Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng meloidogyne spp của các chủng nấm purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở vũng tàu​

Một trong những giải pháp hữu hiệu góp phần đảm bảo an toàn cho cây trồng cũng như người sử dụng, đáp ứng yêu cầu giữ được chứng minh có khả năng kí sinh khối trứng và con cái của tuyến

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HỆ ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KHẢ

NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp CỦA CÁC CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum

PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở VŨNG TÀU

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ MAI CHÂM

TP Hồ Chí Minh, 2015

yêu cầu trong công việc để hình thành hướng nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc

rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong đồ án được thu hoạch trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa được từng được ai công bố trước đây

Tp.HCM, ngày tháng năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Trinh

ngọt đều do bàn tay con người vun xới Để có thể đạt được những kết quả như ngày hôm nay, em biết ơn vô cùng và xin được tỏ lòng biết ơn bằng những lời cầu chúc tốt đẹp và lời cảm ơn sâu sắc nhất đến:

Xin được gửi đến BGH Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cùng toàn thể quý thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền dạy cho em những kiến thức cùng những bài học kinh nghiệm vô cùng quý giá

Xin gửi đến Ban Giám Đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh nói chung và các anh chị trong Phòng Công nghệ vi sinh nói riêng Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị vật chất cũng như những sự quan tâm giúp

đỡ, giúp em hoàn thành tốt bài luận này

Không thể không nhớ bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Th.s Lê Thị Mai Châm và kỹ sư Nguyễn Thùy Dương, những người đã tận tình hướng dẫn trong quá trình tiến hành cũng như từng bước giúp em hoàn thiện hơn bản thân và những bài học kinh nghiệm quan trọng trong bước đường tương lai Nhờ sự động viên dìu dắt của thạc sĩ đã tạo động lực cho em trong suốt quá trình thực hiện

Cuối cùng, xin được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ và tạo những điều kiện tốt nhất Chính những kết quả này sẽ luôn là trang bài học quý giá với em trong suốt quãng đường phía trước

Tp.HCM ngày … tháng… năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc Trinh

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về đặc điểm rễ cây hồ tiêu 3

1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật 4

Phân loại 4

Hình thức ký sinh trên thực vật 5

1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp 5

Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp 5

Vòng đời của tuyến trùng M incognita 6

Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp 6

Đặc điểm gây hại 8

Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp 9

1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum 9

1.3.1 Hệ thống phân loại 9

1.3.2 Phân bố 10

1.3.3 Đặc điểm hình thái 11

Hình thái đại thể 11

Hình thái vi thể 11

1.3.4 Đặc điểm sinh hóa 12

Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào 12

Enzyme protease 12

Chitinase 14

1.3.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng của P liacinum 15

Nhiệt độ 15

pH 16

17

Cơ chế của quá trình xâm nhập và kí sinh tuyến trùng 18

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 19

2.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm 19

Vật liệu 19

Dụng cụ 19

Thiết bị 19

Các môi trường và thuốc thử sử dụng 20

2.4 Nội dung nghiên cứu 23

2.5 Phương pháp nghiên cứu 23

2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P lilacinum - Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch 23

2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp của nấm P lilacinum 24

2.5.3 Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P lilacinum 27

3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm P lilacinum 27

3.1.2 Kết quả định tính hệ enzym ngoại bào chitinase của các chủng nấm P lilacinum 32

3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm P lilacinum trên tuyến trùng Meloidogyne spp 38

3.2.1 Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của nấm P lilacinum trên con cái Meloidogyne spp 38

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ LỤC 1

BVTV : Bảo vệ thực vật

Bảng 3.3 Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme protease theo thời gian của các

chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau 31

Bảng 3.4 Vòng phân giải chitin của các chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất

vùng rễ tiêu khỏe mạnh 33

Bảng 3.5 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P lilacinum phân

lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh 35

Bảng 3.6 Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian của các

chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau 37

Bảng 3.7 Tỷ lệ ký sinh của nấm P lilacinum trên con cái Meloidogyne spp theo

thời gian 38

Bảng 3.8 Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh con cái Meloidogyne spp của các

chủng nấm P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian 40

Bảng 3.9 Tỷ lệ ký sinh của nấm P lilacinum trên khối trứng Meloidogyne spp

theo thời gian 41

Bảng 3.10 Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp của các

chủng P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian 44

P lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian 31

Biểu đồ 3.2 Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P lilacinum

phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian 36

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp trung bình của nấm

P lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian 40

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp trung bình của nấm

P lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian 43

Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp 8 Hình 1.2 Khuẩn lạc P lilacinum trên môi trường PDA sau 15 ngày nuôi cấy ở 250C 11

Hình1.3 Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm 12 Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ

vùng rễ tiêu khỏe Nhóm 1(A), nhóm 2 (B), nhóm 3 (C), nhóm 4 (D) 28

Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ

đất vùng rễ tiêu bệnh Chủng nấm nhóm 2 (A), nhóm 3 (B) và nhóm 4 (C) 30

Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin sau 72h của các chủng nấm phân lập từ

đất vùng rễ tiêu khỏe Chủng nấm nhóm 1 (A) và nhóm 2 (B) 34

Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) và

72h (B) 36

Hình 3.5 Con cái Meloidogyne spp bị nấm P lilacinum ký sinh khi chụp dưới kính

soi nổi ở độ phóng đại 4X Con cái chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập và

ký sinh con cái (B) và con cái bị nấm ký sinh hoàn toàn (C) 39

Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne spp bị nấm ký sinh Khối trứng bắt đầu bị nấm

tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau 9 ngày (B), khối trứng bị nấm ký sinh sau 14 ngày (C) 42

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Theo báo cáo thống kê 6 tháng đầu năm của Bộ NN- PTNT Việt Nam năm

2014 sản lượng tiêu xuất khẩu đạt 111.000 tấn tăng 36% về lượng và 48% giá trị

Có thể nói, cây hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực đẩy mạnh phát triển kinh tế các địa phương, góp phần ổn định đời sống kinh tế của đất nước Cây hồ tiêu được phát triển với quy mô và tốc độ khá lớn tại các tỉnh miền Trung và Khu vực Đông Nam Bộ Đặc biệt là Bà Rịa- Vũng Tàu, theo thống kê của Sở NN- PTNT năm 2013, BR-VT đứng thứ 4 cả nước về diện tích trồng tiêu với tổng diện tích trồng gần 8.000ha đạt sản lượng hơn 12000 tấn, đứng thứ 4 cả nước (Hiệp hội

hồ tiêu Việt Nam) Tuy nhiên, việc sản xuất hồ tiêu trong những năm qua bị tổn thất đáng kể do cây thường bị bệnh với những dấu hiệu như: rễ có nhiều nốt sưng, lá vàng, cây khô chết dần mà một trong những nguyên nhân là do tuyến trùng sần rễ

