PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Nitrosomonas TRONG NƯỚC THẢI

Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật để xử lý nước thải bị ô nhiễm ngày một phổ biến. Quá trình loại bỏ nitơ dư thừa trong nước chủ yếu nhờ vào hoạt động của các nhóm vi khuẩn AOB và NOB qua các quá trình amon hóa, nitrat hóa và phản nitrat hóa. Sự phát hiện ra vi khuẩn Nitrosomonas đã mở ra một phương pháp xử lý amonia mới và hiệu quả thay vì những phương pháp xử lý truyền thống. Nghiên cứu được thực hiện theo 3 giai đoạn, giai đoạn một là phân lập vi khuẩn Nitrosomonas từ nguồn nước thải sản xuất thuộc da, nước thải chế biến nước mắm, nước thải lò mổ và nước thải chế biến thủy sản, giai đoạn hai là thử nghiệm khả năng chuyển hóa amonia và kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas trên môi trường có nồng độ muối khác nhau giai đoạn ba, định danh loài Nitrosomonas có khả năng chuyển hóa amonia tốt, sinh trưởng và phát triển mạnh bằng phương pháp sinh học phân tử.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Nitrosomonas

TRONG NƯỚC THẢI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Nitrosomonas

TRONG NƯỚC THẢI

Hướng dẫn khoa học

TS LÊ CÔNG NHẤT PHƯƠNG

Sinh viên thực hiện

HUỲNH THỊ ĐIỆP

Tháng 02 năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn thầy Lê Công Nhất Phương là người chỉ bảo, hướngdẫn, giúp đỡ em thực hiện và hoàn thành tốt đề tài này Em xin cảm ơn các anh chịtrong viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong quátrình thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ ChíMinh, quý thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạtkiến thức cho em trong suốt quá trình theo học tại trường

Em xin cảm ơn Công ty Hai Thành Food Co LTD, khu Hiệp Phước, Công tyTNHH Tỷ Cao Thắng, khu Hiệp Phước, Công ty nước mắm Liên Thành và Công tyVissan đã tạo điều kiện cho em trong quá trình thu thập các mẫu nước thải để em cóthể hoàn thành đề tài đúng thời hạn

Cảm ơn các bạn lớp DH11SM đã gắn bó, chia sẻ, động viên tôi trong suốt quátrình học tập và thực hiện đề tài

Con xin chân thành cảm ơn gia đình đã tạo mọi điều kiện cho con được học tậpđến ngày hôm nay Con cảm ơn ba mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng, dạy bảo con nênngười, luôn yêu thương và động viên con những lúc khó khăn

Kính chúc tất cả sức khỏe và thành đạt!

Sinh viên thực hiện HUỲNH THỊ ĐIỆP

TÓM TẮT

Ngày nay, việc ứng dụng vi sinh vật để xử lý nước thải bị ô nhiễm ngày một phổbiến Quá trình loại bỏ nitơ dư thừa trong nước chủ yếu nhờ vào hoạt động của cácnhóm vi khuẩn AOB và NOB qua các quá trình amon hóa, nitrat hóa và phản nitrat

hóa Sự phát hiện ra vi khuẩn Nitrosomonas đã mở ra một phương pháp xử lý amonia

mới và hiệu quả thay vì những phương pháp xử lý truyền thống

Nghiên cứu được thực hiện theo 3 giai đoạn, giai đoạn một là phân lập vi khuẩn

Nitrosomonas từ nguồn nước thải sản xuất thuộc da, nước thải chế biến nước mắm,

nước thải lò mổ và nước thải chế biến thủy sản, giai đoạn hai là thử nghiệm khả năng

chuyển hóa amonia và kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas trên môi trường có nồng độ muối khác nhau giai đoạn ba, định danh loài Nitrosomonas có khả năng

chuyển hóa amonia tốt, sinh trưởng và phát triển mạnh bằng phương pháp sinh họcphân tử

Phân lập thành công vi khuẩn Nitrosomonas từ bốn nguồn nước thải trên Môi

trường có nồng độ muối khác nhau, hai loài Td2 và Ts1 vừa có khả năng chuyển hóaamonia cao vừa sinh trưởng và phát triển mạnh Loài Td2 có độ tương đồng 92% so

với vi khuẩn Nitrosomonas sp (AJ005546) được phát hiện tại Na Uy và có độ tương đồng 92% so với vi khuẩn Nitrosomonas europaea ATCC 25978 (HE862405) được phát hiện ở Đức Loài Ts1 có độ tương đồng 90% so với vi khuẩn Nitrosomonas

europaea ATCC 19718 (AL954747) được phát hiện ở Mỹ và tương đồng 90% so với

vi khuẩn Nitrosomonas europaea ATCC 19718 (NC004757) được phát hiện ở Mỹ.

Như vậy, loài Td2 và Ts1 được phân lập tương ứng từ mẫu nước thải thuộc da vàthủy sản có khả năng chuyển hóa amonia cao và sinh trưởng mạnh trong môi trường

có nồng độ muối khác nhau Hai loài Td2 và Ts1 có độ tương đồng với vi khuẩn

Nitrosomonas sp và Nitrosomonas europaea đã dược phát hiện trên thế giới.

The topic: “Isolation and identification of bacteria Nitrosomonas in wastewater”.

Today, the use of microorganisms to treat contaminated wastewater increaserapidly The process of removing excess nitrogen is mainly due to the activity of AOBand NOB bacteria through the process of amonia, nitrification and denitrification

reactors The discovery of Nitrosomonas bacteria has opened a new processing method

and efficient amonia instead of the traditional processing methods

The experiment was arranged in three stages Firstly, Nitrosomonas bacteria

isolated from four wastewater processing tanning, fish sauce processing wastewater,abattoirs wastewater and seafood processing wastewater Secondly, the ability to

handle amonia and the density of bacteria Nitrosomonas cell on environment

containing different salt concentrations were tested Finally, identification of

Nitrosomonas bacteria that grow and treat amonia well by molecular biological

methods

Isolation of Nitrosomonas bacteria from four wastewater processing tanning,

fish sauce processing wastewater, abattoirs wastewater and seafood processingwastewater was done Two strains of TD2 and TS1 had the ability to metabolizeammonia well, growth and strong development in environments with different

concentrations Strain TD2 shared 92% similarity compared with Nitrosomonas sp (AJ005546) was isolated in Norway and 92% similarity with Nitrosomonas europaea

ATCC 25,978 (HE862405) was isolated in Germany Strain TS1 has 90% similarity

compared with Nitrosomonas europaea ATCC 19,718 (AL 954747) was isolated in the America or United State and 90% similarity with Nitrosomonas europaea ATCC

19,718 (NC004757) was isolated in the America or United State

Keywords: Nitrosomonas bacteria, Identification, Isolated, Wastewater.

