ỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍCH LŨYPOLYPHOSPHAT TRONG QUI TRÌNH XỬ LÝNƯỚC - ĐẶC BIỆT NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA

Mục đích của chuyên đề này là tìm hiểu về quá trình loại bỏ phosphat hòa tan bởi visinh vật và tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân lập có hiệu suất loại bỏ phosphat cao để ứng dụng xử lý p

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

ỨNG DỤNG VI KHUẨN TÍCH LŨY

POLYPHOSPHAT TRONG QUI TRÌNH XỬ LÝ NƯỚC - ĐẶC BIỆT NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA

Nghiên cứu sinh thực hiện

LÊ QUANG KHÔIKhóa: 2011 – 2015

Cần Thơ, 9/2013

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN ĐỀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Nghiên cứu sinh thực hiện

LÊ QUANG KHÔIKhóa: 2011 – 2015

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH HÌNH iii

DANH SÁCH BẢNG iii

TÓM LƯỢC v

BẢNG CHÚ THÍCH vi

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 1 Phospho và tác động của chúng đến chất lượng nước 1

1 2 Sự hấp thu và giải phóng phospho hòa tan 2

1 3 Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra 3

1 4 Mục đích của chuyên đề 4

1 5 Yêu cầu chuyên đề 4

CHƯƠNG 2: QUÁ TRÌNH LOẠI BỎ PHOSPHO HÒA TAN 5

2 1 Loại bỏ phospho bằng hóa chất 5

2 2 Cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy polyphosphat 7

2 3 Loại bỏ phospho bằng con đường sinh học thông qua quá trình EBPR 11

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3 1 Phương tiện nghiên cứu 14

3 1 1 Thiết bị, dụng cụ 14

3 1 2 Nguyên vật liệu 15

3 2 Phương pháp nghiên cứu 15

3 2 1 Phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P 15

3 2 2 Chụp kính hiển vi điện tử truyền quét (Transmission Electron Microscopy) 15

3 2 3 Nhận diện gen poly-phosphate kinase 1 (ppk 1): Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk 1 theo He và McMahon, (2011) 16

3 2 4 Định danh dòng TGT025L 17

3 2 5 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường tổng hợp 17

3 2 6 Thí nghiệm loại bỏ phosphat trong nước ao nuôi cá tra (qui mô 10 lít) 18

3 2 7 Thí nghiệm loại bỏ phosphat trong nước ao nuôi cá tra 100 lít 19

3 2 8 Phương pháp phân tích 19

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

4 1 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân lập 20

4 1 1 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat của 20 dòng vi khuẩn 20

4 1 2 Kết quả chụp TEM 20

4 1 3 Kết quả PCR 21

4 1 4 Kết quả định danh 22

4 2 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường tổng hợp 23

4 2 1 Sự biến đổi chỉ số pH theo thời gian 23

4 2 2 Sự biến đổi chỉ số OD.600 nm và hàm lượng PO43- theo thời gian 23

4 3 Kết quả loại bỏ phosphat trong nước ao nuôi cá tra 25

4 3 1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian trong thí nghiệm qui mô 10 lít 25

4 3 1 Sự biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian trong thí nghiệm qui mô 100 lít 27

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 28

5 1 Kết luận 28

5 2 Đề nghị 28

Tài liỆu tham khẢo 29

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Hệ thống tăng cường loại bỏ phospho sinh học (van Loosdrecht et al., 1997)11Hình 2: Các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR Sự chuyển đổi kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí (van Loosdrecht et al., 1997) 12Hình 3: Ảnh chụp TEM dòng TGT025L: [(a) (x20,000)], [(b) (x50,000)] 21Hình 4: Sản phẩm PCR của 5 dòng vi khuẩn trên gel agarose 1,2 % (1) Thang chuẩn DNA 100 bp ladder marker; (2, 9) đối chứng âm; (3, 4, 5, 6, 7) sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA của các dòng vi khuẩn TGT025L, BTT006L, TGT013L, AGH006L và VLH013L; (8) thanh chuẩn DNA marker-C (100 - 1200 bp); (10, 11) sản phẩm PCR đoạn gen ppk 1 dòng TGT013L và TGT025L Ảnh chụp ngày 25/03/2013 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - trường Đại học Cần Thơ 21Hình 5: Cây phả hệ 5 dòng vi khuẩn được xây dựng dựa trên trình tự 16S rRNA theo phương pháp Maximum Likehood [Chương trình MEGA5.0, (Tamura, 2011)] 22Hình 6: Biến đổi pH theo thời gian của 5 dòng vi khuẩn 23Hình 7: Sự biến đổi hàm lượng PO43- và chỉ số OD.600 nm theo thời gian: (a) dòng TGT025L, (b) dòng AGH006L, (C) dòng TGT013L, (d) dòng BTT006L, (e) dòng VLH013L; (f) phương trình tuyến tính giữa chỉ số OD.600 nm và mật số vi khuẩn (CFU) 24Hình 8: Hiệu suất loại bỏ phosphat của 5 dòng vi khuẩn sau 25 giờ nuôi cấy trong môi trường tổng hợp Dòng vi khuẩn có cùng mẫu tự theo sau chỉ sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% (phép thử Turkey, Minitab 16) 25Hình 9: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian 26Hình 10: Biến đổi hàm lượng PO43- theo thời gian giữa 2 nghiệm thức 27

