Nghiên cứu thành phần và hàm lượng lipid, axit béo của một số loài rong nâu tại vùng biển việt nam​

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUY N V N TUY N NH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG LIPID, XIT BÉO CỦ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU TẠI V

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUY N V N TUY N NH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG LIPID,

XIT BÉO CỦ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU

TẠI VÙNG BIỂN VIỆT N M

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI, 11/2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUY N V N TUY N NH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG LIPID,

XIT BÉO CỦ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU

TẠI VÙNG BIỂN VIỆT N M

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm - Hóa sinh

Mã ngành: 8.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hướng dẫn khoa học : TS Lê Tất Thành

Đơn vị : Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên

HÀ NỘI, 11/2018

L I C M ĐO N

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới s hướng d n hoa h c của TS Lê T t Thành C c t qu nghiên cứu thu đư c trong luận văn hoàn toàn trung th c và chưa đư c công bố trong b t ỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Nguy n Văn Tuy n nh

L I CẢM N

Với lòng bi t ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin gửi lời c m ơn tới

TS Lê T t Thành, người th y đ tận tình hướng d n hoa h c, ch ra hướng nghiên cứu cho tôi, c ng như đ ng viên và gi p đ tôi trong suốt qu trình

th c hiện luận văn

Tôi xin trân tr ng c m ơn GS.TS Ph m Quốc Long, Viện trưởng Viện Ho h c c c h p ch t thiên nhiên đ đ ng viên, t o đi u iện cho tôi

h c tập và làm việc đ tôi c th th c hiện tốt c c công việc và đ t đư c t qu

b o c o luận văn này

Tôi xin chân thành c m ơn c c anh ch , c c b n đ ng nghiệp của Trung tâm Nghiên cứu và Ph t tri n c c s n ph m thiên nhiên, Phòng Ho sinh h u

cơ - Viện H a h c c c h p ch t thiên nhiên đ gi p đ , đ ng g p nhi u ý i n quý b u trong suốt qu trình th c hiện luận văn

Tôi xin chân thành c m ơn c c đ ng nghiệp của Phòng Ho sinh so

s nh – Trung tâm Khoa h c Quốc gia v Sinh h c bi n, Phân viện Vi n Đông, Viện Hàn lâm Khoa h c L Nga đ h tr tôi trong qu trình th c nghiệm

Cuối cùng, tôi xin chân thành c m ơn gia đình và b n bè đ đ ng viên tôi hoàn thành tốt b n luận văn này

Luận văn hoàn thành với s h tr inh ph t đ tài

",

VAST TĐ DL 05/16-18

X â ọ ả ơ !

MỤC LỤC

L I CAM ĐOAN i

L I C M N ii

DANH M C NG v

DANH M C H NH, S Đ VÀ I U Đ vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯ NG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Rong bi n 3

1.1.1 Giới thiệu chung 3

1.1.2 Rong Nâu 5

1.1.2.1 Nghiên cứu rong Nâu trên th giới 6

1.1.2.2 Nghiên cứu rong Nâu ở Việt Nam 7

1.2 Lipid 9

1.2.1 C c lớp ch t lipid 10

1.2.2 ng d ng phương ph p hối ph trong phân t ch c u tr c lipid 11

1.2.3 Phương ph p hối ph (Mass Spectrometry - MS) 12

1.2.4 M t số nghiên cứu v lớp ch t lipid trong rong, c bi n 14

CHƯ NG 2: TH C NGHIỆM 19

2.1 D ng c , thi t b , h a ch t 19

1.1.3 D ng c , thi t b 19

2.1.3 Dung môi, h a ch t 19

2.2 Đối tư ng nghiên cứu 19

2.3 Phương ph p nghiên cứu 22

2.3.1 Phương ph p thu và b o qu n m u 22

2.3.2 Phương ph p chi t lipid t ng 22

2.3.3 Phân t ch thành ph n và hàm lư ng c c lớp ch t lipid 23

2.3.4 Phương ph p x c đ nh thành ph n và hàm lư ng c c axit b o trong lipid t ng 24

2.3.5 Phương ph p x c đ nh d ng phân tử và c u tr c của c c h p ch t 25

CHƯ NG III K T QU NGHI N C U 26

3.1 Hàm lư ng lipid t ng trong c c m u rong Nâu nghiên cứu 26

3.2 K t qu nghiên cứu thành ph n và hàm lư ng c c lớp ch t lipid trong lipid t ng của c c m u rong nghiên cứu 27

3.3 K t qu đ nh lư ng thành ph n và hàm lư ng c c lớp ch t lipid trong lipid t ng của c c m u rong nghiên cứu 32

3.4 Thành ph n và hàm lư ng c c axit b o trong lipid t ng c c m u rong Nâu

nghiên cứu 34

3.5 K t qu x c đ nh d ng phân tử của lớp ch t 38

3.5.1 D ng phân tử của lớp monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) 39

3.5.2 D ng phân tử của lớp digalactosyldiacylglycerol (DGDG) 41

3.5.3 D ng phân tử của lớp sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 43

3.5.4 D ng phân tử của lớp phosphatidylglycerol (PG 45

3.5.5 D ng phân tử của lớp phosphatidylinositol (PI 48

3.5.6 D ng phân tử của lớp phosphatidylcholine (PC 50

CHƯ NG IV K T LUẬN VÀ KI N NGH 54

TÀI LIỆU THAM KH O 55

D NH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành ph n loài và phân bố rong Nâu Khánh Hòa 8

Bảng 2.1 Danh s ch 11 m u rong Nâu nghiên cứu 20

Bảng 3.1 Hàm lư ng lipid t ng trong c c m u rong Nâu nghiên cứu ( hối lư ng m u tươi 26

Bảng 3.2 Đ nh t nh thành ph n và hàm lư ng c c lớp ch t trong lipid t ng 28

Bảng 3.3: K t qu hàm lư ng c c lớp ch t lipid trong lipid t ng 32

Bảng 3.4 Thành ph n và hàm lư ng c c axit b o trong c c m u nghiên cứu 34

Bảng 3.5: Thành ph n c c d ng phân tử trong phân lớp MGDG của m u rong 1KT 40 Bảng 3.6 Thành ph n c c d ng phân tử trong phân lớp DGDG của m u rong 1KT 42 Bảng 3.7 Thành ph n c c d ng phân tử trong phân lớp SQDG của m u rong 1KT 44 Bảng 3.8 Thành ph n c c d ng phân tử trong phân lớp PG của m u rong bi n 1KT47 Bảng 3.9 Thành ph n c c d ng phân tử trong phân lớp PI của m u rong 1KT 50

Bảng 3.10 Thành ph n c c d ng phân tử trong phân lớp PC của m u rong 1KT 52

D NH MỤC H NH, S ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 M t số loài rong bi n 4

