PHÂN lập và TUYỂN CHỌN một số CHỦNG VI KHUẨN NITRATE hóa từ nước THẢI CHĂN NUÔI HEO đã chuyển đổi

PHÂN lập và TUYỂN CHỌN một số CHỦNG VI KHUẨN NITRATE hóa từ nước THẢI CHĂN NUÔI HEO đã chuyển đổi Nước thải chăn nuôi heo có nồng độ ô nhiễm lớn, hàm lượng chất hữu cơ cao, lượng BOD, COD lớn, lượng chất dinh dưỡng lớn, N, P vượt nhiều lần so với tiêu chuẩn cho phép. (Vũ Đình Tôn, 2008) Ở nước ta, công tác xử lý nước thải chăn nuôi thường chỉ chú trọng đến việc loại bỏ COD, BOD mà chưa được quan tâm đúng mức đối với chỉ tiêu ô nhiễm ammonium (NH4+), là chất gây độc cho sinh vật khi chuyển thành dạng amoniac (NH3), làm giảm hàm lượng oxy hòa tan của nguồn nước. Đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý ammonium trong nước thải chăn nuôi heo là nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa. Đại diện là vi khuẩn Nitrosomonas đẩy nhanh khả năng oxy hóa ammonium (NH4+) thành nitrite (NO2) để làm nguyên liệu cho quá trình nitrate hóa do vi khuẩn Nitrobacter thực hiện, nhằm hạn chế các hợp chất gây độc, ngăn ngừa dịch bệnh, góp phần xây dựng một nền công nghiệp bền vững, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và môi trường sinh thái.

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đềtài

Chăn nuôi heo là ngành nghề phổ biến và phát triển mạnh tại nước ta, từ nhữngđơn vị chăn nuôi theo hộ gia đình nhỏ lẻ thì ngày nay mô hình chăn nuôi heo theohướng trang trại công nghiệp và bán công nghiệp đang được phát triển Theo Tổng cụcThống kê năm 2015, tổng đàn heo của cả nước có khoảng 27,7 triệu con chiếm gần76% tổng số gia súc

Tuy nhiên, việc phát triển chăn nuôi theo hướng trang trại thải ra một lượngchất thải lớn gây ô nhiễm môi trường, mùi hôi từ nước thải ảnh hưởng khá lớn đến sứckhỏe con người, vật nuôi và môi trường sống xungquanh

Nước thải chăn nuôi heo có nồng độ ô nhiễm lớn, hàm lượng chất hữu cơ cao,lượng BOD, COD lớn, lượng chất dinh dưỡng lớn, N, P vượt nhiều lần so với tiêuchuẩn cho phép (Vũ Đình Tôn, 2008)

Ở nước ta, công tác xử lý nước thải chăn nuôi thường chỉ chú trọng đến việcloại bỏ COD, BOD mà chưa được quan tâm đúng mức đối với chỉ tiêu ô nhiễmammonium (NH4+), là chất gây độc cho sinh vật khi chuyển thành dạng amoniac(NH3), làm giảm hàm lượng oxy hòa tan của nguồnnước

Đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý ammonium trong nước thải chăn nuôiheo là nhóm vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa Đại diện là vi

khuẩnNitrosomonasđẩy nhanh khả năng oxy hóa ammonium (NH4+) thành nitrite(NO2-) để làm nguyên liệu cho quá trình nitrate hóa do vi khuẩnNitrobacterthực hiện,

nhằm hạn chế các hợp chất gây độc, ngăn ngừa dịch bệnh, góp phần xây dựng một nềncông nghiệp bền vững, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và môi trường sinh thái

Do đó“ Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn nitrate hóa

(NitrosomonasvàNitrobacter) từ nước thải chăn nuôi heo”là một đề tài nghiên cứu

thật sự cần thiết, có ý nghĩa thực tiễn cao, góp một phần nhỏ trong công cuộc xử lýnước thải, bảo vệ môi trường và nâng cao chất lượng cuộc sống

1.2 Mục tiêu đềtài

Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn nitrate hóa

(NitrosomonasvàNitrobacter)có có khả năng chuyển hóa các hợp chất gây độc trung

gian (NH4 ,NO2-) thành NO3-

1.3 Nội dung đềtài

- Phân lập vi khuẩnNitrosomonasvàNitrobactertừ nước thải chăn nuôiheo

- Sàng lọc và tuyển chọn vi khuẩnNitrosomonasvàNitrobactercó khả năng chuyển

hóa các hợp chất gây độc trung gian (NH4+, NO2-) thànhNO3-

- Định danh vi khuẩnNitrosomonasvàNitrobacterđã tuyển chọnđược.

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Khái quát về chăn nuôiheo

2.1.1 Tình hình chăn nuôi heo ở ViệtNam

2.1.1.1 Hiện trạng chănnuôi

Theo Tổng cục Thống kê năm 2015, tổng đàn heo của cả nước có khoảng 27,7triệu con, tăng 3,7% so với cùng thời điểm năm trước, trong đó thành phố Hồ ChíMinh có khoảng 360 000 con, tăng hơn 30% Cơ cấu chăn nuôi heo cũng đang chuyểndịch từ hệ thống chăn nuôi nhỏ lẻ sang chăn nuôi trang trại nhằm đáp ứng nhu cầuthực phẩm ngày càng tăng của người tiêudùng

2.1.1.2 Định hướng phát triển chăn nuôi heo tại ViệtNam

Trong số các nước thuộc khối ASEAN, Việt Nam là nước chịu áp lực về đất đailớn nhất Tốc độ tăng dân số và quá trình đô thị hóa đã làm giảm diện tích đất nôngnghiệp Để đảm bảo an toàn về lương thực và thực phẩm, biện pháp duy nhất là thâmcanh chăn nuôi, trong đó chăn nuôi heo là một thành phần quan trọng trong địnhhướng pháttriển

