GIỚI THIỆU Suy tim sung huyết (CHF) là một căn bệnh phổ biến thường xuất hiện ở giai đoạn cuối của các bệnh tim mạch khác nhau. Trung Y (TCM) đóng một vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa và điều trị các bệnh mãn tính, bao gồm cả CHF. Tuy nhiên, can thiệp lâm sàng đối với CHF ở giai đoạn đầu của TCM và Tây y vẫn còn kém vì các triệu chứng tim mạch cụ thể hoặc các hội chứng Trung Y để xác định những người có nguy cơ cao mắc CHF còn bị giới hạn. Vọng, Văn( nghe tim mạch và khứu giác), Vấn và Thiết là Tứ Chẩn trong Trung Y. Nhìn lưỡi là một phần quan trọng của Vọng Chẩn và là một trong những phương pháp chẩn đoán đặc biệt để xác định bệnh theo Trung Y. Thông qua quan sát thích hợp của lưỡi và lớp phủ lưỡi, thầy thuốc có thể phân tích tình trạng sinh lý và bệnh lý của người bệnh. Các bệnh nhân khác nhau bị CHF có thể có biểu hiện lâm sàng khác nhau. Theo các đặc điểm của lớp phủ lưỡi, bệnh nhân có thể được chẩn đoán có hoặc không có hội chứng Khí Hư Huyết Ứ, đây là dạng hội chứng phổ biến nhất trong CHF. Trong những năm gần đây, công nghệ chip protein (Biochip) với thông lượng và độ nhạy cao đã được sử dụng rộng rãi trong việc xác định các protein cụ thể trong mẫu.1 Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã thực hiện các nghiên cứu về việc: Liệu chất lỏng phủ lưỡi ở các thể bệnh CHF khác nhau theo Trung Y có chứa thông tin sinh học khác nhau (ví dụ: protein) hay không ? Và liệu những khác biệt này có thể giúp phân biệt các thể bệnh CHF khác nhau theo Trung Y hay không ? Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát mối liên quan giữa protein dịch phủ lưỡi và CHF ở những bệnh nhân có hoặc không có hội chứng Khí Hư Huyết Ứ.
Trang 1Yếu Tố Chuyển Đổi Tăng Trưởng β1 Là Một Protein Đơn Cử Cho Sự Khác Biệt Của Suy Tim
Sung Huyết Thể Khí Hư Huyết Ứ
Li Xiaoqian, Huang Pinxian, He Jiancheng, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Cổ Phương, Cao đẳng Y
Học Căn Bản, Đại học Trung Y học Thượng Hải, Thượng Hải 201230, Trung Quốc
Wang Shijun, Khoa Tim mạch, Viện Bệnh tim mạch Thượng Hải, Bệnh viện Trung Sơn, Đại học Phúc
Đán, Thượng Hải 200032, Trung Quốc
Cao Xuebin, Khoa Tim mạch, Bệnh viện PLA 252, Bảo Định 71000, Trung Quốc
Được hỗ trợ bởi: Quỹ Khoa học Tự nhiên Trung Quốc (Số 81803996), Dự án Nghiên cứu Lâm sàng lớn
của Quân đội (Số 2006021003), Kế hoạch Đào tạo Nhà lãnh đạo Học thuật Xuất sắc của Hệ thống Y tế Thượng Hải (Số XBR2011070), và Xây dựng Cơ bản Lâm sàng Kỷ luật TCM (Số A1-Z183020110)
Thư liên hệ: He Jiancheng, Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Cổ Phương, Cao đẳng Y học căn bản, Đại
học Trung Y Thượng Hải, Thượng Hải 201230, Trung Quốc hejc8163@163.com
Điện thoại: + 86-21-51322142
Được chấp nhận: ngày 12 tháng 6 năm 2019
J Tradit Chin Med 2020 April 15; 40(2): 311-316 ISSN 0255-2922
Người dịch : ThS.BS Nguyễn Ngọc Khánh Gmail Bsnguyenngockhanh@gmail.com
TÓM TẮT MỤC TIÊU: Để tìm hiểu vai trò của protein dịch phủ lưỡi trong việc điều chỉnh suy tim
sung huyết (CHF) thể Khí Hư Huyết Ứ
PHƯƠNG PHÁP: Chúng tôi nghiên cứu khảo sát các protein biểu hiện khác biệt trên