Hình 1.2 C u t o phân tử lipid 9

Hình 1.3 C u t o lipid trên cơ sở glycerol 10

Hình 1.4 C u t o lipid trên cơ sở sphingozin 10

Hình 1.5 L a ch n i u t o ion 12

H nh 3.1 C u tr c h a h c của d ng phân tử MGDG 39

Hình 3.2 Sắc ý đ của d ng phân tử MGDG 39

Hình 3.3 Ph MS1[E+] và [E-] của lớp ch t MGDG 39

H nh 3.4 Ph MS2 [E+] của d ng phân tử MGDG 18:4/20:5 40

H nh 3.5 C u tr c h a h c của d ng phân tử DGDG 41

Hình 3.6 Sắc ý đ của d ng phân tử DGDG 41

H nh 3.7 Ph MS1 [E+] và MS1 [E-] của lớp ch t DGDG 42

H nh 3.8 Ph MS2 [E-] của d ng phân tử DGDG 16:0/18:1 42

H nh 3.9 C u tr c h a h c của d ng phân tử SQDG 43

Hình 3.10 Sắc ý đ của d ng phân tử SQDG 43

H nh 3.11 Ph MS1 [E-] của lớp ch t SQDG 43

H nh 3.12 Ph MS2 [E-] của d ng phân tử SQDG 16:0/18:1 44

Hình 3.13 C u tr c h a h c của d ng phân tử PG 45

Hình 3.14 Sắc ý đ của d ng phân tử PG 46

H nh 3.15 Ph MS1 [E-] của lớp ch t PG 46

Hình 3.16 Ph MS2 [E-] của d ng phân tử PG 16:1/18:1 47

Hình 3.17 C u tr c h a h c của d ng phân tử PI 48

H nh 3.18 Sắc ý đ của d ng phân tử PI 48

H nh 3.19 Ph MS [E-] của lớp ch t PI 49

Hình 3.20 Ph MS2 [E-] của d ng phân tử PI 16:0/18:1 49

Hình 3.21 C u tr c h a h c của d ng phân tử PC 50

H nh 3.22 Sắc ý đ của d ng phân tử PC 51

H nh 3.23 Ph MS [E+] của lớp ch t PC 51

H nh 3.24 Ph MS [E-] và MS2 [E-] của d ng phân tử PC 16:0/18:1 52

Sơ đồ 2.1 Th c nghiệm chi t lipid t ng 23

Sơ đồ 2.2 Th c nghiệm phân t ch thành ph n và hàm lư ng c c lớp ch t lipid 24

Bi u đồ 3.1 Hàm lư ng lipid t ng trong c c m u 27

Bi u đồ 3.2 Thành ph n và hàm lư ng c c lớp ch t lipid trong c c m u rong bi n 33

MADG Monoalkyldiacylglycerol Monoalkyldiacylglycerol

HW Hydrocarbon wax Hydrocarbon và sáp

MUFA Monounsaturated fatty acids Axit b o hông no 1 nối đôi PUFA Polyunsaturated fatty acids Axit b o đa nối đôi

EPA Eicosapentaenoic acid Axit Eicosapentaenoic

DHA Docosahexanenoic acid Axit Docosahexanenoic

GC Gas chromatography Sắc ý h

GC-MS Gas chromatography mass spectroscopy Sắc ý h hối ph

MGDG Monogalactosyldiacylglycerol Monogalactosyldiacylglycerol DGDG Digalactosyldiacylglycerol Digalactosyldiacylglycerol SQDG Sulfoquinovosyldiacylglycerol Sulfoquinovosyldiacylglycerol

MỞ ĐẦU

Lipid là m t trong nh ng thành ph n sinh h a cơ b n của đ ng th c vật, cùng với protein, axit nucleic, carbonhydrat, lipid t o thành c u tử cơ sở của t t c c c t bào Lipid đ ng vai trò quan tr ng như ngu n cung c p năng lư ng cho cơ th sinh vật với ho ng 8-9 kcal/gam, đ ng thời chứa c c vitamin tan trong d u c ng như các axit béo thi t y u

Đ nh nghĩa lipid theo nghĩa r ng là m t h p ch t h u cơ c ngu n gốc sinh

h c c th chi t ra t vật liệu h u cơ bằng c c dung môi h c nhau Theo nghĩa hẹp, lipid ch c c d n xu t của axit b o m ch dài Hiện chưa c s thống nh t chung v

hệ thống phân lo i lipid Theo phân lo i của loor, lipid đư c chia thành c c lo i: lipid đơn gi n là este của axit b o với các alcol khác nhau (v d : glyceride, sáp ong, steroid) Lipid phức t p là d ng este hi thủy phân gi i ph ng ngoài alcol và axit

b o còn c c c thành ph n h c như axit phosphoric, c c đường… Phospholipid là

c c lo i lipid phức t p trong đ nh m hydroxyl bậc 1 của h p ph n alcol (glycerol, sphingosine, diol… đư c este h a với axit phosphoric hoặc monoester của axit phosphoric ao g m glycerophospholipid và spingophospholipid; glycolipid là lipid phức t p c chứa m t axit béo, shingosin và cacbohydrat; các lipid phức t p khác: sulfolipid, aminolipid Ti n ch t của lipid và d n xu t của lipid bao g m c c axit béo, glycerol và các alcol khác, steroid, sterol, aldehyde của ch t b o và c c th cetone, hydrocarbon, vitamin và hormone Trong t t c c c màng sinh h c bên c nh hàng lo t c c lo i lipid h c nhau, hàm lư ng phospholipid thường chi m ưu th với t lệ 40-90% lipid t ng số của c u tr c màng Trong đ nhi u hơn c là phosphatidylcholin, phosphatidilylethanolamin, phosphatidylserine và cardiolipin Trong c c ho t ch t t sinh vật bi n, lipid c ng là h p ch t c ho t t nh sinh

h c cao, đư c nghiên cứu h nhi u, đặc biệt là ph n lipid phân c c Nghiên cứu của Khotimchen o ch ra c c h p ch t glycolipid ở m t số loài h i miên c ho t

t nh gây đ c t bào, h ng n m, h ng hu n, h ng virus, tăng cường mi n d ch,

ho t t nh chống sốt r t C c h p ch t sphingolipid t sinh vật bi n c h năng kháng virus, ức ch DNA polymerase ức ch s tăng trưởng của t bào ung thư… Ngoài ra các ph n lipid phân c c trong th c vật, đ ng vật, sinh vật bi n c ng đư c

ch ra là c ho t t nh chống oxy h a

Lipid trong rong bi n đư c bi t đ n có chứa nhi u axit b o thi t y u là các axit

b o hông no nhi u nối đôi PUFA (Poly Unsaturated Fatty Acids) C c nghiên cứu trước đây đ ch ra trong rong bi n c chứa đ y đủ c c lớp ch t cơ b n là lipid phân

c c, sterol, diacylglycerol, axit b o t do, triacyglycerol, monoalkydiacyglycerol, hydrocarbon và sáp Tuy nhiên, việc phân lập và nghiên cứu c c lớp ch t chưa c

nhi u tài liệu đ cập đ n, đặc biệt là nh m lớp ch t lipid phân c c Vì nh ng lý do

nêu trên, ch ng tôi l a ch n đ tài lipid, axit

rong Nâu ạ ” nhằm b sung c c t qu

nghiên cứu v lipid và c c axit b o v đối tư ng rong bi n Việt Nam n i chung và rong Nâu n i riêng ên c nh đ , đây c ng là l n đ u tiên thành ph n c c lớp ch t lipid và d ng phân tử của ch ng đư c ti n hành nghiên cứu trên c c đối tư ng rong

bi n Việt Nam

M c tiêu nghiên cứu của luận văn bao g m:

- Phân tích, đ ổ đ

â ổ ế ạ

- P â í ổ

- P â í đ

ổ - Phân tích ạ ạ â ử â ự

01 đ ì

CHƯ NG 1: TỔNG QU N 1.1 Rong bi n

1.1.1 n

Rong bi n là lo i tài nguyên c gi tr inh t và đư c hai th c, sử d ng vào nhi u m c đ ch h c nhau ph c v đời sống con người t hàng trăm năm qua

Ch ng c vai trò quan tr ng trong ngu n l i sinh vật bi n và ngày càng sử d ng

r ng r i trong c c lĩnh v c th c ph m, m ph m và nông nghiệp S n lư ng hai

th c hàng năm trên th giới x p x 4 triệu t n rong tươi Trong đ , ho ng 80 s n

lư ng này đư c s n xu t t c c nước châu Á th i ình Dương C c nước s n xu t nhi u nh t hiện nay là Trung Quốc, Nhật n, Philippine, Việt Nam và Malaysia.[40]

