Khảo sát sự hiện diện của các vi khuẩn có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện gò dầu, tỉnh tây ninh​

Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập .... Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN

CÓ LỢI TẠI MỘT SỐ VÙNG ĐẤT NÔNG NGHIỆP

HUYỆN GÒ DẦU, TỈNH TÂY NINH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Lê Thị Mỹ Hạnh

MSSV: 1051110011 Lớp: 10DSH01

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên

cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS Phạm Minh Nhựt Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Mỹ Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua

Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Mỹ Hạnh

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các bảng viii

Danh sách các hình ix

Mở đầu 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Phạm vi nghiên cứu 2

Chương 1 Tổng quan 3

1.1 Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp 3

1.1.1 Vai trò của vi sinh vật trong đất 3

1.1.2 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất 3

1.1.3 Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất 5

1.2 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật 9

1.2.1 Khái niệm enzyme ngoại bào 9

1.2.2 Phân loại enzyme ngoại bào 9

1.2.3 Đặc điểm – tính chất 10

1.2.4 Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật 13

1.3 Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay 23

Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 24

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 24

2.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập 24

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị 24

2.2.3 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu 25

2.3.2 Phương pháp pha loãng mẫu 26

2.3.3 Phương pháp tăng sinh 27

2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 27

2.3.5 Phương pháp định danh vi sinh vật 28

2.3.6 Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn 30

2.3.7 Phương pháp xác định mật độ tế bào 31

2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 31

2.4 Bố trí thí nghiệm 31

2.4.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn 32

2.4.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập 33

2.4.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh 36

Chương 3 Kết quả và thảo luận 38

3.1 Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu 38

3.2 Kết quả phân lập và định danh sơ bộ 40

3.2.1 Kết quả phân lập 40

3.2.2 Kết quả định danh sơ bộ 41

3.3 Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào 43

3.2.1 Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase 43

3.2.2 Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase 44

3.3.3 Đánh giá khả năng sinh enzyme protease 46

3.3.4 Đánh giá khả năng sinh enzyme lipase 47

3.3.5 Đánh giá khả năng sinh enzyme catalase 49

3.3.6 Đánh giá khả năng sinh enzyme oxidase 49

3.4 Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với vi khuẩn gây bệnh 51

3.4.1 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp 52

3.4.2 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E Coli 53

3.4.3 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella 55

3.4.4 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 57

3.4.5 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L monocytogenes, L innocua, E feacalis, S aureus 59

3.5 Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập 63

Chương 4 Kết luận và đề nghị 68

4.1 Kết luận 68

4.2 Đề nghị 68

Tài liệu tham khảo 69

Asp: Acid aspartic

TSB: Trypton Soya Broth

TSA: Trypticase Soya Agar

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Danh sách mẫu phân lập 24

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập 40

Bảng 3.2 Kết quả định danh sơ bộ của các chủng vi khuẩn phân lập 41

Bảng 3.3 Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập 43

Bảng 3.4 Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập 45

Bảng 3.5 Khả năng phân huỷ gelatin và casein của các chủng vi khuẩn phân lập 46

Bảng 3.6 Khả năng sinh enzyme lipase của các chủng vi khuẩn phân lập 48

Bảng 3.7 Khả năng sinh enzyme catalase của các chủng vi khuẩn phân lập 49

Bảng 3.8 Khả năng sinh enzyme oxidase của các chủng vi khuẩn phân lập 50

Bảng 3.9 Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp 52

Bảng 3.10 Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E Coli 54

Bảng 3.11 Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella 56

Bảng 3.12 Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 58

Bảng 3.13 Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L monocytogenes, L innocua, E feacalis, S aureus 60

Bảng 3.14 Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập 64

Bảng 3.15.A Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập 65

Bảng 3.15.B Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập 66

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật 3

Hình 1.2 Hình thái một số nhóm vi khuẩn 6

Hình 1.3 Hình thái của xạ khuẩn 7

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase 14

Hình 1.5 Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein 15

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của enzyme protease 17

Hình 1.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase 19

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa 21

Hình 1.9 Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước 22

Hình 2.1 Phương pháp pha loãng mẫu 26

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 31

Hình 2.3 Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp 32

Hình 2.4 Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường Starch Agar 34

Hình 2.5 Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường Skim Milk Agar 34

Hình 2.6 Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường Tween Peptone Agar 35

Hình 2.7 Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC Agar 35

Hình 2.8 Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase 36

Hình 3.1 Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu 39

Hình 3.2 Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn phân lập 42

Hình 3.3 Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102, ĐTT112 trên môi trường Starch Agar 44