các bệnh nhân bị suy tim sung huyết (CHF) (3 bệnh nhân bị hội chứng Khí Hư Huyết Ứ
và 3 bệnh nhân không có hội chứng Khí Hư Huyết Ứ ) Chúng tôi cũng lập một nhóm kiểm soát Một mảng kháng thể dựa trên nhãn biotin được sử dụng để kiểm tra các mẫu chất lỏng phủ lưỡi của bệnh nhân Phân tích mạng lưới các protein biểu hiện khác biệt này được thực hiện bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu STRING, có thể dự đoán mối quan
hệ giữa các protein biểu hiện khác biệt và CHF với hội chứng Khí Hư Huyết Ứ
Trang 2KẾT QUẢ: Tổng cộng có bảy protein biểu hiện khác biệt (protein DE) đã được xác
định, và trong số này, yếu tố chuyển đổi tăng trưởng β1 (TGF-β1) được chúng tôi chú ý đặc biệt Phân tích mạng lưới cho thấy mối quan hệ tương đồng của TGF-β1 với protein tạo hình xương 15( BMP-15), có liên quan đến xơ hóa cơ tim
KẾT LUẬN: Sự xuất hiện và phát triển của CHF có thể là do một số protein DE nhất
định và các con đường tín hiệu liên quan Protein TGF-β1 có thể là một dấu hiệu tiềm
năng để đánh giá nguy cơ CHF thể Khí Hư Huyết Ứ
© 2020 JTCM Đã đăng ký Bản quyền
Từ khóa: Suy tim sung huyết; Khí huyết ứ trệ; Biến đổi hệ số tăng trưởng β1; Protein di
truyền hình thái xương 15; Protein biểu hiện khác nhau
GIỚI THIỆU
Suy tim sung huyết (CHF) là một căn bệnh phổ biến thường xuất hiện ở giai đoạn cuối của các bệnh tim mạch khác nhau Trung Y (TCM) đóng một vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa và điều trị các bệnh mãn tính, bao gồm cả CHF Tuy nhiên, can thiệp lâm sàng đối với CHF ở giai đoạn đầu của TCM và Tây y vẫn còn kém vì các triệu chứng tim mạch cụ thể hoặc các hội chứng Trung Y để xác định những người có nguy cơ cao mắc CHF còn bị giới hạn
Vọng, Văn( nghe tim mạch và khứu giác), Vấn và Thiết là Tứ Chẩn trong Trung Y Nhìn lưỡi là một phần quan trọng của Vọng Chẩn và là một trong những phương pháp chẩn đoán đặc biệt để xác định bệnh theo Trung Y
Thông qua quan sát thích hợp của lưỡi và lớp phủ lưỡi, thầy thuốc có thể phân tích tình trạng sinh lý và bệnh lý của người bệnh Các bệnh nhân khác nhau bị CHF có thể có biểu hiện lâm sàng khác nhau Theo các đặc điểm của lớp phủ lưỡi, bệnh nhân có thể được chẩn đoán có hoặc không có hội chứng Khí Hư Huyết Ứ, đây là dạng hội chứng phổ biến nhất trong CHF
Trong những năm gần đây, công nghệ chip protein (Biochip) với thông lượng và độ nhạy cao đã được sử dụng rộng rãi trong việc xác định các protein cụ thể trong mẫu.1
Nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã thực hiện các nghiên cứu về việc: Liệu chất lỏng phủ lưỡi ở các thể bệnh CHF khác nhau theo Trung Y có chứa thông tin sinh học khác nhau (ví dụ: protein) hay không ? Và liệu những khác biệt này có thể giúp phân biệt các thể bệnh CHF khác nhau theo Trung Y hay không ? Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát mối liên quan giữa protein dịch phủ lưỡi và CHF ở những bệnh nhân có hoặc không có hội chứng Khí Hư Huyết Ứ
Trang 3CHẤT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các trường hợp lâm sàng từ Bệnh viện Long Hoa trực thuộc Đại học Trung Y Thượng Hải (Shutcm) được thu thập từ tháng 1 đến tháng 3 năm 2015 Các trường hợp được thu thập theo tiêu chuẩn chẩn đoán của CHF, tiêu chuẩn bao gồm và loại trừ, cũng như tiêu chuẩn chẩn đoán hội chứng CHF như được thiết lập bởi các nghiên cứu sơ bộ của chúng tôi 2,3