Hiện nay, có hai hệ thống phân lo i rong bi n là của Gollerbakh [34] và Philip Size [38] Theo Gollerbakh, rong bi n đư c phân chia thành 10 ngành, bao g m: Ngành rong lam/ khu n Lam – (Cyanophyta); Ngành t o Giáp (Pyrrophyta); Ngành

t o Vàng ánh (Chrysophyta); Ngành t o Khuê (Bacillariophyta); Ngành rong Nâu (Phaeophyta/Ochrophyta); Ngành rong Đ (Rhodophyta); Ngành t o Vàng (Xanthophyta); Ngành t o Mắt (Euglenophyta); Ngành rong L c (Chlorophyta) và Ngành t o Vòng (Charophyta) Theo Philip Size, là 9 ngành, bao g m: Cyanophyta, Rhodophyta, Chlorophyta, Chromophyta, Haptophyta, Pyrrophyta - Dinophyta, Cryptophyta, Euglenophyta, Chrarachniophyta Tuy hai hệ thống có phân chia thành 10

và 9 ngành nhưng v cơ b n không có s sai khác lớn Cơ sở phân chia thành các ngành khác nhau ngoài việc d a vào mối quan hệ h c hàng và mức đ ti n hóa còn d a chính vào sắc tố có trong các loài của ngành đ Và đây c ng là cơ sở đặt tên cho các ngành rong bi n hiện nay

Trong các ngành k trên, số lư ng loài, sinh và tr lư ng ch tập trung vào 4 ngành chủ y u là: Ngành rong lam/ khu n Lam – (Cyanophyta); Ngành rong Đ (Rhodophyta); Ngành rong Nâu (Phaeophyta/Ochrophyta và Ngành rong L c (Chlorophyta)

Phân lo i rong hiện đ i c n t đặc trưng là sử d ng nhi u hệ thống h c nhau, c c hệ thống phân biệt với nhau qua số phân lo i, hối lư ng phân lo i, v tr

c c nh m rong h c nhau trong hệ thống Ngay c c c mức phân lo i cao nh t là giới, ngành và lớp của phân lo i, cho tới nay người ta c ng hông th đi đ n m t ý

i n thống nh t, vì vậy, c c h c biệt còn lớn hơn n a hi x t đ n phân lo i ở c c bậc th p hơn Nhi u hi cùng m t phân lo i trong m t giới c th đư c x p với tư

cách là ngành (Phaeophyta hoặc với tư c ch là h (Phaephyceae M t số t c gi xem rong đ , rong Nâu và rong l c như là c c ngành nhưng số h c l i cho c c nhóm rong đ c bậc phân lo i là h

cơ th sống, chúng có giá tr lớn trong th c ph m, y dư c và công nghiệp [40]

T r t lâu, con người đ sử d ng tr c ti p rong bi n làm thức ăn, rong đư c

tr n với cơm và c , dùng trong canh và gia v hoặc dùng ăn tươi như rau xà l ch

B a ăn của người Nhật thường ngày c đ n 25% là rong bi n, đi u này c ng ph

bi n ở Hàn Quốc và Tri u Tiên Ở Anh người ta b sung rong vào bánh mỳ, ở Trung Quốc rong bi n đư c sử d ng làm c c lo i mứt, ở Việt Nam và nhi u nước

h c rong bi n đư c sử d ng như là c c lo i rau hoặc m t lo i gia v th c ph m trong đời sống Hiện nay, s n ph m thuỷ phân t các loài rong bi n đư c sử d ng như thức ăn b dư ng cao c p, đư c ưa chu ng nhi u ở c c nước châu Âu, châu M

và ph c v r t nhi u cho nh ng người ăn chay c ng như ăn iêng

Rong bi n là đối tư ng có chứa nhi u h p ch t có ho t tính sinh h c cao như các sắc tố của hệ quang t ng h p, các polysaccharide, lipid d tr có ti m năng ứng d ng cao trong lĩnh v c y dư c Hiện nay, ở Việt Nam và trên th giới, ho t

ch t fucan (m t lo i sulphat polysaccharid hay fucan sunphat hoá (fucoidan)) đư c chi t t rong Nâu đ đư c chứng minh là có kh năng ngăn ng a di căn của ung thư,

đi u tr và h tr đi u tr m t số bệnh nan y như ung thư, viêm lo t d dày, rối lo n đường tiêu hoá, viêm nhi m Ho t ch t phloroglucinnol trong rong có tác d ng trung hoà các gốc t do làm gi m cơ ch hình thành khối u Người ta còn sử d ng rong bi n trong v n đ khử đ c, lo i b các nguyên tố kim lo i nặng hay các nguyên tố phóng x như strontium h i cơ th nhờ c u trúc t o gel của các muối alginate Hiện nay, việc sử d ng rong bi n trong đi u tr viêm hoặc sử d ng phối

h p với thuốc tân dư c, trong đi u tr u tuy n gi p đang ph bi n bởi hiệu qu và s

an toàn

1.1.2 Rong Nâu

Rong Nâu là nh m rong c ch thước lớn (macroalgae , g m m t số chi: Sargassum, Turbinaria, Dictyota, Padina, Spatogolossum, Chnoospora có s n

lư ng t nhiên cao hơn so với c c chi khác Đặc biệt, chi rong mơ Sargassum còn

gi p hình thành c c th m rong bi n r ng t vài cho đ n vài ch c hectatrên d i tri u

th p và d i trên của vùng dưới tri u ở vùng bi n nhiệt đới và cận nhiệt đới Rong

mơ ph t sinh hi nhiệt đ môi trường nước bắt đ u gi m xuống

18 – 20oC Ở mi n ắc, rong Mơ xu t hiện sớm hơn và c ng tàn l i sớm hơn Ở ,

mi n Trung và Nam thì xu t hiện mu n hơn và tàn l i c ng mu n hơn S đa d ng

ở mức đ c c taxon ở mi n Trung và Nam cao hơn mi n ắc nhưng ch thước, sinh lư ng l i th p hơn đ ng theo quy luật phân bố của sinh vật thủy sinh Sinh

lư ng rong Mơ ở mi n ắc cao nh t là 10,32kg/m2 vào th ng 3, còn mi n Nam sinh

lư ng cao nh t 7,8 g/m2 vào th ng 4 và o dài đ n th ng 6 H u h t c c loài rong

Mơ thường phân bố ở nơi c song m nh, n n đ y cứng, đ dốc vào ho ng 5-25% [7]

1.1.2.1 rong Nâu ế

Trong quan đi m phân lo i rong Nâu hiện nay còn t n t i m t số b t đ ng, theo ý i n của của nhi u nhà nghiên cứu, ngành Ochrophyta c n đư c chia thành hai lớp Phaeosporophyceae và Cyclosporophyceae Phân lo i rong Nâu do Wynne

đ xu t năm 1981 c ng nhận đư c s công nhận r ng r i [43] Theo hệ thống này các rong Nâu đư c xem x t như m t lớp Phaeophyceae, đư c chia ra c c phân lớp

và thu c ngành Chromophyta Vào c c năm 30 của th ỷ 20 xu t hiện xu th phân

lo i rong Nâu ph thu c vào c c đặc trưng của c c chu ỳ ph t tri n Người ta đ

xu t chia rong Nâu thành ba lớp: Isogenerate, Heterogenerate và Cyclosporae Phân

lo i này sau đ c ng đư c công nhận r ng r i Tuy nhiên việc chia rong Nâu thành lớp đ ng nh t và lớp d th c ng ch là ước lệ, vì rằng trong c hai lớp, c c phân lớp riêng biệt đ u t n t i c c đ i diện c d ng đối ngh ch của s luân chuy n c c hình

th i ph t tri n Theo quan đi m của c c nhà rong h c trên th giới, người ta tuân theo sơ đ phân lo i chia rong Nâu thành hai lớp là Phaeosporophyceae và Cyclosporophyceae, tuy nhiên con số ch nh x c các loài rong Nâu thu c c c lớp này hiện nay v n chưa thống nh t mà tùy theo c c t c gi h c nhau [27]

Theo d liệu Website Powered by Algae ase, Version 4 1, (là trang web uy

t n tập h p d liệu c c t chức nghiên cứu rong bi n trên th giới (Tsutsui Isao et

al, 2005 đ n thời đi m này rong Nâu đư c phân chia thành 9 b , 265 chi và hơn

1500 loài (Svein Jarle Horn, 2000; Siew-Moi Phang, 2010) [24] trong đ số lư ng thành ph n loài m t số chi rong Nâu trên th giới như:

Chi Sargassum C Agardh, 1820 Thu c h Sargassaseae, b Fucales c

ho ng 873 tên loài trong cơ sở d liệu Algae ase, nhưng trong đ 562 loài đư c

ch p nhận s phân lo i (Tsutsui Isao et al, 2005 [24]

Chi Turbinaria J V Lamouroux, 1825 Thu c h Sargassaseae, b Fucales c

ho ng 53 tên loài trong cơ sở d liệu Algae ase, nhưng đ c 28 loài đư c ch p nhận s phân lo i (Tsutsui Isao et al, 2005) [24]

Chi Dictyota J V Lamouroux, 1809 Thu c h Dictyotaceae, b Dictyotales

c ho ng 316 tên loài trong cơ sở d liệu Algae ase, nhưng trong đ 76 loài đư c

ch p nhận s phân lo i (Tsutsui Isao et al, 2005 [24]

Chi Padina Adanson, 1763 Thu c h Dictyotaceae, b Dictyotales Hiện nay

số lư ng loài chi Padina c ho ng 62 tên loài trong cơ sở d liệu Algae ase, nhưng trong đ 39 loài đư c ch p nhận s phân lo i (Tsutsui Isao et al, 2005 [24]

1.1.2.2 rong Nâu ở

Việc i m tra danh m c cập nhật ngành rong bi n Việt Nam đ và đang ti n hành bởi c c nhà phân lo i h c, con số thành ph n loài hiện đ lên tới trên 1000 loài So với c c nước trong hu v c thành ph n loài rong bi n Việt Nam c s đa

d ng, phong ph , c nhi u ti m năng hai th c và ch bi n, g p ph n nâng cao gi

tr v ngu n l i rong bi n hu v c Đông Nam Á

Ngành rong Nâu Việt Nam trước đây đ đư c c c t c gi trong và ngoài nước nghiên cứu tương đối đ y đủ v mặt phân lo i Việc phân lo i đư c th c hiện theo phương ph p so sánh hình th i, trong đ c c tiêu ch phân lo i là đặc đi m của cơ quan sinh s n, là cơ quan t bi n đ i theo đi u iện sinh th i Đây là phương ph p

đư c sử d ng t lâu nhưng v n còn ph bi n và v n đ m b o đư c mức đ tin cậy trong đi u iện Việt Nam và trên th giới Đ n thời đi m này m t số chi rong Nâu thống ê đư c bao g m: chi Dictyota 14 loài, chi Padina 5 loài, chi Turbinaria 5 loài (4 loài 1 thứ , chi Sargassum 68 loài (trong đ c 63 loài, 5 thứ trong đ ở Kh nh Hòa có 37 loài

Năm 2013, theo công bố của t c gi Lê Như Hậu và nn [4], Nguy n Văn

T [29], Đàm Đức Ti n [2] trong t ng số 827 loài đ đư c đ nh danh t i Việt Nam,

c 180 loài thu c ngành rong Nâu Ochrophyta [1,3,8] So với c c nước Philippin, Đài Loan, Thái Lan hay Malaysia, rong bi n nước ta c số lư ng loài lớn hơn r t đa

d ng loài

Ngu n l i rong Nâu đư c tập trung phân bố chủ y u ở hu v c mi n Trung

và tập trung nhi u ở ven bi n Kh nh Hòa theo c c hu v c lớn như:

+ Khu v c 1: V nh Vân Phong (Hòn p, Hòn Ó, Hòn D t, Cù Meo, R n Trào, R n Tướng, M i Dù, M i Đ Son, Sủng Rong, L ch C Cò, Sủng K … -

Huyện V n Ninh

+ Khu v c 2: Ven bi n x Ninh Thủy, x Ninh Phước, x Ninh Vân, Đ m Nha Phu ( i Đ L t, M Giang, Hòn Khô, i Đ N c, i Cây Tra, i C , i Cây àn, i V ng Tàu, Hòn Th , Đ o Kh … và vài b i c n ng m i C – huyện

Ninh Hòa

+ Khu v c 3: V nh Nha Trang (M i Kê Gà, i tiên Đường Đệ, Hòn

Ch ng, hu v c Hòn Đ , Hòn Rùa, Đ o Hòn Tre – M i Nam i Trủ, i R n,

i Ng o, Hòn M t, Hòn Mun, i r n ng m Lớn, M i C s u Tr Nguyên, Sông

Lô, M i C u Hinh

+ Khu v c 4: Đ o ình a, x Cam Lập (d c theo bờ Đông b n đ o Cam Lập, t m i Sốp đ n m i Cà Tiên – Thành phố Cam Ranh

T nh ng chuy n h o s t th c đ a ven bi n Kh nh Hòa, c c nhà hoa h c

đ n t c c c c viện H i Dương h c, Công nghệ ứng d ng Nha Trang, Tài nguyên và

Môi trường bi n đ x c đ nh số lư ng thành ph n loài riêng m t số chi rong Nâu có

t n su t xu t hiện t i c 4 hu v c: Chi Dictyota 9 loài, chi Padina 3 loài, chi Turbinaria 4 loài, Sargassum 21 loài ( ng 1 1)

Bảng 1.1 Thành phần loài và phân bố rong Nâu Khánh Hò a

Vùng 1 – V nh Vân Phong V n Ninh

Vùng 2 – Ninh Thủy, Ninh Phước

Vùng 3 – V nh Nha Trang

Vùng 4 –

V nh Cam Ranh

Cùng với c c protein, c c axit nucleic và carbonhydrat, lipid thu c vào số c c

c u tử cơ sở của m i t bào Thuật ng lipid đư c dùng ở đây là đ ch c c d n xu t của c c axit b o m ch dài, đư c g i là c c axit m [9]

Trong t nhiên, nh ng h p ch t thu c v lớp ch t lipid t n t i r t đa d ng như: các hydrocarbon bậc cao, c c ancol, c c aldehyde, c c axit b o và c c s n ph m thứ

c p của ch ng như glyceride, sáp, phospholipid, glycolipid, sulfolipid [36] Lipid

c nhi u i u c u tr c h c nhau, tuy nhiên c u t o lipid thường c chung m t nguyên tắc là trong thành ph n phân tử lipid bao g m hai ph n: m t ph n là c c đuôi m ch hydrocarbon nước; ph n ia là t h p nh m c c ch t ưa nước (g i là

đ u phân c c Hai ph n của phân tử lipid đư c liên t với nhau bởi mắt x ch liên

t ở gi a và phân tử lipid t n t i như m t liên t t h p của hai ph n, trong đ

nh ng ph n tử nước tham gia c u t o nên pha hông phân c c, còn nh m nh ng

ch t phân c c hình thành nên ranh giới phân c ch gi a pha hông phân c c và nước (hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu tạo phân tử lipid

C u tr c t h p liên t của phân tử lipid ph thu c nhi u vào ngu n gốc t nhiên của c c c u tử tham gia vào thành ph n của n Thường người ta dùng ngu n gốc t nhiên của mắt x ch liên t, gi a ph n phân c c và ph n hông phân c c đ

làm cơ sở phân lo i lớp ch t lipid [36] Theo đ , lipid c hai d ng khung là glycerin

và sphingozin

Trong th c t đa ph n d u m t n t i dưới d ng este của glycerin (1) với c c axit b o (g i là glyceride , hi mà c ba nh m hydroxyl (OH của glyxcerol đ u

đư c este h a thì g i là triglyceride hoặc là triaxylglycerol (2 Do đ , d u m c ng

có tên là lipid trung t nh và c công thức c u t o như sau:

Hình 1.3 Cấu tạo lipid trên cơ sở glycerol

Nh m ch t lipid h c c ng phân bố r ng r i trong lớp màng t bào, đặc biệt là

ở n o, đ là các sphingolipid, ch ng đư c c u t o trên cơ sở liên t nh m amin của sphingozin (3 với c c ax t b o C c sphingolipid đ ng vai trò quan tr ng trong việc truy n d n t n hiệu và nhận bi t t bào, ch ng c t c đ ng đặc biệt vào mô th n inh C c h p ch t nhận đư c qua bi n đ i đư c g i chung là ceramide (4) và có công thức c u t o mô t ở hình 1.4

c vai trò n đ nh màng t bào và t o đi u iện thuận l i cho s nhận bi t c c t bào

l , đi u này vô cùng quan tr ng trong đ p ứng mi n d ch của cơ th Ngoài ra,

O

CH NH

HO CH

HO CH2

ch ng còn là c u nối cho c c t bào liên t với nhau đ hình thành c c mô, cơ quan trong cơ th sinh vật

