2/3 Trong khi CapZ ức chế phảnứng trùng ngưng, Arp2/3 có thể kéo dài sợi acin và bảo vệ sợi khỏi sự khử trùngngưng (depolymerization) Hệ thống vi sợi được hình thành chủ yếu nhờ filamin vàα-actinin Filamin là protein có hình dạng giống chữ V, đầu chụm vào tương tác vớiphần nội bào của GPIb và các -integrin, hai đầu còn lại gắn với hai sợi actin α-actinin giữ các vi sợi gần nhau hơn [47] Hệ thống vi sợi trong tế bào chất, giữ cácbào quan cách xa nhau và tham gia tạo chân giả của tiểu cầu [5, 20] Khi bị kíchthích, hệ thống vi sợi trong tế bào chất làm co hệ thống vi ống lại, đẩy các hạt α vàcác hạt đặc vào trung tâm tiểu cầu Các hạt này giải phóng các chất ra bên ngoài qua

(G-hệ thống các kênh mở Ngoài ra, khu sol – gel còn bao gồm một lượng lớn glycogen

và một vài túi trơn hoặc được bọc clathrin [20]

 Khu bào quan

Khu bào quan chứa hệ thống các hạt đặc hiệu và các thành phần tế bàonhư lysosome, ty thể, bộ máy Golgi… Các bào quan này thực hiện các quá trìnhchuyển hóa của tiểu cầu, dự trữ enzyme và một lượng lớn cơ chất cần thiết chohoạt động của tiểu cầu [51]

Hệ thống hạt đặc hiệu được chia thành 3 nhóm: hạt α, hạt đặc và túilysosome [7] Có mặt ít nhất trong tiểu cầu là túi lysosome (< 3 hạt/tiểu cầu).Thành phần trong túi lysosome là các enzyme phân giải protein (cathepsins,elastase, collagenase, carboxypeptidase); enzyme phân giải carbohydrate(glucosidase, galactosidase, mannosidase) và enzyme cắt cầu ester (acidphosphatase).

Mỗi tiểu cầu có thể chứa 3 đến 8 hạt đặc với kích thước khoảng 150 nm.Hạt đặc chứa một lượng lớn các nucleotide (ADP, ATP, UTP, GTP); cation (Ca++,

Mg++, K+); các amin (serotonin, histamine) và pyrophosphate Các chất này thamgia vào quá trình cầm máu và quá trình đáp ứng viêm

Trong các loại hạt, hạt α có số lượng nhiều nhất với 50 đến 80 hạt/tiểu cầu,kích thước lớn nhất từ 200 đến 500 nm và cũng đa dạng nhất về thành phần chứa

trong hạt Thành phần của hạt α được trình bày ở Bảng 1.2.

Bảng 1.2 Thành phần của hạt α [20]

Protein kết hợp màng αIIbβ3, GPIb/IX/V, GPVI, P-selectin

Chất tham gia quá trình Yếu tố V, IX, XIII, antithrombin, protein

đông máu S, plasminogen, α2-macroglobulin

Protein dính Fibrinogen, vWF, thrombospondin

Yếu tố tăng trưởng Yếu tố tăng trưởng biểu bì, yếu tố tăng

trưởng tế bào ganChất ức chế Angiostatin, endostatin

Chất điều hòa miễn dịch Complement C4 precursor, IgG

Protein vi sinh Thymosin-β4, thrombocidins1 và 2

 Khu màng

Khu màng chứa hệ thống các ống dày đặc và hệ thống các kênh mở Hệthống các ống dày đặc là khối vật chất không định hình, dày đặc điện tử, là nơi

dự trữ Ca++, tổng hợp prostaglandin và chứa nhiều enzyme cyclooxygenase thamgia vào con đường chuyển hóa prostaglandin [5, 51] Hệ thống các kênh mở làcác ống mở vào trong tiểu cầu như các không bào làm tăng diện tích bề mặt tiểucầu Các hạt tiểu cầu giải phóng các chất cũng như các chất ngoại bào có thểthâm nhập vào tổ chức bên trong tiểu cầu qua hệ thống kênh này (như sự hấp thufibrinogen vào hạt α) [5, 43, 47]