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Hóa chất thường dùng để trầm hiện orthophosphat và sản phẩm của chúng 5Bảng 2: Chỉ số sinh học và hóa học để đánh giá khả năng loại bỏ phospho 6Bảng 3: Acid béo hòa tan được hình thành trong bể kỵ khí 11

Bảng 4: Cấu trúc phân tử các đơn vị cấu tạo nên poly-β-hydroxyalkanoates 12Bảng 5: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk 1 16Bảng 6: Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trường của 20 dòng vi khuẩn 20Bảng 7: Kết quả định tên các dòng vi khuẩn dựa trên trình tự gen 16S rRNA 22

TÓM LƯỢC

Loại bỏ hay chuyển hoá phospho bằng con đường sinh học là một phương pháp phổbiến được áp dụng Một số loài vi sinh vật dị dưỡng có khả năng hấp thu phosphat và dựtrử chúng dạng polyphosphat nội bào và chúng được gọi là vi sinh vật tích lũypolyphosphat (polyphosphate accumulating organisms-PAOs) Trong đó, vi khuẩn tíchlũy polyphosphat là nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằngcon đường sinh học Chúng tích lũy lượng lớn polyphosphat nội bào, góp phần vàoquá trình loại bỏ phospho hòa tan trong nước

Mục đích của chuyên đề này là tìm hiểu về quá trình loại bỏ phosphat hòa tan bởi visinh vật và tuyển chọn các dòng vi khuẩn phân lập có hiệu suất loại bỏ phosphat cao

để ứng dụng xử lý phospho hòa tan trong nước ở phạm vi phòng thí nghiệm Trong số

20 dòng vi khuẩn phân lập được tuyển chọn ban đầu, có 5 dòng có khả năng làm giảmnhanh hàm lượng phosphat với hiệu suất loại bỏ từ 55,3 tới 76,6% sau 36 giờ chủng vikhuẩn vào môi trường nước thải tổng hợp Kết quả thí nghiệm ứng dụng 5 dòng vikhuẩn này để loại bỏ phosphat cho thấy rằng, 2 dòng TGT013L và TGT025L có khảnăng làm giảm hàm lượng phosphat trong nước thải tổng hợp từ 17,7 mg/l xuống còn4,1 và 2,6 mg/l sau 25 giờ thí nghiệm, với hiệu suất loại bỏ phosphat trong môi trườngtương ứng là 76,5% và 85,3% (ở pH khoảng pH 8,1; chỉ số OD.600 nm khoảng 0,6).Kết quả chụp TEM và PCR cho thấy rằng 2 dòng vi khuẩn này có gen đồng hóaphosphat thành dạng hạt poly-phosphat nội bào Chúng được xác định có mối quan hệ

gần gũi với Acinetobacter radioresistens và Kurthia sp (cùng tỉ lệ tương đồng với

trình tự 16S rRNA trên Genbank, 99%) Ứng dụng 2 dòng vi khuẩn này loại bỏphosphat hòa tan trong nước ao nuôi cá tra Kết quả loại bỏ phosphat trong môi trường

ở mô hình 10 lít có hiệu suất từ 75,6 đến 88,7% sau 36 giờ; mô hình 100 lít từ 60,35đến 80,90% sau 48 giờ cấy bổ sung vi khuẩn với hàm lượng PO43- còn lại trong môitrường thấp Hai dòng vi khuẩn này có nhiều tiềm năng ứng dụng để xử lý phosphohòa tan trong nước

Từ khóa: Vi khuẩn tích lũy poly-P, polyphosphat, loại bỏ phosphat, nước ao cá tra

BẢNG CHÚ THÍCH

ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long

DPABs: Denitrifying polyphosphate accumulating bacteria (vi khuẩn tích lũy poly-P khử nitơ)EBPR: Enhanced biological phosphorus removal (Tăng cường sự loại bỏ P bằng sinh học)N: Nitơ

TEM: Transmission electron microscopy (kính hiển vi điện tử truyền quét)

SCFAs: Short chain fatty acids (axid béo mạch ngắn)

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nghề nuôi cá tồn tại đã hơn 4000 năm nhưng chỉ vài thế kỷ nay mới mở rộng thành

nghề nuôi trồng thủy hải sản nước ngọt và nước mặn (Trần Bá Cừ et al., 2003) Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là mặt hàng xuất khẩu và tiêu thụ nội địa quan trọng

của ngành thủy sản Đồng bằng sông Cửu Long (Dương Tấn Lộc, 2006) Trong nhữngnăm qua, nghề nuôi cá tra nói riêng và nuôi thủy sản nói chung đang phát triển ngàycàng mạnh mẽ, ngành thủy sản An Giang đạt mức tăng trưởng cao với kết quả vượt kếhoạch nhiều chỉ tiêu như: diện tích nuôi đạt 2.384 ha, tăng 24,3% so với cùng kỳ, sảnlượng 263.592 tấn, giá trị xuất khẩu 125.000 tấn, tương đương 335 triệu USD (Tạp chíKhoa học và Công nghệ An Giang, số 06/2007) Nuôi trồng thủy sản đặc biệt là cá tra,

là một trong những thế mạnh phát triển kinh tế của Đồng Bằng Sông Cửu Long và việcthải nước trực tiếp từ các ao nuôi thủy sản ra ngoài môi trường tự nhiên là không thể

