Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ gluconacetobacter xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già​

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLIN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ

THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN

======

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THỤ

THUỐC NEOMYCIN SULFATE CỦA

VẬT LIỆU CELLULOSE TẠO RA TỪ

GLUCONACETOBACTER XYLINUS NUÔI CẤY TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

Người hướng dẫn khoa học

TS CAO BÁ CƯỜNG

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo Cao Bá Cường, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Sinh - KTNN cùng các thầy cô trong Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ cho em trong quá trình làm thực nghiệm

để em hoàn thành khóa luận này Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này

Do lần đầu em tham gia nghiên cứu khoa học, kiến thức còn hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và các bạn để khóa luận tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2019

Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Cao Bá Cường Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố Những trích dẫn trong khóa luận lấy từ các công

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

NỘI DUNG 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC) 3

1.1.1 Vi khuẩn tổng hợp lên VLC 3

1.1.2 Môi trường nuôi cấy G Xylinus 3

1.1.3 Cấu trúc của VLC 4

1.1.4 Tính chất của VLC 6

1.1.5 Ứng dụng của VLC 6

1.2 Tình hình nghiên cứu VLC 7

1.2.1 Trên thế giới 7

1.2.2 Tại Việt Nam 7

1.3 Tổng quan về NS 8

1.3.1 Công thức cấu tạo 8

1.3.2 Tính chất lí hóa 9

1.3.3 Dược lý học và dược động học 9

1.3.4 Chỉ định và chống chỉ định 9

1.4 Tình hình nghiên cứu về NS 10

1.4.1 Trên thế giới 10

1.4.2 Tại Việt Nam 10

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Vật liệu nghiên cứu 11

2.1.1.Chủng vi khuẩn 11

2.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 11

2.1.3 Trang thiết bị 11

2.2 Phương pháp nghiên cứu 11

2.2.1 Chuẩn bị VLC 11

2.2.2 Chế tạo VLC nạp NS 13

2.2.3 Phương pháp xử lí thống kê 15

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

3.1 Thu VLC và tinh chế màng 16

3.1.1 Thu VLC từ các môi trường lên men 16

3.1.2 Tạo VLC tinh khiết 16

3.1.3 Phương pháp đánh giá độ tinh khiết củaVLC 17

3.2 Phương trình đường chuẩn NS trong PBS (pH = 7,4) 18

3.3 Xác định lượng thuốc NS nạp vào VLC 19

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

5 PBS Phosphate buffered saline

6 S.fradiae Streptomyces fradiae

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của nước dừa già trong 100g [9] 4 Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men thu VLC 12 Bảng 2.2 Môi trường đệm PBS với pH = 7,4 13 Bảng 3.1 Mật độ quang của dung dịch Neomycin sufate ở các nồng độ

(n = 3) 18 Bảng 3.2 Giá trị OD hấp thụ thuốc NS của VLC (n = 3) 19 Bảng 3.3 Khối lượng, hiệu suất hấp thụ thuốc NS vào VLC(n=3) 20

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC 5

Hình 1.2 Cấu trúc của VLC (Yamanaka et al, 2000) 5

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Neomycin sunfate [27] 8

Hình 3.1 VLC nuôi cấy trong 8 ngày 16

Hình 3.2.VLC thô sau khi thu 16

Hình 3.3 VLC 0,5 cm đã được tinh chế 17

Hình 3.4 Thí nghiệm kiểm tra độ tinh khiết của VLC 17

Hình 3.5 Phương trình đường chuẩn của thuốc NS 18

Hình 3.6 VLC đang hấp thụ thuốc NS 19

Hình 3.7 Khối lượng thuốc NS hấp thụ vào VLC( 0,3cm) và VLC(0,5cm) trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ 21

Hình 3.8 Hiệu suất hấp thụ thuốc NS của VLC(0,3cm) và VLC(0,5cm) trong 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ 21

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ngày nay việc sử dụng các vật liệu sinh học để ứng dụng trong các lĩnh vực như: y học, mỹ phẩm, thực phẩm,…đang được các nhà nghiên cứu khoa học trong nước và trên thế giới đặc biệt quan tâm Một trong những vật liệu sinh học được các nhà khoa học đặc biệt chú ý đến đó là vật liệu cellulose (VLC)