1.1.2 Chức năng tiểu cầu

Ở điều kiện sinh lý bình thường, tiểu cầu lưu hành trong máu ở trạng tháinghỉ Khi xuất hiện tổn thương ở thành mạch, tiểu cầu lập tức bị thu hút và trảiqua một loạt các sự kiện diễn biến liên tục Nhìn chung, quá trình này gồm cácbước quan trọng là bám dính, hoạt hóa, chế tiết và ngưng tập

1.1.2.1 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu ban đầu

 Giai đoạn bám dính ban đầu

Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị phã vỡ, một số protein

ở tổ chức dưới nội mô được bộc lộ và tương tác với tiểu cầu, bao gồm: yếu tốvon Willebrand (vWF), collagen, fibronectin, laminin và thrombospodin-1 [7,40] Trong đó, collagen và vWF có vai trò quan trọng nhất vWF bám vàocollagen, dãn thẳng và bộc lộ nhiều vị trí liên kết (vùng A1) với phức hợpglycoprotein (GP) Ib/IX/V trên màng tiểu cầu Dưới tốc độ dòng máu cao, sựbám dính của tiểu cầu phụ thuộc chủ yếu vào liên kết giữa GPIb và vWF Liênkết này được hình thành nhanh và chịu áp lực đẩy của dòng máu nhưng tồn tạikhông lâu Tuy nhiên, nó lại quan trọng do giúp tiểu cầu “lăn” gần về bề mặtbám dính, tạo điều kiện để collagen liên kết với GPVI và tương tác này lại hoạthóa GPIa/IIa gắn với collagen [1, 32, 40]

Hình 1.2 Giai đoạn bám dính [40]

Sự phối hợp giữa những tín hiệu sinh ra bởi các tương tác vWF – GPIb,collagen – GPVI, collagen – GPIa/IIa thúc đẩy một chuỗi các biến đổi phức tạp bêntrong tiểu cầu dẫn đến hoạt hóa phospholipase Cγ (PLCγ) và tạo ra inositol (1,4,5)trisphosphate (IP3) từ sự thủy phân màng phospholipid IP3 gắn với thụ thể của nótrên hệ thống các ống dày đặc để huy động Ca++ từ kho dự trữ này Nồng độ Ca++nội bào tăng kích hoạt một loạt các biến đổi quan trọng của tiểu cầu có ý nghĩatrong giai đoạn ngưng tập sau đó như thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành hình cầugai, hoạt hóa GPIIb/IIIa, giải phóng chất từ các hạt và tổng hợp TXA2

GPIIb/IIIa được hoạt hóa, liên kết với vùng C1 của vWF đảm bảo tiểu cầu bám dính chặt vào vị trí tổn thương của thành mạch [40].

 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu

Hình 1.3 Giai đoạn ngưng tập tiểu cầu [40]

Ngưng tập tiểu cầu (NTTC) là hiện tượng các tiểu cầu liên kết với nhau đểtạo thành nút tiểu cầu và là giai đoạn tiếp theo của quá trình cầm máu ban đầu.Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao, kích hoạt tiểu cầu biến đổi từ hình đĩa thành hìnhcầu gai Đây được cho tín hiệu đầu tiên của sự NTTC [44] GPIIb/IIIa bộc lộ trên bềmặt tiểu cầu và được hoạt hóa từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có ái lựccao, liên kết được với các protein hòa tan trong huyết tương như vWF, fibronectin,fibrinogen [32] Đồng thời, sự giải phóng chất từ hệ thống các hạt đặc hiệu thôngqua hệ thống các kênh mở cũng diễn ra Các chất chủ vận được giải phóng hay hìnhthành trong quá trình bám dính như ADP, thrombin, TXA2 gắn với thụ thể củachúng trên màng tiểu cầu, hoạt hóa tiểu cầu theo những cơ chế

khác nhau Các tiểu cầu này cũng trải qua một loạt biến đổi như thay đổi hìnhdạng, giải phóng chất từ các hạt và ngưng tập với nhau thông qua liên kếtGPIIb/IIIa – fibrinogen – GPIIb/IIIa, GPIIb/IIIa – vWF, GPIb – vWF Cứ nhưvậy, quá trình hoạt hóa và ngưng tập diễn ra làm bền nút tiểu cầu và chuẩn bị chogiai đoạn tạo cục máu đông [40].

