Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng aspergillus niger tái tổ hợp​

Hình 3.9: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân cơ chất của enzyme xylanase tự nhiên và enzyme tái tổ hợp sạch với hệ dung môi n-butanol : acid acetic : H2O =... Rất nhiều chủng vi sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE

TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE

TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đỗ Thị Tuyên

PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội – Năm 2020

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy Người thầy, không những chỉ bảo tận tình cho em về mặt kiến thức, mà thầy còn cho em những lời khuyên bổ ích và định hướng giúp đỡ cho em trong suốt quá trình làm luận văn

Em xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn em trong quá trình học tập, nghiên cứu

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em để

em vững bước và hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 3 tháng 12 năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Kim Thu

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về enzyme xylanase………3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 4

1.1.3 Cấu trúc 4

1.1.4 Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác 6

1.2 Ứng dụng của enzyme xylanase 10

1.2.1 Các chế phẩm xylanase trên thị trường quốc tế 10

1.2.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc 11

1.2.3 Trong công nghiệp thực phẩm 11

1.2.4 Trong công nghiệp giấy và bột giấy 12

1.2.5 Các ứng dụng khác 13

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase 13

1.3.1 Trên thế giới 13

1.3.2 Tại Việt Nam 18

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 20

2.1.1 Chủng giống 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Môi trường 22

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 23

2.2 Phương pháp 24

2.2.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase 24

2.2.2 Xác định hoạt tính enzym xylanase 24

2.2.3 Xác định hàm lượng protein 26

2.2.4 Tinh sạch xylanase 27

2.2.5 Điện di SDS-PAGE 30

2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của xylanase 31

2.2.7 Xử lý số liệu 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Nuôi biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp xylanase 36

3.2 Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp 39

3.2.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ 39

3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH 40

3.2.3 Dung môi hữu cơ 41

3.2.4 Chất tẩy rửa 42

3.2.5 Ion kim loại 43

3.3 Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp 43

3.3.1 Tinh sạch enzyme tự nhiên 44

3.3.2 Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp 45 3.3.3 Khả năng phân giải cơ chất của xylanase tự nhiên và tái tổ hợp 46

KẾT LUẬN 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ 61

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase 14

Bảng 1.2: Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật 15

Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng 20

Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch 21

Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng 23

Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách 31

Bảng 3.1: Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng A niger VTCC017/ pANXlG2 39

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp 42

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính của xylanase 43

Bảng 3.4: Tóm tắt quá trình tinh sạch xylanase từ chủng gốc A oryzae VTCC-F-187 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy phân

xylan 3

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran 5

Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 6

Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng 7

Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm 7

Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ 8

Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase 10

Hình 2.1: Đường chuẩn xylose 26

Hình 2.2: Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn 27

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A niger tái tổ hợp 28

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A oryzae tự nhiên 28

Hình 3.1: Điện di đồ protein tổng số của các mẫu protein và hoạt tính xylanase tái tổ hợp trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất xylan 0,5% 36

Hình 3.2: Hình ảnh hoạt tính enzyme xylanase từ (A) chủng tự nhiên A oryzae VTCC-F187; (B) chủng A niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp 37

Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sau khi qua cột histag xylanase G2 38

Hình 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase tái tổ hợp 39

Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase tái tổ hợp 40

Hình 3.6: Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ hữu cơ methanol (MtOH), ethanol (EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) và n-butanol (n-BtOH) lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng) 41

Hình 3.7: (A) Sắc kí đồ trên cột Sephadex G200, (B) Điện di đồ SDS-PAGE của A oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sephadex G200, (C) Điện di đồ SDS-PAGE của A oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sắc kí trao đổi ion DEAE Error! Bookmark not defined Hình 3.8: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân arabinoxylan lần lượt thương mại và hãng của enzyme xylanase tự nhiên và enzyme tái tổ hợp với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1) 46

Hình 3.9: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân cơ chất của enzyme xylanase tự

nhiên và enzyme tái tổ hợp sạch với hệ dung môi n-butanol : acid acetic :

H2O =

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

APS Ammonium persulfate

ARN Acid ribonucleic

BLAST Basic local alignment search tool

BSA Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

DNA Acid Deoxyribonucleic

dNTP 2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

MỞ ĐẦU

Xylan một loại polysacharid chiếm phần lớn trong thành phần hemicellulose của thành tế bào thực vật Để phân giải hoàn toàn xylan thành xylose cần có sự phối hợp của nhiều loại xylanase khác nhau với các chức năng khác nhau (endo-β-1,4-D-xylanase, EC 3.2.1.8; β-D-xylosidase, EC3.2.1.37; α-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55; α-D-glucuronidase, EC 3.2.1.1; acetyl xylan esterase; EC 3.1.1.6)

