Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của lá cây gai (boehmeria nivea l gaudich)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘIKHOA Y DƯỢC TRẦN THỊ QUỲNH HOA ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO CỦA LÁ CÂY GAI Boehmeria nivea L.. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

TRẦN THỊ QUỲNH HOA

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ

ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO

CỦA LÁ CÂY GAI

( Boehmeria nivea L Gaudich)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

TRẦN THỊ QUỲNH HOA

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ

ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO

CỦA LÁ CÂY GAI

( Boehmeria nivea L Gaudich)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS BÙI THANH TÙNG

Người hướng dẫn 2: ThS NGUYỄN THỊ HUYỀN

LỜI CẢM ƠN

Được làm và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, tôi cảm thấy

vô cùng biết ơn sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới

PGS.TS Bùi Thanh Tùng, ThS Nguyễn Thị Huyền – hai thầy cô giáo đã luôn

quan tâm, giúp đỡ, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôiđược học tập trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường và cho phép tôi thựchiện khóa luận này Đồng thời, tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Dược lý– Dược lâm sàng, Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền đã nhiệttình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiệnkhóa luận

Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh,ủng hộ, động viên, góp ý để tôi hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020

Sinh viên

Trần Thị Quỳnh Hoa

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(high-performance liquid chromatography)

Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose)Mật độ quang

Purine nucleoside phosphorylase

Xanthine oxidase

Xanthin oxyoreductase

Tiêu chuẩn nhà sản xuất

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Acid uric 3

Hình 1.2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể 4

Hình 1.3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase 8

Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase 9

Hình 1.5: Cây lá gai ( Boehmeria nivea L Gaudich) 15

Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B Nivea 17

Hình 2.1: Cây lá gai tại Mê Linh, Hà Nội 21

Hình 2.2: Cao toàn phần ethanol lá Gai 22

Hình 2.3: Quy trình chiết xuất dược liệu 23

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình thí nghiệm 29

Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử 32

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của Acid ascorbic……… 33

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử…… 35

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của Allopurinol…… 35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các thuốc và hóa chất cần thiết……… 23

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các mẫu thử 27

Bảng 3.1: Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử 31

Bảng 3.2: Bảng giá trị IC50 tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử 343

Bảng 3.3: Tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử……… 34

Bảng 3.4: Bảng giá trị IC50 tác dụng ức chế XO của các mẫu thử……… 36

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 3

1.1 Tăng acid uric máu 3

1.1.1 Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric 3

1.1.2 Tăng acid uric máu 4

1.2 Enzym xanthine oxidase 6

1.2.1 Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric6 1.2.2 Cấu trúc, đặc điểm lý hóa 7

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase 9

1.2.4 Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase 10

1.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro 10

1.3 Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa 11

1.3.1 Khái quát 11

1.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro 13

1.4 Cây lá gai ( Boehmeria nivea L Gaudich) 14

1.4.1 Tổng quan 14

1.4.2 Đặc điểm thực vật 14

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 21

2.1.2 Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu 21

2.1.4 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH 25

2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai 26

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ 31

3.1 Kết quả chiết xuất dược liệu 31

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH 31

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của cao chiết phân đoạn lá Gai 33

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37

4.1 Về kết quả chiết xuất dược liệu 37

4.2 Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH 37

4.3 Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các

phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

KẾT LUẬN 41

ĐỀ XUẤT 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong vài thập kỷ qua, tỷ lệ tăng acid uric máu đang gia tăng nhanh chóngtrong dân số thế giới Bằng chứng nổi bật cho thấy tăng acid uric máu phổ biếnkhông chỉ ở các nước phát triển [55, 71] mà còn gia tăng ở các nước thu nhậpthấp và trung bình với tần suất cao [24, 38], trong đó có Việt Nam Một sốnghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng acid uric máu có liên quan đến một sốbệnh bao gồm đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết áp, bệnhtim mạch và hội chứng chuyển hóa [25, 32, 70, 72] Đặc biệt, tăng acid uric máu

đã được biết từ rất lâu là yếu tố nguy cơ hàng đầu của bệnh gout [45, 66]

Ngoài ra, khi tăng acid uric máu sẽ gây ra tình trạng stress oxy hóa ở bệnhnhân gout [13] Xanthine oxidase (XO) là một enzym quan trọng, xúc tác phảnứng chuyển hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric Hoạtđộng của enzym XO là nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do, góp phầngây tổn thương đến nhiều quá trình bệnh lý bao gồm viêm, xơ vữa động mạch,ung thư, lão hóa và bệnh gout [49, 50] Do đó, ức chế hoạt động của XO dẫn đếngiảm nồng độ acid uric và giảm sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS)

