Đến nay, chưa có nghiên cứu về sự phù hợp giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam và chủng dùng sản xuất vaccine.. Tuyển chọn được chủng sản xuất vaccine và các chủng than gây bệnh đầy đủ đ
Trang 11
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN NGỌC BẢO
NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACCINE
THAN Bacillus anthracis
Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 62420107
DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội – 2015
Trang 22
Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN
Người hướng dẫn khoa học:
1 TS Đoàn Trọng Tuyên
2 TS Lê Thu Hà
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ họp tại
vào hồi giờ ngày tháng năm 20
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội
Trang 31
MỞ ĐẦU
Bệnh than là bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguyên nhân do nhiễm trực khuẩn
than B.anthracis B anthracis thường gây bệnh cho các loại động vật móng guốc,
ăn cỏ như: trâu, bò, ngựa, dê, cừu…người mắc bệnh là do ngẫu nhiên tiếp xúc trực tiếp với động vật mắc bệnh hoặc các sản phẩm từ động vật như: thịt, sữa, da, lông[1] Vi khuẩn than được xếp vào nhóm tác nhân nguy hiểm nhóm 3 bởi vì bệnh cảnh lâm sàng và đường lây phong phú, gây tử vong cao, tồn tại bền vững ngoài
môi trường Chính vì, dễ sản xuất và tàng trữ nên B.anthracis thường được các
nước sử dụng như một loại vũ khí sinh học trong phòng chống và đánh trả, luôn có nguy cơ sử dụng khi chiến tranh [4]
Phòng chống bệnh than luôn là vấn đề mang tính cấp thiết, sử dụng kháng chỉ là biện pháp ngắn hạn, tại chỗ Biện pháp bảo vệ lâu dài và chủ động trên diện rộng là tiêm phòng vắc-xin cho các nhóm nguy cơ cao: người dân trong vùng dịch, nhân viên y tế trực tiếp điều trị bệnh nhân than, nhân viên xét nghiệm tại các phòng thí nghiệm Bên cạnh đó, dự phòng bệnh than cho quân nhân thực hiện nhiệm vụ trong điều kiện tác chiến có nguy cơ sử dụng trực khuẩn than cũng là vấn
đề nhiều quốc gia trên thế giới đặt ra
Hiện nay, quan điểm sử dụng vaccine phòng bệnh than cho người có hai xu hướng khác nhau Đối với các nước như: Anh, Mỹ, vaccine phòng bệnh than đã đưa vào sử dụng là loại vaccine phòng bệnh than hấp phụ, sử dụng một phần cấu trúc tế bào với kỳ vọng gây miễn dịch đặc hiệu, an toàn, ít phản ứng phụ hơn so với vaccine toàn tế bào Trường phái của các nước như: Nga; Trung quốc, Ấn độ,, thì sản xuất vaccine bào tử than, toàn tế bào với mục đích gây đáp ứng miễn dịch nhanh và sản xuất đơn giản đầu tư ít Do vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về hai phương pháp này để có được phương án phù hợp nhất với Việt Nam
Tại Việt Nam, hàng năm dịch than vẫn xảy ra trên gia súc và lây sang người nhưng vẫn chưa có vaccine dự phòng cho người Đến nay, chưa có nghiên cứu về
sự phù hợp giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam và chủng dùng sản xuất vaccine Việc nhập vaccine phòng bệnh than cho người có nhiều khó khăn và không đáp ứng được yêu cầu chủ động phòng bệnh Chính vì vậy để đáp ứng yêu cầu của cộng đồng, nhất là yêu cầu của Quân đội chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu sản xuất vaccine than Bacillus anthracis” nhằm mục đích:
1 Tuyển chọn được chủng sản xuất vaccine và các chủng than gây bệnh đầy đủ độc lực tại Việt Nam để đánh giá thử thách
2 Sản xuất được hai loại vaccine phòng bệnh than với hai nguyên lý khác nhau ở quy mô phòng thí nghiệm
3 Đánh giá được tính an toàn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực bảo vệ của hai loại vaccine than trên động vật
Trang 42
Những đóng góp mới của luận án:
1 Phân lập được các chủng than (B.anthracis) từ các ổ dịch mới và cũ, từ mẫu
lâm sàng có tính đại diện cho các vùng dịch (Lai Châu, Hà Giang) Các chủng phân lập từ môi trường là bằng chứng khẳng định ổ dịch lưu hành trong tự nhiên tại các địa phương
Đóng góp xây dựng ngân hàng chủng nhóm B cereus, các chủng than độc lực và không
độc lực
2 Tuyển chọn được chủng sản xuất vaccine phù hợp có tính tương đồng cao, có hiệu lực bảo vệ với các chủng gây bệnh phân lập tại Việt Nam Giải trình tự và đăng ký vùng gene Pacủa chủng độc lực của Việt Nam trên ngân hàng gene NCBI
3 Xây dựng quy trình và sản xuất hai loại vaccine phòng bệnh than, đánh giá tính
an toàn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực bảo vệ trên mô hình động vật
4 Nghiên cứu và sản xuất vaccine phòng bệnh than hấp phụ có thể sử dụng cho người lần đầu áp dụng tại Việt Nam ở quy mô phòng thí nghiệm
Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm dịch tễ học bệnh than - anthrax
1.1.1 Đặc điểm lưu hành bệnh than trên thế giới
1.1.2 Đặc điểm lưu hành bệnh than trong nước
1.1.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh than
1.2.6 Độc tố của trực khuẩn than
1.2.7 Cấu trúc hệ thống gene của B anthracis
1.2.8 Đặc điểm của các chủng B anthracis dự tuyển sản xuất vaccine
1.3 Qui trình sản xuất vaccine phòng bệnh than
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu:
Chủng B.anthracis
+ 02 chủng độc lực (ký hiệu: Toxin) và không độc lực (Non Toxin) do Học viện
Quân y cung cấp
+ 03 chủng vi khuẩn Bacillus anthracis VCM1167 và chủng B anthracis
VCM1166 và BaVCM1168; Hai chủng BaVCM1167 và BaVCM1166 có nguồn gốc từ chủng 34F2 do FAO cung cấp
+ 01 chủng ký hiệu Vaccine lưu giữ tại Khoa vi sinh vật- Viện Y học dự phòng Quân đội
Trang 53
+ Chủng phân lập các từ mẫu môi trường và mẫu bệnh phẩm lâm sàng
+ Trình tự các chủng trên ngân hàng gene:
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://patricbrc.org/portal/portal/patric/Blast? dm=result&pk=-466528958
Vaccine phòng bệnh than
- Vaccine bào tử than sống giảm độc lực, toàn tế bào (TTB) từ chủng dự tuyển
- Vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA) từ chủng dự tuyển
2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.2.1 Sinh phẩm, hoá chất nghiên cứu
a Môi trường nuôi cấy, phân lập tuyển chọn chủng B anthracis
b Sinh phẩm PCR:
c Sinh phẩm giải trình tự gene do hãng ABI cung cấp
d Kháng huyết thanh và kháng nguyên:
e Định lượng kháng thể:
f Thanh định danh trực khuẩn bacillus API 50CHB/E và API 20E ( Pháp)
2.2.2 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
2.2.2.1 Máy móc dụng cụ
- Tủ ấm 370C, Memmert, kính hiển vi Olympus, tủ lạnh âm (-20 0 C)
- Máy đông khô Edward 3400 – Anh quốc
- Buồng cấy vô trùng Class II Nuaire – USA
- Máy Khuếch đại gene Parking Elmer 2400 ( Mĩ)
- Máy điện di Power pac 300 ( Bio - rad)
- Máy ly tâm, máy đo MacFanland, máy ủ (370C)
- Máy sequencer 3130 genetic Analyzer –ABI (Mỹ)
- Cân điện tử, hộp Roux, đĩa Petri và các dụng cụ chuyên dùng
2.2.2.2 Dụng cụ tiêu hao
2.2.2.3 Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh: 18 – 22g/con
- Chuột lang khỏe mạnh: 250 – 350 g/con
- Thỏ khỏe mạnh trọng lượng 2,5 – 3,5 kg/con (thỏ newzeland do Trung tâm
nghiên cứu dê, thỏ Xuân Canh Ba Vì cung cấp)
2.3 Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng sản xuất vaccine và các chủng vi khuẩn than gây bệnh làm chủng thử thách:
Kỹ thuật phân lập và định danh vi khuẩn:
Phương pháp xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm:
- Phương pháp xác định độc tính cấp LD50 của chủng than độc lực