Hình 3.4 Vòng phân giải cellulose của các chủng ĐMT701, ĐRD801, ĐTQ901 và ĐTT111 trên môi trường CMC Agar 46

Hình 3.5 Kết quả dương tính của cáic chủng vi khuẩn phân lập so với

mẫu đối chứng trong thử nghiệm gelatinase 47 Hình 3.6 Kết qảu kiểm tra khả năng sinh enzyme lipase của các chủng

ĐTL201, ĐTL301, ĐTL502 và ĐTB601 trên môi trường

Tween Peptone Agar 48 Hình 3.7 Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL501, ĐRD801

và ĐTT111 đối với vi khuẩn S dublin 53

Hình 3.8 Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL401

và ĐTL501 đối với nhóm vi khuẩn E Coli 55

Hình 3.9 Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL501,

ĐRD801 đối với vi khuẩn Shi sonnei 57

Hình 3.10 Vòng kháng khuẩn của sinh khối chủng ĐTT112 đối với

các vi khuẩn chỉ thị nhóm Vibrio 59

Hình 3.11 Vòng kháng khuẩn của các chủng ĐTL501, ĐTT112, ĐRD801

đối với các vi khuẩn chỉ thị L monocytogenes, L innocua 61

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong giai đoạn hiện nay, nước ta đang trên đà phát triển theo hướng công nghiệp hóa - hiện đại hóa nhưng nông nghiệp vẫn đóng vai trò quan trọng, trong đó ngành trồng trọt vẫn là nền tảng với diện tích đất canh tác chiếm 17% tổng diện tích đất Theo báo cáo Tổng điều tra đất đai năm 2010, tổng diện tích nhóm đất nông nghiệp của nước ta năm 2010 là 26.100.160 ha, tăng 5.179.385 ha (gấp 1,25 lần) so với năm 2000 Trong canh tác nông nghiệp, ngoài trồng lúa nước, người dân còn sử dụng để trồng trọt các loại hoa màu để tăng thêm thu nhập Do đó, để có được mùa

vụ trồng trọt tốt thì chất lượng đất đóng vai trò quyết định, trong đó có sự đóng góp quan trọng của các vi sinh vật

Đất là nơi diễn ra hàng loạt các quá trình chuyển hoá vật chất, trao đổi dinh dưỡng và năng lượng để hình thành và phát triển độ phì nhiêu của đất mà trong đó

vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng Ngoài chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hoá vật chất, vi sinh vật đất sau chu kỳ sống còn để lại cho đất sinh khối rất lớn tạo nên độ phì nhiêu của đất Vì thế vi sinh vật đất là một trong các chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá độ phì nhiêu và chất lượng của đất Với sự hiện diện thường xuyên của các vi sinh vật có lợi trong đất ngoài việc giúp cho đất tăng độ phì nhiêu, giúp người dân hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học thì đây cũng chính là nguồn cung cấp các nhóm vi sinh vật có lợi như có khả năng sinh enzyme ngoại bào cũng như có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Do đó, việc xác định sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất, nhất là trong các vùng đất nông nghiệp như đất trồng lúa, đất trồng hoa mùa sẽ phục vụ cho mục tiêu này

Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài "Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông

nghiệp huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh” Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí

nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi - sản sinh enzyme ngoại bào

và đặc tính đối kháng, trong đất nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn hiện diện trong một số vùng đất trồng lúa và đất trồng hoa màu

- Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập

- Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh

4 Phạm vi nghiên cứu

Chỉ khảo sát vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng, ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp

1.1.1 Vai trò của vi sinh vật trong đất

Hầu hết vi sinh vật là sinh vật dị dưỡng, chỉ một số ít vi sinh vật là vi sinh vật tự dưỡng Quan hệ sinh thái được biểu diễn bằng sơ đồ Hình 1.1

Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật

Vai trò của vi sinh vật là khép kín vòng tuần hoàn trong hệ sinh thái, tái tạo thức ăn cho động vật, thực vật bằng cách phân huỷ để lấy lại chất dinh dưỡng cung cấp cho nhiều cơ thể dạng sống Nó đem lại hai hiệu quả:

- Tăng độ phì của đất

- Giải quyết nạn ứ đọng chất thải trong đất

Như vậy, vi sinh vật khép kín vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, P, S, K thông qua các quá trình phân huỷ các nguyên tố này trong đất