Từ xa xưa con người đã khám phá được sức mạnh thiên nhiên, biết sửdụng nhiều loài thực vật nhằm mục đích chữa bệnh và được đúc kết trong cáckinh nghiệm dân gian trong những bài thuốc y học cổ truyền dùng để điều trị cácchứng bệnh, trong đó có thống phong (bệnh gout) Cây lá gai có tên khoa học là

Boehmeria nivea (L.) Gaudich có chứa nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid,

vitamin, khoáng chất…[14, 21, 23, 61] xuất hiện trong các bài thuốc y học cổtruyền để điều trị các bệnh như lợi tiểu, cầm máu và biết đến với tác dụng chốngviêm, bảo vệ gan

Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu khoa học đượccông bố về tác dụng điều trị bệnh gout, khả năng chống oxy hóa cũng như ức chếenzym XO của lá cây Gai Vì vậy, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Đánh giá

tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Xanthine Oxidase in vitro của lá cây Gai (Boehmeria nivea L Gaudich) với mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH.

2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các phân đoạn dịch chiết

từ lá cây gai

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Tăng acid uric máu

1.1.1 Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric

Acid uric là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng từ nhóm purin ngoại sinh vàchuyển hóa purin nội sinh [74] Trong số các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đếnviệc sản xuất acid uric, chế độ ăn uống đóng vai trò quan trọng Thực tế này đãđược các nhà điều tra châu Âu ghi nhận từ kinh nghiệm của họ trong hai cuộcchiến tranh thế giới và được chứng minh thông qua sự gia tăng của bệnh gout ởNhật Bản kể từ Thế chiến thứ II (Lượng protein trên đầu người đã tăng gấp đôitrong thời kỳ hậu chiến ở nước này) [56] Việc sản xuất acid uric nội sinh chủyếu từ gan [42, 69, 74], ruột và các mô khác như cơ bắp, thận và nội mô mạchmáu [69, 74] Ở người bình thường, acid uric được bài tiết chủ yếu qua thận(chiếm 2/3 tổng lượng acid uric được tạo ra mỗi ngày) [69, 74] Tuy nhiên, một

tỷ lệ nhỏ hơn nhưng đáng kể, acid uric được bài tiết trong dịch tiêu hóa vào ruột

Ít hơn 1% của tổng lượng acid uric được bài tiết qua mồ hôi [56]

Acid uric là một hợp chất hữu cơ dị vòng có công thức C5H4N4O3 dihydro-1H-purine-2,6,8 (3H) -trione), trọng lượng phân tử 168 Dalton

(7,9-Hình 1 1: Acid uricNhiều enzym có liên quan đến việc chuyển đổi hai purin acid nucleic làadenin và guanin thành acid uric như deaminase, nucleotidase (NT), purinnucleoside phosphorylase (PNP), xanthin oxidease (XO), hypoxanthine-guaninphosphoribosyl transferase (HGPRT) [33, 74]

Hình 1 2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [33].

1.1.2 Tăng acid uric máu

1.1.2.1 Định nghĩa

Tăng acid uric máu khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn tối đa của độhòa tan của urat trong dung dịch có nồng độ natri như huyết tương, cụ thể là:Trên 7,0 mg/dl (tức trên 420 mol/l) đối với nam giới và trên 6,0 mg/dl (360mol/l) đối với nữ giới [5]

1.1.2.2 Dịch tễ học

▪ Tại Mỹ, tỷ lệ tăng acid uric máu (> 0,40 mmol/l hoặc 6,8 mg/dl) là 14,6%dân số (ước tính 32,5 triệu người), phổ biến hơn ở nam giới (24,7%) sovới nữ giới (5,2%) Tăng acid uric máu ở người Mỹ gốc Mexico ít phổbiến hơn so với người da trắng và người Mỹ gốc Phi [55]

▪ Tại Trung Quốc, tỷ lệ tăng acid uric máu chiếm 18,1% dân số, trong đó,16,0% đối với nam giới và 19,4% đối với nữ giới Tỷ lệ tăng acid uric máu

của người Hán thấp hơn một chút so với các nhóm dân tộc khác (18,0% sovới 19,5%) [41].