VLC được tổng hợp bởi rất nhiều vi khuẩn, trong đó phải kể đến đó là

vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus ( G.xylinus) – loại vi khuẩn có khả năng

tạo ra VLC tốt nhất

VLC là hợp chất tương hợp sinh học, không độc hại, với cấu trúc siêu mịn, đặc tính cơ học bền, dai, khả năng giữ ẩm cao nên có rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ giấy, thực phẩm, y học, …[4]

Trong y học, VLC đã được ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng

da, mạch máu nhân tạo [4] Không chỉ vậy, VLC còn có khả năng hấp thu thuốc, tăng tác dụng của thuốc, hạn chế được tác dụng phụ của thuốc

Để tạo ra VLC, G.xylinus có thể nuôi cấy trong các môi trường như:

nước dừa già, rỉ đường, dịch ép hoa quả, …Trong đề tài này tôi chọn nước

dừa già là môi trường nuôi cấy G.xylinus vì nước dừa già chứa nhiều chất dinh dưỡng cần thiết để nuôi cấy vi khuẩn G.xylinus

Neomycin sunfate (NS) là loại thuốc kháng sinh nhóm aminoglycoside Được sử dụng để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, ức chế vi khuẩn đường ruột trước khi phẫu thuật, điều trị trong hôn mê gan, nhiễm trùng ống tai ngoài, …

NS hấp thụ qua đường tiêu hóa rất kém, khoảng 97% lượng thuốc uống vào cơ thể bị bài tiết dưới dạng không đổi qua phân Kem NS điều trị bệnh viêm da có khả năng thẩm thấu qua da không cao đạt 45%, nhanh bị khô trên

bề mặt da,…[1]

Chính vì vậy cần phải nghiên cứu hệ thống hấp thụ thuốc NS để giúp thuốc được hấp thụ một cách tốt nhất

Với mục đích tạo ra màng cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn G xylinus, để khảo sát khả năng hấp thụ thuốc NS nhằm hạn chế tác dụng phụ

của thuốc, tăng khả năng thẩm thấu thuốc qua da để thuốc hấp thụ vào cơ thể tốt nhất, rút ngắn thời gian điều trị bệnh

Đó là lí do mà tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thụ thuốc

Neomycin sulfate của vật liệu cellulose tạo ra từ Gluconacetobacter

xylinus nuôi cấy trong môi trường nước dừa già”

2 Mục đích nghiên cứu

Tạo VLC từ môi trường nước dừa già để hấp thụ thuốc NS, nhằm tăng khả năng hấp thụ thuốc vào VLC tối đa, từ đó khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường khi điều trị bệnh viêm da

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Khả năng hấp thụ thuốc NS của VLC tạo ra từ

G xylinus lên men từ môi trường nước dừa già

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

4.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về vật liệu cellulose (VLC)

Cellulose là một hợp chất hóa học, là thành phần chính của sinh khối thực vật Cellulose ngoài được tổng hợp từ thực vật nó còn được tổng hợp từ

thuộc họ vi khuẩn Acetobacteraceae

G Xylinus là vi khuẩn gram âm, thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc

có khả năng tổng hợp sinh màng cellulose trong môi trường nuôi cấy tĩnh Chúng có dạng trực khuẩn, hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng

2 µm Tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi, có thể di động hoặc không

và không sinh bào tử

G xylinus có khuẩn lạc nhỏ, tròn, bề mặt nhầy, trơn bóng, phần giữa

khuẩn lạc lồi lên, dày hơn, sẫm màu hơn các phần chung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.Trong môi trường lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy xuất hiện một lớp đục mỏng trên bề mặt dưới có những sợi tơ Sau 36 – 48 giờ, lớp màng đó dày dần lên, không còn đục như trước mà trong hơn [9]

1.1.2 Môi trường nuôi cấy G Xylinus

Môi trường nuôi cấy G xylinus là môi trường có bổ sung các chất dinh

dưỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh trưởng và phát triển như nguồn cacbon, nito, nguồn sulfur và phosphor, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng

Để tạo VLC G xylinum có nhu cầu sử dụng đường rất lớn chính vì vậy rất

nhiều nhà khoa học đã sử dụng rỉ đường, nước dừa già, nước mía, làm

nguyên liệu nuôi cấy G xylinum

Ở đề tài này, tôi chọn nước dừa già là nguyên liệu nuôi cấy G.xylinus

để tạo VLC bởi:

- Nước dừa già không khó tìm, có thể mua tại các cơ sở sản xuất mứt dừa, dừa sấy hay cơ sở sản xuất dầu dừa tại các nhà máy sản xuất dầu dừa với giá thành rẻ

- Trong nước dừa chứa rất nhiều chất dinh dưỡng được trình bày ở bảng 1.1, chất kích thích tăng trưởng như 1,3 – diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol,… Đó là môi trường dinh dưỡng thích

hợp để cho G.xylinus sinh trưởng và phát triển để tổng hợp VLC

Bảng 1.1: Giá trị dinh dưỡng của nước dừa già trong 100g [9]

Nước 94,99% Zn 0,1 mg Protein 0,72% Cu 0,04 mg

Chất béo toàn phần 0,2% Mangan 0,142 mg Carbonhydrat 3,17% Selenium 1 µg

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học cơ bản của VLC

VLC có cấu trúc hóa học cơ bản giống cellulose của thực vật, nhưng lại khác nhau về cấu trúc đại thể [14],[16]

Theo AJ Brown (1886) [18], VLC gồm nhiều sợi thứ cấp có bản chất là hemicellulose, bề rộng 1,5 nm Các sợi thứ cấp này kết hợp với nhau tạo thành vi sợi có kích thước lớn hơn Các vi sợi này lại kết hợp với nhau thành

bó Nhiều bó hợp thành dải, mỗi dải có chiều dày 3-4nm, chiều dài khoảng 130- 177nm

Hình 1.2 Cấu trúc của VLC (Yamanaka et al, 2000)

Đặc tính cấu trúc của VLC phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy:

Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh (S - BC: Static - Cellulose vi

khuẩn), trong môi trường lỏng G.xylinus tổng hợp tạo thành lớp màng dày

trên bề mặt môi trường VLC thu được dẻo dai, dày, độ tinh sạch, độ bền cơ

học cao, khả năng chịu nhiệt tốt, có thể bị phân hủy sinh học, không độc hại, không gây dị ứng, đặc biệt là khả năng cản khuẩn [4]

Khi nuôi cấy động (A - BC: Agitated - Cellulose vi khuẩn), cellulose hình thành thành dưới dạng huyền phù với kích thước không đều nhau phân tán trong môi trường dinh dưỡng VLC được hình thành trong nuôi cấy động

có hình thái đặc điểm khác hẳn so với VLC được nuôi cấy theo phương pháp tĩnh

1.1.5 Ứng dụng của VLC

Với các tính chất độc đáo của VLC, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng VLC vào các mục đích sử dụng khác nhau trong các lĩnh vực như: y học, mỹ phẩm, thực phẩm, công nghiệp giấy, … [2], [4], [10], [12]

Thực phẩm: Thạch dừa, thuốc rượu Kombucha, màng bao xúc xích, màng bảo quản dừa tươi, thịt tươi

Y tế: VLC được sử dụng để chữa lành các vết thương cho da bị tổn thương nghiêm trọng, màng bao sụn, ống dẫn niệu, vỏ bọc viên nang, tác

nhân vận chuyển thuốc,…

Mỹ phẩm: Làm chất ổn định trong kem dưỡng da, gel vuốt tóc, làm mặt

1.2 Tình hình nghiên cứu VLC

1.2.1 Trên thế giới

Với tính chất vô cùng độc đáo của VLC, VLC được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm tới việc nghiên cứu ứng dụng của nó vào trong nhiều lĩnh vực Trong đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu ứng dụng của VLC làm vật liệu hấp thụ thuốc qua da

Fontana và cộng sự (1990) [22] đã chỉ ra VLC có khả năng băng kín vết thương, duy trì dịch tiết, làm giảm đau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào, làm giảm tỷ lệ nhiễm trùng vết thương, giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiểm tra

