NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA CỦA VI TẢO DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 DƯỚIẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ

DANH MỤC BẢNGBảng 2.1.Thí nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện ức chế khác nhau lên sự tíchlũycarotenoid củaD.bardawilDCCBC15...27 Bảng 3.1.Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vitảoD.ba

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CHU NGỌC PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCHLŨY

CÁC CHẤT CHỐNG OXY HÓA CỦA VI TẢODUNALIELLA

BARDAWILDCCBC15

DƯỚI ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ

Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học:TS Võ Hồng Trung

TPHCM – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là báo cáo khóa luận của riêng em Các thông tin, sốliệu sử dụng phân tích và kết quả nghiên cứu được nêu trong khóa luận là trungthực, khách quan, có nguồn gốc rõ ràng, hoàn toàn được hình thành và phát triểntrong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của em tại Bộ môn Hóa sinh – Độc chấttrường Đại học Nguyễn Tất Thành, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Võ HồngTrung Các luận điểm, dữ liệu được trích dẫn đầy đủ nếu không là ý tưởng hoặc kếtquả tổng hợp của chính bản thânem

Tp Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 10 năm 2018

Sinh viên ký tên

CHU NGỌC PHƯỢNG

LỜ I CẢM ƠN

Saumôt thờigianthưc hiê

n khóaluân tốtnghiêp đếnnay,moi côngviêc liênquanđếnkhóaluân đãhoàn tất Trong suốt thời gian này, em đãnhân đươ

Đăc biêt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS VõHồng Trung, TrưởngBộmônHóasinh-Đôc chất,KhoaDươc Trường Đai ho

c Nguyễn Tất Thành,người đã trực tiếp hướng dẫn, tân tâm truyền đạt cho em nhiều kiến thức thực tế quýbáu về nghiêncứu khoahoc vàgiúpđỡcho em trongsuốtquátrìnhthưc hiê

n khóaluâ

n tốtnghiêp taị Bô ̣môn.

Bêncanhđó,emmuốnbàytỏlòngbiếtơnđếnQuýThầyCôBộmônHóasinh -Đôc chất,KhoaDươc TrườngĐai ho

c NguyễnTấtThành,đăc biê

t làThS.Nguyễn Thi ̣Hồng Phúc đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ và tạo nhiều thuận lợi cho emtrong quá trình thựchiên khóaluân tốtnghiêp này

Sau cùng, xin chân thành cảm ơn các ban cùng khóaDươc 2013 vàcác emsinh viênkhóaDươc 2014 đangthưc hiê

n cácđề tàinghiêncứu khoahoc tai BômônHóasinh - Đôcchất,nhữngngườiluônsátcánhcùngem,đôṇg viên, chiasẻ

những kiếnthức, tìnhcảm,giúpđỡem trongsuốtquátrìnhhoc tâ

p vànghiên cứu

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮVIẾTTẮT iii

DANH MỤCHÌNH ẢNH iv

DANHMỤCBẢNG vi

ĐẶTVẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUANTÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quanvềDunaliella 3

1.1.1 Giới thiệu vitảoDunaliella 3

1.1.2 Hình dạng và cấu trúc tếbàoDunaliella 3

1.1.3 Các chất có hoạt tính sinh họcởDunaliella 4

1.1.4 Cơ chế sinh tổng hợp carotenoidởDunaliella 6

1.1.5 Các điều kiện ức chế ảnh hưởng lên sự tổnghợpcarotenoid 10

1.1.6 Mối quan hệ giữa con đường tổng hợp carotenoidvàlipid 16

1.2 β-carotene và vai trò đối vớisứckhỏe 19

1.2.1 Giớithiệu β-carotene 19

1.2.2 Vai trò của β-carotene đối vớisức khỏe 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊNCỨU 22

2.1 ChủngDunaliella bardawilDCCBC 15 và môi trườngnuôicấy 22

2.2 Phương phápphântích 22

2.2.1 Quan sát hình tháitếbào 22

2.2.2 Xác định mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởngđặchiệu 22

2.2.3 Xác định hàm lượng carotene tổng và diệplụctố 23

2.2.4 Xác định khả năng chốngoxyhóa 23

2.2.5 Xác định hàm lượngphenolictổng 24

2.2.6 Xác định trọnglượngkhô 24

2.2.7 Xác định hàm lượng lipid bằng phươngphápsulfo-phospho-vanillin 24

2.2.8 Thu hoạch sinh khối tảo phântíchβ-carotene 25

2.3 Phương pháp thiết kếthínghiệm 25

2.3.1.Khảosátsự tăng trưởng của vitảoDunaliella bardawilDCCBC15

trong môi trường MD41,5MNaCl 25

2.3.2 Khảo sát sự tăng trưởng và tích lũy carotenoid của vitảoDunaliella bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 26CHƯƠNG3.KẾTQUẢVÀBÀNLUÂN 28

3.1 Kếtquả 283.2 Bànluận 54CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀKIẾNNGHỊ 60

4.1 Kếtluận 604.2 Kiếnnghị 60TÀI LIỆU THAM KHẢO

Gốc tự do oxy hóa

Tế bào/mLCộng sự

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1.Tế bàoDunaliella bardawilchụp dưới kính hiển vi điệntử[11] 4

Hình 1.2.Sơ đồ sinh tổng hợp isoprenoid ở vi tảoDunaliellasalina[54] 8

Hình 1.3.Các con đường tổng hợp carotenoid ở các sinh vật tự dưỡng tạooxy[54] 10

Hình 1.4.Các cơ chế đáp ứng của tế bàoD.salinađối với các ức chế môitrường[54] 13

Hình 1.5.Chu trình glycerol ởDunaliella[11] 14

Hình 1 6.Cấu trúc phântửβ-carotene 20

Hình 3.1.Hình thái của vitảoD.bardawilDCCBC 15 trong môi trường MD4 1,5M NaCl 28

Hình 3.2.Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vitảoD.bardawilDCCBC 15trong môi trường MD41,5MNaCl 29

Hình3 3 H à m l ư ợ n g d i ệ p l ụ c t ố a t r ê n t h ể t í c h ( a ) v à t r ê n t ế b à o ( b ) c ủ a v i tảo D.bardawilDCCBC 15 trong môi trường MD41,5M NaCl 31

Hình3.4.Hàmlượngdiệplụctốtổngtrênthểtích(a)vàtrêntếbào(b)củavitảo D.bardawilDCCBC 15 trong môi trường MD41,5M NaCl 32

Hình 3.5.Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) và tỷ lệ carotenoid/ diệp lục tố (c) của vitảoD.bardawilDCCBC 15 trong môi trường MD41,5MNaCl 34

Hình 3.6.Hình thái của vi tảoD.bardawilDCCBC 15 dưới các điều kiên nuôi cấy ứcchếkhácnhau 36

Hình 3.7.Mật độ tế bào của vi tảoD.bardawilDCCBC 15 dưới các điều kiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 37

Hình 3.8.Tronglươn g khô của vi tảoD.bardawilDCCBC 15 dưới các điều kiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 37

Hình3 9 H à m l ư ợ n g d i ệ p l ụ c t ố a t r ê n t h ể t í c h ( a ) v à t r ê n t ế b à o ( b ) c ủ a v i tảo D.bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 40

Hình 3.10.Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo D.bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 41

Hình 3.11.Hàm lượng carotenoid trên thể tích (a), trên tế bào (b) vàtỷlệ

carotenenoid/diệp lục tố (c) của vitảoD.bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiêṇnuôi

cấyứcchếkhác nhau 44

Hình3.12.Hàmlượngβ-carotenecủavitảoD.bardawilDCCBC15dướicácđiều

kiện nuôi cấy ức chếkhácnhau 47

Hình 3.13.Hàm lượng lipid trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vitảoD.bardawil

DCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 48

Hình3 1 4 H à m l ư ợ n g p h e n o l i c t r ê n t h ể t í c h ( a ) v à t r ê n t ế b à o ( b ) c ủ a v i t