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sự chuyển hóa các hợp chất nitơ nhờ vi sinh vật trong môi trường nước 3

2.2 Sơ lược về nước thải có hàm lượng amonia cao 4

2.2.1 Nước thải chế biến thuộc da 4

2.2.2 Nước thải chế biến nước mắm 5

2.2.3 Nước thải lò mổ 5

2.2.4 Nước thải chế biến thủy sản 6

2.3 Tổng quan về vi khuẩn AOB 7

2.3.1 Vi khuẩn AOB 7

2.3.2 Vi khuẩn Nitrosomonas 8

2.3.4 Sinh học phân tử của vi khuẩn AOB 11

2.3.5 Vai trò của vi khuẩn AOB 12

2.3.6 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn Nitrosomonas 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

3.2.2 Nguồn phân lập và dụng cụ và thiết bị 15

3.2.3 Hóa chất 15

3.3 Phương pháp 17

3.3.1 Bố trí thí nghiệm 17

3.3.2 Phương pháp phân lập và thuần khiết giống vi khuẩn Nitrosomonas 17

3.3.3 Thử nghiệm khả năng chuyển hóa amonia và kiểm tra mật độ 18

3.3.4 Định danh vi khuẩn Nitrosomonas bằng phương pháp sinh học phân tử 19

3.3.5 Một số phương pháp xử lý số liệu 21

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Nitrosomonas 23

4.1.1 Vi khuẩn Nitrosomonas mọc trên môi trường có nồng độ muối cao 23

4.1.2 Vi khuẩn Nitrosomonas mọc trên môi trường có nồng độ muối thấp 24

4.2 Kết quả thử nghiệm khả năng chuyển hóa amonia và kiểm tra mật độ 25

4.2.1.Vi khuẩn Nitrosomonas chuyển hóa amonia trong môi trường muối cao 25

4.2.2 Vi khuẩn Nitrosomonas chuyển hóa amonia trong môi trường muối thấp 29

4.2.3 Kết quả kiểm tra mật độ vi khuẩn Nitrosomonas 33

4.3 Kết quả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử 34

4.3.2 Khuếch đại gen 16S rDNA của các loài phân lập bằng phản ứng PCR 34

4.3.3 Giải trình tự và xây dựng cây phát sinh loài 35

4.3.4 So sánh độ tương đồng trình tự gen của các loài Nitrosomonas 36

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

AOB : Amonia Oxidizing Bacterria

BOD : Biochemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy sinh hóa)

BTNMT: Bộ Tài Nguyên Môi Trường

COD : Chemical Oxygen Demand (nhu cầu oxy hóa học)

Ctv : cộng tác viên

CFU : Colony Forming Unit

DNA : DeoxyriboNucleic Axit

DO : Dissolved Oxygen (oxy hòa tan)

EtBr : Ethium Bromide

Lm3 : Lò mổ 3 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải lò mổ)

Lm4 : Lò mổ 4 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải lò mổ)

Lm5 : Lò mổ 5 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải lò mổ)

Nm1 : Nước mắm 1 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải nước mắm)

Nm4 : Nước mắm 4 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải nước mắm)

Nm5 : Nước mắm 5 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải nước mắm)

NOB : Nitrobacter Oxidizing Bacterria

NXB : Nhà Xuất Bản

PCR : Polymerase Chain Reaction

QCVN : Quy Chuẩn Việt Nam

rDNA : Ribosomal deoxyribonucleic acid

TAE : Tris Acetate EDTA

Td1 : Thuộc da 1 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thuộc da)

Td2 : Thuộc da 2 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thuộc da)

Td5 : Thuộc da 5 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thuộc da)

Ts1 : Thuỷ sản 1 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thủy sản)

Ts3 : Thuỷ sản 3 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thủy sản)

Ts4 : Thuỷ sản 4 (tên loài Nitrosomonas phân lập từ nước thải thủy sản)

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.3 Giá trị hằng số bán tốc độ của quá trình nitrat hóa 10

Bảng 3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn Nitrosomonas 15

Bảng 3.2 Môi trường nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas 16

Bảng 3.3 Mồi dùng trong phản ứng khuếch đại gen 16S rDNA 16

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR với tổng thể tích 25 µl 20

Bảng 4.1 Mật độ vi khuẩn Nitrosomonas (CFU/ml) 33

Bảng 4.2 Trình tự đoạn gen tương đồng với vùng 16S rDNA ở mẫu thuộc da 37

Bảng 4.3 Trình tự đoạn gen tương đồng với vùng 16S rDNA ở mẫu thủy sản 37

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Chu trình hợp chất chuyển hóa nitơ 3