Czaja và cộng sự (2007) [21] sử dụng VLC đắp lên vết bỏng đã thu được kết quả tốt

1.2.2 Tại Việt Nam

Ngày nay, việc nghiên cứu ứng dụng VLC ngày càng được các nhà khoa học chú trọng Một số sản phẩm từ VLC đã được thương mại hóa trên thị trường như: thạch dừa, màng trị bỏng Acetul, mặt lạ dưỡng da, màng bao xúc xích,

Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2006) [9] đã tiến hành thử nghiệm in vivo ứng dụng VLC để điều trị bỏng với hai loại Một loại VLC cho thêm

hoạt chất tái sinh mô và một loại cho thêm hoạt chất kháng khuẩn Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn dạng màng thông thường

Nhóm tác giả Nguyễn Thị Kim Ngoan, Đinh Thị Kim Nhung nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm chế tạo VLC làm mặt nạ dưỡng da

Tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs (2012) [4], [5] đã nghiên cứu và chế tạo thành công chế phẩm VLC trị bỏng có tẩm dung dịch berberin clorid 0,1% có tác dụng kháng khuẩn và tái sinh mô tốt, không gây đau

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy VLC có khả năng hấp thụ một

số loại thuốc rất tốt Đây cũng là một hướng đi khả quan trong việc nghiên cứu phát triển ứng dụng VLC trong việc hấp thụ thuốc NS

1.3 Tổng quan về NS

NS là dạng chế phẩm của neomycin, kháng sinh nhóm aminoglycoid được sản xuất bằng cách nuôi cấy một số chủng S.fradiae [2] Neomycin ở dạng thường có tỉ lệ gây dị ứng cao hơn neomycin dạng chế phẩm Trong những dạng chế phẩm của neomycin thì dạng muối sulfate là dạng dễ hấp thụ nhất và ít gây dị ứng cho người dùng Bởi vậy, tôi chọn NS để nghiên cứu trong đề tài này

1.3.1 Công thức cấu tạo

- Công thức phân tử: C23H46N6O13.3( H2SO4)

- Phân tử khối : 908.866 g/mol

- Công thức cấu tạo thuốc neomycin sunfate thể hiện ở hình:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Neomycin sunfate [27]

1.3.2 Tính chất lí hóa

NS có dạng bột tinh thể màu trắng đến hơi vàng Rất dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [2] Quang phổ hấp thụ ở bước sóng 277 nm Định tính NS trong các chế phẩm (thuốc tiêm, thuốc mỡ, viên nén, dung dịch nhỏ mắt, )

1.3.3 Dược lý học và dược động học

NS là kháng sinh nhóm aminoglycoside có cơ chế và phổ tác dụng tương tự gentamicin sulfat Khi phối hợp với bacitracin, thuốc có tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các nhiễm khuẩn

ngoài da Những vi khuẩn nhạy cảm với NS như: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Heamophilus influ- enzae, Klebsiella, Enterobacter, Neisseria

NS được hấp thu kém qua đường tiêu hóa, khoảng 97% lượng thuốc uống vào cơ thể được bài tiết dưới dạng không đổi qua phân Khi được hấp thu, thuốc sẽ thải trừ nhanh qua thận dưới dạng hoạt tính Điều này gây hại cho thận

1.3.4 Chỉ định và chống chỉ định

NS được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt

do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1]

NS không được dùng trong đường tiêm hoặc toàn thân vì độc tính của thuốc Không dùng NS tại chỗ lâu với liều lượng cao vì có thể gây mẫn cảm trên da và dễ mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid khác [15]

Bên cạnh đó thì NS có những tác dụng phụ như: mụn, làm khô da, nhiễm trùng da, không có khả năng cản khuẩn NS có khả năng thẩm thấu qua da không cao đạt 45%, nhanh bị khô bề mặt trên da,…[1] Để khắc phục được tác dụng phụ của thuốc cần phải sử dụng một loại vật liệu có khả năng giữ ẩm, cản khuẩn Chính vì vậy mà tôi chọn VLC nạp NS để hạn chế tác dụng phụ của thuốc