Tìm hi u c c lớp ch t lipid là việc làm c n thi t trong qu trình phân t ch thành ph n lipid N gi p cho ta c đư c bức tranh t ng th đ trước hi đi vào tìm

hi u c th t ng ph n riêng biệt của lipid sinh vật bi n n i chung và rong bi n n i riêng M i lớp ch t lipid c m t phương ph p nhận d ng và phân t ch đặc hiệu riêng như: c c axit b o thông thường c th phân t ch bằng sắc ý h (GC còn các axit

b o đặc hiệu như axit cyclic, epoxy, hydroxy thì ph i dùng sắc ý h hối ph (GCMS) cùng với m t số ph n ứng h a h c riêng biệt mới c th nhận d ng đư c Đối với triglycerit ph i t h p c sắc ý b n m ng (TLC) và GC đ l gi i C c lipid phân c c như phospholipid, glycolipid l i c n c nh ng phương ph p riêng đ nhận d ng như TLC 2 chi u với c c thuốc thử đặc hiệu là molypdate và ninhydrin cùng m t số ph n ứng h a h c đ nhận d ng

Trong đi u iện phân t ch t i phòng th nghiệm, m t trong nh ng phương

ph p phân t ch nhanh, đơn gi n và hiệu qu là sử d ng TLC đi u ch nhanh với hệ dung môi tri n hai đặc hiệu Qua đ , ta c th bi t đư c nh ng thông tin chung v hàm lư ng, thành ph n của c c lớp ch t cơ b n của lipid Với ti n b thuật phân

t ch của c c phương ph p ph vật lý, cùng với m y m c hiện đ i ngày càng đư c

c i ti n nhanh ch ng đ gi p cho c c nhà nghiên cứu lipid c th thu đư c nh ng thông tin ban đ u v thành ph n c c lớp ch t trong đ V d như: bằng việc sử

d ng m y Iatrocan TLC/FID Japan c t h p với hệ ch t chu n đ cho ta bi t thêm

v hàm lư ng phospholipid và glycolipid sơ b ngoài các thành ph n cơ b n trong lipid đ trên [10]

1.2.2 n ụn p ươn p áp k ối phổ trong phân tích cấu trúc lipid

M t lớp ch t lipid riêng biệt đư c đặc trưng bởi ph n phân c c của c c phân

tử Lipid thu c vào m t lớp hoặc m t phân lớp nhưng h c nhau v thành ph n gốc acyl và v tr của ch ng trong phân tử lipid, đư c g i là c c ―d ng phân tử‖

(molecular species của lớp lipid đ

M i d ng phân tử là m t h p ch t h a h c riêng biệt và m i lớp ch t lipid là hàng ch c, hàng trăm d ng phân tử h c nhau Số lư ng d ng phân tử của m t lớp

ch t lipid sẽ t lệ thuận với số lư ng c c axit b o của lớp ch t đ S đa d ng của axit b o trong c c đối tư ng sinh vật bi n hi n cho việc phân lập c c ―d ng phân tử‖ riêng rẽ t m t lớp ch t lipid trên c mặt lý thuy t và th c t là vô cùng h hăn Ch nh đặc thù c u tr c này đ gây trở ng i cho c c nhà hoa h c trong việc nghiên cứu h a h c, ho t t nh sinh h c c c c u tr c lipid, đặc biệt là c c phân tử lipid phức t p, c ng như sử d ng ch ng trong c c s n ph m dư c ph m Do vậy,

h u h t c c nghiên cứu t trước tới nay v lipid sinh vật bi n mới đi vào phân t ch thành ph n hàm lư ng c c lớp ch t lipid, thành ph n và hàm lư ng c c axit b o trong lipid t ng và trong m t số lớp ch t lipid riêng biệt M t trong nh ng đ nh hướng nghiên cứu hiện đ i là đi sâu vào t ng lớp ch t lipid, ti n hành phân t ch và nhận d ng đư c c c d ng phân tử c mặt trong lớp ch t đ mà hông c n phân lập

t ng h p ch t lipid riêng rẽ

1.2.3 P ươn p áp k ối phổ (Mass Spectrometry - MS)

Việc phân t ch đ nh t nh và đ nh lư ng c c d ng phân tử lipid là m t bài to n phức t p, đư c gi i quy t bằng t h p nhi u phương ph p, trong đ sử d ng hối

ph là m t phương ph p quan tr ng trong phân t ch c u tr c của lipid trong m t h n

h p [25]

Trong nghiên cứu hối ph , h p ch t c n phân t ch đư c chuy n sang d ng

d n xu t d bay hơi, sau đ đư c ion ho bằng c c phương ph p th ch h p C c ion

t o thành đư c đưa vào nghiên cứu trong b phân t ch hối của m y hối ph S

ph t tri n của thuật hiện nay c th cho ph p t ch h p đ ng thời hai i u qu t ion dương (+ và ion âm (- nhằm t o đi u iện thuận l i nh t cho c c nhà nghiên cứu

Hình 1.5 L a ch n i u t o ion

Hiện nay c nhi u thuật đư c sử d ng đ ion h a phân tử trong phương

ph p ph hối ên c nh c c phương ph p ion h a truy n thống, c c thuật ion

h a mới như: bắn ph nguyên tử nhanh (fast atom bombardment, FA , ion ho phun mù điện tử (electrospray ionization, ESI , ion h a h a h c t i p su t h quy n (atmospheric pressure chemical ionization – APCI , ion h a bằng photon t i

p su t h quy n (atmospheric pressure photoionization – APPI , ion h a ph n h p

th laser đư c h tr bởi ch t n n (matrix assisted laser desorption ionization, MALDI đ đư c ph t tri n đ phân t ch c u tr c của c c h p ch t hông bay hơi

Trong đ MALDI thường đư c sử d ng đ phân t ch c c đ i phân tử, APCI là thuật ion h a thường đư c sử d ng đ phân t ch nh ng h p ch t c đ phân c c trung bình, c phân tử lư ng nh , d bay hơi, còn ESI đư c ứng d ng trong phân

t ch c c h p ch t phân tử th p như oligosaccharide, polymer c hối lư ng phân tử

h năng t ch l y c c ion, phân t ch hối, phân lập ion và phân r ion bằng va ch m

do vậy đây là phương tiện r t thuận l i cho việc nghiên cứu cơ ch phân m nh K thuật TOF d a trên s h c nhau v vận tốc của c c ion c hối lư ng h c nhau

hi ở trong cùng m t mức năng lư ng TOF c đ phân gi i cao và số hối ch nh

x c (tới 0,0001

Trong phân t ch m t h n h p ch t, việc sử d ng MS m t l n hông th mang

l i t qu ch nh x c Đ hắc ph c đi u này, người ta đ sử d ng c c thuật hối

ph 2 l n, 3 l n thậm ch nhi u hơn K thuật này đư c g i là MS/MS hay MSn Nguyên tắc của thuật này là l a ch n m t ion x c đ nh trong c c ion của l n ion

h a thứ nh t đ phân m nh nh hơn và lo i b t t c c c ion h c trong b phận phân t ch ion Vì ph hối hi nhận đư c l n này ch t m t ion x c đ nh nên hông

b nh hưởng của c c t p ch t h c trong m u phân t ch Việc phân t ch t qu trên

ph MS/MS sẽ ch nh x c hơn, đặc biệt hi phân t ch c c h n h p phức t p [25] Các thi t b đ th c hiện MS/MS c 2 lo i ch nh là c c ph hối gh p nối ti p (c th