Chúng tôi chọn nhóm đối chứng khỏe mạnh từ các nhân viên của Shutcm đã khám sức khỏe Trong nghiên cứu này, chúng tôi lấy ba trường hợp CHF thuộc thể bệnh Khí Hư Huyết Ứ , ba trường hợp CHF thuộc thể Khí Âm Lưỡng Hư, và bốn trường hợp đối chứng khỏe mạnh.Bệnh nhân được hướng dẫn súc miệng từ ba đến năm lần, và các bác sĩ lấy mẫu chất dịch phủ lưỡi từ bề mặt lưỡi của họ bằng cách sử dụng thìa không gỉ Các mẫu sau đó được hòa tan trong ống ly tâm với 2 mL nước muối 0,9% thông thường Sau khi ly tâm ở 239 × g trong 2 phút, phần nổi phía trên được hút vào một ống ly tâm khác
và được bảo quản lạnh ở －80 ℃ để thử nghiệm sau
Các quy trình chính để phát hiện protein bao gồm định lượng protein, thẩm tách mẫu, dán nhãn biotin của mẫu, làm khô chip thủy tinh, ngăn chặn và ủ mảng kháng thể và phát hiện huỳnh quang Định lượng protein được xác định bằng cách sử dụng Bicinchoninic Acid Kit (Viện nghiên cứu Biyuntian, Hải Môn, Giang Tô, Trung Quốc) để xác định protein Dung dịch đệm thẩm tách mẫu (1 ×nước muối photpha đệm, pH = 8,0) được hòa tan trong 0,6 g KCl, 24 g NaCl, 0,6 g KH2PO4 và 3,45 g Na2HPO4 trong 2500 mL nước khử ion Việc ghi nhãn Biotin của các mẫu và phát hiện huỳnh quang được xác định bằng cách sử dụng RayBio® Biotin Label-based Human Antibody Array I (Norcross, GA USA)
Sàng lọc các protein DE liên quan đến việc xác định những người có mức thay đổi gấp ≥ 2,0 và giá trị P ≤ 0,05 Bản đồ nhiệt và đồ thị núi lửa đã được thực hiện để đánh giá khác biệt đáng kể trong kết quả phân cụm phân cấp trên các microRNA Cơ sở dữ liệu STRING đã phân tích mạng lưới di truyền của các protein biểu hiện khác biệt Kết quả phân nhóm phân cấp hai chiều cho thấy mối quan hệ giữa protein DE và mẫu
Phân tích thống kê
Phân tích thống kê được thực hiện bằng SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) Kết quả được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Sự khác biệt giữa ba hoặc nhiều nhóm được đánh giá về mức độ ý nghĩa bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều, trong khi sự khác biệt giữa hai nhóm được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm khác biệt có ý nghĩa nhỏ nhất P <0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê
Trang 4KẾT QUẢ
Đặc điểm của bệnh nhân
Độ tuổi của 10 đối tượng là 54-80 tuổi, có sự phân bố giới tính cân bằng Bệnh nhân có chứng hậu Khí Hư Huyết Ứ được phân nhóm là G1, Khí Âm Lưỡng Hư là G2, và nhóm chứng khỏe mạnh là G3 Các bệnh cơ bản của G1 và G2 bao gồm bệnh tim mạch vành, với chức năng tim dao động cấp độ 2-3 Ở G1, mức trung bình của Brain Natriuretic Peptide (peptide nội tiết tim mạch BNP) là 246,90 pg / mL và ở G2 là 141,24 pg / mL (bảng 1)
Chú ý : BNP: brain natriuretic peptide (peptide nội tiết tim mạch BNP) ; CHD: coronary heart disease (Bệnh mạch vành) Gender : giới tính ( F – Nữ) Underlying disease ( bệnh cơ bản)
Sàng phân loại các protein DE giữa G1 và G3