▪ Tại Nhật Bản, trong nghiên cứu Yamagata (2016) về “Nồng độ acid urichuyết thanh và tỷ lệ tử vong trong dân số Nhật Bản” đã chỉ ra rằng tỷ lệtăng acid uric máu là 17,4% ở nam giới và 2,2% ở nữ giới [73]

▪ Tại Việt Nam, nghiên cứu về mối liên hệ giữa tăng acid uric máu với bệnhtiểu đường type 2 trong dân số Việt Nam, nhóm tác giả đã chỉ ra rằng tăngacid uric máu cao hơn nhiều trong nhóm người bị rối loạn đường huyết lúcđói, nhóm rối loạn đường huyết lúc đói kết hợp với rối loạn dung nạpglucose, nhóm người tiểu đường so với nhóm dung nạp glucose bìnhthường Nồng độ acid uric không có sự khác biệt đáng kể giữa hai nhómdung nạp glucose bình thường và nhóm dung nạp glucose kém Nam giới

có tỷ lệ tăng acid uric máu cao hơn so với nữ giới trong nhóm dung nạpglucose bình thường, nhóm rối loạn đường huyết lúc đói và nhóm tiểuđường [68]

Như vậy, sự tăng acid uric có sự khác nhau giữa các quốc gia, tộc người,giữa người bình thường và những người có bệnh lý mắc kèm Tuy nhiên, đa

số tỷ lệ tăng acid uric ở nam giới cao hơn nữ giới

1.1.2.3 Nguyên nhân tăng acid uric máu

Nguyên nhân gây tăng acid uric máu là do tăng sản xuất acid uric, thậngiảm bài tiết acid uric hoặc kết hợp cả hai nguyên nhân trên [42, 74]

Tăng tổng hợp acid uric (dưới 5%) bao gồm: khiếm khuyết enzym, hoạt

động quá mức của phosphoribosilpyrophosphate synthetase, giảm hoạt động củahypoxanthine phosphoribosiltransferase, bệnh lưu trữ glycogen (loại I, III, V,VII), tình trạng bệnh dẫn đến sản xuất quá mức purine, rối loạn tủy, bệnh ác tính,tan máu, bệnh vẩy nến, tăng dị hóa hoặc giảm tổng hợp ATP, nghiện rượu, thiếuoxy mô, tập thể dục cơ bắp quá mức, liên kết với thuốc hoặc thói quen ăn uống,vitamin B12, fructose, tiêu thụ purine quá mức

Giảm bài tiết acid uric ở thận (trên 95%) bao gồm: khiếm khuyết di truyền của chức năng ống thận (không xác định), tình trạng bệnh dẫn đến giảm

bài tiết acid uric, suy thận, mất nước, nhiễm toan (thiếu oxy mô), bệnh cườngcận giáp, suy giáp, hội chứng Bartter, sản giật, liên kết với thuốc hoặc thói quen

ăn uống, thuốc lợi tiểu, ethanol, pyrazinamid, lạm dụng thuốc nhuận tràng,salicylat (liều thấp)

Tăng tổng hợp và giảm đào thải acid uric bao gồm: nghiện rượu, thiếu men Glucose-6-phosphatase, thiếu men Fructose-1-phosphate-aldolase.

1.1.2.4 Hậu quả tăng acid uric máu

▪ Tăng acid uric máu và bệnh gout

Khi nồng độ acid uric trong máu lớn hơn 7 mg/dl, vượt quá nồng độ hòatan tối đa, urat kết tủa thành các vi tinh thể mono sodium urat Sự lắng đọng củacác hạt này ở các vị trí khác nhau gây ra các tổn thương khác nhau Các vi tinhthể urat lắng đọng tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi Sự khởi phát cơn goutcấp xảy xa khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ; sự lắng đọng vi tinh thể cạnhkhớp, màng hoạt dịch khớp, trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xươngkhớp mạn tính do gout, và cuối cùng, viêm thận kẽ (bệnh thận do gout) là do tinhthể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận [5]

▪ Tăng acid uric máu và các bệnh khác liên quan

Một số nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng acid uric máu có liên quanđến một số bệnh bao gồm đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết

áp, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa [25, 32, 70, 72]

Như vậy, hạ acid uric máu là một mục tiêu điều trị trong bệnh gout và cácbệnh lý khác liên quan đến tăng acid uric máu

1.1.3 Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric

Năm 1902, Schardinger và các đồng nghiệp đã báo cáo về một chất chưaxác định có trong sữa tươi nguyên chất có thể làm mất màu xanh metylen khi bổsung formaldehyd Gần 20 năm sau, chất này cũng được tìm thấy trong sữa bò,

trong gan, thận, lá lách và phổi của chuột, có khả năng oxy hóa hypoxanthinthành xanthin và sau đó xanthin thành urate trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí.Những phát hiện này đã thúc đẩy rất nhiều sự quan tâm từ các nhà nghiên cứuenzym và sinh hóa, dẫn đến sự phân lập, tinh chế và nghiên cứu về xanthinoxyoreductase (XOR) [43].