Hình 2.2 Vi khuẩn Nitrosomonas 8

Hình 2.4 Cây phân loại của nhóm vi khuẩn AOB 11

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 18

Hình 3.2 Sơ đồ ly trích ADN từ vi khuẩn Nitrosomonas 20

Hình 4.1 Hình ảnh vi khuẩn phân lập từ mẫu nước thải chế biến thuộc da 23

Hình 4.2 Hình ảnh vi khuẩn phân lập từ mẫu nước thải chế biến nước mắm 24

Hình 4.3 Hình ảnh vi khuẩn phân lập từ mẫu nước thải lò mổ 24

Hình 4.4 Hình ảnh vi khuẩn phân lập từ mẫu nước thải thủy sản 25

Hình 4.5 Biểu đồ nồng độ amonia ở mẫu thuộc da 26

Hình 4.6 Biểu đồ hiệu suất chuyển hóa amonia ở mẫu thuộc da 26

Hình 4.7 Biểu đồ nồng độ nitrit ở mẫu thuộc da 26

Hình 4.8 Biểu đồ nồng độ amonia ở mẫu nước mắm 28

Hình 4.9 Biểu đồ hiệu suất chuyển hóa amonia ở mẫu nước mắm 28

Hình 4.10 Biểu đồ nồng độ nitrit ở mẫu nước mắm 28

Hình 4.11 Biểu đồ nồng độ amonia ở mẫu lò mổ 30

Hình 4.12 Biểu đồ hiệu suất chuyển hóa amonia ở mẫu lò mổ 30

Hình 4.13 Biểu đồ nồng độ nitrit ở mẫu lò mổ 30

Hình 4.14 Biểu đồ nồng độ amonia ở mẫu thủy sản 31

Hình 4.15 Biểu đồ hiệu suất chuyển hóa amonia ở mẫu thủy sản 32

Hình 4.16 Biểu đồ nồng độ nitrit ở mẫu thủy sản 32

Hình 4.17 Kết quả khuếch đại gen 16S rDNA ở các loài phân lập 34

Hình 4.18 Cây phân loại của vi khuẩn Nitrosomonas ở mẫu thuộc da 35

Hình 4.19 Cây phân loại của vi khuẩn Nitrosomonas ở mẫu thủy sản 36

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nước là nguồn tài nguyên quý báu và hết sức thiết yếu đối với sự sống trên tráiđất Thực tiễn chỉ ra rằng quốc gia nào cũng quan tâm đến công tác bảo vệ môi trường,trong đó việc khai thác, sử dụng hợp lý nguồn nước, đảm bảo cho nguồn nước trongsạch giúp hạn chế nhiều dịch bệnh, chất lượng cuộc sống được nâng lên Ở Việt Nam,

theo số liệu quan trắc của Bộ Tài nguyên – Môi trường năm 2011, tình hình ô nhiễm môi trường nước đang có những diễn tiến bất lợi đáng báo động Nguồn nước bị ô nhiễm trầm trọng không chỉ ở nước mặt (nước ao, hồ, sông, suối) mà nước ngầm trong lòng đất và nước mưa cũng bị ô nhiễm

Trước năm 1980 cộng đồng châu Âu đã ban hành một loạt các luật liên quan đếnnước, được gọi là làn sóng thứ nhất: hướng dẫn về tiêu chuẩn nước bề mặt (1973), luật

về chất lượng nước sinh hoạt (1980) Các điều luật về nước của EU trước năm 1990chỉ tập trung vào tiêu chuẩn cho nước sinh hoạt, không chú ý tới tiêu chuẩn của cácchất dinh dưỡng (N, P) trừ tiêu chuẩn về nitrat Cũng trong thời gian đó, do việc khaithác, sử dụng nước quá mức, mức độ ô nhiễm trầm trọng cộng với tầm nhìn ngắn củacác dự án quản lý nước nên đã xuất hiện các nguồn nước phú dưỡng, hệ sinh thái bịphá huỷ, sự biến mất của các vùng ngập nước, nước ngầm ở vùng ven biển bị nhiễmmặn Các kết quả đánh giá cho thấy: tầng nước ngầm bị phá huỷ, hệ sinh thái nước vàchất lượng nước bị xấu đi rất nhanh trong giai đoạn của thập kỷ 80 và đầu thập kỷ 90của thế kỷ XX

Ô nhiễm môi trường nói chung, ô nhiễm môi trường nước nói riêng đang là mộtvấn đề toàn cầu Nguồn gốc ô nhiễm môi trường nước chủ yếu là do các nguồn nướcthải không được xử lý mà thải trực tiếp ra môi trường bao gồm từ các hoạt động sảnxuất công nghiệp, nông nghiệp, chăn nuôi, sinh hoạt, vui chơi giải trí… Trong sốnguyên nhân gây ra tình trạng ô nhiễm nguồn nước, nitơ và các hợp chất của nitơ làmột trong những yếu tố gây hiện tượng phú dưỡng hóa và ảnh hưởng xấu đến môitrường Hàm lượng nitơ trong nước thải cao chảy vào sông, hồ làm tăng hàm lượngchất dinh dưỡng Do vậy nó gây ra sự phát triển mạnh mẽ của các loại thực vật phù dunhư rêu, tảo gây tình trạng thiếu oxy trong nước, phá vỡ chuỗi thức ăn, giảm chấtlượng nước, phá hoại môi trường trong sạch của thủy vực, sản sinh nhiều chất độc

trong nước như NH4 , NO2-, NO3-… tiêu diệt nhiều loại sinh vật có ích trong nước.Hiện tượng đó gọi là phú dưỡng nguồn nước Hiện nay, phú dưỡng thường gặp trongcác hồ, các sông và kênh dẫn nước thải Hiện tượng này tác động tiêu cực tới hoạtđộng sống của người dân, làm biến đổi hệ sinh thái của nước hồ, tăng thêm mức độ ônhiễm nước của khu dân cư.

Gần đây có nhiều nghiên cứu tìm giải pháp khắc phục tình trạng ô nhiễm nitơtrong nước, kết quả cho thấy xử lý sinh học là công nghệ có tính khả thi Có rất nhiềuphương pháp sinh học đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm nitơ.Tiêu biểu là việc sử dụng nhóm vi khuẩn AOB và NOB trong việc chuyển hóa nitơtrong tự nhiên.Ứng dụng các nhóm vi khuẩn này trong việc loại bỏ và chuyển hóa nitơtrong nước thải đạt hiệu quả cao và mang tính ổn định Bước đầu trong công cuộc xử

lý ô nhiễm nitơ trong nước, việc phân lập và định danh các nhóm vi khuẩn

Nitrosomonas có sẵn trong tự nhiên là rất cần thiết Chính vì những lý do trên, đề tài:

“Phân lập và định danh vi khuẩn Nitrosomonas trong nước thải” được thực hiện góp

một phần nhỏ trong công cuộc xử lý nước thải, bảo vệ môi trường và nâng cao chấtlượng cuộc sống

1.2 Yêu cầu của đề tài

Phân lập và định danh nhóm vi khuẩn Nitrosomonas có trong các nguồn nước

thải: chế biến thuộc da, chế biến nước mắm, lò mổ và chế biến thủy sản

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập nhóm vi khuẩn Nitrosomonas từ các nguồn nước thải: chế biến thuộc

da, chế biến nước mắm, lò mổ và chế biến thủy sản

Thử nghiệm khả năng xử lý amonia và kiểm tra mật độ tế bào vi khuẩn

Nitrosomonas trên môi trường có nồng độ muối khác nhau.