Bệnh nhân có chứng hậu Khí Hư Huyết Ứ có bảy loại protein DE so với nhóm chứng khỏe mạnh (Bảng 2)
Trang 5Chú ý: BMP-15: bone morphogenetic protein 15; CXCR4: chemokine (C-X-C motif ) receptor 4; FGF-13: fibroblast growth
factor 13; TGF-β1: transforming growth factor β1 Trong G1 / G3, sáu protein biểu hiện khác biệt (Differentially expressed
protein) được tăng cường điều chỉnh, ngoại trừ CXCR4 Giá trị P là kết quả của G1 so với G3 Fold Change : số lần thay đổi
biểu hiện
Sàng phân loại các protein DE giữa G2 và G3
Có tám protein DE giữa G2 và G3 trong (Bảng 3)
Chú ý: CCR7: CC-chemokine receptor 7; IL: interleukin; MCP-1: monocyte chemotactic protein 1; MMP-11: matrix
metalloproteinase-11 Trong G2 / G3, bảy protein biểu hiện khác biệt (Differentially expressed protein) đã được tăng
cường điều chỉnh, ngoại trừ IL-1 R6.Giá trị P là kết quả của G1 so với G3 Fold Change : số lần thay đổi biểu hiện
Sàng phân loại các protein DE giữa G1 và G2
Có ba loại protein DE giữa G1 và G2 (Bảng 4)
Notes: GM-CSF: granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Trong G1 / G2, tất cả các protein biểu hiện khác biệt
(Differentially expressed protein) đều được tăng cường điều chỉnh. Giá trị P là kết quả của G2 so với G3 Fold Change : số lần thay đổi biểu hiện
Trang 6Phân cụm theo thứ bậc của các protein DE
Kết quả phân cụm phân cấp của các protein DE trong các mẫu có bản đồ nhiệt được thể hiện trong Hình 1
Hình 1 Bản đồ nhiệt của G1 / G3, G2 / G3 và G1 / G2 , A: G1 / G3; B: G2 / G3; C: G1 / G2
Trang 7Phân tích mạng lưới gen của các protein DE
Phân tích mạng lưới gen là một phương pháp xác định mối tương quan của các protein cụ thể Trong phân tích mạng của STRING, nút mạng đại diện cho một protein và mạng được thực hiện thay mặt cho chức năng quan hệ dự báo.5
Các vạch màu khác nhau đại diện cho các mối liên quan khác nhau
Chúng tôi nhận thấy mối liên quan chức năng của các protein DE của thể bệnh Khí Hư Huyết Ứ Có sự liên quan trong khai thác dữ liệu giữaprotein follistatin, protein hình thái xương 15 (BMP-15), TGF-β1 và thụ thể chemokine (C-X-C motif) 4 (CXCR4), và
sự tương đồng giữa BMP15 và TGF-β1 (Hình 2)
Hình 2 Phân tích mạng lưới gen của protein DE
Trang 8BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu sơ bộ này, chúng tôi nhận thấy rằng hội chứng Khí Hư Huyết Ứ là mô
hình chính của suy tim sung huyết (CHF) Hội chứng Khí Hư Huyết Ứ thường dẫn đến
tiên lượng xấu hơn về CHF và tỷ lệ tử vong cao hơn.2,6
Một dấu ấn sinh học trong tuần hoàn sẽ thuận tiện cho việc chẩn đoán hoặc điều trị sớm CHF Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sàng lọc và tìm thấy bảy loại protein biểu hiện khác biệt (protein DE)
trong chất lỏng phủ trên lưỡi ở những bệnh nhân thể bệnh Khí Hư Huyết Ứ Trong số đó, TGF-β1 là một protein biểu hiện khác biệt được tăng cường điều chỉnh, và nó là một
cytokine quan trọng có liên quan đến xơ hóa cơ tim TGF-β1 có thể gây ra tăng biểu hiện
của yếu tố tăng trưởng mô liên kết, dẫn đến sự xuất hiện và phát triển của xơ hóa cơ tim