Phương pháp phát hiện B anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật sinh học phân tử
- Kỹ thuật PCR và semi-Nested PCR xác định các gene độc lực B.anthracis
- Kỹ thuật giải trình tự gene và so sánh trình tự các vùng gene:
Trang 64
2.3.2 Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine
2.3.2.1 Quy trình kỹ thuật sản xuất vaccine bào tử sống giảm độc lực
BaVCN1167 đông khô
Nhân chủng trong canh thang TSB
370C/15 giờ
3
Hoàn nguyên chủng với canh
thang TSB (370C/6h) (370C/hhggggiờ)giờ) Thạch dinh dưỡng (NA)
370C/24 giờ
Bất hoạt vi khuẩn (650C/1giờ)
Nuôi cấy thu sinh khối VK trên
- Kiểm tra an toàn chung
- Kiểm tra đáp ứng miễn dịch
và công hiệu
- Kiểm tra chủng giống
- Kiểm tra thuần khiết
- Chọn khuẩn lạc
Trang 75
2.3.2.2 Phương pháp sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA)
Hình 2 2 Quy trình sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA)
2.2.2.2.1 Các bước thực hiện quy trình lên men:
2.3.2.2.2 Các phương pháp áp dụng trong sản xuất và đánh giá độ tinh sạch của protein PA của vaccine hấp phụ
Lựa chọn môi trường thích hợp lên men chủng dự tuyển sản xuất vaccine
Điều kiện môi trường sinh tổng hợp protein PA của B.anthracis
Kỹ thuật thu nhận protein PA [119]
Xác định độ tinh sạch bằng kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide 12,6 %
Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa Ethanol
phương pháp sắc ký trao đổi ion
Nhân giống
24 h
Lên men
Tiếp giống 10%
Tối ưu điều kiện môi trường
Kiểm tra tốc
độ sinh
trưởng
Xác định lượng protein tạo thành
Thu mẫu sau 36h lên men
(10)
(4a) (2)
(8)
Trang 8- Cách xác định LD50 theo phương pháp Kaerker và behrens
- Cách tính LD50 theo công thức Spearman-Karber
2.3.3.2 Đánh giá tính an toàn của vaccine:
2.3.3.3 Kỹ thuật gây miễn dịch trên thỏ
Máu 1 Máu 2 Máu 3 Máu 4
0 tuần 4 tuần
2 tuần 6 tuần 8 tuần 10 tuần
Tiêm mũi 1 Tiêm mũi 2
Hình 2 3: Lịch tiêm và thời gian lấy máu đánh giá đáp ứng miễn dịch của thỏ
Bảng 2 1 Tiêu chuẩn chất lƣợng vaccine bào tử than, sống giảm độc lực
Trang 9Bảng 2 2 Tiêu chuẩn vaccine hấp phụ phòng bệnh than AVA
11 Tính sinh miễn dịch trên
2.3.3.6 Quy trình kỹ thuật đánh giá công hiệu của vaccine AVA
2.3.3.7 Quy trình kỹ thuật đánh giá công hiệu của vaccine TTB:
2.4 Quy trình, kỹ thuật đông khô vaccine
2.5 Xử lý số liệu: Thống kê xử lý số liệu theo các thuật toán trong y học và các
phần mềm trong nghiên cứu
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG SẢN XUẤT VẮC XIN VÀ CHỦNG
THỬ THÁCH
3.1.1 Kết quả phân lập định danh vi khuẩn than từ các loại mẫu khác nhau
Các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và mẫu môi trường được thu thập và phân lập tại Khoa Vi sinh vật viện Y học dự phòng Quân đội Mẫu được phân lập chọn lọc trên môi trường thạch máu, sau đó lựa chọn khuẩn lạc, nhuộm soi hình thể cấu trúc, tính chất bắt màu và trình tự sắp xếp
Trang 108
Các chủng nghi ngờ được định danh trên thanh API 50CHB/E và API 20E,
để xác định tính chất sinh vật hóa học và định danh trên phần mềm của hãng BioMerieux
Bảng 3 1: Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu bệnh phẩm và
chủng được cung cấp bằng bộ kit API 50CHB/E
TT Ký hiệu
Số mẫu/
chủng Nguồn gốc Kết quả định danh
Bacillus cereus 1 (99,9%)
Thể dạ ruột
dày-Bacillus anthracis (99,8%)
độ tin cậy trên 99%: Toxin, BaVCM1167, BaVCM1168, 4NS, 3KV
Bảng 3.2 Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu môi trường bằng bộ
kit API 50CHB/E
T
mẫu Kết quả định danh
1 Niêm Sơn- Niêm Tòng –
4 Trung Thu- Tủa chùa-
Điện Biên
Trang 119
Phân gia súc mắc bệnh 01 B.cereus
- Tống số chủng B anthracis phân lập định danh từ mẫu môi trường là 9/33