ảo

D.bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 50

Hình 3.15.Khả năng chống oxy hóa trên thể tích (a) và trên tế bào (b) của vi tảo

D.bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1.Thí nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện ức chế khác nhau lên sự

tíchlũycarotenoid củaD.bardawilDCCBC15 27

Bảng 3.1.Mật độ tế bào và trọng lượng khô của vitảoD.bardawilDCCBC 15trong

môi trường MD41,5MNaCl 30

Bảng 3.2.Hàm lượng diệp lục tố a, diệp lục tố tổng trên thể tích và trên tế bào

củavitảoD.bardawilDCCBC 15 trong môi trường MD41,5M NaCl 33

Bảng3.3.Hàmlượngcarotenoidtrênthểtích,trêntếbàovàtỷlệcarotenoid/diệp

lục tố củaD.bardawilDCCBC 15 trong môi trường MD41,5MNaCl 35

Bảng 3.4.Mật độ tế bào của vi tảoD.bardawilDCCBC 15 dưới các điều kiên nuôi

cấyứcchếkhácnhau 38

Bảng 3.5.Tronglươn g khô của vi tảoD.bardawilDCCBC 15 dưới các điều kiên

nuôi cấyứcchếkhácnhau 39

Bảng 3.6.Hàm lượng diệp lục tố a trên thể tích và trên tế bào của vitảoD b a r d a w i l

DCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 42

Bảng 3.7.Hàm lượng diệp lục tố tổng trên thể tích và trên tế bào của vi tảo

D.bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 42

Bảng 3.8.Hàm lượng carotenoid trên thể tích của vi tảoD.bardawilDCCBC 15

dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 45

Bảng 3.9.Hàm lượng carotenoid trên tế bào của vi tảoD.bardawilDCCBC 15 dưới

cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 45

Bảng 3.10.Tỷ lệ carotenoid/diệp lục tố của vi tảoD.bardawilDCCBC 15 dưới các

điềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 46

Bảng 3.11.Hàm lượng β-carotene của vi tảoD.bardawilDCCBC 15 dưới các

điềukiện kiện nuôi cấy ức chếkhácnhau 47

Bảng3.12.HàmlượnglipidtổngtrênthểtíchvàtrêntếbàocủavitảoD.bardawil

DCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 49

Bảng3 1 3 H à m l ư ợ n g p h e n o l i c t r ê n t h ể t í c h v à t ế b à o c ủ a v i tảoD.bardawi

l

DCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 51

Bảng 3.14.Khả năng chống oxy hóa trên thể tích và trên tế bào của vi tảo

D.bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấyứcchếkhácnhau 53

Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY CÁC CHẤT CHỐNG

OXY HÓA CỦA VI TẢODUNALIELLA BARDAWILDCCBC 15 DƯỚI ẢNH

HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN ỨC CHẾ

Chu Ngọc PhượngHướng dẫn khoa học: TS Võ Hồng Trung

TÓ M TẮT

Mởđầu:Nhu cầu sử dụng β-carotene trên thế giới ngày càng cao nhưng nguồn cung cấp

chủ yếu là từ tổng hợp hóa học do đóDunaliella bardawilDCCBC 15 được xem là nguồn

sản xuất β-carotene tự nhiên tốt và có khả năng đáp ứng cao vì chứa các hợp chất có ứngdụng quan trọng trong dược phẩm như β-carotene, glycerol và các chất màu khác

Đố itươ

n g và phương pháp nghiêncứu:Chủng tảoDunaliella bardawilDCCBC 15

được sử dụng để khảo sát sự tăng trưởng trong môi trường MD4 1,5M NaCl và ảnhhưởngcủa ức chế H2O2riêng rẽ và H2O2kết hợp với ánh sáng cao, độ muối cao lên sựtăngtrưởng, tích lũy các chất chống oxy hóa, đặc biệt là hàm lượng β-carotene tích lũytrong vi tảo

Kết quả:Dunaliella bardawilDCCBC 15 tăng trưởng tốt trong môi trường MD4 1,5M

NaCl, hàm lượng diệp lục tố tăng cao trong phase tăng trưởng, hàm lượng carotenoid tăngmạnh khi vi tảo đạt phase ổn định hoặc suy vong do cạn kiệt dinh dưỡng Trong các điều

kiện ức chế, sự tăng trưởng củaDunaliella bardawilDCCBC 15 bị ức chế, hàm lượng diệp

lục tố duy trì ổn định, trong khi đó tăng tổng hợp lipid và các chất chống oxy hóa nhưcarotenoid và phenolic Trong đó ở điều kiện ức chế cạn kiệt dinh dưỡng và kết hợp vớicường đô ̣chiếu sáng manh thìhàm lượng β-carotene cao hơn so với các điều kiện còn lại

Kết luâṇ :Dunaliella bardawilDCCBC 15 là vi tảo lục đơn bào có khả năng tổng hợp

lượng lớn β-carotene và các chất chống oxy hóa dưới các điều kiện ức chế ánh sáng cao vàcạn kiệt dinh dưỡng Do đó việc sản xuất β-carotene từ vi tảo này là một hướng nghiên cứumới đầy tiềm năng, đồng thời tận dụng dải bờ biển dài của nước ta cho việc nuôi trồng loài

vi tảo biển này

Từ khóa:Dunaliella bardawilDCCBC 15, môi trường MD4, β-carotene, khả năng chống

oxy hóa

Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 - 2018

STUDY ON THE GROWTH AND ACCUMULATION OF ANTIOXIDANTS OF DUNALIELLA BARDAWIL DCCBC 15 UNDER THE INFLUENCE OF

INHIBITORY CONDITIONS

Chu Ngọc Phượng Supervisor: Vo Hong Trung, Ph.D

ABSTRACT

Introduction:The demand for β-carotene in the world is increasing but the source of

supply is mainly from chemical synthesis.Dunaliella bardawilDCCBC 15 is considered to

be a good natural source of β-carotene production and highly responsive because itcontains important pharmaceutical ingredients such as β-carotene, glycerol and otherpigments

Materials and methods:Dunaliella bardawilDCCBC 15 was used to investigate growth in

1.5M NaCl MD4 medium and the effect of stress culturing conditions includingseparateH2O2supplement and combination of H2O2supplement with high light intensity andsaltconcentration on the growth and accumulation of antioxidants, especially β-carotenecontent in the microalgae

Results:Dunaliella bardawilDCCBC 15 in 1.5M NaCl MD4 medium was high growth

rate, high chlorophyll content at exponental phase and carotenoid content reaching highlevel at stationary phase or death phase due to nutrient starvation of cultural medium

Under stress conditions, the growth ofDunaliella bardawilDCCBC 15 was inhibited and

stable chlorophyll content while the biosynthesis of lipid and antioxidants such ascarotenoids and phenolic increased Under the stress conditions, the nutrient starvation andcombination of high light intensity, the content of β-carotene is higher than the other stressconditions

Conclusion:Dunaliella bardawilDCCBC 15 is a unicellular green microalgae, be able to

accumulate large amount of β-carotene and antioxidants under stress conditions such asnutrition starvation and high light intensity Therefore, the β-carotene production from themicroalgae is one of the studied prospects in future, expecially Viet Nam has longcoastline

Keywords:Dunaliella bardawilDCCBC 15, MD4 medium, β-carotene, antioxidant

capacity

ĐẶT VẤN ĐỀ

Carotenoid được biết đến như là chất chống oxy hóa mạnh có nguồn gốc tựnhiên giúp ngăn cản các tế bào bình thường chuyển thành các tế bào gây ung thư,làm chậm lại sự phát triển của khối u, ngăn cản sự tạo thành các chất gây ung thư.Ngoài ra, carotenoid còn đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa và điều trịcác bệnh như tim mạch, viêm thấp khớp, chứng loạn dưỡng cơ, bệnh đục thủy tinhthể và một số rối loạn về thần kinh

β-carotene là đồng phân quan trọng của carotenoid, thuộc nhóm các sắc tốhữu cơ tự nhiên β-carotene có thể chuyển hóa thành vitamin A trong cơ thể vàđược xem là tiền chất tốt nhất của vitamin A trong các loại carotenoid Nhiềunghiên cứu đã cho thấy rằng β-carotene là một sắc tố tự nhiên có khả năng chốngoxy hóa rất cao, kích thích tế bào miễn dịch, phối hợp với các chất chống oxy hoákhác như vitamin C và vitamin E làm giảm các nguy cơ nhiễm trùng, làm chậm quátrình lão hóa, giảm tác hại của ánh sáng mặt trời, cũng như giảm nguy cơ một sốbệnh về tim mạch và ngăn ngừa một số bệnh ung thư[1]

Hiện nay, chủng tảoDunaliellađược xem là nguồn sản xuất β-carotene tự nhiên tốt nhất do có chứa tỉ lệ cao đồng phân 9-cis-β-carotene, được chứng minh là

có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn nhiều đồng phânall-trans-β-carotene Trong khi