g m c c tứ c c gh p nối nối ti p và b y ion Với b y ion, vì c c ion đư c gi l i trong b y nên việc phân m nh c th đư c th c hiện thêm nhi u l n n a (MSn) Tuy vậy trên th c t người ta thường ch th c hiện tới MS2 và MS3, vì số ion ở nh ng

l n sau gi m nên đ nh y của ph p phân t ch c ng gi m Ngoài hai thi t cơ b n trên, còn c c c lo i h c như Q-Trap ( t h p gi a tứ c c và b y ion , Q-TOF ( t

h p gi a tứ c c và TOF), IT-TOF ( t h p gi a b y ion và TOF , c c thi t b này

c th t nối với LC, GC, HPLC…

Sử d ng phương ph p ph hối cùng với s h tr của c c thi t b phân t ch hiện đ i trong nh ng năm g n đây đ gi p hoa h c v lipid thu đư c nh ng thành công trong việc phân t ch d ng phân tử của c c lớp ch t lipid trong c c đối tư ng

sinh vật h c nhau Lipid t h t th c vật vốn dĩ r t hiêm tốn v thành ph n axit

b o, đ ng nghĩa với việc thành ph n d ng phân tử lipid của ch ng đơn gi n hơn trong đối tư ng đ ng vật C lẽ vì vậy, d ng phân tử của c c lớp ch t lipid t h t

th c vật sớm đư c c c nhà hoa h c nghiên cứu Thông tin v thành ph n ―d ng phân tử‖ của lipid c ngu n gốc t đ ng vật t hơn r t nhi u Thành ph n của phosphatidylcholine trong lipid gan bò, lòng đ trứng và m t số loài nhuy n th đ

đư c Julie L G và c ng s phân t ch sử d ng sắc ý l ng cao p gh p nối hối ph song song (HPLC/ESI-MS Trên đối tư ng sinh vật bi n, đ thu đư c t qu phân

t ch ―d ng phân tử‖ của glycolipid và shingolipid ở m t số loài thân m m, sứa, hay

t m t số loài b t bi n và nhi u đối tư ng sinh vật h c [16,18,21,35] Với s ti n

b lớn trong c c thuật phân t ch, ph hối gi p làm s ng t c c thông tin v d ng phân tử của lipid, mở ra nh ng hi u bi t mới trong nghiên cứu sinh h a lipid

C c nghiên cứu v c c lớp ch t lipid và c c ―d ng phân tử‖ của lipid t rong

bi n trên th giới còn r t t đư c công bố

1.2.4 Một số nghiên cứu l p chất lipid trong ron biển

Năm 1990, Dembits y và c ng s đ nghiên cứu thành ph n axit b o của c c loài rong Nâu thu t i n Đen K t qu thu đư c cho th y rằng c c axit b o ch nh của ch ng là C16:0, C18:1, C18:3, C18:4 và C20:5 Khi i m tra thành ph n glycolipid cho th y hàm lư ng monoglycosyldiacylglycerol của c c m u thay đ i t 26,8 đ n 46,5 t ng glycolipid, hàm lư ng diglycosyldiacylglycerol t 19,6 đ n 44,1 và hàm lư ng sulphaquinovosyldiacylglycerol t 17,5 đ n 51,7 Tỷ lệ c c

ch t b o n i chung trong c c loài h c nhau dao đ ng t 1,2 đ n 4,9 và c c phospholipid t 2,9 đ n 19,7 C c phospholipid ch nh tìm th y trong c c loài rong Nâu này là phosphatidylcholine (PC), phosphatidylglycerol (PG) và phosphatidylethanolamin (PE); Tuy nhiên, trong m t số m u nghiên cứu còn tìm

th y s c mặt PE, PG và PI như c c phospholipid ch nh nhưng hông c PC C c phospholipid hông x c đ nh đư c c ng đ tìm th y ở m t số loài rong trong nghiên cứu này [17]

Nh m t c gi Eichenberger đ công bố t qu v hàm lư ng lipid của hơn 100 loài đ i diện cho 16 h rong Nâu (Phaeophyceae bằng phương ph p TLC vào năm 1993 K t qu là c c glycolipid như monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulphoquinovo- syldiacylglycerol (SQDG) và các phospholipid như phosphatidylglycerol (PG) và phosphatidylethanolamine (PE) c mặt trong h u h t

c c loài đư c nghiên cứu S xu t hiện ch n l c theo loài của c c phân lớp phosphatidylcholine và lipid betain, diacylglycerylhydroxymethyltrimethyl-p-

alanine (DGTA) c th đư c sử d ng trong việc phân lo i rong Nâu và m t số loài

th c vật h c D a trên giới h n ph t hiện là 0,5 pg/mg lipid t ng, DGTA đư c

ph t hiện trong c c phân lớp th c vật Tilopteridales, Dictyotales, Notheiales, Fucales, Durvillaeales, Sphacelariales nhưng hông c mặt ở c c lớp Sporochnales, Desmarestiales, Dictyosiphonales, Laminariales, Ascoseirales, Syringodermatales, Cutleriales và Scytosiphonales Hai lớp Ectocarpales và Chordariales là c c nh m h n h p, c loài c DGTA và c loài hông C c t c gi

c ng hông th y s xu t hiện của PC trong c c phân lớp Dictyotales và Durvillaeales, tr m t vài m u thu c lớp Fucales H c ng nhận th y rằng nh m diacylglyceryltrimethylhomoserine ch c h năng xu t hiện m t lư ng nh trong

m t số t loài rong Nâu nghiên cứu [42]

C ng trong năm 1993, t c gi Khotimchen o c ng đ nghiên cứu thành ph n axit béo và lipid phân c c của ba loài c bi n thu c h Zosteroideae t vùng bi n Nhật n K t qu cho th y rằng, lipid của 3 loài c bi n này r t giàu axit béo không bão hòa C18 (axit linoleic và α-linolenic Ch ng c ng chứa c c axit b o không bão hòa hexadecatrienoic và c c axit m ch dài (≥ C20 Ph n lipid phân c c của ch ng bao g m glycolipid và phospholipid Khi phân tích các glycolipid cho

th y s hiện diện của MGDG, DGDG và SQDG tương t như thành ph n của c c loài rong bi n C c phospholipid chính c mặt trong lipit t ng của ch ng là PC với 41,8–43,8 và PE với 22,4-24,3% N-Acylphosphatidylethanolamine ch đư c tìm th y như

m t thành ph n ph trong phospholipid Thành ph n phospholipid của c bi n c ng

c s h c biệt với thành ph n của rong bi n và ph thu c c c ngành Rhodophyta, Phaeophyta và Chlorophyta C c t qu thu đư c của t c gi Khotimchen o r t

h u ch cho c c m c đ ch phân lo i sau này [28] Cùng năm này, nh m t c gi Viso

và c ng s đ công bố thành ph n axit b o và c c an an của loài c bi n Posidonia

oceanica đư c thu thập trên c c bờ bi n Đ a Trung H i của Ph p và Hy L p Nh m

nghiên cứu đ phân t ch c c ph n diệp l c và ph n hông chứa diệp l c của l và thân r a phân đo n lipid đư c phân lập bao g m ch t b o trung t nh, glycolipid

& phospholipid và thành ph n axit b o của ch ng đ đư c phân t ch K t qu đ tìm

th y s c mặt của axit b o m ch siêu dài C34:0 đư c cho là liên quan đ n ch t b o

trung tính trong loài Posidonia oceanica, đi u này đư c đặc trưng bởi s hiện diện

của c c axit b o m ch dài C22 – C34 cao hơn so với nh ng lo i c trong rong bi n (C20 – C24 C c axit b o ch nh trong ph n l của ch ng là C16:0, C18:2n-6 và C18:3n-3 và trong thân r là 16:0, 18:2n-6 và 18:1n-9 C c an an cho th y ưu th của c c chu i carbon m ch lẻ hơn là chu i carbon m ch chẵn trong cùng s phân bố

lư ng c c; c c chu i an an dài >C20 chi m ưu th ở C23 hoặc C25 đối với t t c

c c b phận của c bi n và c c chu i ngắn đư c chi phối bởi C15 và C19 đối với

c c m u t bờ bi n Đ a Trung H i và C17 và C19 đối với c c m u thu nhận t Hy

L p [41]