1.1.2 Sự phân bố của vi sinh vật trong đất

Trong hệ vi sinh vật đất, vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn chiếm khoảng 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo và nguyên sinh động vật Tỉ lệ này thay đổi tuỳ theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý, tầng đất, thời vụ, chế độ canh tác Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt

độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành phần Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu, màu mỡ

Chất vô cơ Chất hữu cơ Chất hữu cơ

Ánh sáng

SV sản xuất

SV tiêu thụ

SV phân huỷ

Sự phân bố của vi sinh vật trong đất có thể chia ra như sau:

• Phân bố theo chiều sâu

Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp nhất Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi sinh vật

Riêng đối với các đất bạc màu, do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20 cm ít chất hữu cơ hơn tầng 20 - 40 cm nên ở tầng này số lượng vi sinh vật nhiều hơn ở tầng trên, sau đó giảm dần ở các tầng dưới

Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn hiếu khí, vi nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này có nhiều oxy Càng xuống sâu, các nhóm vi sinh vật hiếu khí càng giảm mạnh Ngược lại, các nhóm vi khuẩn

kỵ khí như vi khuẩn phản nitrate hoá phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40 cm Ở vùng khí hậu nhiêt đới nóng ẩm thường có quá trình rửa trôi, xói mòn nên tầng 0 - 20 cm

dễ biến động, tầng 20 - 40 cm ổn định hơn

• Phân bố theo các loại đất

Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH khác nhau dẫn đến sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau Ở đất lúa nước, tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất dinh dưỡng, Chỉ có một lớp mỏng ở trên khoảng 0 - 3 cm là có quá trình oxy hoá, ở tầng đất dưới quá trình khử oxy hoá chiếm ưu thế Do đó trong đất lúa nước các loại

vi sinh vật kỵ khí phát triển mạnh Ví dụ như vi khuẩn amon hoá, vi khuẩn phản nitrate hoá Ngược lại, các loại vi sinh vật hiếu khí như vi khuẩn nitrate hoá, vi khuẩn cố định nitrogen, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít Tỷ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí

và yếm khí luôn nhỏ hơn 1

Ở đất trồng hoa màu, không khí lưu thông tốt, quá trình oxy hoá chiếm ưu thế, bởi vậy các loài vi sinh vật hiếu khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển yếu Tỷ lệ gữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường hợp

đạt tới 4 – 5 Ở đất giàu dinh dưỡng như đất phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật tổng số rất cao Ngược lại, vùng đất bạc màu Hà Bắc có số lượng vi sinh vật rất ít

• Phân bố theo cây trồng

Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh hơn so với vùng không có rễ do rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu

cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnh hơn vùng ngoài rễ

Tuy nhiên, mỗi loại cây trồng trong quá trình sống của nó thường tiết qua bộ

rễ những chất khác nhau Bộ rễ khi chết đi cũng có thành phần khác nhau Thành phần và số lượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng

vi khuẩn cố định nitrogen cộng sinh còn ở vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitrogen tự do hoặc hội sinh Số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng Đất vùng phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúa chồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúa sinh trưởng mạnh Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ

rễ càng lớn – đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ Số lượng vi sinh vật đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín Thành phần vi sinh vật cũng biến động theo các giai đoạn phát triển của cây, phù hợp với hàm lượng các chất tiết qua bộ rễ

1.1.3 Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất

Theo nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố, hệ vi sinh vật trong đất rất phong phú với rất nhiều nhóm gồm: vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn, virus, tảo và nguyên sinh động vật (protozoa) (Lê Quốc Tuấn, 2009)

1.1.3.1 Vi khuẩn

Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước hiển vi, có cấu trúc tế bào đơn giản gồm màng tế bào, tế bào chất và nhân (không có màng nhân) (prokaryote) Kích thước của vi khuẩn từ 0,1- 1,2 x 0,2- 6,0 µm Peptidoglycan là chất đặc biệt ở vách tế bào prokaryote, dựa vào khả năng bắt màu của crystal violet

vi khuẩn được phân biệt hai loại là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm Một

số vi khuẩn di chuyển bằng tiên mao Vi khuẩn sinh sản bằng con đường vô tính Hình thái vi khuẩn rất đa dạng, có thể chia thành 3 nhóm hình dạng chính: hình cầu, hình que và hình xoắn (Hình 1.1)

Hình 1.2 Hình thái một số nhóm vi khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998)

Staphylococcus aureus (a); Bacillus subtilis (b); Spirillum (c)