Theo quyết định số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16 tháng 1 năm 2008 của Thủ tướngchính phủ về việc phê duyệt chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 thì:

o Đến năm 2020 ngành chăn nuôi cơ bản chuyển sang sản xuất phương thứctrang trại, công nghiệp, đáp ứng phần lớn nhu cầu thực phẩm đảm bảo chấtlượng cho tiêu dùng và xuấtkhẩu

o Tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến 2020 đạt trên42%

o Đảm bảo an toàn dịch bệnh và vệ sinh an toàn thực phẩm, khống chế có hiệuquả các bệnh nguy hiểm trong chănnuôi

o Các cơ sở chăn nuôi, nhất là chăn nuôi theo phương thức trang trại, côngnghiệp và cơ sở giết mổ, chế biến gia súc, gia cầm phải có hệ thống xử lýchất thải, bảo vệ và giảm ô nhiễm môitrường

o Mức tăng trưởng bình quân: giai đoạn 2015 – 2020 đạt khoảng 5 – 6 %năm

2.1.1.3 Hiện trạng ô nhiễm môi trường do chăn nuôiheo

Trong những năm gần đây, chăn nuôi heo phát triển với tốc độ rất nhanh nhưngchủ yếu là tự phát và chưa đáp ứng được các tiêu chuẩn kỹ thuật về chuồng trại và kỹ

thuật chăn nuôi Do đó năng suất chăn nuôi thấp và gây ô nhiễm môi trường một cáchtrầm trọng Ô nhiễm môi trường không những ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi, năngsuất chăn nuôi mà còn ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và môi trường sốngxung quanh Mỗi năm ngành chăn nuôi gia súc giacầmthải ra khoảng 75 – 85 triệu tấnphân, với phương thức sử dụng phân chuồng không qua xử lý ổn định và nước thảikhông qua xử lý xả trực tiếp ra môi trường gây ô nhiễm môi trường nghiêmtrọng.

Chất thải chăn nuôi tác động đến môi trường và sức khỏe con người trên nhiềukhía cạnh: gây ô nhiễm nguồn nước măt, nước ngầm, môi trường khí, môi trường đất

và các sản phẩm nông nghiệp Đây chính là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh về hôhấp và tiêu hóa do trong chất thải chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh, trứng giun, tổ chức

y tế thế giới (WHO) đã cảnh báo: nếu không có biện pháp thu gom và xử lý chất thảichăn nuôi một cách thỏa đáng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người, vật nuôi

và gây ô nhiễm môi trường nghiêmtrọng

Cho đến nay, chưa có báo cáo nào đánh giá chi tiết và đầy đủ về ô nhiễm môitrường do ngành chăn nuôi gây ra Theo báo cáo tổng kết của viện chăn nuôi (AntoinePouilieute, Bùi Bá Bổng, Cao Đức Phát, 2010), hầu hết các hộ chăn nuôi đều để nướcthải chảy tự do ra môi trường xung quanh gây mùi thối nồng nặc, đặc biệt là vàonhững ngày oi bức Nồng độ khí H2S và NH3cao hơn mức cho phép khoảng 30 – 40lần (Bùi Xuân An, 2007) Tổng số vi sinh vật và bào tử nấm cũng cao hơn mức cho

phép rất nhiều lần Ngoài ra nước thải chăn nuôi còn có chứaColiform, E.coli, COD…,

và trứng giun sán cao hơn rất nhiều lần so với tiêu chuẩn chophép

Ô nhiễm môi trường khu vực trại chăn nuôi do sự phân hủy các chất hữu cơ cómặt trong phân và nước thải của heo Sau khi chất thải ra khỏi cơ thể của heo thì cácchất khí đã lập tức bay lên, khí thải chăn nuôi bao gồm hỗn hợp nhiều loại khí trong đó

có trên 40 loại gây mùi, chủ yếu là H2S và NH3.Trong điều kiện kỵ khí cộng với sự cómặt của vi khuẩn trong phân và nước thải xảy ra quá trình khử các ion sunphat (SO42-)thành sunphua (S2-) Trong điều kiện bình thường thì H2S là một trong những nguyênnhân gây ra các vấn đề về màu và mùi Nồng độ S2-tại hố thu nước thải chăn nuôi heo

có thể lên đến 330 mg/l, cao hơn rất nhiều so với tiêu chuẩn (theo TCVN 5945-2005,nồng độ sunfua là 1,0mg/l) (Bùi Xuân An, 2007)

Việc kiểm soát chất thải chăn nuôi là một nội dung cấp bách cần được các cấpquản lý, các nhà sản xuất và cộng đồng dân cư phải quan tâm để hạn chế các vấn đề về

ô nhiễm môi trường nhằm bảo vệ sức khỏe của con người, cũng như không kìm hãm

sự phát triển của ngành chăn nuôiheo

2.1.2 Khái quát về nước thải chăn nuôiheo

2.1.2.1 Đặc điểm thànhphần

Nước thải chăn nuôi heo bao gồm một phần phân rắn, nước tiểu, nước rửachuồng và tắm heo (Trương Thanh Cảnh, 2010) Loại nước thải này có khả năng gây ônhiễm môi trường do có chứa hàm lượng cao các chất hữu cơ, cặn lơ lửng, nitơ,photpho và cả vi sinh vật gây bệnh

Số lượng chất thải hằng ngày theo Lochr (1984) là 6 – 8% khối lượng cơ thểheo, do đó lượng chất thải rắn từ các trại chăn nuôi được tạo ra hàng ngày tương đốilớn dẫn đến lượng nước thải xả ra từ các trại khá cao

Bảng 2.1:Lượng nước thải và cách xử lý của các trang trại(Vũ Đình Tôn, 2008)

Tỉnh Lượng nước thải ước tính (m

3/ngày)

Nơi đổ nước thảiHeo nái + đực Heo thịt Tổng số

Hải Dương 1,5 – 4,5 2 -13 3, 5 -17,5 - Ao cá của trại

- Kênh mương công

urea, còn 20g ở dạng phân nitơ vi sinh khó phân hủy an toàn cho môi trường Chính vì

lí do đó, nước thải heo thường chứa hàm lượng N và P rất cao

Bảng 2.2:Thành phần nước thải chăn nuôi heo

2.1.2.2 Hiện trạng ô nhiễm do nước thải chăn nuôiheo

Tại khu vực miền Nam hiện có khoảng hơn 1500 trang trại chăn nuôi heo quy

mô vừa và lớn, trong đó chỉ có khoảng 10,5% số trang trại là có hệ thống xử lý nướcthải Theo Vân và cs (2013) thống kê trên địa bàn toàn miền Nam, chỉ số nước thảiBOD và COD của nước thải chăn nuôi heo đều vượt ngưỡng cho phép (Bảng 1.3)

Bảng 2.3 BOD và COD trong nước thải trang trại chăn nuôi heo tại miền Nam

(Vânvà cs, 2013)

Nước ao gần chuồng trong khuôn viên trang trại 2,4 1,2

2.1.2.3 Một số phương pháp xử lý nước thải chăn nuôiheo

Nước thải chăn nuôi heo được coi là một trong những nguồn nước thải gây ônhiễm nghiêm trọng Hiện nay, để xử lý ô nhiễm môi trường trong chăn nuôi đã cónhiều công nghệ hiện đại được áp dụng Các biện pháp đã được triển khai thực hiệntrong những năm gần đây như: Xây dựng hầm khí biogas, sử dụng một số chế phẩmsinh học xử lý mùi hôi,…Trong đó, việc xây dựng hầm biogas là biện pháp được ápdụng khá rộng rãi và mang lại hiệu quả tương đối rõ nét (Trần Liễu, 2010)