Định danh vi khuẩn Nitrosomonas bằng phương pháp sinh học phân tử

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sự chuyển hóa các hợp chất nitơ nhờ vi sinh vật trong môi trường nước

Nitơ là một trong những thành phần có mặt trong cơ thể động vật, thực vật vàtham gia các quá trình sinh hoá Trong môi trường nước, nitơ thường ở các dạng nhưhợp chất hữu cơ chứa nitơ, amonia, nitrit, nitrat và khí nitơ Vi sinh vật sử dụng nguồnnitơ kể trên vào tổng hợp axit amin, protein, tế bào và chuyển hoá năng lượng (Lê VănCát, 2007)

Hình 2.1 Chu trình hợp chất chuyển hóa nitơ (Lê Công Nhất Phương, 2012)

Trong tự nhiên nitơ tồn tại ở nhiều dạng hợp chất hóa học, tham gia và chuyểnhóa trong nhiều quá trình, quan trọng hơn là chuyển hóa giữa các dạng hợp chất vô cơ

và hữu cơ chứa nitơ Sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa nitơ là một chu trìnhkhép kín nhờ sự có mặt của các vi sinh vật Bắt đầu từ sự cố định nitơ trong tự nhiêndưới tác dụng của vi sinh vật sẽ chuyển hóa nitơ vô cơ thành nitơ hữu cơ Tiếp theocác hợp chất nitơ hữu cơ được một nhóm vi sinh vật phân giải thành NH3 hoặc NH4gọi là nhóm vi khuẩn amôn hóa Quá trình này gọi là sự khoáng hóa chất hữu cơ vì qua

đó nitơ hữu cơ được chuyển thành dạng nitơ khoáng Dạng NH4+ sẽ được chuyển hóathành dạng NO3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa Nhóm vi khuẩn nitrat hóa bao gồm các

giống vi khuẩn: Nitrosomonas, Nitrisocytis, Nitrosopira, Nitrobacter, Nitrospira,

Nitrococcus… Các hợp chất nitrat lại được chuyển hóa thành dạng nitơ phân tử, quá

trình này gọi là sự phản nitrat hóa, được thực hiện bởi nhóm vi khuẩn phản nitrat:

Bacillus, Pseudomonas, Methanomonas, Paracocus, Spirillum, Thiobacillus… Khí

nitơ sẽ được cố định lại trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật sau đó chuyển hóathành dạng nitơ hữu cơ Như vậy vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên được khép kín.Trong các giai đoạn của chu trình chuyển hóa vật chất, vi sinh vật đóng vai trò vô cùngquan trọng Các nhóm vi sinh vật khác nhau tham gia vào các giai đoạn chuyển hoá khácnhau Nếu như vắng mặt một nhóm nào đó thì toàn bộ quá trình chuyển hoá sẽ bị dừng lại,điều này sẽ ảnh hưởng đến toàn bộ hệ sinh thái vì sự tồn tại của các loài sinh vật trong hệsinh thái phụ thuộc vào nguồn thức ăn có trong môi trường (Lê Xuân Phương, 2008)

2.2 Sơ lược về nước thải có hàm lượng amonia cao

2.2.1 Nước thải chế biến thuộc da

Vấn đề môi trường chính trong nhà máy thuộc da là nước thải, mùi và chất thảirắn Nước thải lên tới 50 m3 cho 1 tấn da nguyên liệu, thường có độ màu, hàm lượngchất rắn , chất rắn lơ lửng, Cl-, mỡ, crôm và các chất hữu cơ cao Bên cạnh nước thải,quá trình sản xuất da phát sinh một lượng chất thải rắn như mỡ, mùn bào Khí thải phátsinh ở hầu hết các công đoạn sản xuất với thành phần chủ yếu là H2S, NH3, chất hữu

cơ bay hơi do quá trình phân huỷ các chất hữu cơ gây mùi rất khó chịu Nước thảithuộc da chứa hàm lượng chất hữu cơ cao làm giảm hàm lượng oxy hòa tan trongnước, gián tiếp ảnh hưởng tới đời sống của các loài thủy sinh sống trong nước Nướcthải chứa hàm lượng chất rắn lơ lửng dạng vô cơ và hữu cơ cao gồm các thành phầnvôi, lông, thịt ảnh hưởng đến đời sống các loài động vật sống như cá, các loài phù duđang tồn tại ở dòng sông Các muối vô cơ tan làm tăng độ mặn của nước, tăng áp suấtthẩm thấu và độ cứng của nước Màu tối của nước thải làm giảm quá trình quang hợpcủa các loại rong tảo Nước thải chứa crom dư ở dạng Cr3+ có thể gây dị ứng ngoài da,làm xơ cứng động mạch Sự có mặt của crom trong nước thải sẽ làm giảm hoạt độngphân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật Nước thải chứa sunfua gây mùi, vị khó chịu vàngộ độc cho cá Nếu nước thải thuộc da ngấm vào đất sẽ làm đất trở nên cằn cỗi, kémmàu mỡ do trong nước có chứa hàm lượng muối NaCl cao, mặt khác có ảnh hưởngxấu đến chất lượng nước ngầm Đặc biệt, nước thải thuộc da có hàm lượng nitơ tổngcao khoảng 760 – 1257 mg/l (nguồn dinh dưỡng tạo điều kiện thích hợp cho vi khuẩn