đó, β-carotene tổng hợp chỉ chứa đồng phânall-trans-β-carotene Mặt khác, việc sản

xuất carotenoid từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toàn hơn vì ít tạo racác dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người so

với từ con đường tổng hợp hóa học Vi tảo biểnDunaliella bardawilDCCBC 15 là nhóm vi tảo lục đơn bào thuộc Ngành Tảo lục - HọDunaliellaceaecó giá trị kinh tế

cao bởi nó có chứa các hợp chất có ứng dụng quan trọng trong dược phẩm như carotene, glycerol và các chất màu khác [1] Loài tảo này chẳng những xuất hiện ởchâu Phi, Đại Tây Dương và Địa Trung Hải, mà còn có mặt ở Biển Chết, các đạidương, biển, hồ khác - những nơi nước rất mặn, ánh nắng mạnh và nhiệt độcao.Nhu cầu sử dụng β-carotene trên thế giới ngày càng cao nhưng nguồn cung

cấp carotene chủ yếu là từ tổng hợp hóa học (chiếm 84,8%), trong khi đó carotene ly trích từ tảo chỉ chiếm 8,5% và từ thực vật chiếm 6,7% Do đó, việc sản

β-xuất β-carotene từ vi tảoDunaliella bardawilDCCBC 15 là một hướng nghiên cứu

mới đầy tiềm năng và có khả năng đáp ứng cao, mở rộng khả năng cung ứng nguồnβ-carotene có hoạt tính tốt, đồng thời tận dụng dải bờ biển dài của nước ta cho việcnuôi trồng loài vi tảo biển này [1]

Với những lợi ích đã trình bày trên, việc nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy

làm tăng khả năng tăng trưởng và khả năng tích lũy β-carotene của vi tảoDunaliella bardawilDCCBC 15 là rất quan trọng và cần thiết.Đâycũng chính là mục tiêu

nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu khả năng tăng trưởng và tích lũy các chất chống

oxy hóa của Vi tảoDunaliella bardawilDCCBC 15 dưới ảnh hưởng của các điều

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổngquan vềDunaliella

1.1.1 Giớithiệu vi tảoDunaliella

Vi tảo là một cấu thành quan trọng của sinh vật phù du (plankton), đóng vai tròquan trọng trong việc duy trì và phát triển hệ sinh thái dưới nước Vi tảo là thức ăntươi sống đặc biệt quan trọng cho sự phát triển ấu trùng của hầu hết các loài tôm, cá,

ốc và cho các động vật phù du; tính ưu việt của vi tảo là không gây ô nhiễm môitrường, cung cấp đầy đủ các vitamin, chất khoáng, vi lượng, đặc biệt là chúng chứarất nhiều loại acid béo không no Chúng có giá trị dinh dưỡng rất cao và phạm viứng dụng rộng rãi [2]

Dunaliellalà nhóm vi tảo lục đơn bào thuộc Ngành Tảo lục HọDunaliellaceae Các loàiDunaliellahiện diện trong các môi trường nước biển,

-các hồ muối trên khắp thế giới và có khả năng chống chịu với -các độ muối khácnhau Loài tảo này chẳng những xuất hiện ở Châu Phi, Đại Tây Dương và ĐịaTrung Hải, mà còn có mặt ở Biển Chết, các đại dương, biển, hồ khác - những nơinước rất mặn, có ánh sáng mạnh và nhiệt độ cao Nhiều nghiên cứu cho thấy rằngchúng có khả năng thay đổi hình dạng và thể tích để đáp ứng với sự thay đổi áp suấtthẩm thấu ngoại bào Đây là sinh vật hiếm hoi có thể sinh tồn trong môi trườngnước rất mặn, nhờ chứa nồng độ cao carotenoid bảo vệ chúng khỏi ánh sáng vàchứa lượng glycerol cao giúp chúng giữ độ ẩm Ngoài ra, chúng cũng rất giàuvitamin C và E [2]

1.1.2 Hình dạng và cấu trúc tế bàoDunaliella

Dunaliellalà vi tảo lục đơn bào, có hình cầu, hình trứng, hình ellips, hình trụ

hay hình quả lê tùy theo các giai đoạn tăng trưởng cũng như môi trường dinh dưỡngkhác nhau trong nuôi cấy, có kích thước rộng 4-15 μm và dài 6-25 μm [m và dài 6-25 μm và dài 6-25 μm [m [16], [9] Tếbào di động do có 2 roi, không có vách cellulose mà chỉ có lớp nhầy bên ngoài gọilàglycocalyx[14],chỉcómộtlụclạpvớitâmtạobộtởgiữa[22],[7].Cáctếbào

Dunaliellakhông có vách giúp tế bào có thể nhanh chóng thay đổi thể tích tế bào đế

đáp ứng với những thay đổi áp suất thẩm thấu ngoại bào[3], [11] (hình 1.1)

Tế bàoDunaliellacó các bào quan điển hình của tảo lục: nhân bao bọc bởi

màng nhân nằm ở phần đầu của tế bào [5], ty thể, không bào, bộ máy Golgi và mộtđiểm mắt[3], [12]

Hình 1.1.Tế bàoDunaliella bardawilchụp dưới kính hiển vi điện tử [11]

1.1.3 Cácchất có hoạt tính sinh học ởDunaliella

Vi tảo có thể sản xuất một lượng lớn các chất chống oxy hóa và các sắc tố(carotenoid gồm fucoxanthin, lutein, β-carotene, astaxanthin và phycobilliprotein),LC-PUFA, protein (các acid amin thiết yếu như methionin, threonin vàtryptophan), hợp chất phenolic, hợp chất sulfate và vitamin với ứng dụng rộng rãitrong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, nông nghiệp và các ngành công nghiệp dượcphẩm[3], [40], [45]

Vi tảo đơn bào là một nguồn các chất chống oxy hóa đầy hứa hẹn gồm nhiều

loài khác nhauBotryococcus, Chlorella, Dunaliella, Nostoc, Phaeodactylum,Spirulina, HaematococcusvàChaetoceros.Nhóm hợp chất chống

oxy hóa chính và được biết đến nhiều từ vi tảo là carotenoid Carotenoid đóng mộtvai trò quan trọng trong việc dập tắt các gốc tự do (ROS) tạo ra trong quá trìnhquang hợp, đặc biệt là oxy singlet Ngoài ra, các hợp chất phenolic cũng là chấtchống oxy hóa quan trọng ở vi tảo Hàm lượng các hợp chất phenolic trong sinhkhối tảo tăng khi tiếp xúc với các điều kiện ức chế khác nhau (như ánh sáng, nhiệt

độ, độ muối, cạn kiệt dinh dưỡng ) cho thấy chúng thật sự đóng một vai trò quantrọng trong đáp ứng với các ức chế này[3], [23]

Dunaliellalà một trong những loài tảo lục chịu mặn có thể sản xuất và

tíchlũyba sản phẩm có giá trị cao về thương mại là glycerol, β-carotene và acid

béo [8].D.salinađược nuôi cấy trong điều kiện ức chế khác nhau tăng sản xuất

carotene và dịch trích chứa carotene này có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn

và chống ung thư cao [60]

Milko (1963) đã đề cập đến khả năng tạo ra lượng lớn β-carotene

ởDunaliellasp Sau đó, nhiều nhà khoa học như Ben-Amotz và Avron (1983), Borowitzka (1988) đã chứng minhDunaliellasinh ra nhiều β-carotene để làm chất

bảo vệ cho bộ máy quang hợp dưới các điều kiện môi trường bất lợi Các yếu tốmôi trường như cường độ ánh sáng cao, điều kiện dinh dưỡng giới hạn, nồng độmuối cao và nhiệt độ cao đều tác động đến các quang thụ quan cảm nhận ánh sánghay kênh vận chuyển, làm giảm tính ổn định của chúng, qua đó làm tăng các stressoxy hóa và nồng độ oxy đơn bội Các stress này có thể làm cho sự tăng trưởng

củaDunaliellabị giảm nhưng lại tăng cường sự tích lũy carotenoid Từ đó, các nhà khoa học nhận thấyDunaliellachính là nguồn nguyên liệu chứa β-carotene tự nhiên

tốt nhất với các đồng phân 9-cis (chiếm 41%), all-trans (42%), 15-cis (10%) vàđồng phân khác (7%) Chính vì vậy, từ đầu những năm 1960, người ta đã bắt đầu

sản xuấtDunaliellađể thu β-carotene tự nhiên và đến cuối những năm 1980, việc nuôi trồngD.salinatrên quy mô công nghiệp cũng đã bắt đầu được triển khai tại

Australia, Israel, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Kuwait, Iran

Việc sản xuất carotenoid từ nguồn có sẵn trong tự nhiên được cho là an toànhơn vì ít tạo ra các dạng đồng phân cấu trúc có khả năng ảnh hưởng xấu đến sứckhỏe con người so với từ con đường tổng hợp hóa học Vi tảo biển, đặc biệt là

loàiD.salina, trong các điều kiện nhất định, có khả năng tổng hợp nguồn β-carotene

rất hữu hiệu [9] Trên thế giới, mô hình làm giàu β-carotene trong sinh khối

củaD.salinađã được nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm và sản xuất thương

mại [28]

Để tích lũy β-carotene cần độ mặn cao, nhiệt độ cao và cường độ chiếu sáng

mạnh, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở độ mặn trên 27% NaClD.salinacó thể tích

lũy được lượng carotenoid lên tới trên 14% trọng lượng khô [2] Nước ta có đường

bờ biển dài, cường độ chiếu sáng mạnh quanh năm, vào mùa khô nhiệt độ luôn duytrì ở mức ổn định 25-35oC, hơn nữa có hệ thống các ruộng muối có độ mặn cao, vìvậy là điều kiện rất tốt để vừa xen canh làm muối, vừa nuôi trồng vi tảo biển sinh

carotenoid nhưDunaliella.