Trên cơ sở công nghệ khí sinh học, các nghiên cứu xử lý nước thải chăn nuôiheo ở Việt Nam tập trung vào 2 qui trình chính:

o Sử dụng các thiết bị xử lý kị khí tốc độ thấp như bể biogas kiểu Trung Quốc,

Ấn Độ, Việt Nam hoặc dùng túi nhựa PE (phương pháp này áp dụng cho xử

lý nước thải chăn nuôi heo trong hộ gia đình với số đầu heo không nhiềuhơn 400con)

o Xây dựng qui trình công nghệ và thiết bị tương đối hoàn chỉnh, đồng bộnhằm áp dụng trong các xí nghiệp chăn nuôi heo mang tính chất côngnghiệp

2.2. Các quá trình chuyển hoá nitơ vô cơ và vai trò các nhóm vi khuẩn nitratehóa

Trong nước nitơ tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như ở môi trường trên cạn nhưnitơ phân tử, các hợp chất nitơ vô cơ và các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong các cơthể sống (protein, acid amin)

Quá trình bài ti của động vật

Nitơ hữu cơ

Bể BHT 2

NO − 3

NO −

NH + 4 nước thải

Nitơ hữu cơN2

NH3

Cố định nitơ

ết

Hình 2.1.Vòng tuần hoàn nitơ (Triết và Việt,2009)

Khi cơ thể sinh vật chết đi, các chất hữu cơ chứa nitơ sẽ bị thối rửa và amônhoá dưới tác dụng của các vi sinh vật thành NH3hay NH4 Dạng NH4 sẽ bị chuyển hoáthành dạng NO3-nhờ nhóm vi khuẩn nitrate hoá Các hợp chất nitrate lại được chuyểnhoá thành dạng nitơ phân tử do tác dụng của các vi khuẩn phản nitrtate hoá Khí nitơphân tử sẽ được cố định lại dưới dạng hợp chất hữu cơ nhờ nhóm vi khuẩn cố địnhđạm Các quá trình trên kết hợp lại tạo ra vòng toàn hoàn nitơ trongthuỷvực (Hình1.1) Trong tất cả các quá trình này đều có sự tham gia của các nhóm vi khuẩn khácnhau Nếu sự hoạt động của một nhóm vi khuẩn nào đó ngừng trệ, toàn bộ tiến trìnhchuyển hoá nitơ sẽ bị ảnh hưởng gây tích tụ một số hợp chất nitơ trong thuỷ vực có thểgây nên sự biến đổi chất lượng nước làm ảnh hưởng đến đời sống các thuỷ sinh vậtsống trong thuỷ vực đó (Kiều Hữu Ảnh và Ngô Tự Thành,1985)

2.3. Quá trình nitratehóa

NH4+ + 1.5O2  NO2- + 2H+ +H2ONO2- + 0.5O2  NO3- (Vi khuẩn nhóm AOB)

(Vi khuẩn nhóm NOB)

Amonium là một sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa protein, cầnphải được ngăn chặn vì gây độc hại cho các loài thủy sinh vật ngay cả ở nồng độ thấp.(Grommen,2005)

Quá trình nitrate hoá là quá trình oxy hoá các muối amôn thành muối nitratenhờ hoạt động của một nhóm vi sinh vật được gọi chung là nhóm vi khuẩn nitrate hoá.Đây là nhóm vi khuẩn hiếu khí tự dưỡng hoá năng và bao gồm hai nhóm nhỏ tham giavào hai giai đoạn của quá trình này: Giai đoạn 1 là giai đoạn oxy hoá NH4 thành NO2-được gọi là giai đoạn nitrite hoá được thực hiện bởi nhóm AOB (ammonia oxidizingbacteria) Giai đoạn 2 là giai đoạn oxy hoá NO2-thành NO3-được gọi là giai đoạn nitratehoá bởi nhóm NOB (nitrite oxidizing bacteria) (Cole,1994)

Tóm tắt quá trình nitrate hóa

Quá trình nitrate hóa được xúc tác bởi hai nhómphylogenetically: các vi khuẩn

amonia-oxy hóa (AOB) và các vi khuẩn nitrite-oxy hóa (NOB) (Roeland Grommen,2004)

Nhóm vi khuẩn AOB thuộc nhánh nhân loại phụ và của sinh vật tiền nhân,bao gồm 5 chi:Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosovibrio, Nitrosolobus,Nitrosococcus(Lâm Minh Triết, Lê Hoàng Việt,2009)

Nhóm vi khuẩn NOB thuộc nhánh nhân loại phụ của sinh vật tiền nhân, bao

gồm 4 chi:Nitrobacter ( -Proteobacteria), Nitrococcus ( -Proteobacteria),Nitrospina

(preliminarily assigned to the-Proteobacteria) và Nitrospira (separatephylum)(Aurelie

Cebron & Josette Garnier, 2005) Vi khuẩn nitrate hóa tồn tại trong nhiều loại môitrường sống gồm nước ngọt, nước biển, nước lợ, nước thải, nước sạch và đất Các chi

đại diện làNitrosomonasvàNitrobacter Chúng sử dụng trực tiếp carbon dioxide tổng

hợp thành carbon hữu cơ cho tế bào (Gerardi,2002)

Có nhiều sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy chất hữu cơ và có khả năngtham gia quá trình nitrate hóa Trong đó, các vi khuẩn phân hủy chất hữu cơ chiếmphần lớn (90-97%) và chỉ có khoảng 3-10% là các vi khuẩn nitrate hóa Tuy có nhiều

nhóm sinh vật tham gia vào quá trình nitrate hóa nhưng người ta cho rằng vi khuẩnđóng vai trò quan trọng nhất, tốc độ nitrate hóa của chúng gấp từ 1.000 – 10.000 lần sovới tốc độ nitrate hóa của các nhóm khác.( Lâm Minh Triết và Lê Hoàng Việt, 2009).Quá trình nitrate hóa cũng có thể diễn ra bởi các vi khuẩn dị dưỡng (Arthrobacter) vànấm (Aspergillus) Các vi sinh vật này sử dụng nguồn carbon từ các hợp chất hữu cơ

và oxi hóa amôn thành nitrate Tuy nhiên, các vi khuẩn dị dưỡng cần năng lượng và sựtăng trưởng của chúng chậm hơn nhóm vi khuẩn nitrate hóa tự dưỡng rất nhiều Do đó,mức độ đóng góp của nó vào quá trình nitrate hóa coi như không đáng kể Trong đấtrừng tỉ lệ nitrate hóa do các vi sinh vật dị dưỡng không quá 10% tổng quá trình nitratehóa ( Lâm Minh Triết và Lê Hoàng Việt,2009)