1.1.2.2 Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương

Quá trình đông máu là một chuỗi phản ứng hoạt hóa các yếu tố đông máuhay còn gọi là dòng thác đông máu và kết quả cuối cùng là hình thành cục máuđông từ mạng lưới fibrin Trong đó, có hai con đường khởi động quá trình đôngmáu Con đường đông máu ngoại sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với mô tổnthương, trong khi con đường đông máu nội sinh xảy ra khi máu tiếp xúc với bềmặt lạ [2] Tiểu cầu có vai trò quan trọng trong cả hai con đường này

Màng tiểu cầu có chứa các phospholipid tích điện âm, phosphatidylserine(PS) và phosphatidylethanolamin (PE) Các aminophospholipid này chỉ được bộ

lộ ra khi hoạt hóa tiểu cầu Nhờ đó, các yếu tố đông máu gắn có hồi phục vớimàng tiểu cầu Phức hợp TF-VIIa có thể hoạt hóa yếu tố IX và X một cách hiệuquả Yếu tố XII tự động hoạt hóa trên bề mặt tích điện âm, khởi động con đườngđông máu nội sinh theo nguyên lý khuếch tán diễn tiến cùng với prekallikrein vàkinninogen trọng lượng phân tử cao [7, 45] Tiểu cầu hoạt hóa còn giải phónghàng loạt chất tham gia quá trình đông máu như yếu tố V, IX, XIII, fibrinogen

1.2 Ngưng tập tiểu cầu in vitro hoạt hóa bởi ADP

ADP là phân tử trọng lượng thấp gây NTTC được biết đến đầu tiên Tuy làmột chất chủ vận yếu, ADP đóng vai trò quan trọng trong chức năng tiểu cầu bởi

vì khi được tiết ra từ hạt đặc, nó khuếch đại đáp ứng của tiểu cầu với các chấtchủ vận khác [34] Trong huyết tương giàu tiểu cầu đã chống đông bằng citrate,ADP gây NTTC thông qua tương tác các thụ thể purinergic của nó

1.2.1 Thụ thể purinergic

Khái niệm về thụ thể purinergic lần đầu được mô tả bởi Burnstock vào năm

1972 để chỉ những thụ thể của các nucleotide trên màng tế bào Ban đầu, các thụ thểpurinergic được phân loại dựa trên ái lực của các chất chủ vận Tuy nhiên, hệ thốngsắp xếp đã được thay đổi dựa trên không chỉ những thông tin dược lý mà còn cảnhững thông tin hóa sinh [38] Theo đó, các thụ thể được phân loại thành hai nhómlớn: P1, các thụ thể được hoạt hóa bởi adenosine và P2, các thụ thể được hoạt hóabởi purine và pyrimidine nucleotide (ATP, ADP, UTP và UDP) [41]

Bốn thụ thể purinergic xuất hiện trên màng tiểu cầu là P2X1, P2Y1, P2Y12

và A2A P2X1 được hoạt hóa bởi ATP, trong khi P2Y1 và P2Y12 là hai thụ thể củaADP [33] P2Y1 là thụ thể được tìm ra trước và mỗi tiểu cầu chỉ có khoảng 150thụ thể này P2Y1 là thụ thể bắt cặp với protein Gq Hoạt hóa thụ thể này bởiADP dẫn đến kết quả là nồng độ Ca++ nội bào tăng cao Do đó, P2Y1 điều khiểnquá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu và khởi động quá trình ngưng tập [9,

17, 27] P2Y12 là thụ thể có vai trò trung tâm trong ngưng tập tiểu cầu do ADP và

là đích tác dụng của nhiều thuốc kháng tiểu cầu P2Y12 bắt cặp với protein Gi,khuếch đại và ổn định ngưng tập thông qua tác dụng ức chế AC và tham gia quátrình giải phóng chất từ hạt Sự phối hợp của hai thụ thể này là cần thiết để quátrình NTTC do ADP diễn ra trọn vẹn [9, 27, 42]

 Chất ức chế thụ thể purinergic

Nhiều chất ức chế hay đối vận các thụ thể purinergic đã được phát hiệnhoặc tổng hợp trong quá trình nghiên cứu cơ chế của các thụ thể này cũng nhưquá trình phát triển thuốc mới Nhóm thụ thể của adenosine P1 bị ức chế khôngchọn lọc bởi caffeine, trong khi các dẫn xuất của xanthine được tổng hợp và tối