Meloidogyne spp (Phạm Văn Biên, 1989 và Nguyễn Ngọc Châu, 1990) Đây được

coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất trong nông nghiệp Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp và ký sinh trên hầu hết các loại cây trồng ở các vùng khí hậu khác nhau Hiện nay, khoảng hơn 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó

có 4 loài ký sinh gây hại phổ biến là: M incognita, M arenaria, M javanica và M

hapla (Vũ Triệu Mân, 2007)

Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng thuốc hóa học nhưng vẫn chưa tiêu diệt triệt để Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc cũng đem lại những lo ngại: tồn dư thuốc trong nông sản, làm mất cân bằng hệ vi sinh vật, ảnh hưởng đến môi trường sinh thái, hiện tượng kháng thuốc gây phát sinh những dịch bệnh khác nghiêm trọng hơn…Còn rất nhiều những mối nguy hại không thể kể hết Trong khi đó, việc áp dụng các tiến bộ trong công nghệ sinh học cũng như ứng dụng công nghệ vi sinh còn rất hạn chế, những lo ngại cũng như tâm lý khi sử dụng các sản phẩm vi sinh lại hoàn toàn rất lạ và mơ hồ với chính những người nông dân Trong tình hình đó, việc nghiên cứu và chọn lọc các vi sinh vật bản địa có khả năng ký sinh tuyến trùng gây hại là vấn đề đáng quan tâm và như mở ra cánh cửa

mới trong việc chủ động phòng trừ tác nhân gây bệnh, nhằm giảm thiệt hại và nâng cao chất lượng và sản lượng cây trồng Một trong những giải pháp hữu hiệu góp phần đảm bảo an toàn cho cây trồng cũng như người sử dụng, đáp ứng yêu cầu giữ

được chứng minh có khả năng kí sinh khối trứng và con cái của tuyến trùng (Jatalas

và cs, 1979) Ngoài ra, chúng còn có thể sống hoại sinh trong đất xung quanh vùng

tiến hành xác định sự phân bố của nấm này ở vùng Đông Nam Bộ, trong đó có Vũng Tàu Việc phân lập, xác định hoạt tính enzyme ngoại bào hay khả năng kí sinh tuyến trùng của các chủng nấm phân lập từ các hệ sinh thái đất trồng tiêu khác

nhau là rất cần thiết Đó là lý do tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát hệ enzyme

ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở Vũng Tàu.”

2 Mục tiêu đề tài

 Khảo sát, so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease, chitinase của các

chủng nấm Purpureocillium lilacinum (P lilacinum) phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị

bệnh vàng lá (bị bệnh) và đất vùng rễ tiêu không bị bệnh vàng lá (khỏe mạnh)

 So sánh khả năng xâm nhập vào khối trứng và con cái tuyến trùng

Meloidogyne spp của một số chủng nấm P liacinum đại diện từ đất vùng rễ tiêu bị

bệnh và khỏe mạnh

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Ý nghĩa khoa học

Là một trong những nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính enzyme ngoại bào và khả

năng kí sinh tuyến trùng của nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở vũng Tàu

Ý nghĩa thực tiễn

Từ nghiên cứu này có thể xác định được sự tồn tại của các chủng nấm

P lilacinum có hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase cũng như khả

năng kí sinh tuyến trùng mạnh trong đất trồng tiêu góp phần vào việc định hướng sử dụng chế phẩm vi sinh phòng trừ tuyến trùng hại tiêu trong tương lai

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về đặc điểm rễ cây hồ tiêu

Hệ thống rễ hồ tiêu thường gồm 3 -6 rễ cái và một chùm rễ phụ nằm dưới mặt đất, trên đốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn) Chỉ có những cây tiêu trồng bằng hạt mới

có rễ cọc Rễ này đâm sâu xuống đất khoảng 2,5m và giữ nhiệm vụ hút nước Các rễ cái cũng làm nhiệm vụ chính là hút nước Đối với những cây trồng bằng giâm cành, sau khi trồng ra ngoài nọc được 1 năm các rễ cái này có thể đâm sâu khoảng 2m Các rễ phụ mọc thành chùm, phát triển theo chiều ngang, rất dày đặc Phân bố ở độ sâu 15 – 40cm, làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng trong đất để nuôi cây

Rễ bám mọc ra từ các đốt phần thân dây tiêu, giúp cho dây bám vào choái, vách tường, …để vươn lên cao Khả năng hút nước và chất dinh dưỡng của rễ bám là rất hạn chế và hầu như là không đáng kể

Rễ cây tiêu thuộc loại háo khí, không chịu được ngập úng, do đó để tạo cho rễ cái ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút được nhiều chất dinh dưỡng thì phải thường xuyên có nhiều phương pháp cải tạo làm cho đất được tơi xốp và tăng hàm lượng mùn Chỉ cần ngập úng trong nước từ 12 – 24 giờ thì bộ rễ tiêu sẽ bị tổn thương đáng kể, có thể dẫn tới thối rễ và dây tiêu sẽ bị chết

Một số sâu bệnh phát triển trên cây tiêu

Trên rễ cây hồ tiêu thường xuất hiện một số bệnh:

Mối hại tiêu: mối xông đất tạo thành đường di chuyển trên trụ, dây và rễ tiêu Mối gây hại phần non của rễ, phần vỏ của thân và tạo vết thương trên các bộ phận này tạo điều kiện cho nấm và tuyến trùng có hại xâm nhập và gây bệnh cho tiêu

Rệp sáp giả (Pseudococidae) : gây hại trên đọt non, lá non, chùm quả, dây tiêu

trên mặt đất hoặc gốc tiêu, rễ tiêu trong lòng đất

Bệnh chết nhanh: nguyên nhân do nấm Phytophthora, do tác động của tuyến

trùng, côn trùng, chăm sóc, xới xáo, ngập úng… làm tổn thương rễ, sau đó nấm xâm nhập và gây hại Bệnh gây hại trên tất cả bộ phận của cây