Các điều kiện tối ưu cho quá trình nitrate hóa

Bảng 2.4:Các điều kiện tối ưu cho quá trình nitrate hóa ( Đỗ Hồng Lan Chi và

LâmMinh Triết, 2005)

Khoảng pH cho phép (95% nitrat hóa) 7.2 – 8.4

Nhiêt độ cho phép (95% nitrat hóa),oC 15 – 35

Oxy hòa tan ở lưu lượng tối đa, mg/l >1

với nhu cầu oxy carbonaceous – oxy hóa các chất

hữu cơ do vi sinh vật heterotrophic)

2.3.1 Vi khuẩn nitritehóa

Nitrosomonaslà một trong 5 giống vi khuẩn oxy hóa ammonium (AOB)

gồm:Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosocossus, Nitrosolobus và Nitrosospira Tất cả

các vi sinh vật này đều giống nhau về mặt sinh lý-sinh hóa nhưng khác nhau về mặtđặc điểm hình thái học và cấu trúc học …(Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị ThùyDương, 2003)

Nitrosomonasđược coi là AOB trội nhất trong nước thải (Triết và Việt,

2009).Nitrosomonasthuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, đều có hình que nhưng các tế bào

vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Có 3 hình dạng cơ bảnđược xác định: hình que rất ngắn rộng 0,8 µm và dài 1 - 2 µm, hình que rộng 1 - 1,3

µm và dài 2 - 2,5 µm, hình dạng thứ ba là những tế bào rộng 1,2 µm và dài 2 -2,5 µm(Mecklejohn, 1950; Engel và Alexander, 1958) Những đặc điểm về hình dạng tế bào

như mô tả trên giúp phân biệt với giốngNitrosospiralà những tế bào dạng sợi xoắn, vòng xoắn hay thể xoắn, trong khi đóNitrosococcuscó hình cầu và các tế bào dính chặt

với nhau (Watson và Mandel,1971)

Vị trí củaNitrosomonastrong phân loại:

Hình 2.2.Ảnh chụp Nitrosomonas (A) Ảnh chụp từ kính hiển vi quang học và (B)

ảnhchụp từ kính hiển vi điện tử mặt cắt tế bào Nitrosomonas khác nhau cho thấy sự thay đổi hình dạng, kích cỡ và các chi tiết về cấu trúc của chúng.(Dworkin, 2006)

Trong quá trình oxy hóa ammonium thành nitrite, hai enzyme quan trọng của vikhuẩn AOB là ammonia monooxygenase (AMO) và hydroxylamine oxidoreductase(HAO) Đầu tiên, AMO oxy hóa NH3qua trung gian là hydroxylamine (NH2OH) Quátrình oxy hóa này được chia thành hai bước Phản ứng oxy hóa ammonia cần có haielectron bên ngoài cung cấp do sự khử O2từ H2O

NH2OH+H2O HNO2+ 4H++ 4e-(4)

½O2+ 2H++ 2e

-H2O (5)

NH2OH + ½O2HNO2+ 2H++ 2e-(6)Phản ứng này gồm nhiều phần trong đó enzyme liên kết nitroxyl (NOH) và oxitnitơ được hình thành NOH có thể được chuyển đổi thành oxit nitơ (N2O, NO) 2electron từ quá trình oxy hóa hyroxylamine (4) được chuyển cho quá trình oxy hóa

ammoniac (3) và hai electron khác vượt qua chuỗi hô hấp để cân bằng năng lượng (5).Phản ứng tổng thể cho thấy rằng quá trình oxy hóa ammonia hữu cơ tạo ra axit nitơ (7)(Werner và cs, 2005).

NH3+ 3/2 O2HNO2+ H2O (7)

Nitrosomonasgặp rất nhiều khó khăn trong quá trình nuôi cấy thuần khiết bằng

kỹ thuật pha loãng do vi khuẩn nitrite tự dưỡng phát triển rất chậm, các chất gây ônhiễm dị dưỡng trong môi trường làm giàu phát triển với một tốc độ tương đương hoặclớn hơn so với các vi khuẩn nitrite (Lewis và cs, 1958) Một số ít trường hợp thànhcông được kh ng định, quy trình phân lập tốn khá nhiều thời gian và khó khăn, kết quảthường không chắc chắn (Frankland và Frankland, 1890; Heubult, 1929; Engle vàSkallau, 1937; Bomeke, 1939) Phần lớn các phân lập thành công là từ các môi trườngnuôi cấy với hàm lượng dinh dưỡng phong phú (Lewis và cs, 1958)

Vi khuẩnNitrosomonasđược biết là nhóm vi khuẩn khó phân lập và nuôi do

chúng không có khả năng sống trên môi trường thạch và không hình thành khuẩn lạctrong điều kiện thời gian cho phép(Heselsoe và Sorenser, 1998).Phần lớn những loài vi

khuẩn thuộc giốngNitrosomonaskhông có khả năng di động nên cần phải bám vào bề

mặt giá thể như đá, cát, giá thể sinh học… giúp chúng phát triển thuận lợi Khả năngbám là nhờ chúng tiết ra chất nhầy từ màng bao bên ngoài (Meicklejohn, 1950)

Các nghiên cứu về quá trình tự dưỡng của chiNitrosomonasđã chỉ ra việc sử

dụng các môi trường có chứa một lượng lớn các thành phần không hòa tan Phổ biếnnhất trong sốnàylà canxi cacbonat, đóng vai trò trung hòa axit nitơ tạo ra bởi quá trìnhoxy hóa của nitơ amoni Trong quá trình phát triển chúng sử dụng cacbonat không tantrong dịch nuôi cấy như giá thể để bám vào (Lees, 1955; Imshenetsky và Ruban,1954) Chứng tỏ, lượng canxi hoặc magie cacbonat không những là một chất trunghòa, nguồn cacbon mà còn là bề mặt rắn mà vi sinh vật có thể được hấp phụ.(M.Alexander,1958)

Điều kiện nhiệt độ choNitrosomonasphát triển tốt nhất nằm trong khoảng từ 25

đến 30 °C, pH từ 7,5 – 8,0 (Itoh Y & cs, 2013) và nồng độ các hợp chất ammonium từ

2 – 10mM Nồng độ tối ưu của các hợp chất ammonium phụ thuộc vào độ pH của môitrường và ngượclại