Thực tế, enzym XO được tìm thấy trên nhiều động vật có vú [15, 47],chim, bò sát, vi khuẩn Trong tất cả các động vật có vú được nghiên cứu, enzym

XO có trong gan, ruột, thận, phổi, cơ tim, não, huyết tương và hồng cầu, và các

mô khác Trong đó, gan và ruột có hoạt động XOR cao nhất [19]

.Xanthine oxidase là một enzym có vai trò quan trọng trong quá trình tạo

ra acid uric Dưới tác dụng xúc tác của enzym XO, hypoxanthin được chuyểnthành xanthin và xanthin được chuyển hóa thành acid uric Ức chế XO sẽ làmgiảm nồng độ acid uric, dẫn đến tác dụng chống tăng acid uric [67] Ngày nay,việc kiểm soát nồng độ acid uric là một yếu tố quan trọng trong phòng ngừa vàđiều trị các bệnh liên quan đến tăng acid uric và gout [27]

1.2 Enzym xanthine oxidase

1.2.1 Cấu trúc, đặc điểm lý hóa

Xanthine oxidase là một protein có khối lượng khoảng 300 kDa, gồm 2 tiểuđơn vị [18, 30] Mỗi tiểu đơn vị gồm 4 trung tâm oxy hóa khử : một phần phụmolybden (Mo-co), một FAD và hai Fe2S2 (trung tâm Fe/S) Phần phụ củamolybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tửlưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxy và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác

Hình 1 3: Cấu trúc không gian xanthine oxidaseFAD (màu đỏ), Fe2S2 (màu cam), phần phụ molypden (màu vàng)

Cơ chế hoạt động:

Enzym XO xúc tác quá trình hydroxyl hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric tại trung tâm Mo-co Ở trạng thái oxy hóa, proton từ nhóm Mo-OH tấn công trung tâm ái nhân của cơ chất, hai electron được chuyển đến nguyên tử Mo (Mo VI đến Mo IV ) của Mo-co Sự vận chuyển electron đến FAD thông qua hai trung tâm Fe/S được chuyển tiếp nhanh chóng và tạo

ra MoV Sau đó, được tái sinh bởi hydroxyd từ dung môi khi kết thúc phản ứng [57].

8

Hình 1 4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase [20]

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase

Nồng độ cơ chất: Khi nồng độ cơ chất xanthin tăng thì tốc độ phản ứng tăng, lượng acid uric tạo ra càng nhiều Tuy nhiên đến một mức nào đó, tốc độ

phản ứng sẽ không tăng thêm nữa khi enzym đã bão hòa cơ chất [7]

Nồng độ enzym: Khi nồng độ enzym tăng thì tốc độ phản ứng tăng Tuy

nhiên, nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽtác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phảnứng sẽ không tăng lên nữa [7]

nhiên, nhiệt độ quá cao enzym sẽ bị biến tính Nhiệt độ cũng ảnh hưởng trong quá trình bảo quản enzym XO được bảo quản ở nhiệt độ 2-8oC [54].

9

pH: pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym Với XO, pH thích hợp từ

7,5-8,0 [16]

1.2.3 Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase

Allopurinol (1,5-dihydro-4H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-one) ban đầuđược Falco tổng hợp vào giữa những năm 50 của thế kỷ trước trong một nỗ lực

để tạo ra các chất chống ung thư mới, nhưng nó đã được tìm thấy có hoạt tính ứcchế xanthine oxidase, làm giảm cả nồng độ acid uric trong huyết thanh và nướctiểu Năm 1963, Rundles và đồng nghiệp lần đầu tiên đã thử nghiệm lâm sàngthành công về việc sử dụng allopurinol trong điều trị bệnh gout Thuốc đã đượcFDA chấp thuận vào năm 1966 [19]

Cả allopurinol và oxypurinol (chất chuyển hóa chính của nó) đều ức chếenzym xanthine oxidase, do đó làm giảm sinh tổng hợp acid uric dẫn đến giảmnồng độ acid uric máu, thúc đẩy sự thanh thải hypoxanthin và xanthin qua nướctiểu, vì vậy giảm hình thành sỏi thận và các cơn đau thận hơn [8, 19]

Allopurinol có ứng dụng lâm sàng trong điều trị bệnh gout và các trườnghợp tăng acid uric thứ phát (do dùng thuốc chống ung thư, thuốc lợi tiểuthiazid…) [8]

Tác dụng không mong muốn khi dùng thuốc có thể gây kích ứng tiêu hóa,độc với gan và dị ứng da, có thể gặp cơn gout cấp ở giai đoạn đầu điều trị Khắcphục bằng cách dùng kết hợp với colchicin hoặc các thuốc chống viêm khác [8]

1.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro

Các phương pháp xác định hoạt hoạt độ enzyme XO in vitro thường đo

lượng các sản phẩm chuyển hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thànhaxit uric, cũng như sản xuất gốc superoxide, hydro peroxide hoặc NADH

Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric

Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình oxy hóaxanthin dưới tác dụng xúc tác của XO theo phản ứng:

Xanthine oxidase

Xanthin + H2O + O2 Acid uric + H 2 O 2

Lượng acid uric được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290

nm, lượng acid uric tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym [60]

Phương pháp này thường được dùng trong thử nghiệm in vitro do tính thuận tiện,

nhạy đối với enzym tinh khiết

Phương pháp hóa phát quang phát hiện O 2- gây ra bởi XO

Luminol là chất phát quang hóa học và đặc biệt các chất phát quang có nguồngốc lucigenin (LDCL) thường được sử dụng để phát hiện O2- in vitro sản xuất

bởi hệ thống enzyme hoặc các tế bào nguyên vẹn [19]

Phương pháp xác định O 2 .- bằng thử nghiệm Cytochrom c

Việc sản xuất O2.- có thể được phát hiện trong các tế bào nguyên vẹn nhờ dạngsắt có trong cytochrom c:

Các tế bào được ủ với Fe3+-Cyt c và độ hấp thụ là đo ở 550 nm [19]

1.3 Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa

1.3.1 Khái quát

Chất chống oxy hóa là một chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa docác chất khác gây ra Trong cơ thể, chúng bảo vệ các thành phần tế bào quan trọngbằng cách trung hòa các gốc tự do (là sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa

tế bào Các gốc tự do được tạo ra khi oxy được chuyển hóa hoặc hình thành

trong cơ thể.) Các gốc tự do có electron chưa ghép cặp vỏ ngoài của phân tử.Đây là lý do, tại sao các gốc tự do có khả năng phản ứng cao và có thể phản ứngvới protein, lipid, carbohydrate và DNA Những gốc tự do này tấn công các phân

tử ổn định gần nhất để “đánh cắp” electron để trở thành trạng thái bền vững Khiphân tử bị tấn công mất điện tử, nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, bắt đầu phảnứng dây chuyền, cuối cùng dẫn đến phá hủy tế bào

Các gốc tự do có thể là dẫn xuất oxy (ROS, các loại oxy phản ứng) hoặc

có nguồn gốc nitơ (RNS, các loại nitơ phản ứng) Các phân tử có nguồn gốc oxy

là O-2 (superoxide), HO (hydroxyl), HO2 (hydroperoxyl), ROO (peroxyl), RO(alkoxyl) là gốc tự do và H2O2 Các nitơ phản ứng chủ yếu là NO (oxit nitric),ONOO (peroxy nitrate), NO2 (nitơ dioxide) và N2O3 (dinitrogen trioxide)

Trong một tế bào bình thường, chất chống oxy hóa và chất oxy hóa cân bằng.Tuy nhiên, sự cân bằng này có thể được thay đổi, khi các chất oxy hóa tăng hoặckhi mức độ chất chống oxy hóa bị giảm Giai đoạn này được gọi là stress oxy hóa.Stress oxy hóa dẫn đến tổn thương các phân tử sinh học bao gồm axit nucleic,protein, axit béo không bão hòa đa (PUFA) và carbohydrate Peroxid hóa lipid là sựsuy giảm oxy hóa của lipid không bão hòa đa và nó liên quan đến ROS và các ionkim loại chuyển tiếp Đây là một cơ chế phân tử của tổn thương tế bào dẫn đến mộtloạt các sản phẩm gây độc tế bào, hầu hết là các aldehyd, như malondialdehyd(MDA), 4 hydroxynonrnal (HNE), stress oxy hóa gây ra tổn thương tế bào nghiêmtrọng dẫn đến nhiều loại bệnh ở người như bệnh Alzheimer, Parkinson, xơ vữa độngmạch, ung thư, viêm khớp, suy giảm miễn dịch và rối loạn thoái hóa thần kinh, Thiếu hụt chất chống oxy hóa tự nhiên cũng dẫn đến stress oxy hóa, biểu thị cácchất chống oxy hóa tự nhiên có trong cơ thể người chết

Có 2 loại chất chống oxy hóa là chất chống oxy hóa enzym và không enzym

Trong chất chống oxy hóa enzym có chất chống oxy hóa sơ cấp và thứ cấp [46]

Chất chống oxy hóa sơ cấp là các chất chống oxy hóa phá vỡ chuỗi phảnứng với các gốc lipid và chuyển chúng thành các sản phẩm ổn định hơn Chấtchống oxy hóa của nhóm này chủ yếu là các phenolic, trong cấu trúc và bao gồm

các chất sau: Khoáng chất chống oxy hóa, vitamin chống oxy hóa, các chất hóahọc thiên nhiên bao gồm các flavonoid, catechin, carotenoid, -carotene,lycopene, diterpene, tiêu đen, tỏi.