7,8 Ngoài ra, trong phân tích mạng lưới gen của chúng tôi, chúng tôi đã tìm thấy mối liên kết khai thác dữ liệu của protein follistatin, BMP-15, TGF-β1, và CXCR4, và sự tương đồng giữa BMP-15 và TGF-β1, chỉ ra mối liên hệ mạng lưới gen giữa TGF-β1 với các protein khác Hiện tại, protein sinh bệnh học được sử dụng rộng rãi trong nhiều bệnh tim mạch, bao gồm cả CHF Các nhà nghiên cứu đã nghiên cứu cơ chế bệnh sinh từ mức độ protein và dự đoán các dấu hiệu protein của các bệnh này9 Trong thực hành lâm sàng, khoảng 100 loại protein thuộc tim ở trạng thái bệnh lý đã được xác định 10 Một số nhà nghiên cứu khác đã phát hiện ra rằng các tế bào cơ tim bình thường có thể được phân
tách thành 1232 ± 56 điểm protein Trong số đó, 11 loại protein có sự thay đổi về chất
và định lượng sau căng thẳng/gắng sức, và những protein DE này có thể tham gia vào các phản ứng căng thẳng/gắng sức tim mạch và quá trình chấn thương do căng thẳng/gắng sức 11 Hơn nữa, ngày càng có nhiều nghiên cứu tập trung vào các dấu ấn sinh học trong các xét nghiệm không xâm lấn 12 Kỹ thuật protein chip sinh học đóng một vai trò quan trọng trong việc sàng lọc thông tin tiên lượng từ các mẫu xét nghiệm Trung
Y đóng một vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa và điều trị CHF 13 Hiện nay, các nghiên cứu về cơ sở hữu hình của các chứng hậu Trung Y đã trở thành trọng tâm của nghiên cứu khoa học Trong bệnh Trung Y, thông tin về một căn bệnh được thu thập bằng cách kiểm tra lưỡi của bệnh nhân Tuy nhiên, không có nghiên cứu nào tập trung vào cơ sở sinh học của việc sử dụng chất lỏng phủ lưỡi trong thể bệnh Khí Hư Huyết Ứ trong CHF, và một dấu ấn sinh học protein vẫn chưa rõ ràng Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi đã tìm thấy bảy protein biểu hiện khác nhau trong chất lỏng phủ lưỡi của những bệnh nhân mắc thể Khí Hư Huyết Ứ Trong số đó, protein TGF-β1 đã được điều chỉnh đáng kể Theo hiểu biết tốt nhất của mình, đây là báo cáo tiên phong phân tích mối liên quan giữa mức protein trong lớp phủ lưỡi trong hội chứng TCM của CHF Quan trọng nhất, chúng tôi đã tìm thấy mối quan hệ khai thác dữ liệu tương đồng của β1 với BMP-15, và BMP-15 có liên quan đến xơ hóa cơ tim và tái tạo tim
TGF-β1 là kiểu phụ được biểu hiện rộng rãi nhất trong họ TGF-β.14
Con đường tín hiệu
Trang 9TGF-β1 là một trong những con đường quan trọng ảnh hưởng đến quá trình tái tạo tim trong tăng huyết áp hoặc nhồi máu cơ tim bằng cách kích hoạt và thúc đẩy sự xuất hiện và phát triển của quá trình tái tạo tim.15 TGF-β1 có thể thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa protein Smad bằng cách kết hợp các thụ thể của nó, và sau đó kết hợp với các protein Smad loại phụ trợ thành một Điều này đến lượt nó tương tác với các yếu tố phiên mã trong nhân, thúc đẩy tăng sinh nguyên bào sợi cơ tim và phì đại tế bào cơ tim.16 Trong hệ tim mạch,
TGF-β1 có thể thúc đẩy tổng hợp chất nền ngoại bào và đƣợc coi là một trong những chất xơ hóa tiền cơ tim quan trọng nhất và có liên quan chặt chẽ đến xơ hóa cơ
tim ở CHF.17 Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng TGF-β1 là chất điều hòa hai chiều của tế bào