2.3.2 Vi khuẩn nitratehóa

2.3.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩnNOB

Vi khuẩn nitrate hóa phân bố rất ít trong các thủy vực sạch, nghèo dinh dưỡng,trong các thủy vực giàu dinh dưỡng số lượng của chúng có nhiều hơn, nhưng cao nhấtcũng chỉ khoảng 10 tế bào/mL nước Số lượng của chúng trong thủy vực dao độngtheo mùa rõ rệt: các cực tiểu thường thấy vào mùa đông hoặc đầu mùa xuân, còn cáccực đại thì trong mùa hè Quá trình nitrate hoá là một khâu quan trọng trong vòng tuầnhoàn nitơ trong thủy vực Quá trình này có tầm quan trọng trong quản lý chất lượngnước trong nuôi trồng thủy sản Khi quá trình này xảy ra mạnh chất thải amôn độc hại

sẽ được chuyển hoá nhanh sang dạng nitrate không độc đối với sự sống và sinh trưởngcủa tôm cá (Lê Xuân Phương,2008)

Vi khuẩn nitrate hóa là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, không di độnghoặc di động bằng tiên mao ở đầu cực hoặc ở bên hông tế bào thu năng lượng bằngcách chuyển hóa nitrite thành nitrate Chúng có tế bào đa hình dạng: hình que, hìnhbầu dục, hình cầu hoặc dạng xoắn…(Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương,2003)

Bảng 2.5:So sánh 4 chi của vi khuẩn nitrate hóa (Garrity, 2005 )

Đặc tính Nitrobacter Nitrococcus Nitrospina Nitrospira

Vị trí phát sinh loài Alphaproteo

-bacteria

bacteria

Gammaproteo- bacteria

0,2 – 0,4 ×0,9 – 2,2

Sinh sản

nảy chồihoặc nhânđôi

Vị trí của hệ thống

oxy hoá nitrite trên

màng

tế bào chất tế bào chất periplasmic periplasmic

Vi khuẩn NOB có khoảng pH rộng và chịu mặn Tuy nhiên, chúng tăng trưởngchậm (do khả năng cân bằng năng lượng kém) nên gây khó khăn cho việc nuôi cấy vàgiữ giống.(Garrity, 2005 )

2.3.2.2 Vi khuẩnNitrobacter

Vi khuẩnNitrobacterlà chi nổi trội của nhóm vi khuẩn NOB Chúng thuộc vi

khuẩn Gram âm, không sinh bào tử, tế bào hìnhbầudục, kích thước khoảng 0,8 x 1,0

Vi khuẩnNitrobacterthuộc nhóm vikhuẩntự dưỡng hoá năng vô cơ và hiếu khí bắt

buộc.(John N.Abelson và Melvin I Simon,2011)

Vị trí củaNitrobactertrong phân loại:

Hình 2.3.Hình dạng tế bào và cấu trúc bốn chi vi khuẩn NOB (A) Nitrobacter,

(B)Nitrococcus, (C) Nitrospina, và (D) Candidatus Nitrotoga(John N.Abelson và

Melvin

I Simon, 2011)

Nitrobacternhận nguồn năng lượng từ quá trình oxy hoá NO2-thành NO3-.Chúng sử dụng CO2làm nguồn carbon và không cần các hợp chất hữu cơ trong quátrình phát triển ( Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003)

Hai loàiNitrobacterchủ yếu làN.winogradskyivàN.agilic.Chúng phân bố rộng

trong nhiều môi trường như đất, nước thải công nghiệp và nông nghiệp (Đỗ Hồng LanChi và Lâm Minh Triết,2 0 0 5 )

Nồng độ pH tối ưu cho quá trình tăng trưởng củaNitrobacternằm trong khoảng

7.5-8.2 Nhiệt độ tối ưu tối ưu là 28-30oC (Đỗ Hồng Lan Chi và Lâm Minh Triết,2005)

Nitrobacterrất nhạy cảm với điều kiện không thuận lợi của môi trường, nồng độ

NaNO20,5 g/l bắt đầu kiềm hãm sự sinh trưởng của chúng Năng lượng thu được từquá trình oxy hóa NH4 sẽ được các vi khuẩn sử dụng để sinh tổng hợp vật chất của tếbào từ CO32- Do chỉ nhận được rất ít năng lượng từ quá trình oxy hóa nên tốc độ pháttriển của các vi khuẩn oxy hóa amon và oxy hóa nitrit tự dưỡng là hết sức chậm chạp

Thời gian thế hệ là 12-59 giờ đối vớiNitrobacter.(Cini Achuthan,2000)

2.4. Động học của quá trìnhnitrate

Hai giai đoạn của quá trình nitrate hóa được thể hiện như sau:

- Giai đoạn oxy hóaammonia:

-( Lâm Minh Triết và Lê Hoàng Việt, 2009)

Tốc độ tăng trưởng củaNitrobactercao hơnNitrosomonas Do đó, giai đoạn tốc

độ giới hạn trong quá trình nitrate hóa là sự chuyển hóa ammonium thành nitrite

bởiNitrosomonas.Phương trình sau đây mô tả sự tăng trưởng theoMonod:

Trong các công trình xử lí nước thải, oxy là yếu tố giới hạn tăng trưởng đối vớicác vi sinh vật nitrate hóa Do đó phương trình (1) được biến đổi có tính đến ảnhhưởng của nồng độ oxy nhưsau:

µ=µ

=max

[DO Nồng độ oxy hòa tan, mg/l

Ko– Hằng số bán tốc độ của oxy, mg/l

Ks– Được ước lượng 0.15 – 2 mg/l phụ thuộc vào nhiệt độ

Các phương trình phức tạp hơn biểu thị động học tăng trưởng của các vi khuẩnnitrate hóa có tính đến nồng độ cơ chất [NH+cũng như các yếu tố môi trường như nhiệt

độ, pH, và oxy hòa tan

µncủa các vi khuẩn nitrate hóa T =

nhiệt độ(oC)

pHoptpH tối ưu 7,2

µmax0,3/ngày

Thời gian lưu tối đa là hàm số củanThời

gian lưu tối thiểu 1/n

µmaxcủa vi khuẩn nitrate hóa (0,006 – 0,035 h-1) thấp hơn nhiều so vớimaxcủa môitrường hỗn hợp của các vi khuẩn dị dưỡng sử dụng cơ chất glucose (0,18 – 0,038 h-1).Sản lượng tế bào của vi khuẩn nitrate hóa cũng thấp hơn vi khuẩn dị dưỡng Sản lượng

tối đaNitrosomonaslà 0,29, củaNitrobacterthấp hơn nhiều, khoảng 0,08 Tuy nhiên, các số liệu thí nghiệm thấp hơn nhiểu, thay đổi từ 0,04 – 0,13 đối vớiNitrosomonasvà 0,02 – 0,07 đối vớiNitrobacter Do đó, trong môi trường nitrate hóa,Nitrosomonashiện diện với số lượng lớn hơn nhiều so vớiNitrobacter.