Endoxylanase có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Xylanase dùng cho công nghiệp bột giấy, hỗ trợ quy trình tẩy trắng, giúp giảm hóa chất độc (chlorine) thường dùng để tẩy lignin trong giấy [14], làm trong nước hoa quả, rượu vang, bia, tạo đường xylitol cho công nghiệp bánh kẹo [67] Xylanase thủy phân hemicellulose tạo arabinoxylan (AX) và chuỗi oligosaccharid arabinoxylan ngắn hơn (arabinoxylanoligosaccharid-AXOS) Arabinoxylan (AX) là một thành phần chất xơ chính được tìm thấy trong một loạt các loại ngũ cốc, được dùng cho chế độ ăn kiêng có tác dụng tốt đối với sức khỏe con ngườ Nên arabinoxylan được định hướng dùng làm phẩm chức năng [71, 61, 57]

Rất nhiều chủng vi sinh vật tự nhiên từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi được công

bố có khả năng sản xuất xylanase, trong đó nấm mốc là sinh vật tiềm năng có khả năng tổng hợp xylanase hoạt tính cao [38] Vì những lý do ứng dụng khác nhau, rất nhiều

loại xylanase được sản xuất từ chủng Bacillus [14] và chủng nấm Aspergillus như Aspergillus awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus giganteus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger và Aspergillus sydowii đã được tinh sạch và đánh giá một số tính chất

lý hóa của xylanase [33, 34, 49, 57, 62, 85] Các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới đã tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp xylanase như

E coli [88], Bacillus [85], Pichia pastoris [16] Chủng Aspergillus niger

VTCC017/pANXlnG2 đã được tạo ra từ việc nhân đoạn gen xylanase từ chủng

Aspergillus oryzae VTCC F187, gen mã hóa xylanase được chèn vào vector biểu hiện pAN7.1GluA với cặp mồi đặc hiệu, plasmid tái tổ hợp được đưa vào A niger VTCC

017 với chất cảm ứng hygromycin sau 72 giờ nuôi cấy chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase cao Với mong muốn ứng dụng chủng vào thực tế sản xuất enzyme xylanase tái tổ hợp định hướng nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan

và các chế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch

và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp” với mục

tiêu sau:

1 Tinh sạch được enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp

2 Đánh giá các tính chất lý hóa của xylanase tái tổ hợp

3 Thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme xylanase tái tổ hợp và enzyme xylanase tự nhiên

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về enzyme xylanase

1.1.1 Định nghĩa

Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of

Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 có [67]:

Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase

Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-D-xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β- xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase

Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase

Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan tạo thành các oligosacharid ngắn (oligoxylose) và xylose (Hình 1.1) [67]

Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy

phân xylan [67]

1.1.2 Phân loại

Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật Chúng được phân chia thành hai nhóm dựa vào sự tương đồng về đặc tính lý hóa như là khối lượng phân tử, điểm đẳng điện và các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng:

Enzyme endo-xylanase họ 10 gồm các enyzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (trước đây gọi là họ F) Enzyme endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được (trước đây gọi là họ G) [52, 73]

Sự khác biệt về đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase là endo-xylanase của họ 10

có khả năng thủy phân các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó [41] Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế

Ngoài việc phân loại enzyme xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng

đã tiến hành nghiên cứu, phân chia enzyme xylanase thành những nhóm nhỏ hơn Sapag và cộng sự (2002) chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc Các enzyme nhóm I và II thường là các

enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và Basidiomyceta Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị

pI ở phía axit Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C Nhóm

A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn

toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [73]

1.1.3 Cấu trúc

Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các

enzyme [81], từ cả vi khuẩn và nấm mốc Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans

có nét đặc trưng của họ 11 [41] Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạo thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [73] Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran [39]

Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β cái mà làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác Vũng lõm này được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay phải Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân tử isoleusin [41]

Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [Jeffries1996]

Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc

tác Meagher và cộng sự (1998) nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei có thể

liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác [59] Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [21, 80]

1.1.4 Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác

1.1.4.1 Đặc điểm cơ chất

Xylanase chủ yếu thủy phân xylan và một phần nhỏ cellulose Xylan là thành phần chính cấu tạo hemicellulose tập trung chủ yếu ở cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật, và là một trong số polysaccharid quan trọng trong tự nhiên [48]

Ở cây gỗ cứng, xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.4), còn ở cây gỗ mềm là arabino-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.5) Ở các loài ngũ cốc, thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete 4-Omethylvà arabinose

Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng [48]

Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm [48]