cơ tim TGF-β1 bảo vệ các tế bào cơ tim và thúc đẩy quá trình sửa chữa chúng, duy trì hoạt động bình thường của cấu trúc và chức năng cơ tim Tuy nhiên, sự biểu hiện quá mức của TGF-β1 có thể dẫn đến lắng đọng chất nền ngoại bào và làm trầm trọng thêm quá trình xơ hóa và tái tạo cơ tim.18
BMP là một thành viên của siêu họ TGF-β, và nó đóng một vai trò quan trọng trong việc
biệt hóa tế bào gốc thành tế bào gốc tim, cũng như trong các giai đoạn và vị trí khác
nhau trong quá trình phát triển hệ tim mạch 19,20
Trong nghiên cứu này, việc điều hòa protein TGF-β1 và BMP-15 cho thấy rằng con đường tín hiệu TGF-β1 có thể được kích hoạt ở những bệnh nhân CHF thể Khí Hư Huyêt
Ứ này Sự thay đổi này có thể được cho là do xơ hóa cơ tim trong quá trình CHF Cơ chế
cơ bản của hội chứng Khí Hư Huyết Ứ làm trung gian điều hòa protein TGF-β1 cần được nghiên cứu thêm Tuy nhiên, protein TGF-β1 được tăng cường điều chỉnh có thể là một dấu ấn sinh học hữu ích để dự đoán sự tiến triển của CHF
Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự xuất hiện và phát triển của CHF với hội chứng Khí Hư Huyết Ứ, có thể là do một số protein biểu hiện khác biệt tham gia vào một
số con đường tín hiệu Ngoài ra, chất lỏng phủ lưỡi có chứa thông tin về CHF Điều hòa protein TGF-β1 có liên quan chặt chẽ với CHF, và TGF-β1 có thể hoạt động như một dấu hiệu ứng cử viên để dự đoán nguy cơ mắc hội chứng Khí Hư Huyết Ứ trong CHF
Trang 10TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Seong SY, Choi CY Current status of protein chip development in terms of fabrication and application Proteomics 2013; 3(11): 2176-2189
2 Li XQ, He JC, Huang PX Research on syndrome regularity of congestive heart failure based on clinical case review Zhong Hua Zhong Yi Yao Za Zhi 2013; 28(5):1339-1345
3 Chen HZ, Translation Braunwald cardiology The 5th ed Beijing: People's Medical Press 1999: 407
4 Cheng YW, He L, Liao P, et al Research on tongue coating of chronic renal failure based on protein microarray.Shi Jie Ke Xue Ji Shu （Zhong Yi Yao Xian Dai Hua) 2011; 13(4): 616-621
5 Snel B, Bork P, Huynen MA, et al STRING:a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene Nucleic Acids Research 2000; 28(18): 3442-3444
6 Li XQ, Wu GC, Wang SJ, et al Circulating miR-665 and miR-30c-1-3p, the candidate markers of congestive heart failure with Qi-deficiency-blood-stasis syndrome Int J Clin Exp Med 2016; 9(6): 11675-11679
7 Mauviel A.Transforming growth factor-beta: a key mediator of fibrosis Methods Mol Med 2005; 11(7): 69-80
8 Perbal B CCN proteins: multi-functional signaling regulators Lancet 2004; 363(9402): 62-64
9 Donahue MP , Rose K, Hochstrasser D, et al Discovery of proteins related to coronary artery disease using industrial-scale proteomics analysis of pooled plasma Am Heart J 2006; 152(3): 478-485
10 De Celle T, Vanrobaeys F, Lijnen P, et al Alterations in mouse cardiac proteome after
in vivo myocardial infarction: permanent ischaemia versus ischaemia-reperfusion Exp Physiol 2005; 90(4): 593-606
11 Duan HF, Qian LJ, Ying WT, et al Bidirectional gel electrophoresis analysis of proteome of stressed myocardium cells Zhong Guo Sheng Wu Hua Xue Yu Fen Zi Sheng Wu Xue Bao 2002; 18(2): 234-239