Quá trình nitrate hóa thích hợp với nước thải đầu ra của các công trình xử lísinh học có BOD thấp và nồng độ ammonium cao Quá trình tăng trưởng hiếu khí lơlửng là thích hợp nhất cho sự nitrate hóa nước thải đầu ra Sự nitrate hóa xảy ra trong

bể hiếu khí (thời gian lưu nước 4 – 6h) và bùn chứa lượng lớn vi khuẩn nitratehóa

được tuần hoàn để duy trì hoạt tính nitrate hóa cao ( Đỗ Hồng Lan Chi và Lâm MinhTriết, 2005)

2.5. Các yếu tố kiểm soát quá trình nitratehóa.

Có một số yếu tố kiểm soát quá trình nitrate hóa trong các công trình xử lýnước thải Đó là nồng độ ammonium/ nitrite, nồng độ oxy, pH, nhiệt độ, tỷ sốBOD5/TKN, và sự hiện diện của các hóa chất độc hại

- Nồng độ NH4+/NO2-: sự tăng trưởng củaNitrosomonasvàNitrobactertuân theo

động lực học của Monod và phụ thuộc vào nồng độ của ammonium và nitrate

- Nồng độ Oxy: Nồng độ oxy là một trong những yếu tố quan trọng nhất kiểmsoát quá trình nitrate hóa Hằng số bán bão hòa của oxy (KO) là 1,3 mg/L Đểtiến hành quá trình nitrate hóa oxy phải được phân phối tốt trong bể bùn hoạttính hiếu khí và nồng độ oxy hòa tan không nên dưới 2mg/l Để oxy hóa 1mg

NH4 cần 4,6mgO2

NH3+ O2NO3-+ H++ H2O

- Nhiệt độ: Tốc độ tăng trưởng của các vi khuẩn nitrate hóa bị ảnh hưởng bởinhiệt độ thích hợp trong khoảng 8-30oC Nhiệt độ tối ưu cho quá trình vàokhoảng30oC

- Nồng độ pH: pH tối ưu choNitrosomonasvàNitrobacternằm trong khoảng

7,5-8,5 Quá trình nitrate hóa ngừng lại ở pH thấp hơn 6 Độ kiềm bị phá vỡ là kếtquả của sự oxy hóa ammonium bởi vi khuẩn nitrate hóa Về mặt lý thuyết, quátrình nitrate hóa pháhủyđộ kiềm với số lượng là 7,14mg/1mg của N-NH4 bị oxyhóa Do đó, cần phải có lượng kiềm vừa đủ trong nước thải để cân bằng vớiacid sinh ra trong quá trình nitrate hóa pH giảm do kết quả của quá trình nitratehóa có thể được giảm thiểu bằng cách khuấy trộn nước thải để loại bỏ CO2 Đôikhi người ta thêm vôi vào để làm tăng độ kiềm trong nướcthải

- Tỷ số BOD5/TNK : Một phần vi sinh vật nitrate hóa bị giảm khi tỷ sốBOD5/TNK tăng Trong quá trình nitrate hóa kết hợp oxy hóa cacbon, tỷ số nàylớn hơn 5, trong quá trình nitrate hóa riêng biệt, tỷ số này nhỏ hơn3

- Sự ức chế của các chất độc: Quá trình nitrate hóa khá nhạy cảm với một vài hợpchấtđ ộ c c ó t r o n g n ư ớ c t h ả i N g ư ờ i t a t h ấ y r ằ n g n h ữ n g c h ấ t n à y đ ộ c đ ố i

v ớ i

Nitrosomonashơn làNitrobacter.Các hợp chất hữu cơ trong nước thải không gây

độc trực tiếp cho các vi khuẩn nitrate hóa Sự ức chế của các hợp chất hữu cơ cóthể là gián tiếp và có thể là do sự suy giảm oxy do các vi khuẩn dị dưỡng Cáchợp chất gây độc nhất cho vi khuẩn nitrate hóa là cyanide, thiourea, phenol,aniline, và các kim loại nặng (Ag, Hg, Ni, Cr, Cu, Zn) Ảnh hưởng của Cu đối

vớiNitrosomonas europeatăng khi cơ chất (NH4) tăng từ 3mg/L 23mg/L

( Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003)

2.6. Sinh học phân tử của vi khuẩn AOB vàNOB

2.6.1 Giới thiệu chung về sinh học phân tử của vi khuẩn AOB vàNOB

Việc sử dụng đoạn trình tự 16S rDNA để tiến hành xác định nhóm vi khuẩnAOB, các nhà khoa học đã phát hiện nhóm vi khuẩn AOB thuộc hai lớp ngànhProteobacteria Trong đó nhóm thứ nhất thuộc lớp γ – Proteobacteria bao gồm các

loàiNitrosococus oceanivàNitrosococus halophilus Còn nhóm thứ hai thuộc lớp β – Proteobacteria bao gồm các giốngNitrosomonas, Nitrosospira,

NitrosolobusvàNitrosovibrio.Việc áp dụng công cụ phân tử đã cung cấp những hiểu

biết mới góp phần đa dạng cộng đồng vi khuẩn AOB trong các môi trường khác nhau.(UlrikePurkhold, 2000)

Hình 2.4:Cây phát sinh loài 16S rRNA phản ánh mối quan hệ phát sinh loài vi

khuẩnammonia và nitrite hóa Trong cây nhóm vi khuẩn AOB được chú thích màu xanh, nhóm vi khuẩn NOB được chú thích màu đỏ (Dworkin, 2006)

Trong việc xác định mối quan hệ của các vi khuẩn NOB thì tiêu chí quan sáthình thái thường được coi là không phù hợp Do vậy, phương pháp di truyền nhưDNA-RNA và 16s rDNA oligonucleotide đã được sử dụng Phương pháp này đã chỉ ra

rằng chiNitrobacterthuộc phân alpha củaProteobacteria, trong số những loàikhác,các chiBradyrhizobiumvà các loàiRhodopseudomonas palustris, phylogeneticallyliên quan rất chặt chẽ với chiNitrobacter Nhưng mặc khác phương pháp 16sRNA

oligonucleotide cũng có những hạn chế trong phân biệt các loài NOB cần phải phântích thêm trình tự các gene chức năng và các gene mã hóa protein.(Shawn R.Starkenburg,2008)