kiểm soát Do đó nguy cơ ô nhiễm nguồn nước mặt là điều không tránh khỏi Các nguồn

gây ô nhiễm nước chủ yếu là thức ăn tồn đọng, chất thải bài tiết của cá, bùn đáy ao…Thành phần các chất gây ô nhiễm chủ yếu là protein, lipid, acid béo, photpholipid,carbohydrate, hàm lượng nitơ, chất khoáng…(Nguyễn Văn Châu, 2008) Đây cũngchính là vấn đề mà các ngành chức năng đang quan tâm tìm ra những giải pháp hợp lýcho việc phát triển nghề nuôi thủy sản bền vững Quá trình nuôi thủy sản sẽ dẫn đến sựtích tụ nhiều chất hữu cơ trong ao nuôi và đây là nguyên nhân gây ô nhiễm cho các thủyvực Sự phân giải các chất hữu cơ dư thừa này sẽ làm cho nồng độ nitơ (N) và phospho(P) hòa tan vượt quá mức chịu đựng của thủy sản

1 1 Phospho và tác động của chúng đến chất lượng nước

Phospho được xác định như là yếu tố dinh dưỡng thiết yếu cho sự sống P là thànhphần cấu tạo nên các hợp chất quan trọng của sự sống như: các phân tử di truyềnDNA, RNA; các phân tử cấu trúc như protein, lipid; các phân tử dự trữ năng lượng cho

tế bào như ATP, poly-P…Tuy nhiên, mặc dù P vừa là một yếu tố kiểm soát sự tăngtrưởng và phát triển của sinh vật nhưng chúng cũng là nhân tố chủ yếu gây ra hiệntượng phú dưỡng hóa Ở hàm lượng vượt mức cho phép, P kích thích mạnh mẽ khả năngtăng sinh khối của thủy sinh vật như tảo, tảo lam…Bowman et al., (2007), chỉ ra rằng,một lượng nhỏ P trong nước 0.1 mg/l và duy trì thời gian dài sẽ gây sự phát triển mạnh

mẽ của tảo Sự biểu hiện có thể nhận biết rõ của hiện tượng này là sự bùng nổ của tảo, sự

giảm hàm lượng oxy hòa tan kéo theo nước ô nhiễm nặng, cá chết, các thực vật – động vậtthủy sinh dần dần bị tiêu diệt Trong một vài trường hợp, có sự xuất hiện của tảo độc như

Microsystis Sự quá dư thừa lượng dinh dưỡng trong nước làm gia tăng sự hoạt động các

vi sinh vật có hại như Pfisteria Điều này sẽ tác động đến nền kinh tế thông qua ảnh

hưởng của chúng đến nghề nuôi cá thương mại, du lịch sinh thái và có thể ảnh hưởng đếnsức khỏe con người

1 2 Sự hấp thu và giải phóng phospho hòa tan

Sự hấp thu và giải phóng P hòa tan dạng phosphat phụ thuộc vào các yếu tố nhạy cảmtrong các phản ứng oxy hóa khử dưới điều kiện hiếu khí và kỵ khí Trong điều kiệnhiếu khí P sẽ được hấp thu và giải phóng trở lại trong điều kiện kỵ khí dưới sự hiệndiện của Fe3+/Fe2+ (Zhou et al., 2005) Trước đây, quá trình hấp thu P hòa tan được xemnhư là quá trình loại bỏ bằng con đường hóa học (Peng et al., 2007) Tuy nhiên, nhiềubằng chứng cho thấy quá trình sinh học đóng vai trò quan trọng (Gächter et al 1988).Bên cạnh xử lý P hòa tan bằng con đường hóa học, nhiều vi sinh vật có khả năng hấpthu lượng lớn phosphat và tồn trữ chúng dạng poly-P nội bào Nhiều nghiên cứu cũngcho rằng cả hai quá trình hóa học và sinh học đều có vai trò quan trọng trong quá trìnhhấp thu và giải phóng phosphat (Khoshmanesh et al., 1999) Tác động của vi khuẩntrong quá trình hấp thu và giải phóng phosphat có thể thông qua con đường trực tiếpnhư: sự phân hủy các hợp chất hữu cơ, tích tụ và phóng thích phosphat hoặc gián tiếpthông qua quá trình khoáng hóa (Davelaar 1993) Chính vì vậy, vi khuẩn tích lũy poly-

P được xem xét và sử dụng trong quá trình loại bỏ các thành phần dinh dưỡng trongcác hệ thống xử lý nước thải (Mino et al., 1998), bên cạnh đó, chúng cũng hiện diệntrong các ao hồ trong tự nhiên (Davelaar 1993)

Loại bỏ PO43- thông qua hoạt động vi khuẩn ngày càng được ứng dụng bởi vì các đặctính hữu dụng của chúng là: dễ ứng dụng, hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện vớimôi trường sống Một số vi khuẩn có khả năng hấp thu và tồn trữ P như nguồnphospho nội bào, nguồn P cần thiết cho tế bào khi môi trường sống thiếu hụt vềphospho, và chúng được xem như là vi khuẩn tích lũy poly-phosphat Vi khuẩn tíchlũy poly-phosphat được biết đến như là vi sinh vật có khả năng hấp thu phosphat tự dotrong môi trường và đồng hóa chúng dưới dạng hạt poly-phosphat (poly-P) nội bào.Quá trình này đã được xem như là quá trình làm tăng cường loại bỏ P sinh học