1.1.4.2 Phức hệ enzyme phân cắt xylan

Có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân hoàn toàn xylan Sử dụng kiềm mạnh hoặc axit mạnh là những biện pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay bởi hiệu quả thủy phân và giá trị kinh tế Nhưng vấn đề ô nhiễm môi trường đang ngày càng gia tăng, đòi hòi các nhà khoa học phải tìm tòi, nghiên cứu ra phương pháp thủy phân polysaccharide nói chung và xylan nói riêng bằng enzyme sinh học Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme [68], trong đó endo-β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các oligosaccharide Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β- 1,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase,

Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [68]

Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylo- oligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử Sự thủy phân liên kết α-1,2 -glycosidic bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan Tương tự như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp α-glucuronidase [39]

Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết của các axit acetic và axit phenolic với xylose Esterase phá vỡ liên kết của xylose với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose với axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p- coumaroyl esterase) Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho

sự loại bỏ lignin Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose Nếu sử dụng cùng với xylanase và các enzym

phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [19]

Enzyme quan trọng nhất trong hệ thống enzyme thủy phân cơ chất xylan là enzyme xylanase [67] Vì nó là enzyme khởi đầu cho hệ thống phản ứng phân cắt các liên kết của xylan

1.1.4.3 Cơ chế xúc tác

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase [23, 41, 50, 53] Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa qua Hình 1.7:

(a) Xylanase nhận diện xylan và liên kết nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần cánh trái (cuộn xoắn lại 3 lần); cơ chất xylan hình xoắn ốc được đặt ở vị trí đối diện với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 (a); [41]

(b) Hai gốc glutamat (Glu) được định vị cho phù với vị trí hoạt động (khoảng 5,5

Å) Glu 172 là chất xúc tác acid/base, Glu 78 là chất cho điện tử [41];

(c) Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác (Glu 78), liên kết glycosidic bị kéo căng và bẻ gãy tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị enzyme – cơ chất (b) [53];

(d) Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, nó tách thành ion 𝐻+ gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi 𝑂𝐻− gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm được giải phóng (c), (d) [50];

(e) Enzym dịch chuyển đến vị trí tiếp theo trên cơ chất nhờ sự phân tách và phân tán các đường (xylose) [41]

Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase

1.2 Ứng dụng của enzyme xylanase

1.2.1 Các chế phẩm xylanase trên thị trường quốc tế

Enzym xylanase được sử dụng thương mại trong một số ngành công nghiệp như tẩy trắng bột giấy, thực phẩm, thức ăn và sản xuất bia Ứng dụng chính của xylanase

là tẩy trắng bột giấy và được sản xuất bởi các công ty khác nhau trên thế giới với nhiều tên thương mại khác nhau như Bleachzyme (Biocon, Ấn Độ), Cartzyme (Sandoz, US), Cartzyme MP (Clarient, UK), Ecozyme (Thomas Swan, UK), Ecopulp (Alko Rajamaki, Phần Lan… Xylanase được sản xuất thương mại bởi một số ngành công nghiệp quốc tế để ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi Sankyo từ Nhật Bản, Ciba Giegy từ Thụy Sĩ sản xuất xylanase với tên thương mại lần lượt là Sanzyme và Albazyme-10A, và đã được sử dụng thương mại

trong ngành công nghiệp thực phẩm và làm bánh Một công ty Đan Mạch Novo Nordisk, 2017) [82] Một công ty Mỹ Alltech, Inc., sản xuất thương mại xylanase với tên thương mại Allzym PT và Fibrozyme và đã được sử dụng để nâng cấp thức ăn chăn nuôi Hầu hết các xylanase thương mại được sản xuất bởi nguồn nấm do tiềm năng sản xuất cao

1.2.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc

Xylanase đóng vai trò quan trọng trong thức ăn chăn nuôi bằng cách phá vỡ

thành phần thức ăn arabinoxylan và làm giảm độ nhớt của nguyên liệu thô Chủng A japonicus C03 với khả năng sản xuất endoxylanase và cellulase tốt với độ ổn định

cao trong môi trường dạ cỏ dê, cho thấy các ứng dụng đối với động vật nhai lại [32] Một số nghiên cứu đã cho thấy sự sẵn có xylanase trong các sản phẩm chưng cất hạt khô có thể hòa tan (DDGS) được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi và sử dụng xylanase ngoại sinh trong chế độ ăn của gia cầm để xử lý hàm lượng chất xơ cao hơn [66, 83] Bổ sung xylanase cho thấy sự cải thiện cân nặng và tăng tỷ lệ chuyển đổi thức ăn vì sự cải thiện khả năng tiêu hóa arabinoxylan trong chế độ ăn của động vật

[78] ECONASE XT một quảng cáo nổi tiếng endo -1,4-xylanase đã được sử dụng

làm phụ gia thức ăn cho gà vỗ béo, heo con cai sữa và vỗ béo cho lợn [72]