Các nhóm vi khuẩn rất đa dạng và giữ những vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá vật chất để khép kín vòng tuần hoàn các chất trong đất và trong tự nhiên Vi khuẩn tham gia hình thành và cải tạo đất trồng trọt, phân huỷ, chuyển hoá hợp chất khó tan trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng Một số vi khuẩn có khả năng đồng hoá nitơ trong không khí để làm giàu nitơ cho đất và cung cấp nitơ cho cây trồng Ngoài ra, vi khuẩn còn có khả năng tiết ra các enzyme, các chất kích thích sinh trưởng, các acid hữu cơ trong đất

Một số vi khuẩn quan trọng thường gặp trong đất: Bacillus subtilis,

Chostridium, Lactobacillus, Rhizobium,

1.1.3.2 Vi nấm

Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi Vi nấm khác với vi khuẩn và xạ khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, vì vậy chúng được xếp vào nhóm Eukaryote Vi nấm gồm 2 nhóm lớn là nấm men (yeast) và nấm sợi (filamentous fungi) Trong đó, nấm men có cấu trúc đơn bào còn nấm sợi có cấu trúc đa bào

Nấm men (yeast) có khả năng sinh sản bằng vô tính theo hình thức nẩy chồi,

một vài loài sinh bào tử và cũng có thể sinh sản hữu tính như chi Saccharomyces

Nấm sợi có quá trình sinh sản phức tạp hơn nấm men Sinh sản vô tính có nhiều

a)

cách: bào tử trần, bào tử kín Sinh sản hữu tính của nấm sợi cũng có vài hình thức khác nhau

Thường gặp là các chi Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Chaetomium,

Alternaria, Rhizoctonia, Verticillium, Có vai trò quan trọng trong quá trình mùn

hoá và phân giải xác hữu cơ cho đất (phân giải cellulose, tinh bột, nhựa, lignin, )

1.1.3.3 Xạ khuẩn

Xạ khuẩn là những vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm prokaryote, hình sợi, phân bố rộng rãi trong đất, trong nước và trong các cơ chất hữu cơ Kích thước của

xạ khuẩn nằm trong khoảng 0,2 – 0,5 x 0,4 – 100 µm

Hình 1.3 Hình thái của xạ khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998)

Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu của đất Tham gia vào các quá trình chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất

hữu cơ phức tạp (cellulose, mùn, kitin, lignin, ) Hầu hết các xạ khuẩn thuộc giống

Actinomyces có khả năng hình thành chất kháng sinh Đây là đặc điểm quan trọng

nhất của xạ khuẩn

Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic và nhiều acid amin như acid glutamic, tryptophan,

Một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme như: protease, amylase, chitinase, cellulase Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số

xạ khuẩn lại sinh ra các chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật Một số khác lại là nguyên nhân gây ra một số bệnh khó chữa ở người và gia súc Các bệnh này

gọi chung là Actynomycose

Một số giống xạ khuẩn quan trọng trong đất: Actinomyces, Bacterionema,

Pseudonocardia, Streptomyces

1.1.3.4 Tảo

Tảo là sinh vật tự dưỡng không bắt buộc (nhờ quá trình quang hợp), phát triển mạnh ở lớp đất mặt Tảo có tác dụng làm tăng khả năng hoà tan của khoáng vật đặc biệt là carbonate, làm tăng tốc độ phong hoá, cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ cho đất Một số tảo lục, lam có khả năng cố định nitơ tự do Bên cạnh đó tảo còn giúp hạn chế xói mòn đất do gió

1.1.3.5 Nguyên sinh động vật (protozoa)

Nguyên sinh động vật có kích thước hiển vi, cấu tạo và hoạt động của tế bào nguyên sinh động vật giống tế bào của sinh vật đa bào Nhưng chính tế bào này là tế bào biệt hoá đa năng, đảm nhận mọi chức năng sống của một cơ thể độc lập

Nguyên sinh động vật có vai trò quan trọng ở mức sản xuất sơ cấp và phân huỷ, chúng có thể làm nguồn thức ăn chủ yếu cho nhiều loài không xương sống và gián tiếp cho nhiều loài động vật có xương sống

Một số nguyên sinh động vật thường gặp là: trùng chân giả (Amoeba), trùng roi (Flagellata),

1.2 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật

1.2.1 Khái niệm enzyme ngoại bào

Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Các quá trình dị hóa bên ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn Vì các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật là các hợp chất cao phân tử nên vi sinh vật không thể vận chuyển qua màng tế bào, cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng thuỷ phân các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có trọng lượng thấp hơn để vi sinh vật có thể vận chuyển qua màng tế bào Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng bên ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật

1.2.2 Phân loại enzyme ngoại bào

Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm

phụ:

- Nhóm 1: Oxidoreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử

- Nhóm 2: Transferase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

- Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia)

- Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi

- Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

- Nhóm 6: Ligase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác

Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase

Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O R1OH + R2H

Tinh bột + H2O Dextrin + Maltose + Glucose

Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và lipase…

- Vì có bản chất là protein nên enzyme cũng có tính lưỡng tính (do có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử) Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau:

Protein - COOH Protein - COO- + H+

khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis có thể chịu

được nhiệt độ 110oC Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt

α-amylase

Kiềm Acid Acid Kiềm

còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và

pH kiềm Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi

khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid 2,1…

- Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+

- Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo quy luật cảm ứng cơ chất Khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không có

cơ chất để phân hủy cơ chất đó Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này gọi là enzyme cảm ứng Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi

là cơ chất cảm ứng Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng tăng dần Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu cơ chất gây ra

- Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau

- Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng lượng rất lớn Ví dụ: Trong quá trình thủy phân saccharose thành fructose và glucose:

+ Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân tử gam + Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam

Phương trình phản ứng: Saccharose Fructose + Glucose + Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân

tử gam

Phương trình phản ứng: Saccharose Fructose + Glucose

- Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng Gen quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một

số phản ứng sinh hóa

- Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme

- Enzyme vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, môi trường lên men rẻ tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm enzyme của động vật và thực vật Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động vật hay thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ như từ malt

có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu

đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ vi sinh vật thì ngược lại;

từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn Nuôi cấy vi sinh

Saccharase Acid

vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất

1.2.4 Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật

Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp

1.2.4.1 Enzyme amylase

a) Đặc điểm

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

- Exoamylase: gồm có β-Amylase (EC 3.2.1.2) và Amyloglucosidase (glucoamylase hay 𝛾-Amylase) (EC 3.2.1.3) Đây là những enzyme thuỷ phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

c) Cấu trúc

Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần, trung tâm hoạt động thường là những nhóm chức như: -NH2, -COOH, -SH

α-Amylase (EC 3.2.1.1) β-Amylase (EC 3.2.1.2)

oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Amyloglucosidase (EC 3.2.1.3)

amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.20) Hình 1.4 Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase

d) Cơ chế tác dụng

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thuỷ phân do các liên kết glucoside bị phân cắt Sự thuỷ phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức

độ: dịch hoá và đường hoá Kết quả của sự dịch hoá là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hoá thì sản phẩm là maltose và glucose

- α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả Thông thường α-amylase chỉ thuỷ phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose

- β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng

- R-enzyme còn gọi là α-1,6-glucosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại điểm xuất phát mạch nhánh

- Ngoài ra enzyme amyloglucosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đường đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate

e) Một số vi sinh vật sinh enzyme amylase hiện diện trong đất

Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Bacillus megaterium là một trong số

những sinh vật hiện diện trong đất có khả năng sinh enzyme amylase cao (Verma và ctv, 2011)

1.2.4.2 Enzyme protease

a) Đặc điểm

Nhóm enzyme protease (peptide – hydrolase, EC 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid

Hình 1.5 Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein

Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển acid amin

b) Phân loại

Protease được chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại:

- Aminopeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tripeptide

- Carboxypeptide: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm:

- Serine protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

- Cysteine protease: là những protease có chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động Các cysteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

- Aspartic protease: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở vùng pH trung tính

- Metalloprotease: là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

c) Cấu trúc

Trung tâm hoạt động của protease vi sinh vật ngoài gốc amin acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc amino acid khác

- Serine protease: chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme

- Cysteine protease: chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động

- Aspartic protease: chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động

Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật bao gồm một số gốc amino acid và trong một số trường hợp còn có cả cofactor kim loại

Đối với các protease không chứa cystein, trung tâm hoạt động của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu nối disulphide

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của enzyme protease

E – S*: phức chất trung gian enzyme - cơ chất hóa (axilenzyme)

P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amino tự do mới được tạo thành)

P2: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do được tạo thành)

e) Các vi sinh vật sản sinh enzyme protease hiện diện trong đất

Trong số các vi sinh vật hiện diện trong đất, Bacillus sp là một trong những

nhóm vi khuẩn điển hình sản sinh ra enzyme protease ngoại bào Theo kết quả nghiên cứu của Sethi và ctv (2012), vi khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh

enzyme protease là Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilus, E Coli và