1.1.4 Cơ chế sinh tổng hợp carotenoid ởDunaliella

Carotenoid là isoprenoid được tổng hợp bởi tất cả sinh vật quang hợp, một sốnấm và vi khuẩn không quang hợp [18] Hơn 750 carotenoids đã được xác định cấutrúc [65]

Ở các sinh vật quang hợp, carotenoid gắn với các protein màng thykaloid nơi

mà chúng tham gia vào hấp thu ánh sáng và bảo vệ cho bộ máy quang hợp chốnglại những tổn thương quang oxy hóa[18]

Quá trình sinh tổng hợp carotenoid trong các sinh vật quang hợp được thựchiện qua hai giai đoạn:

+ Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP)

+ Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP

Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyldiphosphat (IPP), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20) Haiphân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếp tục khử hydro tạothành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene Tiếp theo

đó là sự tạo vòng, sự khử hydro và sự oxy hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệtthường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sựchuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khácnhau.

Một lượng lớn các chất biến dưỡng thứ cấp như isoprenoid hayterpenoidgồmmột vài hợp chất có giá trị sinh học và kinh tế như carotenoid Ở cácsinh vật quang hợp, isoprenoid được tổng hợp từ isopentyl diphosphate (IPP) vàdimethylallyl diphosphate (DMAPP) từ con đường mevalonate trong tế bào chất(MVA) hoặc con đường 2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate (MEP) trong lục lạp(con đường không MVA hoặc 1-desoxy-D-xylulose-5-phosphate [DXP]) Ở tảo lụcchỉ có con đường MEP trong lục lạp cung cấp các tiền chất cho sinh tổng hợp tất cảisoprenoid[3],[54]

Ở tảo lục (Chlorophyta) (nhưD.bardawilDCCBC 15) dường như thiếu con

đường MVA trong tế bào chất Ngược với con đường MVA trong tế bào chất cần 3phân tử acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) để tạo IPP, con đường MEP sử dụngpyruvate và glyceraldehyde-3-phosphate làm cơ chất và 8 enzyme nằm trong lụclạp sử dụng các cofactor và ion kim loại khác nhau (hình 1.2)[54]

Hình 1.2.Sơ đồ sinh tổng hợp isoprenoid ở vi tảoDunaliella salina[54]

GA-3P, glyceraldehyde-3-phosphate; DXS, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphatesynthase; DXR, 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase; MCT, 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferrase; CMK, 4-(cytidine 5’-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase; MDS, 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase; HDS, 4-hydroxy 3-methylbut-2-enyl diphosphatesynthase; HDR, 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase; IPP,isopentenyl diphosphate; DMAPP, dimethylallyl diphosphate; IPI1 & 2, isopentenylpyrophosphate isomerase; GPP, geranyl diphosphate; GPS, GPP synthase; FPP,farnesyl diphosphate; FPS, FPP synthase; GGPP, geranyl geranyld i p h o s p h a t e ;

GGPS, GGPP synthase; PSY, phytoene synthase; PDS, phytoene desaturase;CrtISO, carotenoid isomerase; ZDS, ζ-carotene desaturase; ZISO, 15-cis-ζ-isomerase; LCY-b, lycopene β-cyclase; LCY-e, lycopene ε-cyclase; CHY1,carotene β-hydroxylase; CHY2, carotene ε-hydroxylase; VDE, violaxanthindeepoxidase; ZE, zeoxanthin epoxidase; NSY, neoxanthinsynthase.

Ở lục lạp, sau khi hình thành IPP từ con đường MEP, ba phản ứng kết hợp liêntiếp được xúc tác bởi prenyltransferase hình thành geranylgeranyl diphosphate(GGPP) là tiền chất của tất cả các catenoids Bước đầu tiên của sinh tổnghợpcarotenoid gồm sự kết hợp của hai phân tử GGPP (C20) nhờ enzymphytoenesynthase (PSY) thành phytoene Các bước tiếp theo liên quan đến cácenzyme gắn trên màng thực hiện một chuỗi phản ứng khử bão hóa (phytoenedesaturase [PDS] và-carotene desaturase [ZDS] và sự đồng phân hóa (carotenoid isomerase [CrtISO] và 15-cis--isomerase [ZISO] tạo thành lycopene Sau đó hình thành vòng nhờ cyclase (lycopene -cyclase [LCY-e] hoặc lycopene -cyclase[LCY-b])

tổnghợp-carotenevà carotenevàtiếptụccácphản ứnghydroxylhóa tạothành lutein hoặc violaxanthin mà từ đó các carotenoid - sản phẩm cuối có thể được hình thành (hình 1.3) [54]

Hình 1.3.Các con đường tổng hợp carotenoid ở các sinh vật tự dưỡng tạo oxy [54]

Tuy giữa hai con đường MVA và MEP có sự tách biệt về sinh lý trong cácphần khác nhau của tế bào nhưng cũng có sự liên kết giữa chúng Với chỉ con

đường MEP hoạt động trongD.salinađể cung cấp các tiền chất IPP và DMAPP cho

sinh tổng hợp isopren, sự liên kếtnàycần thiết để cân bằng nhu cầu biến dưỡng giữacác phần khác nhau của tế bào Hơn nữa sự liên kết này cần thiết không chỉ giữa tếbào chất và lục lạp mà còn giữa con đường biến dưỡng isopren và lipid khi

carotenoid thứ cấp ởD.salinađược cô lập trong các hạt lipid trong lục lạp, trong khi

triglyceride được dự trữ trong các thể dầu trong tế bào chất [19],[54]

1.1.5 Các điều kiện ức chế ảnh hưởng lên sự tổng hợpcarotenoid

Dưới những điều kiện ức chế như ánh sáng, nhiệt độ, độ muối cao và cạn kiệt

dinh dưỡng, một số chủngDunaliellacó khả năng tích lũy trên 10% β-carotene

(all-transvà 9-cisβ-carotene) so với trọng lượng khô của tế bào [12], [34].D.salinađược cho là nguồn cung cấp β-carotene tự nhiên cao nhất trong hầu

hết các sinh vật quang hợp [15] Beta-carotene là tiền vitamin A được ứng dụngnhiều trong thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược phẩm [15], [21]

Dinh dưỡng

Nitrogen (N) là một trong những nguyên tố thiết yếu trong môi trường đối với

sự tăng trưởng của bất kỳ tế bào nào Điều kiện thiếu hoặc hạn chế nitrogen đượcxem như là ức chế đối với sinh vật Sự hiện diện của nitrogen có ảnh hưởng đến sựtích lũy carotenoid ở một số vi tảo Trong điều kiện giới hạn của nitrogen làm tăng

hàm lượng β-carotene ởDunaliellavà astaxanthin ởHaematococcus Mặt khác, nồng

độ nitrogen cao thích hợp cho sự tích lũy lutein ởMuriellopsissp [20].D.salinangừng tăng trưởng hàm lượng diệp lục tố giảm (do phân tử diệp lục tố

chứa 4 nguyên tử nitrogen trong cấu trúc) khi nitrogen không được cung cấp vàomôi trường, hàm lượng β-carotene tăng gấp 4 lần so với bình thường Sự tăng hàmlượng β-carotene trong các tế bào bị thiếu hụt nitrogen là do sự hình thành nhiềugốc tự do trong điều kiện ức chế β-carotene có các đặc tính chống oxy hóa dập tắtcác gốc tự do, khôi phục trạng thái cân bằng sinh lý, bảo vệ tế bào để tiếp tục tăngtrưởng[3],[51]