ưu để ức chế đặc hiệu các thụ thể P1 Phần lớn các chất đối vận nhóm thụ thểP2X đều gắn vào vị trí dị lập thể, không cạnh tranh vào vị trí gắn của ATP Tácdụng của những chất đối vận này đã và đang được đánh giá lâm sàng Các chất

ức chế thụ thể P2Y đa dạng về cấu trúc, một số cạnh tranh vị trí gắn của các chấtchủ vận, một số gắn vào vị trí dị lập thể của thụ thể Trong đó, thụ thể P2Y12 làđích tác dụng của nhiều thuốc kháng tiểu cầu [33]

Một trong những chất ức chế nhóm thụ thể P2Y được sử dụng nhiều trongnghiên cứu là pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2′,4′-disulfonic acid (PPADS).Ban đầu được mô tả là chất ức chế chọn lọc thụ thể P2X1, tuy nhiên PPADS đãđược chứng minh có tác dụng không đặc hiệu nhóm thụ thể P2 Nồng độ ức chếtối đa 50% (IC50) của PPADS với thụ thể P2Y12 là 100 M Ái lực của PPADSvới P2Y1 là KB = 4 – 12 M [30]

1.2.2 Quá trình ngưng tập tiểu cầu in vitro gây ra bởi ADP

Born là người đầu tiên chỉ ra ADP gây ngưng tập tiểu cầu in vitro vào năm

1962 [8] Quá trình ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP gồm hai pha Pha ngưngtập nguyên phát, có hồi phục, nghĩa là tiểu cầu ngưng tập rồi sau đó giải ngưngtập và pha ngưng tập thứ phát, không hồi phục, liên quan chặt chẽ đến phản ứnggiải phóng chất từ các hạt tiểu cầu [19]

1.2.2.1 Pha ngưng tập nguyên phát

P2Y1 chịu trách nhiệm chính cho sự xuất hiện của pha ngưng tập nguyênphát do đáp ứng làm tăng nồng độ Ca++ nội bào của nó, dẫn đến sự thay đổi hìnhdạng của tiểu cầu Lý do tại sao tiểu cầu phải thay đổi hình dạng trước khi ngưngtập có thể là do hình dạng mới làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa hai tiểu cầu Nhìn

chung, quá trình thay đổi hình dạng của tiểu cầu được chia thành hai bước Đầutiên, tiểu cầu từ hình đĩa trở thành hình cầu do các sợi actin bị phân mảnh, kéotheo là sự phá hủy của hệ khung màng spectrin Sau đó, màng tiểu cầu lồi lên,hình thành các chân giả và phần mở rộng (lamellipodia) do sự tổng hợp của cácsợi actin mới Mỗi bước của quá trình thay đổi hình dạng đều có sự tham gia củarất nhiều protein gắn với actin [44].

Hình 1.4 Hiện tượng thay đổi hình dạng [47]

ADP gắn vào thụ thể P2Y1, phát ra tín hiệu hoạt hóa phospholipase C(PLC), kéo theo sự tổng hợp phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) vàinositol (1,4,5) trisphosphate (IP3) IP3 gắn với thụ thể của nó trên hệ thống các ốngdày đặc và huy động Ca++ từ đây Nồng độ Ca++ nội bào tăng cao hoạt hóa gelsolin,cho phép protein này cắt và gắn luôn vào đầu các sợi actin vừa cắt Cofilin cũngđược kích hoạt để giải phóng các G-actin đơn lẻ ra khỏi chuỗi polymer Những G-actin sau đó này gắn với β-thymosin hoặc profilin Sự xuất hiện của PIP2 cắt đứtliên kết giữa hệ khung màng spectrin với màng bào tương Đồng thời, hệ thống viống bị mất cân bằng, các vi ống xoắn lại và chuyển động rộng Điều này làm chotiểu cầu phồng lên thành hình cầu Khi nồng độ Ca++ giảm xuống, các

protein gelsolin, CapZ, cofilin gắn với PIP2, cùng với hoạt động của Arp2/3 vàFormin đã tạo điều kiện để các sợi actin tiếp tục phản ứng trùng ngưng kéo dàichuỗi Chính sự tổng hợp này đã tạo ra lực đẩy để hình thành chân giả và phần

mở rộng Các vi ống lúc này co lại vào trung tâm tiểu cầu, bị phân mảng và phân

bố rải rác Cuối cùng, các protein gắn trở lại đầu các sợi actin và hình thành hìnhdạng cuối cùng của tiểu cầu sau khi được hoạt hóa: hình cầu gai với những chângiả dài vài micromet [44, 47]