Bệnh chết chậm: do nhiều loại nấm gây hại: Fusarium sp., Rhizoctonia sp.,

Pythium sp., … Các loại nấm này tồn tại trong đất, trên tàn dư của cây trồng trước,

cây giống… Cây bị bệnh sinh trưởng chậm, lá nhạt, màu vàng hoặc biến dạng Hoa quả rụng dần từ gốc đến ngọn Các đốt cũng rụng dần, gốc thối, bó mạch thân cây hóa nâu

Bên cạnh đó bệnh tiêu cũng bị nhiều loài tuyến trùng gây hại, trong đó có hai

loài gây hại nặng nề nhất là tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne và tuyến trùng đục hang Radopholus (Michel Luc, 2005) Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật

không xương sống, thích nghi với đời sống ký sinh trên thực vật Nhóm tuyến trùng này có một số đặc trưng quan trọng phân biệt rõ ràng với nhóm ký sinh trên động vật và các nhóm sinh thái khác: có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển Trong đó, cấu tạo kim hút chuyển hóa là khác biệt quan trọng nhất (Nguyễn Bảo Vệ và ctv 2005)

1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật

Phân loại

Dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập quán sinh sống, đặc tính sinh vật học, mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được chia làm 4 bộ :

Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký sinh ở các phần khác nhau của thực vật

Bộ Aphelenchida: gồm các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất của cây như lá, hoa

Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh thực vật, một số loài có khả năng mang truyền virus

Bộ Triplonchida: gồm các loài của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là nhóm ngoại thực vật, nhiều loài có khả năng mang truyền virus

Trong đó bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng đông đảo nhất và có tầm quan trọng nhất trên phạm vi toàn thế giới

Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh trên tất cả các cơ quan của cây đang phát triển hoa, lá, thân, rễ…trong đó rễ là nơi chịu ảnh hưởng nhiều nhất những tác động của tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000)

cố định (tạo nên các tế bào dinh dưỡng) chúng mất khả năng di chuyển và trở lên phình to (béo phì)

Các kiểu ký sinh này không loại trừ lẫn nhau vì một số giống tuyến trùng có thể là nội ký sinh hay ngoại ký sinh di chuyển phụ thuộc vào vật chủ Ở tuyến trùng

sần rễ (Meloidogyne spp.) và tuyến trùng bào nang (Heterodera/ Globora), ấu trùng

tuổi 2 là giai đoạn xâm nhập vào rễ Nhưng ở các tuyến trùng ngoại ký sinh và hầu hết tuyến trùng nội ký sinh di chuyển thì hầu như tất cả các giai đoạn đều có thể dinh dưỡng và xâm nhập vào rễ (Vũ Triệu Mẫn, 2007)

1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp

Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp

Tuyến trùng sần rễ (root knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất Chúng gây hại hơn 3000 loài thực vật trên toàn thế giới, bao gồm hầu hết các cây trồng quan trọng: rau màu, đậu, ngũ cốc, cây ăn quả, thảo mộc

và nhiều cây cảnh thân gỗ khác (Malcolm & Charles, 2000)

Tuyến trùng làm giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng cây trồng Theo thống kê có khoảng 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loại ký sinh

gây nên ảnh hưởng nghiêm trọng: M incognita, M arenaria, M javanica, M

halpha (Vũ Triệu Mân, 2007) Một số loài Meloidogyne gây hại khá phổ biến và

quan trọng đối với thực vật hiện nay:

 M incognita là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau và phân bố trên vùng địa lý rộng trên phạm vi toàn thế giới Đây cũng là loài gây hại phổ biến trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng gây nhiều nhất trên : hồ tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ cà, cây họ đậu…

 M javanica là loài phổ biến thứ 2 sau M incognita và có dải phân bố rộng tương tự Đây là loài có khả năng chịu đựng qua mùa khô hạn trong thời gian 3 – 6 tháng Ở Việt Nam, loài này cũng ký sinh khá phổ biến trên các cây họ đậu, chuối…

 M arenaria là loài phổ biến thứ 3 sau 2 loài trên, phân bố khắp thế giới Đây

là loài gây hại phổ biến trên các cây họ đậu ở Việt Nam

 M graminicola ký sinh gây hại trên cây lúa ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới là chủ yếu (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ…) Ở nước ta, loài này ký sinh trên tương đối nhiều trên cây lúa ( giai đoạn lúa non, khi chưa ngập nước ) ở vùng đồng bằng sông Cửu Long

Tuyến trùng Meloidogyne spp (Kofoid & White, 1919; Chitwood, 1949) là tuyến trùng nội ký sinh rễ: giống Meloidogyne, Họ Meloidogynedae, Bộ Tylenchida

Vòng đời của tuyến trùng M incognita

Vòng đời tuyến trùng M incognita phát triển qua 5 giai đoạn chính : trứng (ấu

trùng tuổi 1), ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm), ấu trùng tuổi 3, ấu trùng tuổi 4

và tuyến trùng trưởng thành Giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở trong đất, các giai đoạn khác hình thành và phát triển trong rễ cây Trong chu kỳ vòng đời này ở tuyến

trùng Meloidogyne spp thì giai đoạn ấu trùng tuổi 2 và tuyến trùng trưởng thành

giúp xác định loài (Nguyễn Vũ Thanh, Nguyễn Ngọc Châu, 1993)

Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp

Cơ thể tuyến trùng gồm 3 phần: đầu, giữa và đuôi Phần đầu còn được gọi là vùng môi Phần đầu ở chính giữa có miệng chích hút có khi có mấu nhỏ nhô lên, hai đầu hơi nhọn hoặc hình tròn dẹt Phần thân ở giữa chứa ruột giữa và cơ quan sinh

dục Phần đuôi có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu gai hoặc không