Phosphor (P) là một chất dinh dưỡng đa lượng đóng vai trò quan trọng trongcác quá trình biến dưỡng của tế bào do cấu thành nhiều thành phần cấu trúc, chứcnăng cần thiết cho sinh trưởng và phát triển bình thường của vi tảo Trong điều kiện

cạn kiệt phosphor, các tế bàoDunaliellatích lũy β-carotene,Haematococcustích lũy

astaxanthin nhưng không rõ so với sự cạn kiệt nitrogen [55] Sự cạn kiệt nitrate vàsulfate gây ra sự tích tụ β-carotene trong các loài hoang dại [6] Sự giới hạn

nitrogen và phosphor ảnh hưởng đến bộ máy quang hợp củaD.tertiolecta, nồng độ phophor tối ưu cho sự tăng trưởng củaD.salina và D.viridiskhoảng từ 0,002 g/Lđến

0,025 g/L KH2PO4và nồng độ cao (> 5 g/L) ức chế sự tăng trưởng [41]

Sắt (Fe) là một trong những yếu tố vi lượng thiết yếu đóng vai trò quan trọngtrong các thành phần sinh hóa của tế bào do đặc tính oxy hóa khử của nó và gắn

liền với nhiều quá trình cơ bản như quang hợp, hô hấp, cố định nitrogen và tổnghợp ADN Thiếu Fe sẽ cảm ứng nhiều thay đổi sinh hóa, C-phycocyanin và diệplục tố a bị suy thoái khi Fe trở nên giới hạn Fe2+có thể có chức năng như một yếutốtạo OH-hoặc các gốc oxy hoạt động (ROS) (1O2, O2-, H2O2hoặc AO2-) đóng vaitròquan trọng trong việc tăng cường tổng hợp carotenoid ở tảo[55].

Ảnh hưởng của nồng độ cadimium (Cd) lên sự tăng trưởng (số lượng tế bào và

hàm lượng diệp lục tố) và sự tổng hợp β-carotene củaD.salina, tăng nồng độ

cadimium làm giảm số lượng tế bào, hàm lượng diệp lục tố, Mg2+và Ca2+nhưng làmtăng hàm lượng β-carotene trong tế bào Điều này xảy ra có thể là do sự hình thànhcác gốc tự do và sự thiếu hụt các yếu tố thiết yếu như Mg2+và Ca2+gây ra bởi nồng

độ cao của cadimium trong môi trường (lên đến 0,5 mg/L)[59]

Độ muối

Các tế bàoD.salinađáp ứng nhanh (thay đổi thể tích tế bào) với sự thay đổi

trong áp suất thẩm thấu Sự tích lũy β-carotene trong tế bào ở các độ muối khácnhau từ 1,5 - 5M (NaCl) được nghiên cứu Mật độ tế bào giảm ở độ muối 4M(NaCl), ở 5M (NaCl) tế bào trắng hoàn toàn sau 2 ngày bổ sung muối Nồng độmuối cao tạo ra môi trường ưu trương làm cho các tế bào bị co lại, cuối cùng làmphá vỡ cấu trúc và thành phần của tế bào (plasmolysis) Ở môi trường có độ muối1,5M (NaCl), độ muối thấp tạo nên môi trường nhược trương làm cho tế bào căngphồng lên và phá vỡ tế bào Ở độ muối 2M (NaCl) đạt được sinh khối tối đa, lànồng độ tối ưu cho sự tăng trưởng của tế bào Khi tế bào bị thiếu nước do nồng độmuối cao, quang hợp bị ảnh hưởng mạnh Vì thế hàm lượng diệp lục tố giảm khi độmuối tăng Khi độ muối tăng, nó hoạt động như một yếu tố ức chế làm tăng sảnxuất β-carotene Hàm lượng diệp lục tố giảm và β-carotene tăng ở độ muối trungbình Các tế bào chống chịu được với độ muối cao là do có sự hiện diện củaglycerol có khả năng cân bằng ức chế thẩm thấu ngoại bào Nồng độ glycerol nộibào cao gần 50% và đủ để phát triển áp suất thẩm thấu tương ứng để cân bằng với

áp suất thẩm thấu ngoại bào[3],[51]

Sự đáp ứng củaD.salinađối với ức chế muối (hình 1.4a) có thể chia làm hai

giai đoạn [54]:

(i) Sự điều chỉnh nhanh chóng nồng độ glycerol và glycine betaine giống với

cơ chế điều hòa áp suất thẩm thấu phổ biến ở nấm và thực vật bậccao

(ii) Sự đáp ứng dài hạn gồm sự tổng hợp lipid trung tính và tích lũy nhiềucarotenoid

Những thay đổi bất thường trong áp suất thẩm thấu của môi trường dẫn đếnnhững thay đổi trật tự lipid màng tế bào, vì thế gây ra sự hoạt hóa một loạt cácprotein kinase và cuối cùng dẫn đến sự biến đổi tinh bột thành glycerol trong lụclạp Tín hiệu được truyền từ tế bào chất vào lục lạp chưa biết rõ Ngược lại sự đápứng dài hạn đối với độ muối cao bao gồm những thay đổi trong biểu hiện genethông qua mộthaynhiều nhân tố phiên mã chưa được xác định, tiếp theo là sự tổng

hợp proteinde novo Những sản phẩm gene được cảm ứng bởi ức chế muối gồm các

sản phẩm phiên mã và protein liên quan đến sự đồng hóa carbon và sắt cũng nhưsinh tổng hợp carotenoid[54]

Hình 1.4.Các cơ chế đáp ứng của tế bàoD.salinađối với các ức chế môi trường [54]

Cơ chế thích nghi với nồng độ muối khác nhau là sự điều hòa áp suất thẩm

thấu.Dunaliellađiều hòa áp suất thẩm thấu bằng cách thay đổi nồng độ glycerol nội bào KhiDunaliellatăng trưởng trong môi trường có nồng độ muối khác nhau, nồng

độ glycerol nội bàotỷlệ thuận với nồng độ muối ngoại bào và đủ để cân bằng ápsuất thẩm thấu[11],[17]

Shock thẩm thấu bắt đầu tổng hợp hay thoái hóa glycerol, quá trình này kếtthúc khi tế bào trở về với thể tích ban đầu Sự tổng hợp và thoái hóa glycerol phụthuộc vào sự tổng hợp protein và có thể xảy ra ngoài sáng hay trong tối[11],[17]

Cơ chế kiểm soát quá trình tổng hợp và thoái hóa glycerol ởDunaliellađược

cho là một chu trình “chu trình glycerol” duy nhất liên quan đến một số enzymemới (hình 1.4)[11]

Hình 1.5.Chu trình glycerol ởDunaliella[11]

nhiệt độ cao.D.bardawilvàD.salinacó thể sống sót và tăng trưởng ở cường độ ánh

sáng lên đến 4000 lux Ở cường độ ánh sáng 6000 lux và 35oC hàm lượng diệp lục

tố giảm trong 2 ngày đầu, có thể là do sự tiếp xúc đột ngột với cường độ ánh sángcao Tuy nhiên, hàm lượng diệp lục tố tăng lên sau 2 ngày và hàm lượng β-carotenetăng lên gấp 5 lần[3],[51]

Sự ức chế ánh sáng được tạo ra khi cường độ ánh sáng tới lớn hơn cường độ

ánh sáng cần để quang hợp bão hòa.Dunaliellatích lũy lượng lớn β-carotene giúp tế

bào vượt qua điều kiện ức chế ánh sáng và ức chế hoạt tính quang hô hấp cao dướiđiều kiện ánh sánh xanh, trung bình dưới điều kiện ánh sáng trắng và không tồn tạidưới điều kiện ánh sáng đỏ [12] Khi tiếp xúc với ánh sáng xanh cường độ cao trình

tự các sự kiện xảy ra như sau: quang hô hấp, quang phân hủy carotenoid theo thứ tự

9-cis-β-carotene, all-trans-β-carotene, diệp lục tố và cuối cùng là sự phá hủy tế bào

[12] Sự tích lũy các β-carotene (tỷ lệ đồng phân 9-cis/all-trans) phụ thuộc vào

cường độ ánh sáng mà tế bàoDunaliellatiếp xúc trong một chu kỳ phân chia

[36].Tỷlệ này cao ở cường độ ánh sáng thấp (20 - 50 µmol photon/m2/s) hơn ởcường độ ánh sáng cao (200 - 1250 µmol photon/m2/s) [47] Sự tích lũy của β-carotene vàtỷlệ đồng phân của nó phụ thuộc nhiều vào cường độ ánh sáng và chấtlượng ánh sáng được sử dụng[57]

Ngoài các bước sóng nhìn thấy, bức xạ tia cực tím (UV) cũng ảnh hưởng đến

sự tích lũy β-carotene Ánh sáng nhìn thấy gồm 9% tia UV gần (UV-A và UV-B:

290 - 400 nm) tại bề mặt trái đất, trong đó UV-B được hấp thụ bởi ozone ở tầngbình lưu còn lại các tia UV-A chiếu đến trái đất Quang hợp ở nhiều loài thực vậtphù du bị ức chế bởi các bức xạ UV tự nhiên, đặc biệt UV-A đã được nghiên cứu[30] Khi bức xạ UV-A kết hợp với PPFD cao tỷ lệ carotenoid và diệp lục tố trênprotein tăng lên 80 – 310 % [32] Trong điều kiện tiếp xúc với UV-A trong 84 giờkích thích sự gia tăng hàm lượng carotene tổng, trong đó lutein và zeaxanthin tănggấp 3 – 5 lần Bức xạ UV-A có lợi thế là ứng dụng dễ dàng nhưng trong các nuôicấy hệ thống mở việc kiểm soát nó sẽ trở nên khó khăn[3], [56].