(Enhanced biological phosphorus removal - EBPR) trong các hệ thống xử lý nước thảitheo chuỗi [Sequencing batch reactors – SBRs, (Mino et al., 1998; Bond et al., 1999)].Dưới điều kiện thiếu oxy, PAOs phân giải poly-P lấy năng lượng cho quá trình đồnghóa các hợp chất hữu cơ mạch ngắn như acetat thành poly-hydroxyalkanoates (PHAs),đồng thời phóng thích PO43-, kết quả là làm gia tăng tạm thời hàm lượng PO43- trongmôi trường Khi điều kiện môi trường có oxy, chúng phân hủy PHAs tạo nguồn carboncho quá trình tăng trưởng và nguồn năng lượng để tái tạo lại poly-P Kết quả là làmgiảm tổng lượng phosphat thông qua lượng sinh khối tăng thêm chứa lượng poly-Pmới tái tạo (Mino et al., 1998).

1 3 Nguồn chất thải từ ao nuôi cá tra

Nguồn chất thải chủ yếu chứa lượng lớn P là phân động vật Chúng tồn tại 3 dạng: P hữu

cơ (P liên kết trong các hợp chất hữu cơ), orthophosphat (PO43-) và poly-P Hầu hết các Phữu cơ và poly-P có thể chuyển hóa thành PO43- thông qua quá trình sinh học

Theo Lê Bảo Ngọc (2004), bình quân sản xuất 1kg cá Tra sẽ thải ra môi trường 23,2g

N và 8,6g P Khi cho ăn, cá chỉ hấp thu được chỉ khoảng 17% năng lượng trong thức

ăn và phần còn lại (83%) sẽ thải ra và hòa lẫn trong môi trường nước trở thành cácchất hữu cơ phân hủy

Theo Huỳnh Trường Giang et al., (2008) nước ao nuôi cá Tra thâm canh ở An Giangvào mùa khô có TSS từ 3,5-122,7mg/l, TAN từ 0,053-2,513mg/l, PO43- từ 0,004-1,973mg/l, NO2- từ 0,001-1,359mg/l, NO3- từ 0,122-18mg/l; trong mùa mưa TSS từ18,5-188mg/l, TAN từ 0,11-4,062mg/l, PO43- từ 0,003-2,28mg/l, NO2- từ 0,034-1,359mg/l, NO3- từ 0,194-8,743mg/l

Thay nước ao nuôi là việc làm rất cần thiết trong quá trình nuôi cá Tra Số lần thaynước trong sáu tháng bình quân là 30-40 lần và có thể lên đến 90 lần (Lê Anh Tuấn,2008) Lượng nước nầy hầu như 100% được thải trực tiếp ra sông, rạch mà không qua

xử lý Đây là mối đe dọa lớn đến chất lượng nước mặt cho sinh hoạt và tăng nguy cơlây lan bệnh trong nuôi trồng thủy sản

Để có 100 tấn cá phi lê phải có 300 tấn cá nguyên liệu, tức phải cần 480 tấn thức ănthủy sản (tính theo hệ số chuyển hóa thức ăn bình quân 1,6) Như vậy, nếu vùngĐBSCL đạt chỉ tiêu 1 triệu tấn cá phi lê xuất khẩu thì phải đưa vào nguồn nước 4,8

triệu tấn thức ăn - tức cùng lúc phải làm sao có đến 26 triệu ha mặt nước để tự xử lý ônhiễm do 2,1 triệu tấn chất thải hữu cơ phát sinh.

Đối với các ao nuôi công nghiệp, chất thải trong ao có thể chứa đến 45% Nitrogen và22% là các chất hữu cơ khác Nguồn chất thải này lan truyền nhanh ra bên ngoài gâynguy cơ ô nhiễm còn khiến dịch bệnh thủy sản phát sinh trong môi trường nước

Ở các nơi có nguồn thải N và P cao như khu vực nuôi cá tra công nghiệp tập trung ởĐBSCL Tổng N và P thải ra từ các ao nuôi cá tra khoảng 31,6 tấn N và 9,8 tấn P năm

2007 và 50,4 tấn N và 15,7 P tấn năm 2008 (De Silva et al., 2010) Nếu tất cả chúngthải trực tiếp ra các con sông ở ĐBSCL thì gây cơ gây ô nhiễm nặng Tuy nhiên,không phải tất cả chúng đều thải ra các con sông ở ĐBSCL, một phần chất thải sửdụng cho nông nghiệp và một phần chúng tích tụ trong bùn đáy ao hoặc được hấp thubởi các vi sinh vật trong ao Phan et al., (2009) quan sát sự tích lũy thành phần dinhdưỡng trong ao cho thấy rằng, khoảng 51% P được tích lũy trong bùn đáy ao Điều nàycho thấy rằng vai trò quan trọng của các vi sinh vật trong quá trình tích tụ P hòa tantrong nước nuôi cá tra Chính vì vậy, việc tuyển chọn vi khuẩn tích lũy poly-P có hiệusuất loại bỏ phosphat cao để ứng dụng vào trong xử lý P hòa tan trong nước ao nuôi cátra là điều cần thiết hiện nay