Song song với quá trình thay đổi hình dạng, nồng độ Ca++ cao cũng hoạt hóaphospholipase A2, khởi đầu một chuỗi phản ứng để cuối cùng hình thànhthromboxane A2 (TXA2), một chất kích tập, giúp khuếch đại và củng cố ngưng tậpgây ra bởi ADP Sự phối hợp giữa P2Y1 và P2Y12 là cần thiết để giải phóng TXA2[25] Ca++ cũng hoạt hóa yếu tố trao đổi guanine điều hòa bởi canxi và DAG – 1(CalDAG-GEFI) xúc tác chuyển Rap1-GDP thành Rap1-GTP Quá trình biến đổingược lại được xúc tác bởi RASA3 đã bị ức chế do phosphoinositide 3-kinase(PI 3-K) được hoạt hóa bởi tương tác P2Y12 – ADP Điều này cho thấy sự phốihợp giữa thụ thể P2Y1 và P2Y12 là rất quan trọng để ổn định sự ngưng tập giữacác tiểu cầu [9]

Hình 1.5 Cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa [9]

RAP1-GTP kích thích talin và kindlin 3 gắn vào miền nội bào củaGPIIb/IIIa, hoạt hóa thụ thể này từ trạng thái có ái lực thấp thành trạng thái có áilực cao và liên kết được với fibrinogen hòa tan trong huyết tương Nhờ đó, tiểucầu ngưng tập với nhau thông qua cầu fibrinogen, hình thành sự ngưng tậpnguyên phát Tuy nhiên, sự ngưng tập nguyên phát có thể hồi phục nếu phản ứnggiải phóng chất từ các hạt không diễn ra do liên kết giữa các tiểu cầu không đượccủng cố.

1.2.2.2 Pha ngưng tập thứ phát

Ngưng tập thứ phát xảy ra khi có phản ứng giải phóng các chất từ hạt.Phản ứng này giúp bài tiết các thành phần chứa trong hạt α và hạt đặc giúpkhuếch đại quá trình ngưng tập và tạo điều kiện cho quá trình hình thành cụcmáu đông P2Y12 được chứng minh có vai trò trung tâm trong ngưng tập thứphát Điều này được chứng minh ở sự vắng mặt của sóng ngưng tập thứ phát ởnhững bệnh nhân mắc bệnh thiếu hụt P2Y12 [10, 22] Một trong những tác độngcủa thụ thể P2Y12 giúp ổn định sự ngưng tập một cách gián tiếp là ức chếadenylyl cyclase (AC), dẫn đến ngăn cản sự thoái hóa của ATP thành cAMP.cAMP làm giảm NTTC bằng cách hoạt hóa protein kinase A (PKA), dẫn đếnphosphoryl hóa và ức chế thụ thể của IP3, do đó làm giảm huy động Ca++ nội bào[29] Sự hoạt hóa PI 3-K ngoài tham gia vào cơ chế hoạt hóa GPIIb/IIIa như đãtrình bày ở trên, còn dẫn đến sự phosphoryl hóa serine-threonine protein kinaseB/Akt (PKB/Akt) Con đường tín hiệu này đóng vai trò quan trọng trong phảnứng giải phóng chất từ các hạt Tuy nhiên, cơ chế hoạt hóa các protein tham giaphản ứng giải phóng chưa được làm rõ [9, 14]

Hòa màng là cơ chế chính của phản ứng giải phóng chất từ các hạt Trongquá trình thay đổi hình dạng, các hạt được kéo vào trung tâm tiểu cầu do chuyểnđộng của hệ thống vi sợi Các hạt này có thể hòa màng với nhau để tạo thành hạtlớn hơn Sau đó, các hạt này hòa màng với hệ thống các kênh mở hoặc màng bàotương, giải phóng các chất ra môi trường ngoại bào Các protein liên kết màng hạt(v-SNARE) và màng bào tương (t-SNARE) có vai trò quan trọng trong quá trình

hòa màng và được điều hòa chặt chẽ bởi các protein Sec1/Munc, Rab [20] Nhìnchung, quá trình giải phóng chất từ các hạt diễn ra theo ba bước chính: gắn màng(docking), chuẩn bị (priming) và hòa màng Rab27 trên màng hạt đặc (hoặc Rab4trên màng hạt α) cùng với protein giống syntaptotagmin (SLPs) và Munc13-4 làcần thiết cho sự gắn với màng bào tương Sự hoạt hóa tiểu cầu dẫn đến sự thayđổi hình dạng của syntaxin, vốn bị cô lập bởi Munc18b ở trạng thái nghỉ Sau đó,một phức hợp liên kết các SNARE được hình thành trong đó có một v-SNARE(VAMP) và hai t-SNARE (syntaxin và SNAP-23) Sự kết hợp chặt chẽ của cácSNARE cung cấp năng lượng cần thiết cho quá trình hòa màng [16, 39].