Serratia marscens Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của các vi

sinh vật hiện diện trong đất của Nadrendra và ctv (2012) cũng cho thấy rằng đó

Cơ chất của enzyme cellulase là cellulose

còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hoá, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể Trong quá trình phân huỷ cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosyl hoá có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme

Hình 1.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase

d) Cơ chế tác dụng

Sự thuỷ phân cellulose nhờ hệ enzyme cellulase gồm 4 enzyme, gồm:

- Cellobiose dehydrolase: cắt các liên kết hydro biến cellulose có cấu trúc không gian thành cellulose vô định hình

- Endoglucanase: cắt các liên kết β - 1, 4 - glucoside tạo thành các chuỗi dài

- Exoglucanase: Cắt các chuỗi thành cellobiose

- β – glucosidase: thuỷ phân cellobiose thành glucose

e) Vi sinh vật sản sinh enzyme cellulase hiện diện trong đất

Theo kết quả nghiên cứu của Sethi và ctv (2012), vi khuẩn được phân lập từ

đất và có khả năng sinh enzyme cellulase là Pseudomonas fluorescens, Bacillus

subtilis, E Coli và Serratia marescens Nghiên cứu của Pandey và ctv (2005) cho

thấy nhiều loài nấm cũng có khả năng sinh enzyme cellulase cao, điển hình là

Trichoderma reesei, Humicola, Penicillium, Aspergillus

1.2.4.4 Enzyme lipase

a) Đặc điểm

Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glyceryl

và acid béo tương ứng

Lipase tan trong nước và các dung môi phân cực khác, không tan trong ete

và các dung môi không phân cực

Lipase rất cần thiết cho việc tiêu hoá, vận chuyển và xử lý các chất béo như triglyceride, dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống

b) Phân loại

Theo nguồn gốc, enzyme lipase được chia làm 3 loại:

- Lipase từ động vật: thu nhận thường khó và hiệu quả kinh tế không cao

Hình 1.8 Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa

Nhóm quan trọng nhất tạo thành trung tâm hoạt động của lipase là bộ ba aspartic, histidine và serine Lipase tham gia vào vị trí xúc tác với proteinase và esterase Đối lập với proteinase, trung tâm xúc tác của nó không phân bố ở bề mặt ngoài mà nằm dưới chuỗi xoắn bề mặt Vị trí hoạt động của mọi lipase đều có Ser, His và Asp (hoặc Glu) và hoàn toàn bị che khuất bởi một đoạn nắp cấu tạo bởi một hoặc hai chuỗi xoắn Bề mặt mang Trypsin hoàn toàn không phân cực và tác động qua lại với đầu kỵ nước bao quanh trung tâm hoạt động Trong hầu hết cấu trúc lipase, đầu serine hoạt động trong chuỗi pentapeptide có trình tự Gly-X1-Ser-X2-Gly cấu trúc đó cũng được tìm thấy ở protease serine (Boel và ctv, 1998)

d) Cơ chế động học xúc tác của lipase

Lipase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glyceryl và acid béo tương ứng Chúng xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng liên kết chứ không cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng một lúc Quá trình xúc tác của lipase thường chậm hơn so với quá trình xúc tác của các enzyme khác như protease hay amylase

Với các cơ chất không tan trong nước, hoạt tính của lipase đạt cực đại chỉ khi

nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu nước Quá trình đó được gọi là quá trình hoạt hoá phân pha

Hình 1.9 Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong

nước Sự thay đổi hình thể của lipase trong quá trình hoạt động xúc tác Mô hình

này do Verger đề xuất (1980) Trong đó:

E: Lipase hoà tan không hoạt động

E*: Lipase hoà tan dạng hoạt động

Es*: Lipase hoạt động có hấp phụ

Eis*: Lipase không hoạt động được hấp phụ

Sw: Cơ chất tan trong nước

S: Cơ chất không tan trong nước

E*Sw và Es*S: Phức hợp lipase - cơ chất

Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phản ứng este hoá

và phản ứng este được ưu tiên Trong trường hợp này, những đặc tính như tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất (Woolley & Petersen, 1992)

e) Vi sinh vật sản sinh enzyme lipase hiện diện trong đất

Nhiều sinh vật như thực vật, nấm và vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme lipase Theo nghiên cứu của Prasad (2014) về việc cô lập enzyme lipase của các vi sinh vật hiện diện trong các mẫu đất khác nhau gần các nhà máy sản xuất dầu giàu

hàm lượng lipid đã xác định được đó chính là Pseudomonas aeruginosa Kết quả nghiên cứu của Veerapagu và ctv (2013) cũng cho thấy rằng Pseudomonas

gessardii được phân lập từ đất ở những vùng bị tràn dầu từ các nhà máy chế biến

dầu thực vật là vi khuẩn lý tưởng cho việc sản sinh enzyme lipase ngoại bào ở mức