Chất chống oxy hóa thứ cấp là những hợp chất phenolic thực hiện chứcnăng thu giữ các gốc tự do và ngăn chặn các phản ứng dây chuyền Các hợp chấtbao gồm: butylated hydroxy anisole (BHA), butylated hydroxy toluene (BHT) vàpropyl gallate (PG)

1.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro

Có nhiều phương pháp để đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro Dựa trên

phản ứng hóa học giữa các hợp chất chống oxy hóa và các gốc tự do, các phươngpháp đánh giá khả năng chống oxy hóa được phân loại thành hai loại [26]

1 Thử nghiệm dựa trên phản ứng chuyển nguyên tử hydro (HAT)

2 Thử nghiệm dựa trên phản ứng chuyển điện tử (ET)

Thử nghiệm ET bao gồm: phương pháp DPPH, phương pháp nhặt gốcSuperoxide anion, FRAP, TEAC sử dụng ABTS, thử nghiệm CUPRAC, FCR-xét nghiệm tổng phenol, thử nghiệm DMPD, ức chế gốc oxit nitric, thử nghiệmTBARS

Thử nghiệm dựa trên HAT bao gồm: ORAC, phương pháp ABTS, thửnghiệm Crocin, TRAP, hoạt động quét gốc hydroxyl, HORAC, thử nghiệmLPIC, quét các gốc H2O2, IOC, thử nghiệm PCL, thử nghiệm -carotene-axitlinoleic (linoleate)

Một số phương pháp chống oxy hóa in vitro khác: hàm lượng axit ascoric,

CAA, đo quang EPR, thử nghiệm phosphomolybdenum, phương pháp Xanthineoxyase, hoạt động chelating kim loại

Trong số các phương pháp nhặt gốc tự do, phương pháp picrylhydrazyl (DPPH) còn nhanh hơn, đơn giản (tức là không liên quan đếnnhiều bước và thuốc thử) và không tốn kém so với các mô hình thử nghiệm khác

1,1-diphenyl-2-1.4 Cây lá gai (Boehmeria nivea L Gaudich)

1.4.1 Tổng quan

Cây lá gai (Boehmeria nivea (L.) Gaudich), còn có nhiều tên gọi khác là

Gai tuyết, Trữ ma, Tầm Ma,…[6, 10], là một loài thực vật có hoa thuộc họUrticaceae, được trồng rộng rãi ở các nước Đông Á như Hàn Quốc, Ấn Độ vàTrung Quốc [34, 40, 65] Tại Việt Nam, cây mọc rải rác khắp nơi, được trồng ởmột số tỉnh miền Bắc, khu vực miền Trung đến các tỉnh Trung Nam bộ [1].Trong dân gian, từ lâu đời, lá gai vẫn thường được sử dụng như một loại thuốclợi tiểu và cầm máu, và được cho là có đặc tính bảo vệ gan, chống oxy hóa vàchống viêm [11, 37]

1.4.2 Đặc điểm thực vật

1.4.2.1 Tên khoa học

Boehmeria nivea (L.)

Gaudich 1.4.2.2 Phân loại thực vật

1.4.2.3 Tên địa phương

Gai tuyết, Trữ ma, Tầm ma, Co pán (Thái), Bẩu pán (Tày), Chiểu đủ

(Dao)….[11]

1.4.2.4 Đặc điểm thực vật

Cây nhỏ cao 1,5-2m; gốc hoá gỗ Rễ dạng củ, hình trụ thường cong queo,màu vàng chứa nhiều nhựa gôm Cành màu nâu nhạt, có lông Lá lớn, mọc so le,hình trái xoan dài 5-16 cm, rộng 9,5-14 cm, mép khía răng, mặt trên xanh, mặtdưới trắng bạc phủ lông mềm và mịn; lá kèm hình dải nhọn, thường rụng, cuống

lá màu đo đỏ Hoa đơn tính cùng gốc Hoa đực có 4 lá đài và 4 nhị Hoa cái cóđài hợp chia làm 3 răng Quả bế mang đài tồn tại Mùa hoa tháng 5-8, mùa quảtháng 8-11 [6, 10]

Hình 1 5: Cây lá gai (Boehmeria nivea L Gaudich)