1.2.3 Trong công nghiệp thực phẩm

Xylanase tìm thấy ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm như công nghiệp bánh mì Bánh mì được tạo thành từ lúa mì bao gồm hemicelluloses như arabinoxylan Xylanase có thể hòa tan arabinoxylan không thể tách rời thành arabinoxylan chiết xuất được trong nước [24] Điều này giúp phân phối nước đồng đều

và cải thiện sự hình thành mạng gluten bột trong suốt Butt et al (2008) đã chứng minh

vai trò của GH11 endoxylanase từ B subtilis trong việc hòa tan arabinoxylan

[22] Điều này làm tăng độ nhớt và khối lượng bột và giảm sự kết tụ gluten và độ cứng của bột làm cho các mảnh vụn đồng đều và mịn GH11 xylanase (0,12 U/g bột)

từ Penicillium constitanis Pol6 cải thiện quá trình sản xuất bánh mì như giảm sự hấp

thụ nước (8%) và tăng bột nhào (36,8%), khối lượng (17,8%), cụ thể khối lượng

(34,9%) và độ kết dính Bánh mì đã được cải thiện tính chất lưu biến và cảm quan (kết cấu, hương vị, hương vị, độ mềm) Xylanase được tinh chế một phần để sản xuất bánh

mì có đặc tính cảm quan tốt hơn (màu sáng hơn) [36] Việc bổ sung xylanase cũng dẫn đến tăng khối lượng riêng và thời hạn sử dụng, với độ cứng thấp hơn và thuận tiện trong quá trình bảo quản Tương tự, xylanase tái tổ hợp (r-XynBS27) thu được

từ Pichia pastoris (gen xynBS27 từ Streptomycessp S27) được sử dụng làm phụ gia

trong quá trình làm bánh mì

Quá trình sử dụng enzyme trong chiết xuất và làm trong nước ép trái cây được sử dụng rộng rãi Nước ép trái cây thô chứa polysacaride như cellulose, hemicellulose, pectin tinh bột và lignin liên kết bề mặt và làm giảm chất lượng của nước ép, ví dụ, màu đục và độ nhớt cao Việc sử dụng enzyme làm giảm độ nhớt và tránh sự hình thành các cụm, bằng cách loại bỏ chất rắn lơ lửng và không hòa tan bằng phương pháp

ly tâm và lọc Điều này làm tăng độ trong, mùi thơm và màu của nước ép

[26] Xylanase được tinh chế một phần từ Streptomyces sp AOA40 đã được sử dụng

trong ngành công nghiệp nước ép trái cây để tăng độ trong của nước ép từ táo (17,8%), cam (18,4%) và nho (17,9%) [10] Xylanase cố định hoạt hóa glutaraldehyde được sử

dụng để làm trong nước ép cà chua Xylanase từ P acidilactici GC25 đã được sử dụng

cho kiwi, táo, đào, cam, mơ, nho và lựu trong đó tăng lượng đường và giảm độ đục của nước ép [11]

1.2.4 Trong công nghiệp giấy và bột giấy

Quá trình loại bỏ lignin từ bột gỗ để tạo ra giấy thành phẩm trắng sáng được gọi

là tẩy trắng [17] Theo truyền thống, các chất tẩy trắng hóa học (như clo) được sử dụng để tẩy trắng [75] Việc sử dụng các enzyme ligno-hemiaellulolytic để tẩy trắng

đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới Xylanase có khả năng thủy phân xylan được liên kết với cellulose và lignin của sợi bột giấy Do đó, sự gián đoạn xylan cuối cùng

sẽ dẫn đến sự phân tách giữa các thành phần này, cải thiện việc chiết xuất lignin từ bột giấy [77] Do đó, xylanase kết hợp với enzyme phân giải lignin giúp tăng độ sáng của bột giấy [65] Sự tiếp xúc của sợi cellulose với quá trình nghiền enzyme giúp

tăng cường lực liên kết của giấy và cải thiện độ bền của giấy thông qua sự thoái biến của xylan và loại bỏ lignin trong quá trình xử lý enzyme [55] Hệ thống enzyme đã được lựa chọn rất cao, không độc hại, thân thiện với môi trường để tẩy trắng sinh học [15]

Tiền xử lý Paenibacillus campinasensis BL11 xylanase cho thấy độ sáng và độ nhớt của bột giấy gỗ cứng tăng lên [47] S thermophilum xylanase hoạt động ở nhiệt

độ cao (50-70°C) đã được sử dụng để tẩy trắng bã mía [43] T lanuginosus VAPS24

xylanase ổn định ở phạm vi pH rộng có thể hữu ích trong cả hai chế phẩm sinh học kiềm và axit [51] Các đơn vị sản xuất giấy của các quốc gia khác nhau, tức là Nhật Bản, Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Châu Âu đang dần thay thế tẩy trắng bột hóa học bằng tẩy trắng bột qua trung gian xylanase Canada được biết đến là nhà sản xuất bột giấy hàng đầu và họ đang tẩy trắng hơn 10% bột giấy thông qua xylanase [28]