Con cái trưởng thành hình cầu, nằm sâu trong mô rễ Đường kính cơ thể 0,5–0,7 mm với cổ cân đối Vỏ cutin màu trắng nhạt, mỏng và phân đốt Lớp vỏ cutin tương đối bền và có thể co giãn được Vỏ cutin về cơ bản được chia thành 3 lớp : epidocutin, exocutin và endocutin (Bird, 1984) Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các

thành phần protein collagen từ 3 lớp của vỏ cutin của M incognita với một lượng

tiết, và một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau Phía trong gắn với vỏ cutin là hạ bì và hệ cơ soma Bên trong thành cơ thể là xoang cơ thể mà thực chất là giả xoang, không được bao bọc bằng cấu trúc biểu mô Nó được tạo áp lực thường xuyên làm cho cơ thể tuyến trùng luôn ở trạng thái căng phồng lên Áp lực này cũng có tác dụng làm giảm tác động lên cơ soma và cho phép tuyến trùng vận động được Xoang cơ thể chứa các tế bào tuyến khác nhau hệ tiêu hóa và hệ sinh sản Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa, là cấu trúc cutin dày lên hoặc đậm nét khi quan sát dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Ngọc Châu, 2003)

Trứng được con cái đẻ ra bên ngoài cơ thể vào khối gelatin nằm trên bề mặt của sần rễ Đôi khi các bọc trứng này cũng nằm bên trong nốt sần Có hình bầu dục dài hay hình quả thận, cũng có loại trứng hình tròn và tương đối lớn Vỏ trứng

là phần cứng bên ngoài của trứng tuyến trùng, giúp bảo vệ khỏi các tác nhân hóa học và vi sinh vật tấn công Lớp vỏ trứng có thể có từ 1 – 5 lớp tùy thuộc vào từng loài tuyến trùng Các cấu trúc phổ biến nhất có lớp nội lipid, một lớp chitin ở giữa (thành phần chính) và một lớp vitelline ngoài (Bird và McClure, 1976) Lớp bên ngoài bao gồm các vitellin protein Lớp rào cản đầu tiên bên ngoài giúp ngăn cản sự

xâm nhập của nấm lên trứng Trong Bộ Tylenchida, tuyến trùng M javanica, lớp

vitelline là rất mỏng (10-40 nm) và chứa lipoprotein Vỏ trứng của tuyến trùng sần

rễ M hapla có hơn 40% protein (Wharton, 1980) Dày 400 nm là lớp chitin lớn

được kết hợp với protein để tạo thành một phức tạp chitin-protein Vỏ trứng M

javanica chứa 50% protein và 30% chitin (Bird và Bird, 1991) Vai trò chính của

lớp chitin có thể đảm bảo độ bền cấu trúc vỏ trứng và để bảo vệ lớp lipid Các lớp lipid bao gồm một loạt các màng lipoprotein (Wharton, 1980) và dày nhất ở các đầu (0.02- 0.04 µm) Các lớp lipid chịu trách nhiệm chống thấm của một số vỏ trứng, và nó bảo vệ trứng hạn chế chất độc hại (Wharton, 1980) Nếu các lớp chitin được loại bỏ, lớp lipid là dễ dàng bị hư hỏng …(Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000)

Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp

Đặc điểm gây hại

Quan sát mô học chỉ ra rằng sự xâm nhập của ấu trùng tuổi 2 xuất hiện nhiều nhất tại vùng mô phân sinh rễ Tuyến trùng ở đất xâm nhập vào rễ tiêu ở giai đoạn

ấu trùng cảm nhiễm IJ2 Sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng khu trú tại một chỗ

và dùng kim hút chọc thủng tế bào mô trụ của rễ, tiết men tiêu hóa vào mô để thực hiện dinh dưỡng Tại đây, tuyến trùng nhanh chóng phát triển qua các giai đoạn để phát triển thành tuyến trùng trưởng thành (tuyến trùng đực dạng chỉ dài, tuyến trùng cái hình quả lê) Dưới tác dụng của men tiêu hóa do tuyến trùng tiết ra, các tế bào xung quanh tuyến trùng phát triển bất thường, tạo thành các tế bào khổng lồ có nhiều nhân Rễ phình to ra tạo thành u hay nốt sần, hệ rễ bị biến dạng Những nốt

sần này có thể nhỏ, riêng biệt hay to và xếp thành chuỗi, phụ thuộc vào mức độ nhiễm của cây ký chủ ( Nguyễn Ngọc Châu và ctv.,1990)

Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp

Trên thực tế, chỉ có thể phát hiện tình trạng của bệnh khi cây bắt đầu xuất hiện các triệu chứng bộ lá bắt đầu suy giảm nên việc khống chế và phòng trừ sẽ rơi vào tình trạng bị động và gặp rất nhiều khó khăn, kém hiệu quả dẫn đến cây chết, dịch bệnh lây lan trên diện rộng Vì vậy, để phòng trừ có hiệu quả cần có các biện pháp phòng trừ tích cực, hiệu quả, chủ động Một số biện pháp phòng trừ: biện pháp chọn giống, biện pháp canh tác, biện pháp hóa học, biện pháp sinh học

Hiện tại biện pháp phòng trừ sinh học vẫn chưa thể thay thế biện pháp hóa học

do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học còn cao và không đáp ứng đầy

đủ nhu cầu sản xuất Tuy nhiên, phòng trừ sinh học rất phù hợp trong hệ thống quản

lý tuyến trùng Trong đó, việc nghiên cứu, tìm tòi về khả năng đối kháng, ký sinh là những bước tiến quan trọng đang được quan tâm và phát triển

1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum

1.3.1 Hệ thống phân loại

Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae Chi này chỉ

có một đại diện duy nhất là Purpureocillium lilacinum (hay còn được biết đến với tên phổ biến Peacilomyces lilacinus) Nấm sợi Purpureocillium lilacinum là loài

hoại sinh khá phổ biến và đang được chú trọng vì có tiềm năng trong việc kiểm soát mật độ của tuyến trùng gây hại trên cây trồng Phân loại theo Jennifer và cs năm

2011 như sau:

Giới: Fungi

Ngành: Ascomycota

Lớp: Sordariomycetes

Bộ: Hypocreales

Họ: Ophiocordycipitaceae

Chi: Purpureocillium

Loài: Pupureocillium lilacinum

Loài Purpureocillium lilacinum được miêu tả đầu tiên bởi nghiên cứu của Charles Thomas vào năm 1910, dưới tên Penicillium lilacinum Một số tên gọi khác của nó Penicillium amethystinum (Wehmer,1923), Spicaria rubidopurpurea (Aoki, 1941) Năm 1974, Samon đổi tên thành Paecilomyces Những công bố trong thập niên 20 chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là đơn ngành (Inglis và Tigano,

2006) Nấm này đã từng được phân loại thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes) Người ta đã phân lập được nhiều chủng nấm này từ khắp nơi trên thế giới và nó