Nitrosomonas sinh trưởng và phát triển), độ muối cao từ 4500 – 6500 mg/l thích hợp

cho những dòng vi khuẩn Nitrosomonas ưa mặn phát triển Như vậy, nước thải thuộc

da nếu không được xử lý sẽ gây tác động lớn tới môi trường

Nhìn chung nước thải thuộc da phức tạp do đặc tính của nó là tập hợp của nhiều

dòng thải có tính chất khác nhau Đa số các cơ sở thuộc da ở Việt Nam chưa có hệthống xử lý nước thải đạt yêu cầu QCVN 40 : 2011/BTNMT Do đó, vấn đề ô nhiễmmôi trường từ ngành công nghiệp thuộc da hiện nay là nghiêm trọng và rất bức xúc,cần sớm có giải pháp giải quyết (Bộ công thương, 2008)

2.2.2 Nước thải chế biến nước mắm

Sản xuất nước mắm là một ngành chế biến thực phẩm khá phổ biến ở nước

ta Gắn liền với quá trình phát triển sản xuất nước mắm thì nhu cầu xử lý nước thải sản xuất cũng ngày càng tăng mạnh Nước thải của các nhà máy sản xuất nước

mắm bắt nguồn từ hoạt động sơ chế, làm sạch nguyên liệu, vệ sinh các thùng chứa,lượng nước mắm dư, tồn động Đặc trưng của nguồn nước thải này là hàm lượngBOD, COD cao, độ màu, đặc biệt có hàm lượng nitơ và độ muối cao (nguồn dinh

dưỡng cho vi khuẩn Nitrosomonas) Nồng độ ô nhiễm của nước thải sản xuất nước

mắm thể hiện cụ thể qua hàm lượng COD khoảng 1800 mg/l, hàm lượng BOD5khoảng 1200 mg/l, độ muối khoảng 4000 mg/l Nếu không xây dựng các hệ thống xử

lý nước thải và xả trực tiếp vào môi trường thì đây là nguyên nhân gây ra nhiều tácđộng ảnh hưởng xấu đến môi trường như: giảm hàm lượng oxy hòa tan, lan truyềnnhiều mầm móng gây bệnh, ô nhiễm môi trường sống của con người và các loài sinhvật khác

Nhìn chung, chất thải của các nhà máy chế biến nước mắm gây ô nhiễm môitrường theo những mức độ ảnh hưởng khác nhau, tùy thuộc vào loại hình chế biến, quy

mô sản xuất, nguyên liệu đầu vào, trình độ công nghệ, trình độ quản lý… Trong đó,yếu tố kỹ thuật và trình độ tổ chức sản xuất sẽ quyết định mức độ ảnh hưởng đến môitrường (Nguyễn Hồng Thơm, 2009)

2.2.3 Nước thải lò mổ

Theo số liệu điều tra của Cục Thú y Hải Phòng, tính đến tháng 08 năm 2011 cảnước có 29,281 điểm cơ sở giết mổ gia súc, gia cầm, trong đó chỉ mới có 30,16% điểmgiết mổ được kiểm soát Ô nhiễm môi trường do hoạt động giết mổ gia súc, gia cầmđang là vấn đề được xã hội quan tâm bởi chất thải phát sinh (kể cả chất thải rắn vànước thải) với lưu lượng lớn, nồng độ các chất ô nhiễm cao, ngoài ra còn chứa nhiều

loại vi khuẩn gây bệnh Những hoạt động này nếu không được kiểm soát đúng đắn sẽ

gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến hệ sinh thái và sức khỏe cộng đồng Nước

thải từ các lò giết mổ phát sinh từ khâu tắm heo, vệ sinh chuồng trại, rửa thịt từ côngđoạn mổ, làm lòng, vệ sinh bệ mổ… chứa nhiều các thành phần hữu cơ như axit béo,protein, máu, lông, da, nitơ, phospho Do đó, đặc trưng nước thải lò mổ như sau: hàmlượng COD dao động từ 640 – 3000 mg/l, hàm lượng BOD5 từ 510 – 1100 mg/l, hàmlượng nitơ dao động từ 98 – 348 mg/l

Hiện nay, đa số công nghệ đang áp dụng xử lý nước thải cho ngành giết mổ giasúc quy mô vừa và nhỏ đều không đạt các tiêu chuẩn QCVN 40 : 2011/BTNMT, đặcbiệt là thông số N tổng và NH4+ Một số công nghệ đã được thiết lập để loại nitơ trongnước thải lò mổ thường là kết hợp 2 quá trình nitrat hóa (nitrification) và khử nitrat(denitrification) hoặc hồ thực vật thủy sinh (Nguyễn Thị Hoa Lý, 2013)

2.2.4 Nước thải chế biến thủy sản

Những sản phẩm thủy sản được chế biến không những phục vụ nhu cầu tiêu thụnội địa mà còn được xuất khẩu, đem về ngoại tệ cho đất nước Những bước thăng trầmcủa ngành này luôn gắn liền với nhịp sống chung của nền kinh tế đất nước, nhất làcông cuộc đổi mới toàn diện đất nước Song song với việc đem lại lợi ích về mặt kinh

tế, các nhà máy chế biến thủy sản đã đưa vào môi trường một lượng lớn chất thải gâyảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống con người và một số sinh vật khác

Nước thải ngành chế biến thủy sản chứa phần lớn các chất thải hữu cơ có nguồngốc từ động vật và có thành phần chủ yếu là protein và các chất béo Trong nước thảichứa các chất như cacbonhydrat, protein, chất béo… khi xả vào nguồn nước sẽ làmsuy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước, tạo mùi khó chịu, gây ô nhiễm về mặt cảnhquan Nước thải của phân xưởng chế biến thủy sản có hàm lượng COD dao động từ

300 – 3000 mg/l, hàm lượng BOD5 dao động từ 300 – 2000 mg/l, hàm lượng chất rắn

lơ lửng dao động từ 200 – 1000 mg/l Đặc biệt, nước thải thủy sản cũng bị ô nhiễmchất dinh dưỡng với hàm lượng nitơ cao từ 50 – 200 mg/l, với nồng độ này gây ra hiệntượng phú dưỡng nguồn nước, rong tảo phát triển làm suy giảm chất lượng nguồnnước (Nguyễn Việt Anh, 2011) Thời gian qua, Nhà nước rất quan tâm đến công tácbảo vệ môi trường thông qua việc ban hành hệ thống văn bản pháp quy chỉ đạo cáccấp, các ngành tập trung tập trung quy hoạch, đầu tư xây dựng hệ thống giết mổ giasúc, gia cầm tập trung, đảm bảo phòng chống dịch bệnh và bảo vệ môi trường