độ công nghiệp

1.3 Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay

Tất cả các sinh vật trong sinh quyển đều phụ thuộc vào hoạt động của vi sinh vật (Pace, 1997) Vi sinh vật hiện diện trong đất đóng vai trò quan trọng trong các chu trình chuyển hóa chất dinh dưỡng và trong hệ sinh thái trên mặt đất Do đó vi sinh vật đất đã sớm được các nhà khoa học chú ý nghiên cứu Điều quan trọng để nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật không chỉ để nghiên cứu khoa học cơ bản, mà còn

để hiểu mối liên hệ giữa sự đa dạng, cấu trúc và chức năng của quần thể vi sinh vật cũng như sự tiến hoá của chúng Những tác động của con người như sự ô nhiễm, hoạt động nông nghiệp và việc sử dụng hoá chất có thể ảnh hưởng bất lợi đến sự đa dạng vi sinh vật, ảnh hưởng đến hệ sinh thái trên và dưới mặt đất Theo nghiên cứu của Buckley và Schmidt (2001) đã tìm thấy một lượng 16S rRNA cao ở tất cả các nhóm vi sinh vật trong các cánh đồng chưa được canh tác so với các cánh đồng đã được canh tác Điều này cho thấy hoạt động canh tác của con người có tác động đến

vi sinh vật hiện diện trong đất

Trevors và ctv (2003) đã ước tính trong 1 g đất có 4000 đơn vị gen vi khuẩn khác nhau dựa trên DNA-DNA ghép đôi Ước tính có khoảng 5000 loài vi khuẩn đã được mô tả Khoảng 1 % quần thể vi khuẩn đất có thể được nuôi cấy invitro nhưng không thể biết được 1 % quần thể vi khuẩn này có là đại diện của quần thể vi khuẩn hay không Ước tính có khoảng 1,500,000 loài nấm tồn tại trong thế giới (Giller và ctv, 1997) Không giống như vi khuẩn, nhiều loại nấm không thể được nuôi cấy invitro Mặc dù phương pháp phân tử đã được sử dụng để nghiên cứu các cộng đồng

vi khuẩn đất nhưng rất ít nghiên cứu về nấm đất được thực hiện (Van Elsas và ctv, 2000)

Dựa vào kết quả của các nghiên cứu đã đạt được, các chuyên gia sẽ đưa ra các biện pháp khai thác đầy đủ theo hướng có lợi các loài sinh vật hữu ích và ngăn chặn những tác hại của các loài sinh vật có hại nhằm nâng cao độ phì của đất, tăng năng suất và chất lượng nông phẩm của các loại cây trồng

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp HCM

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ 02/2014 đến 07/2014

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Nguồn mẫu phân lập

Nguồn mẫu phân lập được thu tại vùng đất canh tác của ông Nguyễn Văn Hoàng gồm có đất trồng lúa và đất trồng hoa màu tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh

Bảng 2.1 Danh sách mẫu phân lập

Nguồn phân lập Địa điểm thu mẫu

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 19 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế công cộng (V), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Tp Hồ Chí Minh (K) và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm:

- Nhóm vi khuẩn Salmonella: S enteritidis, S typhii (K), S.ntyphii (V), S

typhimurium, S dublin

- Nhóm vi khuẩn E Coli: E Coli (K), E Coli (V), TEC, EC 02 08

- Nhóm vi khuẩn Shigella: Shi sonnei, Shi boydii, Shi flexneri

- Nhóm vi khuẩn Vibrio: V parahaemolyticus, V alginolyticus, V harveyi

- Các vi khuẩn: L monocytogenes, L innocua, E feacalis, S aureus

2.2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy và phân lập

- Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ)

- Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ)

- Bông thấm và bông không thấm nước

- Đũa thuỷ tinh

- Các loại đầu típ

- Micropipette 100 µl, 1000 µl

- Các loại dụng cụ khác như: bao chịu nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng, dao, thun,

b) Thiết bị

- Autoclave (Huxky Đài Loan)