được chấp nhận như biến thể của chi Paecilomyces Paecilomyces có mối quan hệ gần với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola

(Sung và ctv, 2007)

Loài nấm Paecilimyces lilacinus được nghiên cứu nhiều nhất trong việc phòng trừ tuyến trùng Năm 2011, Jennifer và cs đã đổi tên Paecilomyces lilacinus thành

Purpureocillium lilacinum và sử dụng cho tới hiện tại Những kết quả khi phân tích

quan hệ phát sinh loài của các chủng Purpureocillium lilacinum chỉ ra rằng nó có liên quan chặt chẽ với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài ký sinh thuộc chi Paecilomyces, họ Hypocreales (Inglis và Tigano, 2006)

1.3.2 Phân bố

P lilacinum đã được phân lập từ các môi trường sống bao gồm đất (canh tác

và không canh tác, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông), nước thải và côn

trùng, tuyến trùng P lilacinum cũng đã được tìm thấy trong trứng và con cái của tuyến trùng sần rễ và tuyến trùng bào nang Ngoài ra, P lilacinum cũng được tìm

thấy trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995)

1.3.3 Đặc điểm hình thái

Hình thái đại thể

Bào tử nấm P lilacinum nảy mầm khi độ ẩm và chất dinh dưỡng đầy đủ

Khuẩn lạc trên môi trường thạch PDA tăng trưởng khá nhanh, đường kính đạt 5-7

có màu trắng nhưng khi bắt đầu phát sinh bào tử chuyển thành màu tím, hoặc màu nâu khi đưa lên ánh sáng Một số trường hợp, bào tử không màu nhưng đa số là màu tím (Samson, 1975)

Hình1.2 Khuẩn lạc P lilacinum trên môi trường PDA

ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_colony.htm)

Hình thái vi thể

Các sợi nấm sinh dưỡng có thành trơn láng trong suốt và rộng khoảng 2,5 - 4,0

µm (Samson, 1974) Cuống bào tử đính phát sinh từ các sợi nấm cơ chất và sợi nấm dinh dưỡng, dài khoảng 400 - 600 µm Cuống bào tử phình ra ở phía gốc và thon gọn ở phía ngọn gọi là thể bình Bào tử đính phát sinh từ thể bình có dạng hình tròn hay bầu dục, ban đầu có vách trơn láng, sau đó trở nên hơi gồ ghề (Samson, 1974)

Hình1.3 Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm

P lilacinum khi chụp từ kính hiển vi huỳnh quang

độ phóng đại 460X (http://en.wikipedia.org/wiki/Purpureocillium)

1.3.4 Đặc điểm sinh hóa

Có rất nhiều nghiên cứu về enzyme ngoại bào của nấm P lilacinum, đặc biệt

là enzyme protease Enzyme này có khả năng phá hủy vỏ trứng của tuyến trùng

Meloidogyne hapla (Bonants và cs, 1995) Ngoài ra enzyme ngoại bào chitinase

được tiết ra từ P lilacinum cũng góp phần vào việc thủy phân thành phần của vỏ

trứng tuyến trùng (Khan và cs, 2004)

Các độc tố của nấm cũng được nghiên cứu, đáng chú ý là Peacilotoxin Tuy nhiên việc tiết độc tố cũng tùy thuộc vào nguồn gốc phân lập của chủng nấm (Khan

và cs, 2003; Park và cs, 2004) Năm 2003, Khan và cs đã thử nghiệm một chủng P

lilacinum để sản xuất Paecilotoxin và chủng này không hề sinh độc tố

Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào

Enzyme protease

Protease là loại enzyme tham gia phân giải protein để tạo thành các peptit

sống và enzym này có trong nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật

và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết, hệ protease VSV là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau

về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất (Võ Thị Bích Vân, 2010)

Phân loại protease: Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) Protease được chia ra làm một số loại dựa trên những đặc điểm riêng của chúng cũng như cấu tạo của tâm hoạt động của enzyme Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase (E.C.3.4.11-17) và exopeptidase(E.C.3.4.21-99) Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin protease: là những protease chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu

cơ chất tương đối rộng Cysteine protease: Các protease chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động Các cystein protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính,

có tính đặc hiệu cơ chất rộng Aspartic protease: Hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm sợi cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo protease thường hoạt động vùng pH trung tính

Cơ chế hoạt động của protease: Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính (Barrett, 1994): Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử C trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine Bước 2, khử acyl

bước một Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme (Võ Thị Bích Vân, 2010)

P lilacinum có khả năng tiết ra serine protease Năm 2004, Khan đã chứng

minh rằng serine protease được tiết ra bởi chủng nấm P lilacinum 251 làm ngừng

sự phát triển của trứng M javanica và làm giảm sự nở của ấu trùng hay có thể giết

chết một lượng lớn ấu trùng tuổi 2 đã nở Đồng thời nghiên cứu này còn chỉ ra rằng

enzyme này kết hợp với enzyme chitinase có thể gây tổn thương đến phôi trứng tuyến trùng và làm thay đổi cấu trúc vỏ trứng do lớp vitelline bị tan ra và thay đổi tính thấm ảnh hưởng đến lớp lipid trong cùng gây ra những thay đổi như trứng bị phồng lên

Chitinase

Chitinase [Poly-Beta-1-4- (2-acetalmido-2-deoxy) -D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin

Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14

và N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như

Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens…Họ Glycohydrolase 19 gồm hơn 130

chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces

griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae…Chúng có cấu trúc hình cầu với một

vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người

Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-f-chitobiosidase,

chitobiosidase và β–N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và f-N-acetylhexosaminidase Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng f-N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của f-N-acetylhexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase Chính vì thế có thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và f-N- acetylhexosaminidase Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine (Đinh Minh Hiệp, 2007)

Theo đó, P lilacinum làm thay đổi phần nhiều cấu trúc của vỏ trứng dưới sự

tác động của chitinase tạo không gian cho nấm trong suốt quá trình xâm nhập (Morgan-Jones và ctv, 1984) Đồng thời tiết ra enzyme chitinase làm mỏng đi lớp chitin của vỏ tuyến trùng và gây chia tách với lớp lipd trong cùng