1 5 Yêu cầu chuyên đề

Tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn tích lũy polyphosphat để ứng dụng xử lýphosphat hòa tan trong nước ao nuôi cá tra

Viết 01 bài báo khoa học

CHƯƠNG 2: QUÁ TRÌNH LOẠI BỎ PHOSPHO HÒA TAN

Loại bỏ P hòa tan có ý nghĩa vô cùng quan trọng Hiện nay, một số biện pháp có thểloại bỏ P được sử dụng là biện pháp hóa học và sinh học Ba biện pháp được áp dụngnhư lắng tụ P bằng quá trình bổ sung các kim loại như muối natri hoặc kẽm, loại bỏ Pbằng màng thấm lọc, tích tụ P trong tế bào vi sinh vật

Quá trình loại bỏ P hòa tan bằng biện pháp hóa học phụ thuộc vào sự cân bằng giữa hàmlượng P hòa tan - chất tạo lắng và hiệu quả loại bỏ các chất lắng tụ Thường thì loại bỏ cácchất bùn lắng tốn kém và vì thế chi phí xử lý P bằng phương pháp hóa học thường cao.Quá trình loại bỏ P hòa tan bằng con đường sinh học tùy thuộc vào hàm lượng P hòa tan

và hiệu quả của quá trình tách bùn Trong quá trình làm tăng cường sự loại bỏ P hòa tan,thì sinh khối có thể chứa 6 đến 8%, một lượng P vượt quá mức nhu cầu thiết yếu của tếbào và P tích lũy trong tế bào sẽ được loại bỏ bằng quá trình lắng tụ sinh học

2 1 Loại bỏ phospho bằng hóa chất

Hóa chất làm trầm hiện orthophosphat thường sử dụng trong các nhà máy xử lý nướcthải và mặc dù polyphosphat và hợp chất phospho hữu cơ có thể được loại bỏ bằng hóachất, nhưng chúng phải được thủy giải và khoáng hóa (phân hủy) để phóng thíchorthophosphat rồi sau đó làm trầm hiện trở lại

Khoáng kim loại thường sử dụng để trầm hiện orthophosphat là Al3+, Ca2+, Fe3+, và

Mg2+ (Bảng 1) Hóa chất làm trầm hiện orthophosphat được kiểm soát bởi pH ví dụ:pH>8,5 cho Ca2+ và pH 5,5 đến 7,0 cho Al3+ và Fe2+ Hóa chất làm trầm hiệnorthophosphat có thể bổ sung ở đầu vào hay đầu ra của bễ hiếu khí Tuy nhiên, trầmhiện đầu vào của bễ hiếu khí có thể dẫn kết quả làm giảm dinh dưỡng (orthophosphat)trong bễ hiếu khí

Bảng 1: Hóa chất thường dùng để trầm hiện orthophosphat và sản phẩm của chúng

Trong bể hiếu khí, orthophosphat có thể được liên kết trong các phân tử keo tụ như làdạng hydroxyapatit khó tan (CaOH(PO4)3), điều này xảy ra tự nhiên mà không cần có sựtác động của các phản ứng hóa học Nếu hàm lượng oxi hòa tan trong bể hiếu khí kém vànhiều khí CO2 thải ra từ sự phân hủy BOD kéo dài trong dung dịch, pH của bể hiếu khígiảm Sự giảm sút này là do nồng độ CO2 hòa tan cao và acid carbonic (H2CO3) được tạo

ra, dưới điều kiện này orthophosphat vẫn còn trong dung dịch ở dạng ion H2PO4- Tuynhiên, nếu nồng độ oxi hòa tan trong bể hiếu khí cao và nồng độ khí CO2 giảm dần, ít acidcarbonic và pH trong bể hiếu khí gia tăng, dưới điều kiện này orthophosphat sẽ hiện diện

ở dạng ion HPO42-; Nếu nước chứa nhiều canxi (nước cứng), orthophosphat sẽ trầm hiện

từ dung dịch thành hydroxyapatite và liên kết trong các phân tử keo tụ

Orthophosphat có thể duy trì trong dung dịch của bể hiếu khí trong hai dạng: dạng ionđược xác định bởi pH hay dạng liên kết để tạo ra dạng kim loại kiềm

Phospho hữu dụng từ quá trình tạo bùn hoạt tính xấp xỉ 90% orthophosphat, dạngorthophosphat này có thể ở dạng ion hòa tan hay dạng liên kết, để khử hàm lượngphospho hữu dụng từ quá trình tạo bùn hoạt tính, một hệ thống xử lý nước thải tiêntiến cần có những dụng cụ hay thiết bị để đo: Chất rắn lơ lửng vô cơ và hữu cơ, hỗnhợp chứa phospho và nitơ đóng góp vào trong hiện tượng nở hoa, hỗn hợp hữu cơphân hủy nhanh hay phân hủy chậm chạp

Bảng 2: Chỉ số sinh học và hóa học để đánh giá khả năng loại bỏ phospho

Đồng hóa Liên kết phospho như là nguồn dưỡng chất trong sự tổng hợp

màng tế bào và chuyển hóa năng lượng Phospho đóng góp 3% trọng lượng vi khuẩn trong chất thải

1-Tăng cường loại bỏ

phospho sinh học Liên kết phospho như là nguồn dưỡng chất trong sự tổng hợpmàng tế bào, chuyển hóa năng lượng và hạt poly-P Phospho