1.4.2.5 Phân bố

Cây có nguồn gốc ở khu vực nhiệt đới châu Á, phân bố ở các nướcBhutan, Campuchia, Trung Quốc (Nam An Huy, Phúc Kiến, Nam Cam Túc,Quảng Đông, Quảng Tây Quý Châu, Nam Hà Nam, Hải Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam,Giang Tây, Nam Thiên Tây, Tứ Xuyên, Vân Nam, Chiết Giang), Ấn Độ,Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Nepal, Sikkim, Đài Loan, Thái Lan, ViệtNam [17, 34, 40, 65] Tại Việt Nam, cây mọc rải rác khắp nơi, thường mọc ở rìarừng, bụi cây, những nơi ẩm ướt dọc theo suối, ven đường, được trồng ở một sốtỉnh miền Bắc, khu vực miền Trung đến các tỉnh Trung Nam bộ [1]

1.4.2.7 Thành phần hóa học

Kết quả định tính trong dịch chiết lá B nivea chỉ ra các thành phần hóa

học có chứa trong dịch chiết bao gồm anthraquinon, phenol, tinh dầu, steroid,terpen, acid amin, polysaccharid và acid hữu cơ, lacton và coumarin [63] TheoYongsheng Chen và cộng sự (2014), lá Gai có chứa các hợp chất có tác dụngchống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm và tác dụng chống ung thư đối vớiung thư phổi và gan, trong đó bao gồm các phenolic và flavonoid [21]

Tại Hàn Quốc, các công trình nghiên cứu xác định thành phần hóa học của lá

gai bằng HPLC đã chỉ ra nhiều hợp chất có tác dụng dược lý: lá B nivea chứa một

lượng lớn các hợp chất phenolic có khả năng ức chế men chuyển angiotensin; cáchợp chất polyphenolic hay flavonoid là epicatechin, epicatechin gallate và rutin,acid chlorogenic được biết đến với các đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chốngkhối u, chống vi khuẩn, chống vi rút và chống dị ứng [22, 37, 59] Bên cạnh đó,theo 3 tác giả Mi-Ran Park và cộng sự (2010), Ah-Ra Kim và cộng sự (2014),Sunghun Cho và cộng sự (2017) đều chỉ ra rằng lá Gai chứa nhiều loại amino acid,acid béo, acid hữu cơ, carbohydrat, vitamin, khoáng chất [14, 23, 52]

Trong đó, các phenolic bao gồm: chlorogenic acid, caffeic acid, coumaric acid, ferulic acid, benzoic acid

4-Các flavonoid bao gồm: epicatechin, rutin, isoquercetin, hyperoside

Các carbohydrate bao gồm: sucrose, glucose, fructose, galactose, mannitol

Các amino acid bao gồm: threonine, glutamic acid, proline, methionine,tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine, arginine

Các acid béo bao gồm: palmitic acid, margaric acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, behenic acid, tricosylic acid, lignoceric acid

Các acid hữu cơ bao gồm: oxalic acid, citric acid, succinic acid

Các vitamin bao gồm: vitamin A (retinol), vitamin E (α- tocopherol), vitamin C

Các khoáng chất bao gồm: Ca, Fe, K, Mg, Mn, Zn, Na

Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B Nivea [22]

1 β-sitosterol, 2 Loliolide, 3 Rutin, 4 Pyrimidinedione

1.4.2.8 Công dụng cổ truyền

Trong y học cổ truyền ở Cộng hòa dân chủ Congo (DR Congo), toàn bộ câyđược nghiền nát và ngâm trong nước để được một loại thuốc bôi lên cơ thể điều trịbệnh thấp khớp, bệnh phong, bệnh ngoài da và vết thương, thấm vào mắt để điều trịbệnh về mắt, thấm vào mũi chống viêm mũi, và ngâm rượu để điều trị tiêu chảy vàgiun sán Ở Malaysia, lá gai được sử dụng để đắp mụn nhọt và chống đầy

hơi; thuốc sắc của rễ và lá được dùng làm thuốc bổ trong trường hợp kiết lỵ và rễđược sử dụng trên các vết loét Ở Ấn Độ, rễ và lá được xem là có tác dụng làmmát, lợi tiểu và được sử dụng trong một số rối loạn bao gồm rối loạn tiểu tiện,viêm niệu sinh dục và sa tử cung Ở Trung Quốc và Đài Loan, cây được sử dụngcho mục đích lợi tiểu, hạ sốt và bảo vệ gan [51].

