Application of the MinION sequencer for identifying several bacteria pathogens

16S rRNA gene of bacteria were sequenced on Minion device Oxford Nanopore by using 16S barcoding kit SQK-RAB204 on R9.4 flow cell.. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đề nghị sử dụng phân t

Università degli Studi di Sassari Dipartimento di Scienze Biomediche

Master Universitario Internazionale di II livello denominato

International Master in Medical Biotechnology

in Accordo con la Huè University of Medicine and Pharmacy, (Huè, Vietnam)

(Direttore del Master Prof Daniele Dessì)

TITLE

“APPLICATION OF THE MINION SEQUENCER FOR

Relatore:

Assoc Prof RODNEY A LEA

Dr NGUYEN HOANG BACH

Assoc Prof NGUYEN DANG QUOC CHAN

Tesi di:

HO THI THANH MAI

Anno Accademico 2019/2020

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING HUE UNIVERSITY

HUE UNIVERSITY OF MEDICINE AND PHARMACY

HO THI THANH MAI

“APPLICATION OF THE MINION SEQUENCER FOR

THESIS OF MASTER IN MEDICAL SCIENCE

ACKNOWLEDGEMENTS

Firstly, I would like to thank Associate Professor Rodney A Lea, Doctor Nguyen Hoang Bach, Associate Professor Nguyen Dang Quoc Chan, my supervisors who guided, supported and helped me for my Master study and research with all kindness, patience and immense knowledge Associate Professor Rodney is also a person that gives me a chance to go abroad to Australia I really appreciated him

My sincere thanks also goes to Professor Flavia She is an expert about bacterial genetics at QIMR, Australia She had given me appropriate knowledge in order to make me understand more about my projects I would like to express my special thanks of gratitude to Doctor Neven who is very kind and enthusiastic She spent her time to guide me about anything sequencing

A grateful thanks to send Associate Professor Larisa for providing me with all the facility that was required I also thank Ms Cao Thi Thao Van, Mr Nguyen Hoang Son and all colleges in Innovation Health Biomedical I, Queensland University of Technology, Australia

I am extremely thankful to thank Associate Professor Nguyen Dang Quoc Chan, director of School Medicine and Pharmacy, the University of Da Nang, who gave me a change to attend this Master course

Special thanks to all of the Microbiology Department : Associate Professor

Le Van An, Associate Professor Le Viet Quynh Tram, Ms Nguyen Thi Tuyet Ngoc who helped me and shared useful experiences for my research Lastly, I would like to thank my family: my parents, my husband and my daughter, for supporting me through the time that I learnt my Master course

Ho Thi Thanh Mai

ABBREVIATIONS

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate

PCR Polymerase chain reaction

RT PCR Real time Polymerase chain reaction

SGS Second generation sequencing

TGS Third generation sequencing

rRNA Riboxom ribonucleic acid

ARMA Antibiotic Resistance Mapping Application

SMRT Single molecule real time

PacBio Pacific Biosciences

MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption

ionization time-of-flight

ABSTRACT

Infectious diseases causes by bacterial pathogens that have a substantial global health impact and it could become serious if remained undiagnosed with several diseases related to nervous system, blood infection,…Many technologies in diagnostics are related to bacteria culture performed by morphological trait differentiation and biochemical testing, which could be more time-consuming and labor intensive In this study, we offer using a culture-independent analysis simultaneously for several bacteria pathogens from clinical samples using MinION sequencing

Oxford Nanopore Technologies (ONT) recently released the MinION in

2014, giving it the smallest footprint of any current sequencing platform and can be connected to an individual computer via a USB 3.0-interface The MinION is unique among TGS platforms in that it is the only portable real time device for DNA and RNA sequencing Importantly, the MinION is commercially available at a very low entry cost of $1,000USD

For this research, whole genomes of bacterial pathogens will be extracted from urine and sputum samples of 10 patients in Hue University Hospital, Viet Nam The bacterial DNA concentration were estimated by using a quantitative PCR assay (qPCR) 16S rRNA gene of bacteria were sequenced on Minion device (Oxford Nanopore) by using 16S barcoding kit SQK-RAB204 on R9.4 flow cell Genomic 16S rRNA will be analysed using external databases and bioinformatics pipelines with MinKNOW, EPI2ME software On the EPI2ME platform, the bacteria pathogens base on the total of reads were classified via “analysis workflow” as: FASTQ 16S QC Barcoding, FASTQ WIMP (What in my pot )