đóng góp 1-3% trọng lượng vi khuẩn trong chất thảiHình thành

hydroxyapatit

Hydroxyapatit được hình thành trong suốt giai đoạn nồng độoxi hòa tan thấp và pH tăng trong bể hiếu khí

Trầm hiện hóa học Sử dụng nhôm, clorric sắt, sulphat sắt hay vôi để trầm hiện

orthophosphat như là muối kim loạiTrầm hiện chất trung

gian sinh-hóa

Trầm hiện hóa học orthophosphat phóng thích từ vi khuẩn quachỉ số tăng cường loại bỏ phospho sinh học

Phospho có thể được loại bỏ khỏi hệ thống xử lý nước thải thông qua các thông số đolường hệ số xử lý sinh học và hóa học (Bảng 2) Một vài hệ số được đánh giá hay xemxét để biết hệ thống xử lý nước thải tiên tiến bao gồm các hệ số trầm hiện hóa học củaphospho hay hệ số tăng cường loại bỏ phospho sinh học-EBPR và hệ số trầm hiệnphospho sinh học và hóa học.

2 2 Cấu trúc quần thể vi khuẩn tích lũy polyphosphat

Quá trình loại bỏ phospho bằng con đường sinh học tùy thuộc vào sự tăng cường khảnăng của vi sinh vật hấp thu lượng phosphat tự do trong môi trường vào tế bào Do đó,quá trình này thường cho là quá trình làm tăng cường sự loại bỏ phospho sinh học(EBPR) Quá trình EBPR được ứng dụng trong hầu hết các hệ thống xử lý nước thải.Mặc dù quá trình EBPR cho thấy loại bỏ phospho hiệu quả, nhưng đôi lúc hoạt độngnày bị gián đoạn; nhiều nghiên cứu trong 50 năm qua đã góp phần giải thích hiệntượng này Tuy còn vài khía cạnh chưa được làm sáng tỏ, nhưng các nghiên cứu cũng

đã mang lại nhiều sự hiểu biết quan trọng về con đường trao đổi chất và được áp dụngvào thực tiển Về mặt cơ bản, con đường trao đổi chất kỵ khí - hiếu khí và xác định visinh vật có vai trò cho quá trình EBPR là rất quan trọng Về mặt thực tiển, sự áp dụngđồng thời 2 quá trình: loại bỏ nitơ và phospho với nồng độ oxy hòa tan thấp thì rất có ýnghĩa, sẽ làm giảm đáng kể chi phí xử lý Phương pháp xử lý bằng sinh học có thể làmgiảm nồng độ phospho trong nước xuống dưới 0,5 mg/l

Trải qua nhiều thập niên ứng dụng quá trình EBPR để xử lý nước thải, mặc dù chúngthể hiện tính hiệu quả về mặt kinh tế và thân thiện với môi trường, nhưng đôi lúc quátrình này biểu lộ tính không ổn định và quá trình loại bỏ P khỏi nước thải đôi khi thấtbại (Neethling et al., 2005) Chính vì thế tìm hiểu rõ poly-P được tích lũy bởi nhóm visinh vật nào, chúng tích lũy để làm gì và tích lũy như thế nào có vai trò quan trọng đểcung cấp cơ sở cho thiết kế, vận hành và khắc phục các sự cố không mong muốn xảy

ra trong các hệ thống xử lý nước thải

Từ nghiên cứu phân lập đầu tiên của Fuhs và Chen (1975) cho rằng các loài vi khuẩn

thuộc giống Acinetobacter được xác định như là PAOs Vào những năm 1980, nhiều báo cáo cũng cho rằng sự đa dạng loài trong giống Acinetobacter trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý (Stephenson, 1987) Sau đó, Acinetobacter được xem là nhóm

vi khuẩn có vai trò chính trong quá trình EBPR (Auling et al., 1991; Carr et al., 2001;Ohtake et al., 1985; Tandoi et al., 1998; Bark et al., 1992; Boswell et al., 2001; Sidat etal., 1999), nhiều nghiên cứu về các kiểu trao đổi chất phản ánh các đặc tính trao đổichất của PAOs tập trung vào nhóm vi khuẩn này (Wentzel et al., 1986; Wentzel, 1991).

Trong các loài thuộc giống Acinetobacter, A Johnsonii cho thấy có khả năng tích lũy

lượng lớn poly-P và được xem là loài vi khuẩn kiểu mẫu cho nghiên cứu về quá trìnhtrao đổi năng lượng, các enzyme chuyển hóa poly-P và quá trình vận chuyển các hoạtchất qua màng tế bào (van Veen et al., 1994) Những năm gần đây, các kỹ thuật sinhhọc phân tử được sử dụng để mô tả cấu trúc quần thể của PAOs dựa trên mối quan hệphát sinh loài Áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định quần thể củaPAOs cho thấy vi khuẩn trong bùn hoạt tính của các hệ thống xử lý nước thải rất đadạng bao gồm các lớp Proteobacteria (α, β và ɣ), Gram positive với hàm lượng G+Ccao (Actinobacteria), Planctomycetes và Bacteroides (Crocetti et al., 2000; Ahn et al.,2007; Bond et al., 1995; Bond et al., 1999; Kong et al., 2005; Liu et al., 2001; Gloess

et al., 2008; Tamaki et al., 2005) Bên cạnh đó, thường có sự khác nhau về thành phầncác nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các hệ thống xử lý khác nhau Sự thể hiện thànhphần và tính chất của từng loại nước thải mà có sự khác biệt trong thành phần củaPAOs (Beer et al., 2006; Wong et al., 2005; Crocetti et al., 2000) Trong lớp

Actinobacteria các vi khuẩn được xem là PAOs như Arthrobacter sp (Shoda et al., 1980), Mycobacterium sp (McMahon et al., 2002), Gordonia sp (Beer et al., 2006).