Sự đáp ứng của tế bào với các điều kiện tổng hợp carotenoid như tăng độ muối(hình 1.4a) liên quan đến đáp ứng sớm, nhanh với các thay đổi trong tính thẩm thấu

mà không cần đến cảm ứng quá trình phiên mã Sự đáp ứng này dẫn đến sự tích lũynhanh các chất tan thích hợp như glycerol Thứ hai là sự đáp ứng chậm đối với ứcchế muối (hình 1.4a), sự giới hạn dinh dưỡng và ánh sáng cao (hình 1.4b) liên quanđến sự tiếp nhận tín hiệu bởi các chất cảm ứng sơ cấp và hoạt hóa các con đườngtruyền tín hiệu trên màng tế bào và bộ máy quang hợp, lần lượt thay đổi sự biểuhiện gene trong nhân vàtếbào chất Các sản phẩm gene được dịch mã (như enzyme)được đưa vào lục lạp dẫn đến việc sản xuất lipid trung tính và isoprenoid tăng, sau

đó qua con đường MEP (con đường 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate) trong lụclạp Đồng thời cảm ứng con đường sinh tổng hợp carotenoid dẫn đến sự tích lũycarotenoid trong các hạt lipid trong stroma, trước hết là vùng lân cận thylakoid Cáckinase, yếu tố phiên mã (TF), các nhóm oxy hoạt động (ROS) và những thay đổitrong trạng thái oxy hóa của tế bào (như giảm quá mức gốc plastoquinone [PQ] khitiếp xúc với ánh sáng cao) cùng với các nhân tố chưa được biết rõ (X) có thể là mộtphần của mạng lưới phân tử điều hòa đáp ứng của Dunaliella đối với các ức chếmôi trường[3],[54]

1.1.6 Mốiquan hệ giữa con đường tổng hợp carotenoid vàlipid

Các loài vi tảo là những nguồn tiềm năng về nhiên liệu sinh học, các chấtchuyển hóa có giá trị cao và quá trình sản xuất chúng phụ thuộc vào sự tăng trưởngcủa vi tảo Các sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng đã được chứng minh có khả năng sản

xuất chất béo cũng như các sản phẩm có giá trị (đặc biệt là carotenoid) dưới ảnhhưởng của các điều kiện ức chế lý hóa Bên cạnh một số sắc tố, một số loài vi tảo

có thể tổng hợp các acid béo không bão hòa mạch rất dài (VL-PUFA, > 20C) nhưacid Docosahexaenoic và Eicosapentaenoic[42]

Ở H.pluvialishơn 90% các phân tử astaxanthin được ester hóa với các acid

béo Acid oleic là loại acid béo chính liên kết với các phân tử astaxanthin,điềunàycho thấy sinh tổng hợp astaxanthin và acid béo diễn ra đồng thời trong tếbào, phản ứng ester hóa astaxanthin phải gắn liền với hai con đường này Acyl-CoA

là một tiền chất của sự ester hóa astaxanthin, khi dư thừa nó có thể ức chế ngượcenzym acetyl-CoA carboxylase, một enzym giới hạn tốc độ tổng hợp acid béo.Ester hóa astaxanthin là điểm quan trọng cho sự kiểm soát con đường sinh tổng hợpnày Nhiều vi tảo tổng hợp triglyceride cao dưới điều kiện ức chế không sinh học vàđược ứng dụng làm nguyên liệu cho nhiên liệu sinh học[67]

Hiện nay, việc kết hợp sản xuất lipid và carotenoid từ sinh khối của nhiều vitảo đã trở thành một chiến lược đầy hứa hẹn, sự tổng hợp lipid phụ thuộc vào sựtích lũy carotenoid dưới điều kiện ánh sáng cao và sự sản xuất acid béo gắn liền với

sự tích lũy carotenoid [69] ỞH.pluvialis, sự tích lũy carotenoidphụthuộc vào sự sản xuất triglyceride [26] Tương tự,D salinasự tích lũy carotenoid (β-carotene) và

lipid tăng dưới điều kiện ức chế ánh sáng và độ muối[50]

Có thể thấy rằng, các phân tử kỵ nước như carotenoid, đặc biệt là carotene,không thể tích lũy trong tế bào chất hoặc chất nền ưa nước của tế bào mà không cócác cấu trúc hoặc thể phù hợp [46] Carotenoid thứ cấp được tích lũy trong các cấutrúc riêng: hạt lipid (plastoglobuli) và thể dầu (OB-oil body) Tất cả các cấu trúcnày được hình thành với sự tham gia của các chất béo trung tính, chủ yếu là cáctriacylglycerol (TAG) và protein, oleoresin [49] Hơn nữa, xanthophyll như

astaxanthin được ester hóa bởi acid béo Như vậy,H.pluvialisvà các loài của chiChlorellacó khả năng tổng hợp carotenoid ở những bước cuối cùng của sự hình

thành bào tử, hơn 95 % xanthophyll thứ cấp được ester hóa với acid béo (chủ yếu làC18) Điều này cho thấy, một lượng lớn xanthophyll phân cực tích lũy trongm ô i

trườngkỵnước của OB [63] Các kích thích sinh tổng hợp carotenoid thứ cấp

ởH.pluvialisvà các vi tảo có khả năng tổng hợp carotenoid khác luôn gắn với sự

tích lũy TAG nhanh chóng Cuối cùng, ở các vi tảo này TAG chiếm hơn 95 % tổng

số lipid trong tế bào được biểu hiện bởi TAG của OB chứa carotenoid thứ cấp Vìvậy, ở vi tảo tồn tại mối liên hệ chặt chẽ giữa sinh tổng hợp carotenoid thứ cấp vàlipid, đặc biệt là sinh tổng hợp FA và TAG [69] Sự ức chế gây ra tích lũy lipidtrung tính trong các thể lipid trong tế bào chất hoặc chất nền là điều kiện tiên quyếtcho sự tích lũy carotenoid thứ cấp trong các tế bào tảo[3]

Các yếu tố ức chế tự dưỡng (như ánh sáng, nhiệt độ, nitrate, phosphate, độmuối ) và dị dưỡng (như glucose, glycerol, ure) được sử dụng nhiều và các yếu tố

ức chế lý hóa ảnh hưởng lên sự chuyển hóa của vi tảo đã được xác định Những yếu

tố ức chế được sử dụng phổ biến để tăng sự tích lũy lipid là ánh sáng, nhiệt độ vànitrate [42]

Nhiệt độ là yếu tố ức chế ảnh hưởng mạnh lên sự tăng trưởng và tích lũycarotenoid, lipid và thành phần acid béo ở nhiều loài vi tảo Sự tăng trưởng và cáccon đường chuyển hóa ở vi tảo thay đổi với sự thay đổi của nhiệt độ [33]

Ánh sáng có thể mang lại những thay đổi trong thành phần hóa học của vi tảo.Ánh sáng cần thiết cho quang hợp và chu kỳ ánh sáng cũng là yếu tố quan trọng

cho sự tăng trưởng của vi tảo ỞMychonastes homosphaera,Chlorella vulgaris,Raphidocelis subcapitatavàScenedesmussp sự sản xuất lipid tăng khi tăng

cường độ ánh sáng [24] Theo Khotimchenko và Yakovleva (2005) hàm lượng acidbéo không bão hòa (PUFA) cao, tuy nhiên ở cường độ ánh sáng cao thì sựtíchlũylượng acid béo bão hòa và acid béo không bão hòa có một liên kếtđôi