Như vậy, việc sản sinh enzyme ngoại bào của nấm P lilacinum cũng có ý

nghĩa và vai trò quan trọng trong việc phá hủy vỏ trứng tuyến trùng với 3 lớp bảo

vệ cơ bản: protein, chitin và lipid và lớp biểu bì cutin bên ngoài của con cái cùng các lỗ mở tự tiên trên cơ thể chúng là những nơi dễ bị xâm nhiễm Nơi đầu tiên để nấm xâm nhập và là cơ sở để kiểm soát sinh học Protease, chitinase, và lysozyme là các enzyme thường được tổng hợp và tiết ra bởi nấm làm bào mòn vỏ trứng và lớp biểu bì con cái tuyến trùng (Bonants và ctv, 1995; Dackman và ctv, 1989; Gupta và ctv, 1993)

1.3.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng của P liacinum

Nhiệt độ

40oC, cá biệt có một số loài có thể sống sót ở 00C và ở 600C (Trần Thị Nhã Uyên,

2010) Nấm P lilacinum có thể tăng trưởng được trong một khoảng nhiệt độ khá

rộng, từ 8- 38°C (46 đến 100°F), nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển khoảng 26-30°C (79-86°F)

pH

Nói chung, nấm sợi có thể phát triển tốt ở môi trường acid (pH=6) nhưng pH

tối ưu là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9

(Ingold, 1967) Theo đó, loài P lilacinus này cũng thích nghi với khoảng pH khá

rộng 4 – 8 (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) và có thể tăng trưởng được trên môi trường

có sự thay đổi nhiều cơ chất (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995)

Nguồn dinh dưỡng

Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho

nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và

Ca Nếu các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản thì sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh

và tiết ra bên ngoài các loại enzyme ngoại bào thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào (Trần Thị Nhã Uyên, 2010) Ảnh hưởng của nguồn C: Nguồn C có vai trò quan trọng đối với vi sinh vật và

là cơ chất cần thiết cho quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp Nấm sợi có khả năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau: các hidrat cacbon, các acid hữu cơ, lipit…Nhiều loại nấm sợi còn có khả năng đồng hóa các chất hữu cơ rất bền hoặc chất độc đối với nhiều sinh vật khác Các loài nấm sợi thường không có những đòi hỏi nghiêm ngặt về các loại thức ăn cacbon Tuy nhiên, có thể là loại hợp chất này đồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác

Ảnh hưởng của nguồn N: Nguồn N ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng Có thể sử dụng cả nguồn N vô cơ và hữu cơ Các nguồn N hữu cơ thường dùng là pepton, casein, bột đậu nành, cao nấm men… Dễ tiêu nhất là nguồn N từ

casein.(Trần Thị Nhã Uyên, 2010) P lilacinum rất dễ thích nghi với điều kiện sống,

tùy thuộc vào sự sẵn có của các chất dinh dưỡng trong môi trường xung quanh

Chúng có thể vừa sống hoại sinh trong đất, vừa ký sinh côn trùng (Rombach và ctv, 1986; Marti và ctv, 2006; Fiedler và Sosnowska, 2007), vừa ký sinh tuyến trùng (Tigrano và ctv, 1995)

1.3.6 Khả năng kiểm soát và sự ký sinh của nấm P lilacinum trên tuyến

trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật gây ra thiệt hại đáng kể về kinh tế đối với nhiều loại cây trồng Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng thuốc hóa học Tuy nhiên, các chất hóa học diệt tuyến trùng hiện đang được coi là mối nguy hiểm đối với môi trường, đe dọa sức khỏe con người và động vật, chi phí

cao, và làm xuất hiện các loại tuyến trùng có khả năng kháng thuốc P lilacinum

được sử dụng như một tác nhân kiểm soát sinh học đối với một số loài tuyến trùng,

như M incognita Một số loài nấm có khả năng ký sinh như Exophiala pisciphila;

Scytalidium fulvum ký sinh trên trứng tuyến trùng; Scytalidium fulvum ký sinh bọc

trứng bằng các sợi nấm ăn sâu vào bên trong; Paraphoma radicina ký sinh bọc trứng; Sợi nấm Phoma terrestris ăn sâu vào bên trong trứng; Phytophthora

cinnamomi; F solani; Paecilomyces lilacinus; Paecilomyces variotii ký sinh trên

trứng tuyến trùng, Heterodera glycines; F.oxysporum ký sinh bọc trứng…(Ownley

Gintin và ctv, 1983) Liên quan đến việc phá vỡ hay làm thủng lớp vỏ của tuyến trùng hay tuyến trùng còn chịu tác động dưới lực cơ học và tiêu hóa các enzyme từ nấm Verticillium suchlasporium (Lopez-Llorca and Robertson,1992; Stirling, 1991)

Vào năm 1979, Jatala và ctv phát hiện rằng P lilacinum ký sinh lên trứng của loài Meloidogyne incognita ở Peru và nhiều thử nghiệm dùng nó diệt tuyến trùng gây hại được thực hiện ở đây đã thành công P lilacinum được quan sát ký sinh lên

trứng tuyến trùng lần đầu tiên bởi Lysek vào năm 1996 Đến năm 1991, Stirling và

West đã phân lập được P lilacinum từ nhiều loài tuyến trùng sần rễ, tuyến trùng

bào nang và từ mẫu đất ở nhiều địa điểm

Cơ chế của quá trình xâm nhập và kí sinh tuyến trùng

Trước khi lây nhiễm vào trứng tuyến trùng, P lilacinum sẽ tiết enzyme phân hủy và áp chặt vào vỏ trứng Nó tạo ra đĩa áp khắp vỏ trứng tuyến trùng sau đó một

vài sợi nấm phát triển dọc theo bề mặt trứng tạo thành mạng lưới các sợi nấm trên trứng Sự hiện diện của đĩa áp quanh trứng là dấu hiệu trứng này sẽ bị lây nhiễm

(Money, 1998) Khi có mặt của protease cùng với chitinase của P lilacinum làm tan

rã lớp vitelline, sự phân tách chitin và lipid của vỏ trứng M javanica tạo điều kiện

vật lý cho sự xâm nhâp (Khan, 2004) Khi sợi nấm đã xâm nhập vào trứng, nó nhanh chóng phá hủy các thành phần bên trong trứng, lúc này vỏ trứng trở nên rỗng, bào tử tiếp tục sinh trưởng và xâm nhiễm trứng gần đó

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Thời gian thực hiện: 04/2015 – 08/2015

Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh thuộc phòng Công nghệ vi sinh (Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Tp.HCM)