Nguyen et al., (2011) sử dụng kỹ thuật dò mẫu gen kết hợp khuếch đại và giải trình tựđoạn 16S rRNA bằng cặp mồi (27F và 1492R) của nhóm vi khuẩn Actinobacteria

trong các hệ thống EBPR phát hiện giống Tetrasphaera thuộc họ Intrasporangiaceae

chiếm khoảng 30% trên tổng số vi khuẩn quan sát và có các kiểu hình khác nhau Khảnăng hấp thu orthophosphate và hình thành poly-P xảy ra ở hầu hết các dòng

Tetrasphaera Khả năng hấp thu orthophosphate dưới điều kiện hiếu khí chỉ xảy ra khi

chúng hấp thu nguồn carbon dưới điều kiện kỵ khí Nguồn carbon rất đa dạng như acidamin, glucose và acetate Chúng có hình dạng rất khác nhau như hình que ngắn, quechia nhánh, hình cầu, hình sợi

Ivanov et al., (2005) phân tích vi khuẩn loại bỏ phosphate dựa trên khuếch đại và giải

trình tự 16S rRNA bằng cặp mồi 27F và 1492R cho thấy Stenotrophomonas

maltophilia LMG 10989 có khả năng loại bỏ phosphate cao vừa là giảm hàm lượng Fe

với tỉ lệ 0,17 g P/g Fe2+

Hesselmann et al., (1999) đặt tên nhóm vi sinh vật tích lũy Poly-P là Candidatusaccumulibacter phosphatis hay accumulibacter Chúng được xem là nhóm có liên quan

trực tiếp đến Rhodocyclus Các nghiên cứu sau đó cũng chứng tỏ Accumulibacter rất

phổ biến (Oehmen et al., 2007) Trong một số nơi Accumulibacter chiếm khoảng 90%trong bùn hoạt tính có khả năng loại bỏ phosphat cao Sau đó, một số nghiên cứu cũngcho biết, không chỉ có Accumulibacter chứa hạt Poly-P (poly-P) và một vài nhóm vi

khuẩn khác cũng có như Actinobacter (Wong et al., 2005).

Nakamura et al (1991, 1995) phân lập Micrococcus NM-1 Chúng tích lũy Poly-P

trong điều kiện hiếu khí và sử dụng chúng như là năng lượng để hấp thu nguồn carbontrong điều kiện kỵ khí như glucose và casamino acid, không phải là acetate Ubukata

và Takii (1994) cũng phân lập dòng vi khuẩn tương tự và chứng minh rằng các vikhuẩn này chỉ thể hiện sự đồng hóa nguồn carbon (PHAs) và tích lũy poly-P vào trong

tế bào khi có sự luân phiên quá trình kỵ khí –hiếu khí Tuy nhiên, chúng không phải làmột trong các vi khuẩn nổi trội trong tiến trình EBPR vì chúng không chuyển hóaacetate tới PHAs dưới điều kiện kỵ khí Gần đây, việc áp dụng các kỹ thuật sinh họcphân tử như FISH (Fluorescence in situ hydridization) (Wagner et al., 1994 ; Kampfer etal., 1996 ; Liu, 1995) cho thấy có ít nhất ba nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trongquá trình EBPR với hình dạng khác nhau

Auling et al., (1991) sử dụng phương pháp DAP để phân tích quần thể vi sinh vật tích

lũy poly-P trong hệ thống xử lý nước thải Bên cạnh Acinetobacter còn có Pseudomonas

sp và Xanthobacter sp cũng góp phần quan trọng trong quá trình EBPR.

Sidat et al., (1999) phân lập các vi khuẩn tích lũy Poly-P trong bùn hoạt tính cho thấy

có sự đa dạng trong thành phần các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng tích lũy

Poly-P Bên cạnh hai giống Pseudomonas spp (chiếm 58% trên tổng số vi khuẩn phân lập được) và Staphylococcus spp (chiếm 40%), còn có một số giống cũng có khả năng tích lũy lượng lớn Poly-P như Acinetobacter calcoaceticus, Enterobacter spp.,

Aeromonas spp., Moraxella spp., Bacillus cereus Trong đó, Enterobacter spp và Pseudomonas spp tích lũy Poly-P nhiều nhất (> 5,3 x 10-12 mg/tế bào)

Crocetti et al (2000) đã sử dụng phương pháp FISH để phân tích các vi sinh vật tích lũy

P trong bùn nước thải Các nhóm vi sinh vật tích lũy P ở mức cao chiếm khoảng 15,1%

trong lượng sinh khối có chứa vi khuẩn coccobacilli Có hơn 80% vi khuẩn là β -2

Proteobacteria thuộc nhóm coccobacilli là nhóm vi sinh vật PAOs Nhóm vi khuẩn trội

thứ hai là Actinobacteria Bên cạnh đó, phương pháp PCR để khuếch đại gen 16S rRNA

của vi khuẩn, những dòng thuộc nhóm β-2 Proteobacteria được giải trình tự Trong các dòng này có mức độ tương đồng của Rhodocyclus spp (94 ÷ 97%) và Propionibacter

pelophilus (95 ÷96%) được nhận diện là các vi khuẩn có khả năng tích lũy Poly-P nhiều

nhất Ba mẫu dò PAO462, PAO651 và PAO846 cũng được thiết lập để nhận diện PAOs

Cả ba mẫu dò nhận diện vi khuẩn thuộc nhóm β -proteobacteria.