1.2.5 Các ứng dụng khác

Xynalase được ứng dụng rộng rãi trong việc làm mềm rau quả, gạn lọc chất xơ trong công nghiệp nước hoa quả và rượu vang, hóa lỏng chất nhày trong quá trình tạo café lỏng, tách chiết hương liệu và chất màu, dầu thực vật và tinh bột…Ngoài ra xynalase còn được dùng trong các nghiên cứu khoa học Như trong việc mô tả một vài xylanase có được sử dụng nhằm cải thiện khả năng làm mềm thành tế bào đối với quá trình tạo tế bào trần

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase

1.3.1 Trên thế giới

1.3.1.1 Xylanase tự nhiên

Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật, nhiều loại vi khuẩn và nấm được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [17, 70, 84]

Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [75]

Vi sinh vật Hoạt tính enzyme xylanase (IU/ml)

Bảng 1.2: Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [76]

Vi sinh vật

KLPT (KDa)

Điều kiện tối ƣu Độ bền

pI Km (mg/ml) Vmax (µmol

/ phút /

pH Nhiệt độ pH (giờ) Nhiệt độ

(giờ) Nấm mốc

1.3.1.2 Xylanase tái tổ hợp

Để có năng suất enzyme cao với các đặc tính cụ thể như độ ổn định cao trong phạm vi nhiệt độ và pH rộng, độ đặc hiệu cơ chất cao và khả năng kháng mạnh đối với các cation kim loại và hóa chất cho ứng dụng công nghiệp [35, 69] Enzyme nội sinh thường được sản xuất với số lượng thấp và cũng thiếu tất cả các đặc tính để đáp ứng nhu cầu công nghiệp [13] Do đó, các phương pháp công nghệ sinh học khác nhau được sử dụng để cải thiện năng suất và truyền các đặc tính đặc trưng cho enzyme mong muốn Những phương pháp này liên quan đến thao tác di truyền liên quan đến đột biến và công nghệ DNA tái tổ hợp

Nhân bản gen và biểu hiện gen xylanase bằng DNA tái tổ hợp Các xylanase tái

tổ hợp được thiết kế để có các đặc tính tương đương hoặc tốt hơn các enzyme tự nhiên

có năng suất cao trong hệ thống biểu hiện, để có thể được sử dụng trong ngành công nghiệp lên men

Một số nghiên cứu cho thấy gen xylanase mong muốn đã được nhân bản vào vectơ phù hợp, sau đó là biểu hiện của nó trong các hệ vi sinh vật phù hợp như vi khuẩn, nấm men và nấm [18, 37, 42, 44, 63, 79]

Biểu hiện ở vi khuẩn

Goswami và cộng sự (2014) đã nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xylanase từ

Bacillus brevis trong E coli BL21 Chủng tái tổ hợp chủ yếu tiết ra xylanase trong môi

trường nuôi cấy với hoạt tính xylanase đạt 30 IU/ml Dịch lọc nuôi cấy không có hoạt tính cellulase và được tìm thấy hoạt động trong khoảng rộng pH và nhiệt độ [37] Một gen mã hóa xylanase ổn định nhiệt kiềm (Mxyl) đã được lấy từ thư viện và nhân bản

vector pET28a biểu hiện trong E coli BL21 (DE3) Xylanase tái tổ hợp có thời gian

bán hủy lần lượt là 2 giờ và 15 phút ở 80°C và 90°C Xylanase tái tổ hợp có pH tối ưu

và nhiệt độ tương ứng là 9,0 và 90°C [79]

Escherichia coli được sử dụng rộng rãi nhất do điều kiện tăng trưởng không tốn

kém, thao tác dễ dàng, yêu cầu kỹ thuật đơn giản, mức độ tích lũy sản phẩm cao trong

tế bào chất của tế bào [42] Tuy nhiên, với E coli khả năng biểu hiện hiệu quả và chức

năng của nhiều gen xylanase là không có, điều này có thể là do sự xuất hiện lặp đi lặp lại của các codon hiếm và yêu cầu điều chỉnh dịch mã (hình thành liên kết disulfide và

glycosyl hóa [18, 42, 44] Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa xylanase của A usamii E001 Gen mã hóa một protein gồm 184 amino acid, có khối lượng 19,8 kDa