2.3 Tổng quan về vi khuẩn AOB

2.3.1 Vi khuẩn AOB

Vi khuẩn oxy hóa amonia (AOB – ammonium oxidizing bacteria) được phân lậplần đầu tiên vào cuối thế kỷ XIX Các nhà khoa học liên tục nghiên cứu, tìm hiểu hoạt

động sinh lý của AOB và đã chỉ rõ AOB là vi khuẩn gram (–), dinh dưỡng vô cơ hóa,

cũng như dự đoán rằng có rất nhiều loài tham gia vào quá trình oxy hóa amonia, nhưngmãi đến những năm cuối thập kỷ 1960 thì nhiều loài mới của AOB mới được phân lập

Quá trình nitrat hóa có sự góp mặt bởi hai nhóm vi khuẩn Phylogenetically và

Chemolithoautotrophic: vi khuẩn oxy hóa amonia (AOB) và các vi khuẩn oxy hóa

nitrit (NOB) Vi khuẩn AOB thuộc hai nhóm đơn ngành Betaproteobacteria và

Gammaproteobacteria, bao gồm các chi Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus,

Nitrosococcus và Nitrosovibrio (Grommen, 2005) Theo Annette Bollmann và ctv,

2013, đã tìm ra 10 loài Nitrosomonas, 5 loài Nitrosospira, 3 loài Nitrosococcus, 2 loài

Nitrosolobus, 2 loài Nitrosovibrio.

Những vi khuẩn này có hình dấu phẩy, xoắn, hay chia thùy Roi của tế bào phân

bố khắp nơi Những sinh vật hóa tự dưỡng, phát triển nhờ vào amonia như là nguồnnăng lượng và CO2 như là nguồn cacbon chính Nhiệt độ phát triển tối ưu là 28 – 30oC

và pH tối ưu là 7,5 – 8,0 Những loài này tồn tại ở nhiều vùng khác nhau như đất, vùng

nước lợ, sông, hồ và hệ thống rác thải (Hoàng Phương Hà và ctv, 2010)

Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học nhận thấy rằng khi tiến hành phânlập nhóm vi khuẩn AOB từ các nguồn nước thải thì chủ yếu phân lập ra vi khuẩn

Nitrosomonas và Nitrosospira Sự khác biệt sinh lý giữa các đại diện nhóm vi khuẩn

AOB nhờ vào hai yếu tố sinh lý là hoạt động của enzyme urease và độ muối (Koops

và Pommerening, 2001)

2.3.2 Vi khuẩn Nitrosomonas

Hình 2.2 Vi khuẩn Nitrosomonas ( Brenner D J, 2005).

Về mặt phân loại học các nhà khoa học đã sắp xếp Nitrosomonas như bảng 2.2.

Trong quá trình nguyên cứu, các nhà khoa học đã xác định 10 loài vi khuẩn

Nitrosomonas bao gồm: N eurpatea, N eutropha, N halophila, N communis, N marina, N aestuarii, N nitrosa, N oligotropha, N cryotolerans, N ureae.

Vi khuẩn Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục, tế bào

cơ bản là hình que, màng bao tế bào chất có các lỗ nằm rãi rác, đôi khi lớp màng này

gấp cuộn vào bên trong tế bào chất Khoảng pH thích hợp cho vi khuẩn Nitrosomonas

là 7,8 – 8,0, nhiệt độ ở 20 – 30oC Vi khuẩn Nitrosomonas sống ở những nơi giàu NH3

và các muối vô cơ như trong bùn đáy ao, nước cống, nước ngọt, các thủy vực bị ônhiễm chứa nhiều hợp chất nitơ (Hoàng Phương Hà, 2008)

Tất cả các loài thuộc giống Nitrosomonas sử dụng NH3 làm nguồn năng lượngcho sự chuyển hóa thành NO2- Theo Jordening và Winter (2010) cơ chế quá trình nitrit

hóa của vi khuẩn Nitrosomonas: amonia được thủy phân thành hydroxylamine nhờ

enzyme AMO (ammonium monooxygenase) Hydroxylamine được oxy hóa thànhnitrit nhờ enzyme HAO (Hydroxylamine Oxydoreductase)

NH4+ NH2OH NO2

Hydroxylamine được oxy hóa không cần oxy sẽ tạo ra 4 điện tử, trong đó 2 điện

tử sẽ được chuyển cho phản ứng, các điện tử còn lại sẽ dùng cho chuỗi hô hấp Ta cócác phản ứng:

Quá trình trên được thực hiện nhờ các vi sinh vật tự dưỡng N.europaea,

N.oligocarbogenes, trong điều kiện hiếu khí, nguồn carbon sử dụng là CO2, HCO3-,

CO3- không cần bổ sung các nguồn carbon hữu cơ khác trong quá trình hoạt động.Trong điều kiện DO > 0,6 mg/l, hoạt động oxy hóa amonia của vi khuẩn

Nitrosomonas đã diễn ra bình thường Ngoài ra, quá trình nitrit hóa còn có sự tham gia

của các vi khuẩn oxy hóa amonia khác như: Nitrosopiar, Nitrosococus, Nitrosolobus

 Yếu tố pH

Trong quá trình xử lý sinh học, pH là yếu tố ảnh hưởng rõ rệt nhất đến đời sống

và hoạt động của sinh vật, pH tối ưu cho vi khuẩn Nitrosomonas khoảng 7,5 – 8,0.

HAOAMO

Nếu pH < 7 vi khuẩn Nitrosomonas chậm phát triển và bị ức chế ở pH = 6,5 có khi

pH < 6 hoặc thấp hơn nữa (Villaverde S, 1997)

 Hàm lượng DO (oxy hòa tan)

Vi khuẩn Nitrosomonas là vi khuẩn hiếu khí do đó DO rất cần thiết để phát triển.