Năm 2000, m t nh m nghiên cứu t Nga đ ti n hành đ nh gi vai trò của lipid

trong cơ ch thu n p nhiệt của loài c bi n Zostera marina Ngư c l i với đ ng vật,

lipid màng th c vật chủ y u đư c đ i diện bởi glycoglycerolipid, đây hông ch là

thành ph n c u tr c của l c l p, mà n còn tham gia vào qu trình quang h p Zostera

marina thu c v nh m c c đ i th c bào của bi n và th c hiện vai trò quan tr ng trong

hệ sinh th i bi n Với quan đi m này, nh m đ ti n hành nghiên cứu giai đo n chuy n ti p của glycolipid ch nh bao g m MGDG và DGDG c ng như phospholipid

PC và PE của Zostera marina Ngoài ra, thành ph n axit b o c ng đ đư c phân

tích đ đ nh gi qu trình thu n p và chuy n h a nhiệt của lipid trong c bi n [23]

Năm 2015, lipid t c c loài Ulva armoricana (Chlorophyta) và Solieria

chordalis (Rhodophyta t vùng bi n rittany, Ph p, đ đư c nh m t c gi Melha

Kendel ti n hành nghiên cứu K t qu cho th y, hàm lư ng lipid t ng của c c loài

này l n lư t là 2,6 và 3,0 tr ng lư ng hô C c thành ph n ch nh của S

chordalis là lipid trung tính (37%) và glycolipid (38%), trong khi loài U armoricana ch chứa chủ y u là lipid trung t nh (55 Axit b o hông b o hòa đa

(PUFA t nh đư c là 29 t ng số ch t b o trong U armoricana và 15% S

chordalis Trong c hai loài rong đư c nghiên cứu, phospholipid đư c t o thành t

PUFA chi m tới 18 Ngoài ra, PUFA đư c chứng minh là đ i diện cho 9%

glycolipid trong loài U armoricana và 4,5% trong S chordalis C c PUFA chủ y u

là C16:4n-3, C18:4n-3, C18:2n-3, C22:6n-3 trong U armoricana và C20:4n-6; C20:5n- 3 trong S chordalis Đi u quan tr ng là s xu t hiện của s u axit hydroxy-

3, 3-hydroxy- và hai axit b o hydroxy hông b o hòa đơn c ng đư c x c đ nh và c

th cung c p số liệu cơ sở cho thành ph n h a h c của hai loài rong này Ngoài ra,

nh ng lo i rong bi n này chứa c c h p ch t đ ng quan tâm như squalene, tocopherol, cholest-4-en-3-one và phytosterol Ch ng c t c d ng chống tăng sinh

α-và ho t t nh với t bào ung thư ph i- ph qu n ( hông bào nh của con người

(NSCLC-N6 với IC50 là 23μg/ml đối với MGDG phân lập t S Chordalisand và 24μg/ml đối với DGDG t U armoricana Nh ng t qu này cho th y ti m năng

của hai loài này gi tr trong c c lĩnh v c y t , dinh dư ng và h a h c [32]

Năm 2016, Masaki Honda và c ng s đ nghiên cứu c c lớp ch t lipid, axit

b o và thành ph n glycerolipid trên đối tư ng rong câu Gracilaria vermiculophylla,

vốn đư c coi là ngu n d tr ho t ch t prostaglandine n i ti ng, như PGE2 và PGF2α Trong nghiên cứu này, t c gi đ làm r c c đặc t nh của glycerolipid dùng

làm cơ ch t cho qu trình chuy n h a thành prostaglandin C c lớp lipid, thành ph n axit béo và các d ng phân tử glycerolipid c ng đ đư c nghiên cứu sâu hơn trên đối

tư ng này C c lớp lipid ch nh trong loài G vermiculophylla là MGDG, DGDG và

SQDG, c ng như PC, chi m tới 43,0% hàm lư ng lipid t ng Axit arachidonic (C20: 4n-6, ti n ch t prostaglandin và axit palmitic (C16:0 là c c axit b o chi m

ưu th trong lipid t ng của loài rong này Hàm lư ng axit b o 20:4n-6 cao đ ng trong lớp MGDG và PC với hơn 60 Hàm lư ng axit C16:0 cao đ ng trong DGDG và SQDG với hơn 50 ằng việc sử d ng sắc ý l ng hiệu năng cao HPLC đ x c đ nh rằng c c axit b o đư c ester h a ở v tr sn-1 và sn-2 của c c ch t

b o đ C c phân tử glycerolipid ch nh bao g m 20:4n-6/20:4n-6 (sn-1/sn-2) cho MGDG (56.5%) và PC (40.0%), 20:4n-6/16:0 cho DGDG (75,4%) và SQDG(58,4%) T đ , c c t c gi cho rằng c c phân tử glycerolipid c chứa m t

hoặc C20:4n-6 là c c ch t n n ch nh cho s n xu t prostaglandin trong G

vermiculophylla [31]

C ng trong năm 2016, t c gi Lê T t Thành và c ng s đ h o s t c c loài Rhodophyta và công bố x c đ nh PGE2 ở m t số loài rong Đ của Việt Nam và Liên ang Nga T c gi Andrey, Ph m Quốc Long, Lê T t Thành đ ph t hiện PGE3 t

loài rong Câu Gracilaria vermiculophylla [5,6]

Năm 2017, Costa và c ng s đ tìm đư c hơn 147 d ng phân tử trong lipid của chi Gracilaria đư c phân bố trong c c lo i glycolipid như MGDG, DGDG, sulfoquinovosylmonoacylglyceride (SQMG), SQDG, PC, lyso-PC, PG, lyso-PG, PI,

PE, PA, inositolphosphoceramide (IPC) và lipid betain monoacylglyceryland diacylglyceryl-N, N, N- trimethyl homoserine (MGTS và DGTS Nh m t c gi

c ng đ thử nghiệm t c d ng chống viêm của lipid t Gracilaria sp bằng c ch theo

d i h năng t n t i của t bào trong c c dòng ung thư ở người và bằng c ch sử

d ng c c đ i th c bào của chu t tương ứng K t qu cho th y d ch chi t lipid của

c c loài này đ làm gi m h năng t n t i của t bào ung thư v T-47D ở người và

t bào ung thư bàng quang 5637 ở người (n ng đ ức IC 50 tương ứng là 12,2g /ml

và 12,9g/ml và ức ch việc s n xu t oxit nitric (NO t o ra bởi th th giống như 4

ch t hiệp đ ng lipopolysaccharide (LPS trên dòng t bào đ i th c bào RAW 264 7 (ức ch 35 ở n ng đ 100g/ml Nh ng ph t hiện này g p ph n làm tăng vai trò

của Gracilaria sp Khi c c sinh hối này đư c tr ng trong đi u iện i m so t trên

hệ thống IMTA [20]

Nghiên cứu v c c lớp ch t lipid của c c loài rong Nâu còn r t t đư c công bố,

c c nghiên cứu sâu v d ng phân tử trong c c phân lớp lipid ở c c đối tư ng rong Việt Nam hoàn toàn chưa đư c th c hiện Ch nh vì vậy, trong n i dung luận văn này

ch ng tôi ti n hành m t số nghiên cứu bước đ u v lipid, axit b o, c c lớp ch t lipid

và m t số d ng phân tử lipid của m t số loài rong Nâu thu ở vùng bi n Việt Nam

CHƯ NG 2: TH C NGHIỆM 2.1 Dụng cụ, thi t bị, hóa chất

1.1.3 Dụng cụ, thiết bị

M y sắc ý h (GC h ng Thermo Finnigan Italia S.P.A TRACE GC Ultra series, c t mao qu n DB-XLB (30m x 0,25mm), với detector ion h a ng n lửa FID,

ch thước c t 30m x 0.25mm ID Khí mang He với tốc đ 30 cm/s

M y sắc ý h t nối hối ph (GC-MS) hãng Shimadzu GCMS QP5050A (Kyoto, Nhật n , c t sắc Supelcowax 10 (Supelco, Bellefonte,