Hình 1.6 Cơ chế hòa màng và giải phóng chất từ hạt tiểu cầu [16]

Hạt đặc giải phóng một lượng lớn ADP, ATP, serotonin và các cation ATPhoạt hóa kênh ion P2X1, làm tăng nồng độ Ca++, khuếch đại tín hiệu của thụ thểP2Y1, đóng góp vào sự giải phóng TXA2 và bắt đầu quá trình ngưng tập gây rabởi TXA2 [23] Serotonin làm tăng trương lực mạch máu trong khi Ca++ vàpolyphosphate giúp hình thành cục máu đông Hạt α giải phóng fibrinogen vàvWF, thúc đẩy hình thành liên kết giữa các tiểu cầu [16, 20] Nhờ đó, pha ngưng

tập thứ phát là không hồi phục và quá trình NTTC in vitro do ADP diễn ra trọn

vẹn

1.3 Các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu

Hình 1.7 Các con đường hoạt hóa tiểu cầu và đích tác dụng của các thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu [37]

Thuốc kháng ngưng tập tiểu cầu là những thuốc ức chế hoạt hóa tiểu cầu[5] Do đó, chúng có vai trò quan trọng trong kiểm soát và ngăn ngừa các bệnhmạch vành và mạch máu não liên quan đến huyết khối [37] Nhìn chung, hoạtđộng của tiểu cầu được vận hành bởi ba nhóm chất Nhóm thứ nhất gồm các chấtđược tổng hợp bên ngoài tiểu cầu và tương tác với các thụ thể trên màng tiểucầu: collagen, thrombin Nhóm thứ hai gồm các chất được tổng hợp bên trongtiểu cầu và tương tác với các thụ thể trên màng: ADP, serotonin, prostaglandin

D2 Nhóm thứ ba gồm các chất được tổng hợp và hoạt động bên trong tiểu cầu:cAMP, cGMP Dựa vào cách phân loại trên, các đích tác dụng của thuốc khángtiểu cầu được xác định và làm cơ sở để phát triển thuốc mới [26]

1.3.1 Nhóm ức chế Cyclooxygenase 1 (COX-1)

Aspirin được tổng hợp vào cuối thế kỷ 19, ban đầu được sử dụng để giảmđau, hạ sốt, chống viêm Đến những năm 1970, tác dụng kháng NTTC của aspirinmới được phát hiện và làm rõ cơ chế Cho đến nay, aspirin vẫn là thuốc hàng đầutrong điều trị hội chứng mạch vành cấp, giảm 23% nguy cơ tử vong sau 5 tuần sử

dụng [32] Aspirin ức chế không hồi phục COX-1 bằng cách acetyl hóa enzymenày, ngăn cản sự tổng hợp TXA2, một chất gây ngưng tập rất mạnh Sự ức chếrất mạnh và kéo dài suốt đời sống của tiểu cầu [7, 26] Liều 75 – 100 mg/ngày là

đủ để ức chế hoàn toàn sự tổng hợp TXA2 ở tiểu cầu [18] Ngoài ra, aspirin còn

ức chế tổng hợp prostaglandin I2 (PGI2), có tác dụng chống đông, do ức chếprostacyclin synthetase Tuy nhiên, sự ức chế này không mạnh bằng tác dụng ứcchế COX-1 và cũng không kéo dài [7]

Các thuốc khác thuộc nhóm chống viêm không steroid (NSAID) như mobic,apo – piroxicam cũng có tác dụng chống NTTC với cơ chế tương tự aspirin nhưngtác dụng không dài bởi chúng không acetyl hóa được COX-1 [7, 26]