Nitrate là một trong những dinh dưỡng đa lượng quan trọng trong các môitrường nuôi cấy, nitrogene chiếm khoảng 1-10% sinh khối khô của vi tảo, là chấtdinh dưỡng quan trọng nhất ảnh hưởng lên sự tăng trưởng và tích lũy lipid ở vi tảo[25] Ở một số vi tảo sự tích lũy lipid tăng trong điều kiện cạn kiệt dinh dưỡng

nitrogene như sự sản xuất lipid tăng gấp đôi ởNeochloris oleoabundans Sự cạn

kiệtn i t r o g e n e c ũ n g ả n h h ư ở n g l ê n c o n đ ư ờ n g t ổ n g h ợ p c a r b o h y d r a

t e n h ư h à m

lượng carbohydrate tăng gấp 4 lần ởTetraselmis subcordiformisvà khoảng 29% ởScenedesmus obliquus[70], [31] Tuy nhiên, sự tích lũy lipid tăng khi tăng nồng

độ nitrate ởAuxenochlorella pyrenoidosavàScenedesmussp., ngược lại ởAuxenochlorella protothecoidesvàC Vulgarissự tích lũy lipid cao ở nồng độ

nitrate thấp [52]

Phosphor chiếm ít hơn 1% sinh khối của vi tảo (khoảng 0.03 - 0.06%) nhưng

là một phần thiết yếu trong môi trường cho sự tăng trưởng và phát triển ổn định của

vi tảo Sự thiếu phospho trong môi trường dẫn đến ức chế quang hợp, ảnh hưởnglên sự tăng trưởng và chuyển hóa của vi tảo Sự giới hạn phosphate dẫn đến sự tăng

tích lũy lipid ở tế bào vi tảo như ởScenedesmussp LX1 nước ngọt vàBotryococcus braunii, sự tích lũy lipid tăng khi bị giới hạn phosphor Những nghiên cứu khác cũng cho thấy hàm lượng carbohydrate tăng từ 11 đến 67% ởSpirulina,Arthrospira platensistrong điều kiện giới hạn phosphor[39].

Độ muối là một yếu tố ức chế phức tạp ảnh hưởng lên sự tích lũy lipid và loạiacid béo ở vi tảo Nhiều loại vi tảo có khả năng chống chịu với ức chế muối ở phổ

rộng.Dunaliellasp là một trong những loài có khả năng chống chịu với độ muối cao, tạo ra lượng lớn lipid và sinh khối như ởD tertiolectaATCC 30929 tích lũy

hàm lượng lipid cao lên đến 70% trong điều kiện độ muối cao Tuy nhiên, độ muốiquá cao trong môi trường nuôi cấy gây ra ức chế quang hợp làm giảm sinh khối vàhàm lượng lipid [64]

1.2 β-carotene và vai trò đối với sứckhỏe

1.2.1 Giớithiệuβ-carotene

β-carotene là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn[1].β-carotene có công thức phân tử là C40H56, điểm nóng chảy là 180oC, khối

lượngphân tử là 536,8726 g/mol Công thức cấu tạo của β-carotene:

Hình 1.6.Cấu trúc phân tử β-carotene

β-carotene là tiền chất của vitamin A Khi hấp thu vào cơ thể, β-carotene sẽchuyển hóa thành vitamin A β-carotene là chất chống oxy hóa mạnh, ngăn chặn tếbào ung thư, chống sự hình thành cục máu đông trong thành mạch máu Sau khichuyển thành vitamin A có tác dụng bảo vệ niêm mạc mắt, tăng cường miễn dịch cơthể [1]

β-carotene có nhiều dạng đồng phân nhưng các loại β-carotene tổng hợp chỉchứa các đồng phân all-trans-β-carotene Trong khi đó đồng phân 9-cis lại là thànhphần chống oxy hóachủyếu của β-carotene và nó chỉ có trong β-carotene tự nhiên,thường thấy trong các loại trái cây và rau quả có màu vàng và xanh đậm như cà rốt,gấc, khoai lang, rau ngót… chiếm khoảng 0,001% - 0,01% sinh khối khô; trong các

cơ quan động vật như gan cá, trứng… Một số loài vi sinh vật như nấm sợiBlakeslea, nấm menRhodotorulacũng chứa hàm lượng đáng kể β-carotene 0,05% - 0,2% sinh

khối khô Ở vi tảo, β-carotene thường chiếm khoảng 0,1% sinh khối khô Tuy nhiên,

ở một số loài, β-carotene có thể chiếm tới5% sinh khối khô như vi tảoAmphidinium carterea,hoặc thậm chí tới 10% sinh khối khô như vi tảoD.salina[1].

1.2.2 Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe

Đối với người lớn

- β-carotene là nguồn bổ sung vitamin A cho những người ăn chaythuần

- β-carotene giúp loại bỏ tế bào chết dư thừa trên da, nhờ đó có công dụng trong làmđẹp

- β-carotene còn là một chất có khả năng chống oxy hóa mạnh, ngăn chặn quá trình lão hóa và cả phòng ngừa ung thư

Đối với trẻ nhỏ

- β-carotene rất quan trọng cho trẻ nhỏ để có được đôi mắt thêm sáng và tinh anh, ngăn chặn mùlòa

- Ngoài ra, β-carotene còn tốt cho hệ miễn dịch của trẻ

Đối với phụ nữ mang thai

- β-carotene rất quan trọng trong quá trình phát triển của cả tim, gan, phổi, thận, mắt, xương và hệ thần kinh trung ương của thainhi

- Ngoài ra, β-carotene còn hỗ trợ sự phục hồi của phụ nữ sau sinhmổ

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ChủngDunaliella bardawilDCCBC 15 và môi trường nuôicấy

VitảođượcsửdụngtrongnghiêncứunàylàchủngtảoDunaliellasalinavar.bard awilD C C B C 1 5 ( Dunaliellab a r d a w i l D C C B C 1 5 ) đ ư ợ c c u n g c ấ p b ở i T S

Juergen E.W.Polle, phòng Sinh học, trường Đại học Brooklyn, New York,HoaKỳ.Tảođ ư ợ c n u ô i t r o n g m ô i t r ư ờ n g M D 4 1 , 5 M N a C l c ó c á c t h à n h p h ầ n g ồ

m : NPK0, 1g / L , M g S O41,86g/ L, E D T A 8, 76 m g / L , F eC l30,49m g / L , Mn C l21,89mg/L,N a H C O350 mM, pH = 7.5, ở 25oC với cường độ ánh sáng 50

μm và dài 6-25 μm [molphoton/m2/s, chukỳsáng : tối = 12 : 12giờ

2.2 Phương pháp phân tích

2.2.1 Quan sát hình thái tếbào

Hình thái tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại400X sau mỗi 2-3 ngày

2.2.2 Xác định mật độ tế bào và tốc độ tăng trưởng đặchiệu

Lấy 100 µL dịch tảo được cố định bởi dung dịch Lugol (5% Iod và 10% muốiKI) Mật độ tế bào được xác định bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồngcầu mỗi 2-3 ngày, sử dụng kính hiển vi quang học với buồng đếm có độ sâu 0,1

mm và diện tích ô vuông 1 mm2 Mật độ tế bào trong 1 mL được tính theo côngthức[27]:

µ =Trong đó:

N1, N2: mật độ tế bào tại ngày 1 và ngày 2

t1, t2: thời điểm ngày 1 và ngày 2

2.2.3 Xác định hàm lượng carotene tổng và diệp lụctố

Lấy 1 mL dịch nuôi cấy, ly tâm ở 5000 vòng trong 5 phút, phần tảo bên dướiđược ly trích với 3 mL ethanol: hexane (2:1 v/v) Thêm vào 2 mL nước và 4 mLhexane, vortex Hỗn hợp ly trích này được ly tâm 5000 vòng trong 5 phút.Lớpsắc

tố có hexane bên trên được đọc ở các bước sóng 450 nm, 645 nm, 662nm

- Hàm lượng carotenoid tổng có trong 1 mL mẫu phân tích được xác định theocông thức [58],[53]:

A450là độ hấp thu tại bước sóng 450 nm

A645là độ hấp thu tại bước sóng 645 nm

A662là độ hấp thu tại bước sóng 662 nm

2.2.4 Xác định khả năng chống oxyhóa

- Thuốc thử DPPH được pha loãng bằng cách hòa tan 0,004 g DPPH 1-picrylhydrazyl) trong 100 mL methanol [21],[52]