Khi DO < 2 mg/l, quá trình nitrat hóa khó xảy ra khi đó hoạt động của vi khuẩn AOBvượt trội hơn vi khuẩn NOB Nồng độ oxy hòa tan có ảnh hưởng quan trọng tới tốc độsinh trưởng của vi khuẩn nitrat hóa Theo Park Hee-Deung (2004), DO là chất nền giớihạn sự tăng trưởng của vi sinh vật được biểu diễn theo phương trình Monod

µN = µmax.n.(DO/(KO.n + DO))DO: nồng độ oxy hòa tan, mg/l

KO.n: hằng số bán tốc độ, mg/lGiá trị hằng số bán tốc độ của quá trình nitrat hóa được nhiều tác giả xác định có giá trị khoảng 0,15 – 2 mg/l Kết quả của một số tác giả được cho bởi bảng 2.3

Bảng 2.3 Giá trị hằng số bán tốc độ của quá trình nitrat hóa

Nitrosomonas

0,30,250,5

Loveless và Painter (1968)Peters (1969)

Laudelot (1976)

( Park Hee-Deung, 2004).

 Ảnh hưởng của chất độc hại

Các chất vi lượng rất cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật nhưng nếu vượt

qua ngưỡng cho phép thì các chất này sẽ gây độc cho vi khuẩn Nitrosomonas Các kim loại nặng với nồng độ gây hại cho vi khuẩn Nitrosomonas được tìm thấy như niekel

0,1 – 0,25 mg/l, crom 0,25 mg/l, đồng 0,1 – 0,5 mg/l (Forstner U và ctv, 2002) TheoPainter (1970) cho thấy các tác nhân ức chế như thioure, allyl – thioure,

hydroxyquinoline, salicyladotme và histidine gây độc cho loài Nitrosomonas Pepton làm giảm tốc độ sinh trưởng của loài Nitrosomonas 25% với nồng độ 1 mg/l và giảm

60% ở nồng độ 10 mg/l

2.3.4 Sinh học phân tử của vi khuẩn AOB

 Giới thiệu chung

Ngày nay với việc sử dụng đoạn trình tự 16S rDNR để tiến hành xác định nhóm

vi khuẩn AOB, các nhà khoa học đã phát hiện nhóm vi khuẩn AOB thuộc hai lớpngành Proteobacteria Trong đó nhóm thứ nhất thuộc lớp γ – Proteobacteria bao gồm

các loài Nitrosococus oceani và Nitrosococus halophilus Còn nhóm thứ hai thuộc lớp

β – Proteobacteria bao gồm các giống Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosolobus và

Nitrosovibrio (Ulrike Purkhold và ctv, 2000) Vào năm 2003, Patrick Chain đã giải

mã được bộ gen của Nitrosomonas europaea ATCC 19718 tạo điều kiện rất thuận lợi

cho nguyên cứu về vi khuẩn AOB sau này

Hình 2.4 Cây phân loại của nhóm vi khuẩn AOB (Purkhold, 2000).

 Phương pháp PCR trong đinh danh vi khuẩn AOB

Vào những năm gần đây các nhà khoa học đã phát minh ra phương pháp đơngiản khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA, mà không qua tạo dòng Kỹthuật này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR, được hiểu là phảnứng polymerase dây truyền (Phạm Thành Hổ, 2004)

PCR cho phép khuếch đại từ một trình tự ban đầu của DNA bộ gen thành hàngtriệu bản sao trong vài giờ mà không cần có sự hiện diện của tế bào hoặc là bộ máy saochép của chúng PCR đã giải quyết một trở ngại lớn về lượng vật chất di truyền, đểgiải quyết vấn đề này người ta phải nhờ vào tế bào vi khuẩn hay đúng hơn là nhờ vàokhả năng sinh sản nhanh của chúng để nhân lên một trình tự DNA đích nào đó Người

ta gọi đó là việc tạo dòng Hiện nay, với phương pháp PCR, một phương pháp đơn

giản hơn nhiều đã làm nhiệm vụ thay thế cho phương pháp tạo dòng trong hầu hết cáctrường hợp (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

Nguyên tắc của phương pháp PCR, tất cả các DNA polymerase khi hoạt độngtổng hợp một mạch mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyênbiệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu củamạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phươngpháp PCR đã hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase (Hồ HuỳnhThùy Dương, 2003) Phản ứng PCR được thực hiện theo các bước:

Bước 1: Thực hiện quá trình biến tính DNA Đưa DNA vào dung dịch phản ứng(gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép) phân tử DNA được biến tính ở nhiệt

độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thường ở nhiệt độ 94 – 95oC trong thờigian 30 giây – 60 giây

Bước 2: Thực hiện quá trình bắt cặp Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm củacác mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này daođộng trong khoảng 40 – 70oC tùy thuộc vào nhiệt độ của các mồi và kéo dài trong thờigian 30 giây – 60 giây

Bước 3: Tổng hợp mạch mới (giai đoạn kéo dài) Nhiệt độ được tăng lên đến

72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt Thời gian tùy thuộc độ dàicủa trình tự DNA cần khuếch đại, kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

2.3.5 Vai trò của vi khuẩn AOB

Vi khuẩn AOB tham gia vào chu trình sinh hóa nitơ trong quá trình nitrat hóa Vi

khuẩn oxy hóa amonia như Nitrosomonas chuyển hóa NH3 thành NO2- nhờ hoạt độnghiệu quả của enzyme amonia monooxygenase (AMO) và hydroxylamine

oxidoreductase (HAO) Vi khuẩn Nitrosomonas europaea thuộc nhóm vi khuẩn có khả

năng phân giải protein, vi khuẩn được xem là có khả năng quang hợp Các vi khuẩnoxy hóa amonia trên mặt đất đã được định danh là có khả năng phân giải protein dưới

lớp β – Proteobacteria bao gồm Nitrosomonas, Nitrosospira gener, trong khi đó ở vùng biển thì phát hiện ra giống vi khuẩn Nitrosococcus dưới lớp β – Proteobacteria và lớp γ – Proteobacteria Ngoài ra vi khuẩn Nitrosomonas europaea được xem là vi

khuẩn có khả năng oxy hóa amonia tốt nhất ở cấp độ phân tử Những nghiên cứu trướcđây đề cập đến nét đặc trưng trong sự phát triển của loài này, đó là khả năng sử dụng

NH3 và năng lượng sinh học có liên quan đến quá trình nitrat hóa (Patrick Chain

và ctv, 2003).