2.6.2 Phương pháp PCR trong định danh vi khuẩn AOB vàNOB

PCR cho phép khuếch đại từ một trình tự ban đầu của DNA bộ gen thành hàngtriệu bản sao trong vài giờ mà không cần có sự hiện diện của tế bào hoặc là bộ máysao chép của chúng PCR đã giải quyết một trở ngại lớn về lượng vật chất di truyền, đểgiải quyết vấn đề này người ta phải nhờ vào tế bào vi khuẩn hay đúng hơn là nhờ vàokhả năng sinh sản nhanh của chúng để nhânlênmột trình tự DNA đích nào đó Người

ta gọi đó là việc tạo dòng Hiện nay, với phương pháp PCR, một phương pháp đơngiản hơn nhiều đã làm nhiệm vụ thay thế cho phương pháp tạo dòng trong hầu hết cáctrường hợp (Hồ Huỳnh Thùy Dương,2003)

Nguyên tắc của phương pháp PCR, tất cả các DNA polymerase khi hoạt độngtổng hợp một mạch mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyênbiệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu củamạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phươngpháp PCR đã hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase (Hồ HuỳnhThùy Dương,2003)

Phản ứng PCR được thực hiện theo các bước:

Bước 1: Thực hiện quá trình biến tính DNA Đưa DNA vào dung dịch phản ứng(gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép) phân tử DNA được biến tính ở nhiệt

độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thường ở nhiệt độ 94 – 95oC trong thờigian 30 giây – 60giây

Bước 2: Thực hiện quá trình bắt cặp Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm củacác mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này daođộng trong khoảng 40 – 70oCtùythuộc vào nhiệt độ của các mồi và kéo dài trong thờigian 30 giây – 60giây

Bước 3: Tổng hợp mạch mới (giai đoạn kéo dài) Nhiệt độ được tăng lên đến

72oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt Thời gian tùy thuộc độ dàicủa trình tự DNA cần khuếch đại, kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.(HồHuỳnh ThùyDương,2003)

2.7. Tình hình nghiêncứu

2.7.1 Một số nghiên cứu trên thếgiới

- Năm 1958, Stojanovic và Alexander đã nghiên cứu chủngNitrobacter agilisđể

xác định tầm quan trọng của vi khuẩn nitrate hóa trong nôngnghiệp

- Năm 1995, Degrange và cộng sự đã nhận diện giốngNitrobacter trong đất bằng

kỹ thuật sinh học phân tửPCR

- Năm 1997, Degrange và cs đã nghiên cứu vai trò của NO2-và carbon hữu cơ lên

cấu trúc, mật độ và hoạt động của quần thểNitrobactertrong đất Trong môi trường bổ sung carbon hữu cơ, tế bàoNitrobactertăng mật độ theo cấp số nhân

trong 6 ngày đầu, nhưng mật độ giảm đáng kể từ ngày thứ7

- Năm 2002, Grommen và cộng sự đã cấy hỗn hợp vi khuẩn nitrate hóa

(NitrosomonasvàNitrobacter) trong một sản phẩm probiotic có tên thương mại

là ABIL (ammonia binding incolum liquid) vào bể lọc hoàn toàn trong hệ thốngnước ngọt và nước lợ Kết quả cho thấy với hàm lượng ABIL 3 – 5 mg/L có thểloại bỏ TAN và NO2-, dưới mức phát hiện trong vòng 4 – 14 ngày vận hànhtrong cả hai hệ thống nóitrên

- Năm 2003, Konrad Egli & cs đã nghiên cứu các điều kiện phù hợp để hìnhthành nhóm vi khuẩn thực hiện quá trình nitrate hóa từ bùn thải thôngthường

- Năm 2006, Bram Vanparys & cs đã nghiên cứu trình tự gen 16s rRNA củanhóm vi khuẩn Nitrobacter và kết quả hoàn thành được chuỗi trình tự gene của

30 chủng và cho thấy sự đa dạng trình tự gene giữa các loài khác nhau làthấp

- Năm 2012, John R C và Okpokwasili G C qua nghiên cứu đã kết luận rằng vikhuẩn nitrate có thể sử dụng dầu hỏa, dầu diesel, nhiên liệu máy bay phản lực

và dầu động cơ như nguồn carbon Đưa ra hướng mới cho việc phân lập vikhuẩn nitrate hóa từ dầu thô cho mục đích xử lý sinhhọc

- Năm 2013, Itoh Y & cs đã phân lập thành côngNitrosomonassp JPCCT2 từ nhà

máy nhiệt điện có khả năng sống ở nhiệt độ cao từ 37 –45oC

- Cũng trong năm 2013, Annette Bollmann & cs đã hoàn thành toàn bộ trình tự

bộ gen của vi khuẩnNitrosomonas sp.Is79, vi khuẩn có khả năng thích nghi với

nồng độ ammoniumthấp

- Năm 2015, Tatsunori Nakagawa và Reiji Takahashi đã phân lập thành công

giống vi khuẩn oxy hóa ammonia mới làNitrosomonas stercoris, có khả năng

oxy hóa ammonia ở nồng độ cao lên tới 1.000mM

- Năm 2016, Karthik R và Angelin C Pushpam đã đưa ra các nghiêncứuvề việc

sử dụng các chủng vi khuẩn nitrite có lợi trong nuôi tôm để ngăn chặn hiệntượng phú dưỡng, kiểm soát bệnh vi khuẩn và tăng cường năngsuất

2.7.2 Một số nghiên cứu ở ViệtNam

- Năm 2007, Trần Liên Hà và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn các chủng vikhuẩn nitrate hóa ứng dụng trong xử lý nước hồ ô nhiễm Kết quả thu được 4chủng có khả năng nitratehóa

- Năm 2008, Lại Thúy Hiền và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh

họcNitrobacterứng dụng trong xử lý nước nuôi tôm tại Thừa Thiên Huế Kết

quả thu được 7 chủng vi khuẩnoxyhóa ammonium, 4 chủngoxyhóa nitrite, 3chủng khửnitrate

- Năm 2008, Hoàng Phương Hà và cộng sự đã phân lập các chủng vi khuẩn

nitrate hóa có phân lập từ nước lợ nuôi tôm tại Quảng Bình và Hà Tĩnh Kết quảphân lập được 3 chủng vi khuẩn oxy hóa ammonium và 7 chủng vi khuẩn oxyhóa nitrite có đặc điểm và hình thái đặc trưng của vi khuẩn thuộc

chiNitrosomonasvàNitrobacter.

- Năm 2011, Phạm Thị Tuyết Ngân và cộng sự đã tiến hành định danh các vikhuẩn chuyển hóa đạm bằng phép thử sinh hóa vàkỹthuật sinh học phân tử Kết

quả đã thu được dòng S6 đồng hình với dòngNitrosomonadaceae3CC11 (98%),

2 dòng S8 và S12 đồng hình với dòngNitrosomonas nitrosa(90% và 91%) Cả 2 dòng N10 và N12 đều có mức độ đồng hình với dòng vi khuẩnNitrobacter

winogradskyiATCC 25381 (99% và100%).