PA, USA) với ch thước c t 30m x 0 25 mm x 0,25µmID Kh mang He với tốc

đ h là 30 cm/s

M y LCMS-IT-TOF, Shimadzu, nhiệt đ ngu n 300oC, ph m vi đo m/z

100-1200 (1500 , điện th ngu n ion 4 5 V, h mang N2 p su t 25 Pa, tốc đ dòng h

2 l/ph t

M y Scan Epson Perfection 2400 PHOTO (Nagano, Nhật n

Ph n m m phân t ch hình nh Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar,

LB Nga

Cân phân tích Sartorius analylic (10-4 , Th y s

Máy li tâm Heraeus (5000 vòng/phút), Germany

M y c t quay chân hông uchi hệ đi u ch nh t đ ng, Switzerland

Pipiet 50-1000 l, l vial 2-4ml, ống nghiệm và c c d ng c ph bi n trong phòng th nghiệm

2.1.3 Dung môi ấ

CH3OH (PA), CHCl3 (PA), C6H14 (PA), (CH3CH2)2O (PA), Na2SO4,

CH3COOH, H2SO4, H2O…

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tư ng nghiên cứu là 11 m u rong Nâu thu t i m t số vùng bi n của Việt Nam thu c c c t nh Qu ng Ninh, Qu ng ình, Th a Thiên – Hu , Khánh Hòa, Bà

R a V ng Tàu Thời gian thu m u t năm 2016-2017 M u đư c gi m đ nh tên hoa

h c bởi PGS TS Đàm Đức Ti n và lưu gi tiêu b n t i Viện Tài nguyên và Môi trường bi n, Viện Ho h c c c h p ch t thiên nhiên

Bảng 2.1 Danh sách mẫu rong Nâu nghiên cứu

thu mẫu

Thời gian

Kí hiệu mẫu Chi Sargassum

1 Sargassum tortile

J Ag

Lăng Cô (Th a Thiên

4 S congkinhii

Pham Hoang

Cô Tô 1 (Qu ng Ninh)

5 S gracile

J Ag

Hòn N m (Qu ng Bình)

6 S heterocystum

Mont

Lăng Cô (Th a Thiên

8 (Kützing) Sonder P gymnospora

Nha Trang (Khánh Hòa)

9 P australis

Hauck

Nha Trang (Khánh Hòa)

Chi Distromium

V ng Tàu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 P ươn p áp thu và bảo quản mẫu

Việc thu m u ở vùng tri u d a vào quy ph m t m thời đi u tra t ng h p bi n (ph n rong bi n của Uỷ ban Khoa h c và Kĩ thuật Nhà nước ban hành năm 1980 Kh o

s t vùng dưới tri u d a vào tài liệu hướng d n của Wil inson & a er 1997 bằng thi t b lặn SCU A, m y ch p nh dưới nước hiệu OLYMPUS ĩ thuật số (s n xu t

th c đ a b o qu n bằng t i b o qu n l nh hoặc đ hô, trong phòng th nghiệm bằng

tủ b o ôn SANAKY sau đ b o qu n bằng tủ l nh sâu ở -20oC và -47oC)

M u thành ph n loài đư c phân t ch trong phòng th nghiệm của Phòng Sinh thái và Tài nguyên th c vật bi n (Viện Tài nguyên và Môi trường i n Việc đ nh

lo i chủ y u d a vào c c tiêu chu n v hình th i ngoài và c u t o trong (bằng c c tiêu b n l t cắt dưới nh hi n vi Leica với đ ph ng đ i 1350 l n Việc phân lo i rong bi n tuân theo nguyên tắc chung phân lo i th c vật Tài liệu đ nh lo i căn cứ vào c c t c gi như: Taylor (1960 , Segawa (1962 , Ph m Hoàng H (1969 , Tseng (1983 , Nguy n H u Dinh và nn , (1993 , Tseng và Lu Baoren (2000), Yoshida (1998)

2.3.2 P ươn p áp ết lipid tổng

Chi t lipid t ng theo phương ph p của ligh and Dyer [11], phương ph p

đư c sử d ng thường quy cho m u rong bi n t i phòng th nghiệm của phòng Hoá sinh h u cơ, Trung tâm Nghiên cứu và Ph t tri n c c s n ph m thiên nhiên- Viện

H a h c c c h p ch t thiên nhiên

ự : 50g m u tươi đư c xay hoặc cắt nh , chi t với h n h p dung

môi CHCl3/CH3OH, t h p siêu âm ở 400C trong 2 giờ Toàn b d ch chi t đư c

l c ra, ph n b đư c chi t l i m t l n n a như trên xung thêm m t th tích

H2O, lắc m nh, sau đ đ lắng đ n hi toàn b h n h p d ch chi t đư c phân thành hai lớp Pha dưới chứa lipid t ng đư c chi t ra, làm han bằng Na2SO4, l c b muối, d ch chi t đư c cô quay lo i b dung môi Hàm lư ng lipid t ng t nh theo

ph n trăm so với lư ng m u ban đ u đem chi t Lipid t ng đư c b o qu n trong CHCl3 tinh hi t ở nhiệt đ -20oC

Sơ đồ 2.1 Th c nghiệm chi t lipid t ng

2.3.3 Phân tích thành phần à àm lượng các l p chất lipid

Thành ph n và hàm lư ng c c lớp ch t lipid đư c phân t ch và x c đ nh trên

b n m ng tr ng sẵn (6cm 6cm, Sorbfil, Krasnodar, LB Nga) D ch chi t lipid t ng

đư c th i iệt dung môi bằng h argon, b sung vào 1V CHCl3 phân t ch, ch m

đi u ch trên b n m ng 3 vệt theo n ng đ tăng d n Cho b n m ng ch y tri n hai

Mẫu rong (50g)

Chi t, làm han bằng Na 2 SO4, Quay c t

CHCl3, hu y 2h, l c

Xay nh , CHCl 3 /CH3OH 2/1 Siêu âm 40oC, 2h

trong hệ dung môi C6H14 : (CH3CH2)2O :CH3COOH, đ hô sau đ cho ch y l n 2 trong hệ CHCl3:MeOH/40:60 Sử d ng thuốc thử H2SO410%/MeOH, s y b n

m ng ở 110-220o

C Scan trên m y Epson perfection 2400 PHOTO với đ phân gi i

và ch thước tiêu chu n Ph n trăm của c c lớp ch t trong lipid t ng đư c x c đ nh

d a trên s đo diện t ch và cường đ màu trong chương trình phân t ch hình nh Sorbfil TLC Videodensitometer, Krasnodar, LB Nga [37,39]

Sơ đồ 2.2 Th c nghiệm phân t ch thành ph n và hàm lư ng c c lớp ch t lipid

2.3.4 P ươn p áp á ịn àn p ần à àm lượn á o on lipid ổn

M u lipid t ng đư c metyl este ho theo phương ph p của Carreau & Dubacq (1978) [15]

ự : 10mg lipid t ng đưa vào l vial 4ml và b sung 2ml h n h p tác

nhân H2SO4 2%/MeOH Sau hi ph n ứng hoàn toàn, h n h p đư c b sung thêm 1ml n-hexan và 100 l H2O, lắc và phân lớp bằng m y ly tâm (3000vòng/phút)

H t phân lớp ph a trên, sau đ b sung thêm 1ml n - hexan, ly tâm và h t iệt phân lớp ph a trên G p c c ph n d ch n-hexan l i đem cô iệt dung môi và b sung 100µl CHCl3 tinh hi t, làm s ch bằng sắc ý lớp m ng đi u ch , gi i h p bằng CHCl3, lo i b dung môi, thu đư c ph n metyl este (ME) của c c axit b o Thành

Hòa tan trong CHCl 3

Scan Hiện hình với H 2 SO4 10%/MeOH, 130÷ 210oC

Sử d ng ph n m m t nh to n Sorbfil

Lipid tổng (50mg)

SK b n m ng C 6 H14:(CH3CH2)2O:CH3COOH