2.3.6 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn Nitrosomonas

 Nghiên cứu trong nước

Có nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước tìm hiểu về đặc điểm, vai

trò cũng như khả năng xử lý nước thải giàu amonia của vi khuẩn Nitrosomonas Trong quá trình nghiên cứu, nhiều loài Nitrosomonas trong tự nhiên được tìm thấy, giúp giải

quyết được nhiều vấn đề ô nhiễm môi trường

Từ tháng 12 năm 2002 đến tháng 07 năm 2004, Nguyễn Việt Anh cùng với ctv ởTrung tâm kỹ thuật môi trường đô thị và khu công nghiệp – Đại học Xây dựng Hà Nội,phối hợp với Đại học tổng hợp Kumamoto (Nhật Bản) đã chọn phương pháp xử lýamonia sinh học, kết hợp nitrat hóa và khử nitrat với giá thể vi sinh là acrylic đểnghiên cứu Kết quả, sau hai quá trình nitrat hóa và khử nitrat, hàm lượng amoniatrong nước thí nghiệm từ khoảng 20 mg/l đã giảm xuống chỉ còn xấp xỉ 0 – 0,7 mg/l,đạt hiệu suất từ 93,2 – 99,9%

Năm 2008, Hoàng Hà Phương và ctv đã thực hiện nghiên cứu phân lập và tuyểnchọn một số loài vi khuẩn nitrat hóa từ nước lợ nuôi tôm, tại Quảng Bình và Hà Tĩnhvới mục đích tuyển chọn một số loài điển hình có khả năng sử dụng để xử lý môitrường nuôi trồng thủy sản Kết quả đã phân lập được 17 loài vi khuẩn nitrat hóa (10loài vi khuẩn oxy hóa amonia và 7 loài vi khuẩn oxy hóa nitrit) Nhiệt độ 28 – 30oC,

pH = 8 là tối ưu cho sự sinh trưởng và hoạt tính nitrat của các loài vi khuẩn này

Năm 2008, Bùi Thị Minh Thi phân lập vi khuẩn Nitrosomonas từ các nguồn nước thải giàu amonia Kết quả, phân lập thành công vi khuẩn Nitrosomonas từ 3

nguồn nước thải từ quán ăn, nước thải từ hố xí tự hoại và nước thải chăn nuôi heo

 Nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 1975, Focht và Chang đã tìm ra nhiệt độ tối ưu cho quá sự phát triển

của vi khuẩn nitrat hóa là 25 – 30oC Forstner và ctv (2002) đã nghiên cứu những ảnh

hưởng của một số chất độc haị đến vi khuẩn Nitrosomonas. Năm 2003, Patrick

Chain và ctv đã giải mã được bộ gen của Nitrosomonas europaea ATCC 19718 tạo

điều kiện rất thuận lợi cho nguyên cứu về vi khuẩn AOB sau này

Vào năm 2005, Boopathy và ctv đã ứng dụng phương pháp sinh học sử dụngthiết bị SBR trong xử lý nước thải ao tôm có độ mặn thấp, luân phiên giữa quá trìnhhiếu khí và thiếu khí Kết quả đạt được là COD giảm từ 1201 mg/l xuống còn 32 mg/l

trong 8 ngày và nồng độ amonia trong nước thải từ 101 mg/l giảm xuống còn 0 mg/lsau ba ngày, hiệu suất xử lý đạt 100% Cũng trong thời gian đó, Grommen R và ctv đãthử nghiệm ảnh hưởng nồng độ muối lên sự đa dạng quần thể oxy hóa amonia trong bểlọc sinh học Hoạt động và sự thay đổi quần thể vi khuẩn oxy hóa amonia thuộc vàolớp β – Proteobacteria đã được theo dõi trong bể lọc sinh học nước ngọt và nước biểnnhân tạo trong thời gian 2 tháng Kết quả khi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường cónồng độ muối trung bình khoảng 11 g/l thì làm giảm tính đa dạng của quần thể khuẩnnitrat hóa trong nước biển nhân tạo

Năm 2009, Manju và ctv ở trung tâm quốc gia về động vật biển Ấn Độ đã nghiêncứu và đưa ra quy trình cố định hệ vi khuẩn nitrat hoá lên bột gỗ của cây thân thảoAilantus altissima nhằm chuyển hoá lượng amonia trong nước nuôi tôm sang nitrat.Chế phẩm có tên thương mại là TANOX (Total Amonia Nitrogen Oxidizer)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 7/2014 đến tháng 2/2015 tại phòng Vi sinh của viện Sinh học Nhiệt đới, thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Nitrosomonas được phân lập từ các nguồn nước thải giàu amonia.

3.2.2 Nguồn phân lập và dụng cụ và thiết bị

 Nguồn phân lập vi khuẩn Nitrosomonas

- Nước thải chế biến thuộc da tại Công ty TNHH Tỷ Cao Thắng

- Nước thải chế biến nước mắm tại Công ty nước mắm Liên Thành

- Nước thải từ lò mổ tại Công ty Vissan

- Nước thải chế biến thủy sản tại Công ty Hai Thành Food Co, khu Hiệp Phước

 Dụng cụ và thiết bị

Máy quang phổ hiệu Thermo Spectronic Moder 4001/4, nồi hấp Tomy SS – 325,máy luân nhiệt PCR Sprint, máy li tâm EBA 20-Hettich Thermo Cycler, eppendorf 1,5

ml, bộ điện di, máy đọc gel Bio – Rad UV 2000, tủ sấy Prolabo, lò viba Các thiết bị

và dụng cụ khác của phòng thí nghiệm vi sinh như máy vortex, cân, đèn cồn, que cấy,

tủ cấy và một số dụng cụ nhỏ khác

3.2.3 Hóa chất

 Môi trường phân lập và tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas

Bảng 3.1 Môi trường phân lập vi khuẩn Nitrosomonas