MinION sequencing was optimized to 98.7 % workflow successful with 2,160,000 reads analysed ; 1,884,027 reads classified, the average of

sequencing length was 1,340 base for pathogen detection compared with other

methods ( culture-dependent method, real-time PCR, AFB Ziehl-Neelsen stain) The species levels of bacteria could identify accurately via WIMP

program on EPI2ME

Nanopore 16S results showed good correlation with bacteria culture, real-time PCR but can be more sensitive, manageable, less expensive and time saving Sequencing the genomic 16S rRNA via MinION sequencer could

be a good ideal in clinical diagnostic microbiology With the rapid development of Nanopore technology, in the term of chemistry advances, more accurate base callers and analysis software, the MinION offers promise for wide use in the future and might contribute to a reduction in broad spectrum antibiotic use

TÓM TẮT

Các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn gây ra có ảnh hưởng sức khỏe toàn cầu đáng kể và có thể trở nên nghiêm trọng nếu không được chẩn đoán nhanh chóng với một số bệnh liên quan đến hệ thống thần kinh, nhiễm trùng máu….Tuy nhiên, các công nghệ chẩn đoán liên quan đến nuôi cấy vi khuẩn được thực hiện bằng phương pháp phân biệt hình thái và xét nghiệm sinh hóa,

có thể tốn nhiều thời gian và công sức hơn Trong nghiên cứu này, chúng tôi

đề nghị sử dụng phân tích độc lập nuôi cấy đối với một số tác nhân vi khuẩn

từ các mẫu lâm sàng sử dụng công nghệ giải trình tự gen MinION

Gần đây, công nghệ Oxford Nanopore (ONT) đã cho ra đời một thiết bị Minion vào năm 2014, mang lại cho nó dấu ấn nhỏ nhất của bất kỳ nền tảng giải trình tự hiện tại nào và có thể được kết nối với một máy tính thông qua giao diện USB 3.0 MinION là duy nhất trong số các nền tảng NGS ở chỗ nó

là thiết bị thời gian thực di động duy nhất để giải trình tự DNA và RNA Điều quan trọng, MinION có sẵn trên thị trường với chi phí rất thấp khoảng

$ 1.000USD

Đối với nghiên cứu này, toàn bộ bộ gen của vi khuẩn sẽ được tách chiết

từ mẫu nước tiểu và mẫu đàm của 10 bệnh nhân tại Bệnh viện Đại học Y Dược Huế, Việt Nam Nồng độ DNA của vi khuẩn được định lượng nhanh bằng cách sử dụng kỹ thuật qPCR Vùng gen16S rRNA của vi sinh vật được giải trình tự trên thiết bị giải trình tự MinION (Oxford Nanopore) bằng cách

sử dụng bộ mã vạch 16S kit có tên SQK-RAB204 trên flow cell R9.4 Vùng gen 16S rRNA được phân tích bằng cơ sở dữ liệu và xử lý tin sinh học với phần mềm MinKNOW, EPI2ME Trên phần mềm EPI2ME, một số loài vi khuẩn được định danh dựa vào các “reads” được phân loại thông qua các quy trình phân tích như: FASTQ 16S QC Barcode, FASTQ WIMP

Phương pháp giải trình tự MinION được tối ưu hóa đạt 98.7% mức độ làm việc với 2,160,000 các “reads” được phân tích; 1,884,027 các “reads” được phân lớp và chiều dài trung bình gen là 1,340 base để phát hiện ra vi khuẩn khi được so sánh với phương pháp khác ( nuôi cấy, RT PCR, Nhuộm AFB Ziehl-Neelsen) Vi khuẩn được định danh chính xác ở mức độ loài thông qua chương trình WIMP trên phần mềm EPI2ME

Các kết quả chạy qua các lỗ Nanopore gene 16S đã chỉ ra được mối tương quan tốt với phương pháp nuôi cấy vi khuẩn thông thường nhưng có thể nhạy hơn, dễ quản lý, ít tốn kém và tiết kiệm nhiều thời gian hơn Vùng gen 16S rRNA được giải trình tự gen bằng thiết bị MinION là một ý tưởng tốt trong chẩn đoán vi sinh lâm sàng Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ Nanopore , trong sự cải tiến về hóa học, phần mềm phân tích và gọi base chính xác hơn, MinION hứa hẹn sẽ được sử dụng rộng rãi trong tương lai và góp phần giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh trong phổ rộng