Vùng mã hóa của gen có một intron nên việc nhân dòng gen được tiến hành thông qua bước tổng hợp cDNA từ RNA Cùng với việc sử dụng pET-28a (+) làm vector biểu

hiện, gene được biểu hiện trong E coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Xylanase từ

chủng tái tổ hợp có hoạt tính cao nhất đạt 49,6 U/mg Nhiệt độ và pH tối ưu là 50°C,

pH 4,6 Hơn 50% hoạt lực enzyme duy trì trong dải pH từ 4,2 - 5,3 Đây là công bố

đầu tiên về việc tách dòng gen xylanase từ A usamii [88]

Biểu hiện và đặc tính của gen xylanase (xynB) từ Dictyoglomus thermophilum Rt46B.1 trong hệ thống Bacillus subtilis Độ pH tối ưu và nhiệt độ của enzyme tái tổ

hợp đã được tinh chế lần lượt là 6,5 và 85°C Xylanase bền ở 95°C và hoạt tính vẫn còn được duy trì khi được ủ với các chất hoạt động bề mặt như EDTA, DTT, và Triton X-100 [86, 87]

Biểu hiện trong nấm men

Sự biểu hiện protein dị loại trong hệ thống nấm men rất hấp dẫn nhờ khả năng thực hiện các sửa đổi sau dịch mã của sinh vật nhân chuẩn và có thể phát triển đến mật

độ tế bào rất cao với khả năng tiết enzyme vào môi trường lên men Hầu hết các loại

nấm men không tạo ra độc tố [44] Saccharomyces cerevisiae đã được thiết lập như

một vi sinh vật công nghiệp, do đó, có thể được sử dụng thuận tiện cho sản xuất xylanase [13]

Việc áp dụng Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện đã trở nên khó khăn vì nó

có thể tự thúc đẩy sự biểu hiện của protein bằng cách sử dụng rượu oxyase làm chất

xúc tiến sử dụng con đường sử dụng metanol [13, 44] Pichia pastoris là hệ thống biểu

hiện được ưa thích vì nó có thể phát triển với mật độ tế bào rất cao, thừa hưởng các

chất xúc tiến mạnh và được điều hòa chặt chẽ, và tạo ra protein tái tổ hợp (g/L) cao cả

về nội bào và ngoại bào [12] Nhân bản của hai gen GH11 xylanase, MYCTH_56237

và MYCTH_49824, từ nấm ưa nhiệt Myceliophthora thermophila và biểu hiện của nó trong Pichia pastoris Hoạt độ của xylanase tái tổ hợp lần lượt là 1533,7 U/mg và

1412,5 U/mg đối với MYCTH56237 và MYCTH_49824 Xylanase tái tổ hợp ổn định trong điều kiện khắc nghiệt (pH và nhiệt độ cao) và hiệu quả cao đối với quá trình

đường hóa sinh khối [16] Tuy nhiên, việc áp dụng Pichia pastoris ở quy mô lớn bị

hạn chế do các nguy cơ về sức khỏe và cháy nổ của methanol [13]

Biểu hiện ở nấm sợi

Nấm sợi có thể được sử dụng một cách hiệu quả cho biểu hiện gen dị loại và tương đồng dẫn đến sản lượng gen tái tổ hợp cao [74, 63, 64]

Việc áp dụng nấm như một hệ thống biểu hiện cũng có những lợi thế liên quan đến chi phí của tổng thể quy trình do cơ chất chi phí thấp Hơn nữa, nấm đã trải qua nhiều quy trình cải tiến chủng để tăng cường sản xuất xylanase Do đó, máy móc biểu hiện xylanase tự nhiên có thể được sử dụng một cách hiệu quả để biểu hiện chức năng của một gen xylanase ngoại lai từ các nguồn khác Gen xylanase xyn2 được biểu hiện

ở T reesei bằng biểu hiện tương đồng dẫn đến 1,61 g/L của xylanase 2 trên môi

trường chứa glucose [54] Sự biểu hiện của gen xylanase 2 (XYN2) và xylanase từ

nấm ưa nhiệt Humicola grisea var thermoidea và P griseofulvum đã được thể hiện trong Trichoderma reesei và Aspergillus oryzae [27] Một đánh giá toàn diện về ứng

dụng của nấm sợi làm hệ thống biểu hiện và cho rằng nghiên cứu hiện đang tập trung vào việc tìm hiểu các cơ chế tế bào để kiểm soát chất lượng protein tốt hơn và quá trình bài tiết Việc sử dụng các công cụ omics có thể giúp cải thiện quy định sản xuất xylanase bằng cách sử dụng nấm sợi làm hệ thống biểu hiện [63]

1.3.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về xylanase từ các chủng vi sinh vật Nguyễn Thị Uyên Thảo và cộng sự (2004) đã nghiên cứu về việc sử dụng vi nấm

Trichoderma để thu nhận các enzyme cellulose, xylanase và pectinase từ nguồn

nguyên liệu bã khoai mì Tổ hợp enzyme này được nghiên cứu, ứng dụng vào sản xuất thức ăn chăn nuôi [4]

Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2009) ghiên cứu và đánh giá một số tính chất hóa lý

của chủng Aspergillus niger DSM1957 trên dịch tinh sạch sơ bộ Hoạt tính của enzym

xylanase đạt cao nhất ở nhiệt độ 55oC, pH là 5,0 Hoạt tính xylanase bị giảm khi ủ với một số ion kim loại (Fe2+, Fe3+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, K+, EDTA) ở nồng độ 2

mM [7]

Bên cạnh đó cũng có một số nghiên cứu về xylanase tái tổ hợp Năm 2009, Nguyễn Thị Thu Thùy và cộng sự đã biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của

xylanase tái tổ hợp từ A oryzae VTCC F187 trong Pichia pastoris GS115 [5] Khi

nghiên cứu biểu hiện và đánh giá tính chất hóa lý của xynalase tái tổ hợp từ chủng

Asprgillus niger DSM1957 trong Pichia pastoris GS115 Hoạt tính xynalase tái tổ hợp

cao nhất là 125 U/mg protein Nhiệt độ và pH tối ưu là 40o

C và pH 4,0 Hoạt tính xynalase vẫn còn duy trì được hơn 70% sau khi ủ 1h ở pH 4,0 – 5,0 và 40oC [8]

Lê Văn Trường, Thomas Schweder (2010) đã biểu hiện gen mã hóa xylanase

trong B subtilis sử dụng promoter α-amylase từ B amyloliquefaciens Sau khi biểu

hiện, hàm lượng XynA tái tổ hợp được tiết ra môi trường ngoại bào với mức độ cao, đạt khoảng 0,5 mg/ml trên môi trường BMM Nhiệt độ tối ưu và pH tối ưu tương ứng

là 50oC và pH 6,0 [6]

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Chủng giống

Chủng A niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp được cung cấp bởi phòng Công

nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học Chủng được tạo ra bằng sử dụng

đoạn gene mã hóa sinh tổng hợp xylanase G2 từ A oryzae VTCCF187 có kích thước

699 bp mã hóa cho 232 acid amin được nhân dòng, phân tích trình tự và đăng ký trên gene bank với mã số E4848307 Gen được chèn vào vector biểu hiện pAN7.1GluA, với cặp mồi đặc hiệu có điểm cắt enzyme giới hạn BamHI, plasmid tái tổ hợp được đưa vào

3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) Honeywell Fluka (Mỹ)

Acrylamide Bio Basic Canada Inc (Canada)

Sodium metabisulfite Bio Basic Canada Inc (Canada)

Brommophenol blue Sigma (Mỹ)

Cao nấm men Bio Basic Canada Inc (Canada)

Coomassie brilliant blue Sigma (Trung Quốc)

Tris Bio Basic Canada Inc (Canada)

Xylan from birchwood Biochemika

L- arabinose, Arabinoxylan Megazyme

Arabinoxylan Trường ĐHKH tự nhiên, ĐHQG Hà Nội, Việt

Nam

Và một số hóa chất thông dụng khác

Bột đậu tương, bột lõi ngô đều đạt tiêu chuẩn của nhà sản xuất tại Việt Nam Các dung dịch và đệm sử dụng được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng độ được tóm tắt trong Bảng 2.2

Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch

Bradford stock solution 100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200

ml 88% phosphoric acid Bradford working buffer 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88%

phosphoric acid; 30 ml Bradford stock solution Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl; pH 8,8

Dung dịch APS 20% amoni persulfat

Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C 30% acrylamid; 0,8% bis-acrylamid

Dung dịch D 10% SDS (tinh thể); 25 mM EDTA

Dung dịch DNS

(1000ml)

153 g KNaC4H4O6.4H2O; 4,15g Na2S2O5; 5,3 g DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol (làm tan ở 50oC)

Dung dịch nhuộm 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)

methanol; 10% (v/v) acetic acid

Dung dịch tẩy PAGE 60% (v/v) H2O; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v)

acid acetic Đệm potasium phosphat 20 mM K2HPO4; pH 6,5

Đệm điện di protein (biến tính) 20 mM Tris-HCl; 192 mM glycerin; 0,1% (w/v)

SDS; pH 8,4 Đệm tra mẫu protein 5X

(biến tính)

0,05% brommophenol blue; 50% glycerol 100%; 10% SDS; 10% β-mercaptho-ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8

Dung dịch cơ chất 0,5% xylan, pha trong đệm 20 mM potasium

phosphat pH 6,5 Dung dịch đặc cơ chất 0,5% xylan; 1,2% agar

Dung dịch Native purification

Dung dịch Native wash buffer

(NWB)

250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 20 mM imidazole pH 8,0

Dung dịch Native elution

buffer (NEB)