- Tủ ấm 300C, 370C (Memmert

mermany)

- Máy ly tâm (Tuttligen Germany)

- Máy đo pH (Hach – Germany)

- Máy đo UV – VIS (Hach)

Germany)

- Bếp từ (Billy – England)

- Máy nước cất (Branstead USA)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu

Đối với đất trồng lúa: Sử dụng muỗng lấy đất ở lớp đất mặt cho vào túi nylon (khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 gam)

Đối với đất trồng hoa màu: Sử dụng muỗng gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 - 3

cm, lấy lớp đất ở dưới cho vào túi nylon (khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 gam)

Các mẫu đất được bảo quản trong túi nylon vận chuyển về phòng thí nghiệm Cân 10 gam mẫu (sai số ± 0,1) cho vào erlen có chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, khi đó sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1

2.3.2 Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu

Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết

Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1 Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2 Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng (Phạm Minh Nhựt, 2013)

Hình 2.1 Phương pháp pha loãng mẫu

2.3.3 Phương pháp tăng sinh

Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường

vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản Đây cũng là bước đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo

Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường

Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013)

2.3.4 Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật

2.3.4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật

Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa

là 3 tháng cấy chuyển một lần

Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.4.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu

Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng,

có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ

trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol

Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn Hút glycerol 40 % cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007)

2.3.5 Phương pháp định danh vi sinh vật

2.3.5.1 Phương pháp nhuộn gram

Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của lớp peptidoglycan với thuốc

nhuộm tím kết tinh và iod, vi khuẩn được phân làm hai loại là vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm

Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày bắt màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi tẩy cồn nên bắt màu tím khi nhuộm

Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng không bắt màu thuốc nhuộm nên mất màu khi tẩy cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung Vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng khi nhuộm (Prescott và ctv, 2005)

Các bước tiến hành:

- Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame

- Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong erlen chứa 10ml môi trường TSB ủ ở 300C trong 24 giờ Dùng que cấy lấy sinh khối hòa vào giọt nước

- Nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước

- Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin hoặc safranin từ 10 – 30 giây, rửa lại bằng nước cất, để khô và soi tiêu bản với vật kính dầu 100X

2.3.5.2 Phương pháp thử nghiệm catalase

Nguyên tắc: Phương pháp này nhằm xác định vi sinh vật có enzyme catalase hay không Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi chứa chuỗi chuyển điện tử có

cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp.) Enzyme catalase

có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân

tử oxy trong tế bào vi sinh vật Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2 Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.Vi sinh vật có enzyme catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2010)

Cách tiến hành:

- Dùng que cấy lấy một ít sinh khối làm vết bôi trên lame

- Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vết bôi và quan sát hiện tượng sủi bọt

Kết quả:

- Có hiện tượng sủi bọt → vi sinh vật có khả năng phân huỷ H2O2 → có enzyme catalase

- Không có hiện tượng sủi bọt → vi sinh vật không có khả năng phân huỷ

H2O2 → không có enzyme catalase

2.3.5.3 Phương pháp thử nghiệm oxidase

Nguyên tắc:

Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật Thành phần quan trọng nhất là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine Nếu có sự hiện diện của cytochrome trong

tế bào thì thuốc thử sẽ bị oxy hoá thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương

2.3.5.4 Phương pháp thử nghiệm gelatinase

Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thuỷ phân của gelatin thành polypeptide và acid amin Để nhận biết khả năng làm tan gelatin của vi sinh vật, cơ chất này được bổ sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy Sau khi cấy chủng, chủng vi sinh vật có khả năng tiết gelatinase sẽ làm môi trường tan chảy thành dạng lỏng

Tiến hành:

Môi trường sử dụng là môi trường Nutrient Gelatin được chứa trong ống nghiệm Tiến hành cấy đâm sâu một lượng sinh khối của vi khuẩn khảo sát vào trong ống môi trường Nutrient Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày Thực hiện

ủ song song một ống đối chứng không cấy vi sinh vật

Kết quả:

Trong ống thạch sâu, thử nghiệm là (+) khi môi trường ở ống có cấy vi khuẩn bị tan chảy trong khi ở ống đối chứng môi trường vẫn ở trạng thái đông đặc Thử nghiệm (-) là khi môi trường trong ống có cấy vi khuẩn vẫn ở trạng thái đông đặc giống ống đối chứng (Trần Linh Thước, 2010)

2.3.6 Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn

Nguyên tắc: Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị vi khuẩn phân huỷ sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc (Phan Thanh Phương, 2007)