(2,2-diphenyl Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 5.000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch Thêm

1mL ethanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều và ủ 4 tiếng ở 4oC Ly tâm 5000 vòngtrong 5 phút, dùng 0,5 mL dịch trích trộn với 1 mL dung dịch DPPH, để trong tốikhoảng 30 phút và đo quang ở bước sóng 517nm

- Mẫuđ ối ch ứn g đ ư ợ c c h u ẩ n b ịt ư ơ n g tự n h ư t r ê n n hư ng dù ng e t h a n o l tu yệ tđ ối

thay cho mẫu Khả năng chống oxy hóa (I%) được tính dựa trên khả năng ức chếcủa các bức xạ tự do của DPPH theo công thức [4], [68]:

I% = (A đối chứng - A mẫu )/A đối chứng x 100 2.2.5 Xác định hàm lượng phenolictổng

- Lấy 1,0 mL dung dịch tảo ly tâm 5.000 vòng trong 5 phút, loại bỏ dịch Thêm 1

mL methanol tuyệt đối vào cắn, trộn đều Ly tâm 5000 vòng trong 5 phút,lấy0,5 mLdịch trích cho vào eppendorf 2 mL, sau đó thêm vào 0,5 mL thuốc thử Folin-Ciocalteau's phenol, lắc đều Sau 3 phút, thêm 0,5 mL Na2CO310% vào hỗn hợp,đểtrong tối 1,5 giờ và hỗn hợp được đo quang ở bước sóng 750 nm [37], [23], [38],[62] Hàm lượng phenolic tương đương với lượng acid gallic/g[29]

- Đường chuẩnphenolic:

Sử dụng nồng độ acid gallic chuẩn từ 10 đến 200 mg/L đểxâydựng đườngchuẩn và xác định nồng độ phenolic tổng trong mẫu bằng phương trình đườngchuẩn y = 30,263x – 0,0638; R² =0,9948

2.2.6 Xác định trọng lượng khô

Lấy 10 mL dịch nuôi cấy tảo, lọc qua màng lọc sợi thủy tinh với đường kínhmàng là 47 mm, đường kính lỗ 1µm đã sấy khô và biết khối lượng [A(g)] Sau khilọc màng lọc được rửa bằng nước cất sau đó sấy khô trong tủ sấy ở 60oC trong 12tiếng hoặc cho đến khi trọng lượng khô không đổi Sau khi sấy, chuyển màng lọcvào bình hút ẩm, để nguội và cân lại khối lượng màng lọc [B(g)] Trọng lượng khôcủa tảo [C(g)] là phần khác biệt giữa khối lượng màng lọc trước và sau khi lọc tảo[C (g/L)] = [B (g) – A (g)]*100

2.2.7 Xác định hàm lượng lipid bằng phương phápsulfo-phospho-vanillin

Thuốc thử Phosphovanillin được chuẩn bị bằng cách hòa tan 0,06 g vanillintrong 2 mL ethanol tuyệt đối và 8 mL nước cất, lắc kỹ Sau đó thêm 50 mL acidphosphoric đậm đặc Hỗn hợp thu được được bảo quản trong tối Để đảm bảo hoạttính cao, thuốc thử Phosphovanillin được chuẩn bị ngay trước mỗi lần làm thínghiệm [43]

Xác định hàm lượng lipid: 1 mL dịch đem đi ly tâm 5000 vòng/5 phút và cắn

thu được chiết với 2 mL acid sulfuric đậm đặc (98%) sau đó đun trên bếp cách thủy

100oC trong 10 phút, làm lạnh trong bể nước đá Bổ sung 5 mL thuốc thửPhosphovanillin được chuẩn bị sẵn, mẫu được ủ ở 37oC và lắc mẫu liên tục Độ hấpthu được đo ở bước sóng 530 nm [43] Hàm lượng lipid có trong mẫu được xácđịnh bằng đường chuẩnlipid

Đường chuẩn lipid: dầu cải thương mại (hiệu Tường An) được pha trongchloroform (nồng độ 1 mg/mL), nồng độ lipid chuẩn (10 – 150 µg) và thực hiệntrong các ống nghiệm có nắp Ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 90oC, 10 phút đểbayhơichloroform Thêm 2 mL acid sulfuric đậm đặc, sau đó đun trên bếp cách thủy 100oCtrong 10 phút, làm lạnh trong bể nước đá Bổ sung 5 mL thuốc thử Phosphovanillin,hỗn hợp được ủ ở 37oC và lắc mẫu liên tục Đo mẫu ở bước sóng 530 nm Sau đóthu được phương trình lipid chuẩn y = 0,005x – 0,0531, R2= 0,9929

2.2.8 Thu hoạch sinh khối tảo phân tíchβ-carotene

Ly tâm dịch nuôi cấy tảo trong falcon 15 mL với tốc độ 5000 vòng/15 phút đểlấy sinh khối tảo Sau đó sấy bằng tủ sấy ở 60oC đến khi khô hoàn toàn Mẫu thuđược bảo quản trong tối và đem đi phân tích β-carotene

2.3 Phương pháp thiết kế thínghiệm

2.3.1 Khảosát sự tăng trưởng của vitảoDunaliella bardawilDCCBC 15 trong

môi trường MD4 1,5MNaCl

Dunaliella bardawilDCCBC 15 đạt phase tăng trưởng sau 8-10 ngày nuôi cấy

được sử dụng để bố trí các thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện trong bình tamgiác 500 mL với 370 mL môi trường MD4 1,5M NaCl, pH = 7,5, mật độ tế bào banđầu là 14×104tế bào/mL và sục khí liên tục

Điều kiện nuôi cấy: cường độ ánh sáng 50 µmol photon/m2/s, chu kỳ sáng : tối

= 12 : 12 giờ, nhiệt độ 25 ± 2oC

Quan sát hình thái tế bào, xác định mật độ và trọng lượng khô tế bào, phân

tích hàm lượng diệp lục tố, carotenoid củaD.bardawilDCCBC 15 sau mỗi 2 ngày

nuôi cấy Nghiệm thức được lặp lại 3lần

Sinh khối khô của vi tảoDunaliella bardawilDCCBC 15 thu hoạch sau 22

ngày nuôi cấy được sử dụng để phân tích hàm lượng β-carotene bằng phương pháp

HPLC tại phòng thí nghiệm Kiểm nghiệm thuốc công ty DHG Pharma

2.3.2 Khảos á t s ự t ă n g t r ư ở n g v à t í c h l ũ y c a r o t e n o i d c ủ a v i tảoD u n a l i e l l

a

bardawilDCCBC 15 dưới cácđiềukiên nuôi cấy ức chế khác nhau

Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường MD4 1,5M NaCl gồm

Giai đoạn nuôi cấy ức chế: Sau 16 ngày nuôi cấy tăng trưởngD bardawil

DCCBC 15 được chuyển sang các điều kiện ức chế khác nhau (bảng 2.1)

Quan sát hình thái tế bào, xác định mật độ tế bào, phân tích hàm lượng diệp

lục tố và carotenoid, khả năng chống oxy hóa, hàm lượng phenolic tổng, hàm lượng

lipid và trọng lượng khô củaD.bardawilDCCBC 15 ở các nghiệm thức được xác

định sau mỗi 3 ngày nuôi cấy Các nghiệm thức được lặp lại 3lần

Sinh khối khô của vi tảoDunaliella bardawilDCCBC 15 thu hoạch sau 31

ngày nuôi cấy được sử dụng để phân tích hàm lượng β-carotene bằng phương pháp

HPLC tại phòng thí nghiệm Kiểm nghiệm thuốc công ty DHG Pharma

Bảng 2.1.Thí nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện ức chế khác nhau lên sự tích lũy

carotenoid củaD.bardawilDCCBC 15

Cạn kiệt dinh

dưỡng

Sau 16 ngày nuôi cấyD.bardawilDCCBC 15

được chuyển qua điều kiện ánh sáng 100µmol photon/m2/s

Đối chứng

Ức chế H2O2

Sau 16 ngày nuôi

cấyD.bardawilDCCBC15được chuyển qua

điều kiện ánh sáng100µmol photon/m2/s kết hợp bổ sungH2O212,5µM

H2O2+ AS300

2.4 Phương pháp phân tích sốliệu

Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft office Excel 2016 và thực hiệnphân tích One-way ANOVA bằng phần mềm SPSS phiên bản 20.0 Mức ý nghĩathống kê p < 0,05 Tất cả các số liệu trong thí nghiệm được trình bày dưới dạngTrung bình (Mean) ± Sai số chuẩn (SE)