- Năm 2013, Võ Văn Nhân và Trương Quang Bình , đã nghiên cứu thử nghiệm

xử lý nước thải nhà máy chế biến thủy sản bằng vi sinh vật với sự kết hợp

củaBacillus subtilis, Nitrosomonas sp., Nitrobacter,Saccharomyces.

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu thínghiệm

3.1.1 Nguồn mẫu

- Mẫu nước thải từ các cơ sở chăn nuôi heo tại xã Trần Văn Cội, huyện Củ Chi, TP.Hồ ChíMinh

3.1.2 Đối tượng nghiêncứu

- Các chủng vi khuẩn thuộc dòngNitrosomonas, Nitrobacterđược phân lập từ

nguồn nước thải giàuammonium

3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóachất

3.2.1 Thiếtbị

- Một số thiết bị sử dụng để tiến hành thí nghiệm gồm: Nồi hấp tiệt trùng, tủ cấy vôtrùng, tủ sấy dụng cụ, tủ ấm, tủ hút, tủ lạnh, cân phân tích, máy lắc, máy đo pH,máy khuấy từ, kính hiểnvi

3.2.3 Hóachất

- Hóa chất được sử dụng để tiến hành thí nghiệm gồm: Nước cất, Cồn 70o, 96o, acidsulfanific, α-napthylamine, sodium acetate, HCl, NaOH, FeSO4.7H2O, NaCl,KNO2, CaCl2, (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4.7H2O, CaCO3, NH4Cl, Na2HPO4,NaHCO3,FeCl3.6H2O,KH2PO4,Fe-EDTA,MnSO4,Fe2(SO4)3,agar,thuốc

nhuộm Violet, thuốc nhuộm Safarin, dầu soi kính

3.3 Phương pháp nghiêncứu

3.3.1 Sơ đồ nội dung nghiêncứu

Khảo sát khả năng chuyển hóa NH4+ thành NO2- và NO2- thành Quan sát hình thái sinh học

NO3-Thuần mẫu trên môi trường thạch

Mẫu

Trải trên môi trường thạch đặc trưng

Test sinh hóaThuần mẫu trên môi trường lỏng

Test sinh hóa

Phân lập trên môi trườnglỏng đặc trưng

Định danh

Dựng đường cong sinh trưởngKhảo sát hiệu quả giữ giống của 1 số phương pháp

Đồng nhất mẫu

Hình 3.1.Sơ đồ nội dung nghiên cứu

3.3.2 Phương pháp thu mẫu (Somsiri,2006)

- Thu mẫu bằng hệ thống ống PVC đã được tiệt trùng bằng cồn70o

- Thu mẫu ở 3 vị trí khác nhau: đầu, giữa và cuối theo đường chéo của vùng lấy mẫu.

- Mẫu được giữ lạnh và chuyển về PTN trong vòng từ 3 – 5 giờ, bảo quản lạnh và

xử lý trong vòng 2giờ

- Ghi chú đầy đủ các thông tin: địa điểm, ngày, tháng, năm và thời gian thu mẫu vàdán trên chai mẫu thuđược

3.3.3 Phương pháp phân lập vikhuẩn

3.3.3.1 Phương pháp phân lập nhóm vi khuẩnNitrosomonas

- Môi trường ammonium-calcium-carbonate (SM1) được sử dụng để phân lập vi

khuẩnNitrosomonasdựa theo phương pháp của Ehrlich, 1975 (BảngPL1).

- Thuốc thử Griess-Ilosway dùng kiểm tra sự hiện diện củaNO2-

- Các bước phân lập: mẫu nước thải ở 3 vị trí của vùng lấy mẫu được trộn lẫn nhaurồi chuyển 10 ml nước thải hỗn hợp vào bình tam giác 90 ml nước cất tiệt trùng,đồng nhất mẫu Sau đó chuyển 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml môi trườngSM1 vô trùng để thu được mẫu phân lập ở nồng độ 10-1 Các ống nghiệm chứamẫu pha loãng và ống đối chứng âm (môi trường SM1 không bổ sung mẫu) được

ủ trong bóng tối ở 30oC, 150 vòng/phút Sau 21 ngày, kiểm tra kết quả bằngthuốc thử Griess-Ilosway Phản ứng cho màu đậm nhạt chứng tỏ có sự hiện diện

của nhóm vi khuẩnNitrosomonastrong môi trường vì vi khuẩnNitrosomonassẽ

chuyển hóa một phần hoặc hoàn toàn NH4+có trong môi trường thành NO2-, ở ốngđối chứng âm không cho phản ứng màu Đối với các ống mẫu dương tính tiếp tụccấy chuyền vào ống nghiệm chứa môi trường SM1 vô trùng để thu được mẫu ởnồng độ 10-2, nuôi mẫu ở điều kiện như trên trong 7 ngày thì tiếp tụccấychuyềnlần 3 để thu được mẫu ở nồng độ 10-3 Sau 7 ngày, kiểm tra kết quả bằng thuốcthửGriess-Ilosway

3.3.3.2 Phương pháp phân lập nhóm vi khuẩnNitrobacter

- Môitrườngnitrite-calcium-carbonate(BM1)đượcsửdụngđểphânlậpvikhuẩn

Nitrobacterdựa theo phương pháp của Ehrlich, 1975 (Bảng PL2).

- Thuốc thử Griess-Ilosway được dùng để kiểm tra sự hiện diện của nhóm vikhuẩn

Nitrobacter.

- Các bước phân lập: được thực hiện tương tự vi khuẩnNitrosomonas.

- Xác định dương tính đối với nhómNitrobacter: cho thuốc thử Griess-Ilosway vào

mẫu vớitỷlệ 1:1, lắc đều, quan sát sự thay đổi màu trong 5 phút Các ống nghiệmchứa mẫu trong môi trường nitrite-calcium-carbonate không xuất hiện màu đỏhồng sau khi phản ứng với thuốc thử Griess-Ilosway cho thấy không còn NO2-

Điều này chứng tỏ có sự hiện diện của nhóm vi khuẩnNitrobacter.

3.3.4 Phương pháp định tínhnitrite

- Xác định sự hiện diện của nitrite trong mẫu bằng phương pháp Diazo hóa vớithuốc thử Griess-Ilosway (Ehrlich,1975)

+ Nguyên lý của phương pháp:

 Đầu tiên, ion nitrite (NO2-) phản ứng với acid sunfanilic tạo thành muốidiazo

 Tiếp theo, muối này phản ứng với α – naphtylanmine tạo thành hợp chất có màuhồng