1.3.2 Nhóm ức chế thụ thể P2Y 12

Nhóm Thienopyridin gồm ticlodipin, clopidogrel và prasugrel là các tiềnthuốc (prodrug), dùng đường uống Sau khi hấp thu vào cơ thể, chúng chuyển hóathành các chất có hoạt tính, ức chế không hồi phục thụ thể P2Y12 của ADP [37]

Nhóm dẫn chất nucleotide gồm ticagrelor và cangrelor Ticagrelor dùngđường uống, gắn vào vị trí dị lập thể của P2Y12, không cạnh tranh vị trí gắn củaADP, ức chế chọn lọc có hồi phục P2Y12 Sản phẩm chuyển hóa của ticagrelorcũng có hoạt tính tương đương [18, 37, 46] Cangrelor dùng đường tiêm tĩnhmạch, thời gian bán hủy của thuốc rất ngắn (3 – 6 phút), thời gian bắt đầu cho tácdụng nhanh (2 phút) và duy trì tác dụng trong khoảng 1 – 2 giờ [37] Vì các đặctính đặc biệt, cangrelor được sử dụng cho những tình huống khẩn cấp, cho bệnhnhân đang chờ phẫu thuật hay không thể sử dụng thuốc đường uống [18, 32]

1.3.3 Nhóm ức chế thụ thể của thrombin

Thrombin là một serine protease, hoạt hóa tiểu cầu chủ yếu thông qua haithụ thể bắt cặp protein G, PAR1 và PAR4, trong đó PAR1 có ái lực với thrombinmạnh nhất Hiện nay, nhóm này mới chỉ có vorapaxar đang được sử dụng.Vorapaxar ức chế chọn lọc có hồi phục PAR1, dẫn đến ức chế NTTC gây ra bởi

thrombin nhưng không ảnh hưởng đến cầm máu ban đầu Do lo ngại về độ antoàn, việc sử dụng vorapaxar trên lâm sàng còn hạn chế [21, 32].

1.3.4 Nhóm ức chế phức hợp GPIIb/IIIa

Nhóm thuốc ức chế phức hợp GPIIb/IIIa là những phân tử bắt chước phối

tử của GPIIb/IIIa, ngăn fibrinogen gắn với các tiểu cầu hoạt hóa, do đó ức chế sựngưng tập của chúng Các thuốc ức chế thụ thể GPIIb/IIIa được sử dụng tronghội chứng mạch vành cấp tính Ba thuốc hiện đang được sử dụng: abciximab,một kháng thể đơn dòng; eptifibatid, một heptapeptid vòng có nguồn gốc từ nọcđộc rắn chuông chứa chuỗi Arg-Gly-Asp giống với trình tự của fibrinogen liênkết với GPIIb/IIIa và tirofiban, một phân tử nhỏ cũng chứa chuỗi Arg-Gly-Asp

Do có nửa đời thuốc ngắn, các thuốc này phải được tiêm truyền liên tục [18, 32]

1.3.5 Nhóm ức chế phosphodiesterase

Dipyridamol là thuốc ức chế phosphodiesterase, do đó làm tăng nồng độcAMP dẫn đến làm ức chế tổng hợp TXA2 và gián tiếp tăng nồng độ adenosine.Ngoài ra, dipyridamol còn có tác dụng giãn mạch vành [7] Nếu chỉ sử dụng mộtmình dipyridamol thì hầu như không có tác dụng nên dipyridamol thường được

sử dụng phối hợp với aspirin hoặc warfarin [26]

Cilostazol là một thuốc ức chế phosphodiesterase mới, có tác dụng giãnmạch và ức chế NTTC Cilostazol được sử dụng để điều trị đau cách hồi ở chân[26]

1.4 Tổng quan về cây Dong riềng đỏ Canna warszewiczii A Dietr

1.4.1 Đặc điểm thực vật, thực trạng phân bố và công dụng

Họ Dong riềng (hay Ngải hoa) Cannaceae là họ thực vật một lá mầm, trong

đó chi Canna là chi duy nhất của họ này với khoảng 10 – 20 loài trên thế giới Hiện nay, ở Việt Nam, các nhà khoa học đã phát hiện 6 loài thực vật thuộc họ Cannaceae.

Đó là Canna edulis Ker., C generalis Bail., C glauca L., C indica L., C sylvestris Rosc và C warszewiczii A Dietr mới được phát hiện và định danh gần đây [3, 6].

C warszewiczii là một loài cây chịu bóng râm, thường mọc dưới