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu trồng ở Vũng

Tàu Trong đó, có 16 chủng được phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và 13 chủng

từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh.(Bảng 2.1)

2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm

Vật liệu

Con cái và khối trứng tuyến trùng Meloidogyne.spp được tách từ sần rễ tiêu và

được bảo quản trong dung dịch nước muối sinh lý (NaOCl 0.5%) đến khi sử dụng

Thước đo điện tử

Nồi nấu môi trường

Đèn cồn, diêm, dao cấy, que cấy, bông thấm, bông không thấm, giấy báo cũ, đũa khuấy, giấy lọc, phễu, vải lọc…

Cân phân tích điện tử

Máy chụp ảnh kỹ thuật số

Tủ lạnh

Các môi trường và thuốc thử sử dụng

Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA)

Potato dextrose agar 39g

Nước cất 1000ml

pH = 6.1 – 6.5

Môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào

Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease dựa theo Gradisar và ctv, 2005 có cải tiến

Thuốc thử Trichloroecetic acid (TCA) 10%: 10g TCA hòa tan với nước cất cho đủ 100ml ( thuốc thử dùng cho khả năng phân giải casein)

Môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase dựa theo Gradisar và ctv,

2005 có cải tiến

được lọc qua giấy lọc Rửa lại với nước cất nhiều lần cho đến khi đạt pH trung tính

Lugol (thuốc thử dùng để xác định khả năng phân giải chitin)

Môi trường Water agar (WA)

Bảng 2.1 Danh sách các chủng nấm P lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu

2.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Khảo sát và so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease và

chitinase của các chủng nấm P lilacinum phân lập ở các hệ sinh thái đất trồng tiêu

thuộc tỉnh Vũng Tàu

Nội dung 2: Khảo sát và so sánh khả năng kí sinh khối trứng và con cái tuyến

trùng Meloidogyne spp của một số chủng P lilacinum đại diện từ đất vùng rễ cây

tiêu khỏe mạnh và bị bệnh ở Vũng Tàu

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P lilacinum -

Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch

Nguyên tắc

Khi nuôi cấy nấm trên môi trường có chứa cơ chất thích hợp (casein, chitin),

nấm P lilacinum sẽ tiết ra enzyme tương ứng (protease,chitinase) Cơ chất sẽ bị

phân giải dưới tác động của enzyme tạo ra vòng trong suốt quanh khuẩn lạc khi nhỏ thuốc thử vào, kích thước vòng trong suốt đó phản ánh hoạt động của enzyme (Lê Thị Huệ, 2010)

Chuẩn bị

Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, WA và môi trường cảm ứng enzyme ngoại bào được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri

Thực hiện

Dùng khoan thạch có đường kính 5 mm đã khử trùng, khoan lấy phần thạch có

tơ nấm trên môi trường WA sau đó dùng dao đã khử trùng lấy khoanh thạch đặt vào tâm đĩa chứa 10ml môi trường cảm ứng enzyme Mỗi chủng nấm khảo sát sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường Dùng parafilm quấn đĩa lại trước khi đưa ra khỏi tủ cấy Ghi lại tên giống và ngày, giờ cấy để theo dõi

Chỉ tiêu theo dõi

Đường kính vòng phân giải cơ chất (D, mm) và đường kính khuẩn lạc (d, mm) được đo sau khi nhuộm thuốc thử ở thời điểm 24h, 48 và 72 h nuôi cấy Đánh giá mức độ phân giải cơ chất của nấm dựa vào hiệu D – d (mm) Hiệu D – d của nấm càng lớn thì khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng nấm đó càng mạnh

- Đối với thử nghiệm định tính enzyme protease:

 Chủng có khả năng tiết enzyme mạnh là chủng có D – d ≥ 9 mm

 Chủng có khả năng tiết enzyme khá là chủng có 9 mm > (D – d) ≥ 7 mm

 Chủng có khả năng tiết enzyme trung bình là chủng có 7 mm > (D – d) ≥ 5 mm + Chủng có khả năng tiết enzyme yếu là chủng có (D – d) < 5mm

- Đối với thử nghiệm định tính enzyme chitinase:

 Chủng có khả năng phân hủy chitin mạnh: D – d >5 mm

 Chủng có khả năng phân hủy chitin khá: 5 mm > (D – d) ≥ 4 mm

 Chủng có khả năng phân hủy chitin trung bình : 4 mm > (D – d) ≥ 3 mm

 Chủng có khả năng phân hủy chitin yếu : (D – d) < 3 mm

2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp của nấm P lilacinum

Chuẩn bị

cấy chuyển sang đĩa Petri chứa 10 ml môi trường WA mềm

Khối trứng và con cái tuyến trùng được rửa nhiều lần bằng nước cất đã được hấp khử trùng để loại bỏ tạp chất nhằm hạn chế bị nhiễm trong quá trình theo dõi khi thử khả năng ký sinh Sau khi rửa sạch, cho chúng vào các đĩa Petri có đặt 1 lớp giấy mỏng đã được làm ẩm và vô trùng

Các môi trường cần thiết: môi trường PDA, Môi trường WA mềm được chuẩn bị rồi phân phối ra các đĩa Petri

Thực hiện

Dùng khoan thạch có đường kính 5 mm đã khử trùng khoan lấy phần thạch có

tơ nấm trên môi trường PDA rồi dùng dao đã khử trùng lấy khoanh thạch đặt vào tâm đĩa môi trường WA mềm Ngay sau đó, đặt vào mỗi đĩa 4 trứng hoặc con cái tuyến trùng tại 4 điểm xung quanh và cách khoanh nấm 0.5cm Mỗi chủng nấm khảo sát sẽ được cấy lặp lại 3 lần trên 3 đĩa môi trường WA mềm Ủ ở nhiệt độ

Chỉ tiêu theo dõi

Theo dõi sự kí sinh sau mỗi 24 giờ đến khi có chủng nấm khảo sát kí sinh hoàn toàn số khối trứng hay con cái ở 1 lần lặp lại Tính số con cái hay khối trứng bị nấm kí sinh (sợi nấm xâm nhập, sử dụng chất dinh dưỡng của kí chủ tạo thành một cụm sợi nấm mang cả thể bình và bào tử xung quanh khối trứng hay con cái) Mức

độ ký sinh của tuyến trùng được tính theo phần trăm (%) và chia làm 4 cấp:

- Ký sinh mạnh: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh trên 75%

- Ký sinh trung bình: tỷ lệ trứng/con cái bị ký sinh từ 25 - 50%

2.5.3 Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu

Thí nghiệm khảo sát khả năng tiết enzyme ngoại bào của P lilacinum

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu CRD, gồm 2 yếu tố:

các chủng nấm Purpureocillium spp (29 chủng) và thời gian khảo sát (3 mức thời

gian 24, 48, 72 giờ) Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa Petri chứa môi trường cảm ứng enzyme tương ứng

Sau khi lấy chỉ tiêu, tính hiệu D-d bằng chương trình Excel Phân tích ANOVA hiệu D-d bằng phần mềm SAS 9.0 So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo LSD với mức ý nghĩa 0.05

Thí nghiệm khảo sát khả năng ký sinh của P lilacinum trên tuyến trùng Meloidogyne spp

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên theo kiểu CRD, gồm 2 yếu tố:

các chủng nấm Purpureocillium spp tối ưu về khả năng tiết enzyme ngoại bào (10

chủng) và thời gian khảo sát (Đối với con cái: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày; còn đối với khối trứng: từ ngày 1 đến ngày thứ 14) Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần trên 3 đĩa Petri chứa môi trường WA mềm

Sau khi lấy chỉ tiêu, tính tỷ lệ ký sinh bằng chương trình Excel Phân tích ANOVA tỷ lệ ký sinh bằng phần mềm SAS 9.0 So sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức theo LSD với mức ý nghĩa 0.05

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P lilacinum 3.1.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm

P lilacinum

Để kiểm tra khả năng tiết enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm

P lilacinum, tiến hành theo phương pháp mục 2.5.1 Kết quả được ghi nhận trong

Dựa vào bảng 3.1 có thể thấy tất cả 13 chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh đều có khả năng tiết enzyme protease Tuy nhiên, các chủng nấm

P lilacinum tiết enzyme yếu nhất sau 24h nuôi cấy, 48h và 72h sau đó chúng tiết

enzyme tốt hơn nhưng đường kính vòng phân giải cơ chất không có sự khác biệt có

ý nghĩa về mặt thống kê Sự khác nhau về lượng enzyme được tiết ra có sự thay đổi

như vậy là do trong 24h đầu nấm phải thích nghi với môi trường nên khả năng phân giải cơ chất còn thấp Trong 2 mốc thời gian kế tiếp nấm tiến hành dinh dưỡng và phân giải cơ chất casein mạnh hơn để tận dụng nguồn cơ chất cho việc dinh dưỡng Khi xét riêng từng chủng, KL5.3 có khả năng tiết enzyme phân hủy casein tốt nhất (đường kính vòng phân giải casein là 9.412 mm), chủng tiết enzyme yếu nhất là HT5.1 (5.707 mm) Khi xét khả năng phân giải casein của các chủng nấm khảo sát theo thời gian, thấy rằng khả năng phân giải cơ chất của các chủng nấm khác nhau

là khác nhau Nhìn chung được chia thành 4 nhóm: Nhóm 1 là nhóm có khả năng phân hủy cơ chất tối ưu ở ngay 24h đầu và giảm dần sau đó (KL5.2, HT4.3); nhóm

2 có sự khác biệt hẳn khi đột ngột giảm khả năng phân giải tại 48h và tăng lên sau

đó ở thời điểm 72h (HT5.1); nhóm 3 là nhóm các chủng có khả năng phân giải cơ chất tối ưu ở 48h (HT1.2, HT3.1, HT6.3) và nhóm còn lại là nhóm có đường kính vòng phân giải cơ chất tăng dần sau thời gian khảo sát (KL4.1, Kl5.3, HT2.2, HT4.1, HT6.1, HT7.2, HT7.3) Nhìn chung, chủng KL5.3 có khả năng phân giải casein mạnh nhất tại thời điểm 72h sau cấy, cũng tại thời điểm đó chủng HT4.1 cũng phân giải casein tương đối mạnh Chủng HT5.1 có khả năng phân giải casein yếu nhất ở 48h sau cấy (4.547 mm)

Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ

Từ kết quả ở bảng 3.2, cả 16 chủng nấm P lilacinum phân lập từ đất vùng rễ

tiêu của cây tiêu bị bệnh đều có khả năng tiết protease Thời gian có sự ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tiết enzyme của các chủng, 72h là thời gian mà các chủng có khả năng tiết enzyme mạnh nhất (đường kính vòng phân giải casein trung bình 8.112 mm) và có sự khác biệt rõ ràng so với thời điểm 24h và 48h Khả năng tiết enzyme protease của các chủng nấm không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống

kê ở 24h và 48h

Ở bảng 3.2, khi xét riêng theo chủng, KL6.2 có khả năng phân giải casein tốt nhất (9.398 mm) và KL1.3 là chủng thể hiện khả năng phân giải casein yếu nhất (5.698 mm) Đồng thời, khi xét theo thời gian 24, 48 và 72h sau cấy, tương tự như nhóm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh, các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh được chia thành 3 nhóm (đặc điểm tương tự như đối với nhóm các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh): Nhóm 2 bao gồm các chủng: KL54.1, Kl5.2, KL6.2, KL8.2, HT2.3 và HT3.3 Nhóm 3: KL6.1, HT1.1 và HT1.3 Nhóm 4: KL1.2, KL1.3, KL3.1, HT2.1, HT4.2, HT 5.2 Nhìn chung, HT5.2 có khả năng tiết enzyme phân giải casein mạnh nhất tại thời điểm 72h (10.557 mm), tiếp theo là chủng HT2.3 Chủng có khả năng phân giải casein yếu

nhất là HT3.2 tại thời điểm 48h sau cấy (4.323 mm)

Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P lilacinum phân

KL 4.1 6.883i-q 5.893o-s 8.213d-l 6.997EFG

KL 5.1 8.000e-m 7.247g-o 8.770a-h 8.001CDE

KL 6.1 6.953h-q 9.343a-e 6.227m-r 7.508DEF

KL 6.2 9.950a-d 8.093e-l 10.150abc 9.398A

KL 8.2 6.730j-r 5.130qrs 7.830e-n 6.563FGH

HT 1.1 7.993e-m 9.347a-e 7.350f-o 8.230BCD

HT 1.3 7.687e-o 10.290ab 7.333f-o 8.437A-D

Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