250 mM NaH2PO4; 2,5 M NaCl và 250 mM imidazole pH 8,0

Các hóa chất thông thường khác: NaOH, HCl, ethanol, nước khử RO Các hóa

chất này đều đạt tiêu chuẩn phân tích

2.1.3 Môi trường

Môi trường YP gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone

Môi trường YPG bao gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone; 2% (w/v) D-glucose

Môi trường YPGS bao gồm: 1% (w/v) yeast extract; 2% (w/v) peptone; 2% (w/v) D-glucose, 1 M sorbitol

Môi trường nuôi cấy: 7% bột lõi ngô, 5% bội đậu tương, pH 7,0 được khử trùng

2.1.4 Thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học được liệt kê ở Bảng 2.3

Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng

Bể ổn nhiệt VS-1205CW Vision (Hàn Quốc)

Box cấy vi sinh vật clean bench TTCG Công nghệ (Việt Nam)

Máy lắc rung ổn nhiệt ProvocellTM Esco (Mỹ)

 Dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống

Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích

2.2 Phương pháp

2.2.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase

Đối với chủng tự nhiên: Chủng nấm A oryzae VTCCF187 sinh tổng hợp

xylanase được hoạt hóa, nhân giống trong môi trường Czapek nhiệt độ 30C, lắc 180 vòng/phút sau 72 giờ Sau đó được nuôi trong môi trường nuôi cấy chứa 7% bột lõi ngô, 5% bội đậu tương, pH 7,0 ở 28C, lắc 180 vòng/phút sau 168 giờ [29]

Đối với chủng tái tổ hợp: Chủng nấm A niger VTCC017/pANXlnG2 sinh tổng

hợp xylanase được hoạt hóa, nhân giống trong môi trường YPG nhiệt độ 30oC, lắc 180 vòng/phút sau 72 giờ Sau đó được nuôi trong môi trường YP cảm ứng hygromycin, lắc 200 vòng/phút, thời gian lên men 72 giờ [29]

2.2.2 Xác định hoạt tính enzym xylanase

Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất xylan trong nước cất dày khoảng 0,5 cm, được đục

lỗ đường kính 0,5 cm 100 μl dịch enzym được cho vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4o

C cho enzym khuếch tán Sau đó, đĩa thạch được ủ 6 giờ ở 37oC lấy ra và nhuộm bằng lugol 1% Bán kính vòng thủy phân Rhalo = R-r (với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ), biểu thị hoạt tính tương đối của enzym

để tính hàm lượng đường giải phóng tương đương Từ đó tính ra hoạt độ enzym

Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ xylanase là lượng enzym phân giải cơ chất

xylan thành đường khử tương đương 1 µmol xylose trong một phút ở điều kiện nhất định [60]

Tiến hành:

Xây dựng đường chuẩn: xylose được pha trong 100 mM đệm natri acetat pH 5,0

với các nồng độ chuẩn khác nhau từ 10-70 µg/ml Tiến hành phản ứng với DNS và đo

độ hấp thụ ở 540 nm Độ hấp phụ và nồng độ xylose được vẽ theo chương trình Excel Kết quả cho thấy, đuờng nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ từ 10-70 µg/ml Đường chuẩn có phương trình y = 0,0178x + 0,0312 Trong đó, y là độ hấp phụ (OD)

ở bước sóng 540 nm, x là nồng độ xylose (µg/ml) (Hình 2.1)

Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzym 0,4 ml được cho vào ống

nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% xylan pha trong 20 mM đệm potasium phosphat

pH 6,5 Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50oC, sau đó bổ sung ngay 1,25 ml DNS Lắc đều hỗn hợp và đun cách thủy 5 phút Sau đó, dịch được làm nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm Lặp lại 3 lần

Ống kiểm tra: Hút 0,1 ml dịch enzyme, thêm 1,25 ml DNS, ủ 5 phút Sau đó bổ

sung 0,4 ml dung dịch 0,5% xylan pha trong 20 mM đệm potasium phosphat pH 6,5

Hỗn hợp được lắc đều và ủ 5 phút ở 50oC Sau đó đun cách thủy 5 phút Dịch được làm nguội và đo OD ở bước sóng 540 nm

Hình 2.1: Đường chuẩn xylose

2.2.3 Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [20]

Nguyên lý:

Các protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ hình thành phức hợp màu

có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm, độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ protein Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò

Tiến hành:

Dựng đường chuẩn: albumin huyết thanh bò (BSA) được pha trong nước muối

sinh lý NaCl 0,9% với dải nồng độ 2,5-30 µg/ml Cho 900 µl dung dịch Bradford working phản ứng với 100 µl dung dịch BSA chuẩn Hỗn hợp được đảo đều, để ở nhiệt

độ phòng trong 2 phút sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm Kết quả đường chuẩn