Một số bài thuốc sử dụng lá gai:

1 Lá gai dùng riêng hoặc giã đắp với cây cứt lợn có tác dụng cầm máu,làm lành vết thương; lá gai phối hợp với lá vông, lạc tiên, rau má, nấuthành cao, pha đường uống, làm thuốc an thần, gây ngủ [11]

2 Rễ và lá gai còn là thuốc lợi tiểu, chữa đi tiểu ra máu với liều dùng trung bình 10 – 30g mỗi ngày, sắc nước uống [11]

1.4.2.9 Tác dụng dược lý

1 Dịch chiết bằng cồn từ cây gai trên ống nghiệm có tác dụng thúc đẩy quátrình đông máu, trên thí nghiệm cắt đuôi chuột nhắt để xác định thời gianchảy máu, thuốc có tác dụng cầm máu Trong thí nghiệm lấy máu từ tĩnhmạch sau hố mắt trên chuột nhắt trắng, dạng thuốc trên với liều 0,3ml bằngđường tiêm phúc mạc hoặc với liều 0,5ml bằng đường uống có tác dụng rútngắn thời gian đông máu Trên những chó thí nghiệm gây xuất huyết dưới dabằng cách dùng chất cobalt để chiếu xạ thì dạng chế phẩm trên của gai có tácdụng làm giảm hiện tượng xuất huyết một cách rõ rệt [11]

2 Acid chlorogenic có trong dược liệu là một chất ít độc, có tác dụng tăngcường hiệu lực của adrenalin, thông tiểu tiện, kích thích sự bài tiết mật và

có khả năng ức chế tác dụng của pepsin và trypsin Acid chlorogenic còn

có tác dụng diệt nấm và kháng khuẩn [11]

3 Muối ammonium của acid cafeic được phân giải từ acid chlorogenic, trên thỏthí nghiệm tĩnh mạch với liều lượng 7mg/kg có tác dụng rút ngắn thời gianđông máu 58%, rút ngắn thời gian chảy máu 52% Trên chuột nhắt trắng đãdùng cobalt để chiếu xạ, dùng acid cafeic tiêm xoang bụng với liều lượng14mg/kg, tiêm liên tục trong 2 tuần lễ thì số lượng bạch cầu tăng

76,4% và số lượng tiểu cầu tăng 45,6% Với nồng độ pha loãng 1: 128 trênống nghiệm, thuốc có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn vàng [11].

bán mãn trên thỏ thí nghiệm với liều 14mg/kg tiêm liên tục trong 10 ngày qua kiểm tra thấy các cơ quan tim, gan, thận về mặt công năng và tổ chức học không có biểu hiện gì về biến đổi

bệnh lý [11]

1.4.2.10 Một số nghiên cứu về tác dụng của lá gai trên thế giới liên quan

đến tác dụng chống oxy hóa và bệnh gout

Nghiên cứu của Mi Jeong Sung và cộng sự (2013) đã đánh giá tác dụngchống viêm của chiết xuất ethanol 70% từ lá gai bằng cách đo sự bài tiết của oxitnitric (NO), yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) và interleukin 6 (IL-6), đượckích thích bởi lipopolysacarit (LPS) trong các đại thực bào RAW264.7, kết quảchỉ ra rằng lá gai có tác dụng chống viêm đối với các đại thực bào bằng cách ứcchế p38 và JNK (là các phân tử tín hiệu đóng vai trò trung gian đáng kể trongviệc sản xuất các cytokine gây viêm), cho thấy lá gai có thể được sử dụng nhưmột thành phần có tác dụng chống viêm [58]

Ngoài ra, tác dụng chống oxy hóa của lá gai đã được chứng minh bởi JinWoo Nho và cộng sự (2010) bằng phương pháp đo DPPH với IC50 là 97 g/ml[48] Trong nghiên cứu của Qin Wang và cộng sự (2018) về đánh giá khả năng

chống oxy hóa và hoạt động ức chế α -glucosidase chiết xuất từ mười giống lá

gai khác nhau ở Trung Quốc đều cho thấy tác dụng chống oxy hóa và khả năng

ức chế α-glucosidase của dược liệu này [62]

1.4.2.11 Một số nghiên cứu về tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym

xanthine oxidase của lá gai tại Việt Nam

Nguyễn Thị Thu Hoài (2014) đã nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc Việt

Nam có tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro trên 147 dược liệu bằng dung

môi methanol cho thấy lá cây gai thuộc một trong tám mẫu dược liệu có khảnăng ức chế XO mạnh nhất (IC50 = 10,60 µg/ml) [2]

Phạm Ngọc Khôi (2019) đã ghiên cứu khảo sát khả năng ức chế enzymxanthine oxidase và kháng oxy hóa từ cao chiết lá cây gai cho thấy giá trị IC50của cao chiết ethanol 50% từ lá gai là 273 µg/ml, tuy kết quả IC50 của cao chiếtyếu nhưng các hợp chất sinh học trong cao chiết lá cây gai có khả năng ức chếenzym XO và có tiềm năng sử dụng cao chiết lá cây gai như thực phẩm bổ sungtrong điều trị bệnh gout [4].

Trong đề tài này, nhóm nghiên cứu tiếp tục đánh giá tác dụng của lá cây gai

ở các phân đoạn khác nhau với mục đích tìm ra phân đoạn dịch chiết có hoạt tínhcao nhất