CONTENTS

ACKNOWLEDGEMENTS i

ABSTRACT iii

TÓM TẮT v

LIST OF FIGURES ix

LIST OF TABLES xi

INTRODUCTION 1

CHAPTER I REVIEW OF LITERATURE 3

1.1 Introduction about microbiology laboratory diagnostic 3

1.1.1 Phenotypic method 4

1.1.1.1 Cytological examination 4

1.1.1.2 Culture methods 8

1.1.2 Genotype method 12

1.1.2.1 Real-Time Polymerase chain reaction (RT- PCR) 12

1.1.2.2 Sequence technology 14

1.2 Introduction about 16S rRNA gene sequencing for identification bacteria pathogens 24

1.2.1 Characteristics of 16S rRNA 24

1.2.2 Comparison of the sequencing platforms for 16S metagenomic analysis to identify bacteria 25

1.3 Introduction about 16S Barcoding kit (SQK-RAB204) 28

CHAPTER II MATERIALS AND METHODS 29

2.1 Ethics statement 29

2.2 Sampling 29

2.3 DNA extraction 29

2.4 Optimization of qPCR for detection of 16S ribosomal rRNA of bacteria 30

2.5 MinION sequencing 30

2.5.1 Library preparation 31

2.5.2 Sequencing 32

2.5.3 Analysis data 35

CHAPTER III RESULTS 37

3.1 Species identification by using culture-dependent method and Real time PCR 37

3.2 Optimization of qPCR assays for detection of gen 16S rRNA bacteria 38

3.3 Evaluation of Nanopore MinION sequencing result 39

3.3.1 Control sequencing with the MinION 39

3.3.2 16S QC Barcoding 41

3.3.3 WIMP for identifying bacteria pathogens 45

CHAPTER IV DISCUSSION 50

CONCLUSION 53

REFERENCES 54

LIST OF FIGURES

Figure 1 Classification of general Positive Gram and Negative Gram Bacteria 5

Figure 2 Gram stain 6

Figure 3 Ziehl–Neelsen stain 7

Figure 4 Mycobacterium tuberculosis visualization using the Ziehl–Neelsen stain 8

Figure 5 Biomedical test 9

Figure 6 MALDI-TOF MS for bacterial identification 11

Figure 7 Review of molecular biology methods used for the identification of different microorganisms 13

Figure 8 The Sanger (chain-termination) method for DNA sequencing 16

Figure 9 NGS Workflow 18

Figure 10 The Minion sequencing device 20

Figure 11 The Oxford Nanopore sequencing process 22

Figure 12 A representation of 16S rRNA 24

Figure 13 Most common metabarcoding sequencing strategies for each sequencing technology generation 26

Figure 14 Workflow for the SQK RAB-204 kit 28

Figure 15 Detecting structural variants with nanopore 34

Figure 16 The default data analysis workflow 35

Figure 17 Data acquisition 36

Figure 18 Mux Scan Results 39

Figure 19 A screenshot of the flow cell activity during 2 day run 40

Figure 20 Cumulative Output Result 40

Figure 21 The workflow successful of 16S QC Barcoding 41

Figure 22 Read count per hour result 43

Figure 23 The chart of yield per flow cell 43

Figure 24 The distribution of quality score 44

Figure 25 The sequence length (bases) 44

Figure 26 The reads count per Barcode ID 45

Figure 27 WIMP process results 46

Figure 28 The Taxa at species level 46

Figure 29 NCBI Taxonomy tree (WIMP) 47

LIST OF TABLES

Table 1 Summary of Acid-Fast Stain 7

Table 2 Comparison of the available sequencing platforms for 16S metagenomic analysis using metabarcoding approach 27

Table 3 Bacterial identification by Ziehl-Neelsen stain and RT - PCR 37

Table 4 Bacterial identification by culture-dependent method from urine samples 37

Table 5 Result of qPCR running 38

Table 6 The number of reads for each Barcode 42

Table 7 Comparing Minion sequencing results and the other methods 48

Table 8 Comparing the culture-dependent method and MinION sequencing results 49