McMahon et al.(2002) đã phát hiện ra poly-P kinase gense (ppk) từ các vi khuẩn trongbùn hoạt động quá trình loại bỏ P bằng phương pháp sinh học Bốn gen mới được tìm

ra, trong đó có hai kiểu gen (kiểu I và II) có mức độ tương đồng về trình tự acid amin

với gen của vi khuẩn Rhydocyclus tenuis (86 ÷ 87%) Hoạt tính của gen ppk này sau

tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu có thể so sánh với các gen ppk khác của vi khuẩn tíchlũy Poly-P

He et al (2007) sử dụng poly-P kinase 1 gene (ppk1) như là marker di truyền để phân

tích cấu trúc quần thể “Candidatus Accumulibacteria” trong hệ thống EBPR Sự phát

sinh loài thông qua phân tích 16S rRNA và ppk1 có sự tương đồng lớn, sử dụng ppk1

gene như là marker di truyền để phân tích sự phát sinh loài phát hiện cho thấy có sự đadạng như khi phân tích bằng 16S rRNA trong quần thể “CandidatusAccumulibacteria”

Bên cạnh sự loại bỏ P hòa tan trong nước bằng con đường hóa học, thì biện pháp sinhhọc trở nên phổ biến Quá trình tích tụ và hòa tan P bằng con đường sinh học, đặc biệt làthông qua vi khuẩn, có vai trò quan trọng trong sự điều chỉnh hàm lượng P hòa tan trongnước Chúng giải phóng P từ bùn đáy ao vào các tầng nước thông qua quá trình phân rãcác hợp chất hữu cơ hoặc các hợp chất vô cơ chứa P (poly-P), bên cạnh đó, P cũng cóthể tích tụ trở lại bùn thông qua quá trình lắng tụ sinh học, kết quả là có thể loại bỏ P hòatan trong nước

2 3 Loại bỏ phospho bằng con đường sinh học thông qua quá trình EBPR

Quá trình EBPR liên kết với hai nhóm vi khuẩn: vi khuẩn lên men và vi khuẩn poly-P.Trong các hệ thống xử lý nươc thải ít nhất phải thiết kế có sự hiện diện của hai bể xử lý,một bể kỵ khí (vi khuẩn lên men) và một bể hiếu khí, được dùng cho EBPR (Hình 1)

Hình 1: Hệ thống tăng cường loại bỏ phospho sinh học (van Loosdrecht et al., 1997)

Lên men là quá trình phân hủy vi sinh của hợp chất hữu cơ hòa tan (BOD) mà khôngcần sử dụng oxi tự do hay nitrat Hợp chất hữu cơ lên men hay cơ chất tạo ra trong bể

kỵ khí sẽ là các hợp chất hữu cơ mạch ngắn và một loạt các acid béo (Bảng 3)

Bảng 3: Acid béo hòa tan được hình thành trong bể kỵ khí

Acid Caproic CH3CH2CH2CH2CH2CH2COOH

Trong bể kỵ khí, vi khuẩn poly-P hấp thu acid béo và tích trữ chúng dạng như là mộtloại tinh bột khó tan (poly-β-hydroxyalkanoates hay PHAs) (Bảng 4) PHAs trong vikhuẩn poly-P giữ hai chức năng Đầu tiên, nó giúp vi khuẩn phát triển và tái cấu trúcpolyphosphat bằng cách hấp thu nhiều phosphat hòa tan Thứ hai, PHAs cùng với

Bùn hoại tính thải bỏBùn hoại tính

hoàn lưu

polyphosphat giúp vi khuẩn poly-P sống sót trong điều kiện môi trường thiếu nguồncarbon.

Bảng 4: Cấu trúc phân tử các đơn vị cấu tạo nên poly-β-hydroxyalkanoates

Đa phân-tử hóa các acid béo đòi hỏi phải có một nguồn năng lượng tổng hợp Nănglượng này được hình thành từ sự phân hủy poly-P nội bào tạo ATP và orthophosphat.Kết quả của quá trình phân hủy là làm phóng thích orthophosphat nội bào ra trong bể

kỵ khí làm gia tăng tạm thời hàm lượng orthophosphat trong nước thải đầu vào

Hình 2: Các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR Sự chuyển đổi kiểu

trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí (van Loosdrecht et al., 1997)Trong bể hiếu khí vi khuẩn poly-P sử dụng oxi tự do để phân hủy PHAs nội bào như làmột nguồn carbon và nguồn năng lượng cho tế bào tăng trưởng và phát triển Vi khuẩn

- ATP: Adenosine triphosphate

- NADH: Nicotinamide adenine dinucleotide

- Pi: phosphate