chủng
3.1.2 Kết quả phát hiện B.anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR
Kết quả phát hiện vùng gene đặc hiệu Ba813 trên các chủng vi khuẩn than
Kết quả phát hiện vùng pagA thuộc pXO1 của các chủng vi khuẩn than
Kết quả phát hiện các vùng gene capA, capB, capC thuộc pXO2
Bảng 3.3 Kết quả PCR phát hiện B anthracis và các yếu tố độc lực từ các
chủng đƣợc cung cấp và chủng phân lập
TT Ký hiệu mẫu Chromosome Các vùng gene thuộc plasmide (pXO1 và pXO2)
Kết quả bảng trên cho thấy:
Chủng BaVCM1167 chỉ có gene pagA nằm trên plasmide pXO1, không có
các gene trên plasmide pXO2 phù hợp tiêu chí của chủng sản xuất vaccine [25][80]
Phát hiện 4 chủng độc lực ký hiệu Toxin, BaVCM1168, 4NS và 1C3 đầy đủ độc lực sử dụng làm các chủng thử thách
Trang 1210
3.1.3 Kết quả thử nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên chuột nhắt trắng
Bảng 3.4: Thử nghiệm độc tính các chủng than trên chuột nhắt trắng
TT Tên chủng Nguồn gốc chủng Thời gian chuột chết
5 Ba1168 Chủng được cung cấp 24 giờ - 48 giờ
3.1.4 Kết quả đánh giá chủng dự tuyển vaccine BaVCM1167
3.1.4.1 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa đặc trưng của chủng sản xuất
vaccine - BaVCM1167
Bảng 3.4 Đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng BaVCM1167
Chủng BaVCM1167
Khuếch đại đoạn gen pagA bằng phản ứng PCR
Đọc trình tự nucleotide của gene pagA của chủng VCM 1167
3.1.4.3 Kết quả so sánh pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ PA của chủng
BaVCM1167 với các chủng gây bệnh trong nước
Kết quả so sánh trình tự của chủng BaVCM1167 và các chủng than phân lập được tại Việt Nam cho thấy độ tương đồng rất cao, phát hiện hai đột biến điểm dẫn đến thay đổi 2 aa ở chủng Toxin và chủng 4NS của Việt Nam
Hình 3.1: So sánh trình tự nucleotide vùng pagA của 3 chủng B.anthracis phân lập tại Việt Nam và chủng dự tuyển sản xuất vaccine BaVCM1167 (Ba1167)
bằng phần mềm Mega5
Trang 1311
3.1.5 Kết quả đánh giá chủng than độc lực sử dụng làm chủng thử thách
Bảng 3.5 Kết quả xác định LD50 của chủng 4NS trên chuột lang
- lgDN: logarit của liều tiêm lớn nhất 10.000 = 4
- ∂ : log của hệ số pha loãng 10 = 1
Ta có : LgLD50 = 4 – 1(2,8 – 0,5) = 1.7 LD50 = 50 bào tử
3.2 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN THAN
3.2.1 Nghiên cứu sản xuất vaccine hấp phụ phòng bệnh than (AVA)
3.2.1.1 Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp và khả năng sinh tổng hợp
protein PA của chủng BaVCM1167 phục vụ sản xuất vaccine hấp phụ
Nghiên cứu sinh trưởng chủng BaVCM1166 và BaVCM1167 trên môi trường 1, 2 dạng đặc và dạng lỏng, ở 37 oC trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn Khả năng sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp protein PA của các chủng khi nuôi cấy trên cả hai môi trường 1, 2 dạng rắn rất tốt mật độ tế bào đạt 108 CFU/ml sau
36 h nuôi cấy Trong khi đó, ở môi trường 1 (mt C) dạng lỏng các chủng vi khuẩn phát triển yếu hơn môi trường 2 (mt R) Kết quả điện di kiểm tra protein trên gel polyacrylamide 12,6%
Trang 1412
Hình 3.2: Điện di phát hiện sản phẩm protein Pa của chủng B.anthracis nuôi
cấy trên môi trường 1 và 2 sau 42 giờ
3.2.1.2 Nghiên cứu thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp protein PA trên môi trường 1 và 2 dạng lỏng và rắn
Hình 3.3: Điện di phát hiện sản phẩm protein PA của các chủng B.anthracis ở
các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h trên môi trường 2 dạng rắn
Hình 3.4: Điện di phát hiện protein PA của các chủng B.anthracis sinh tổng hợp ở các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h nuôi cấy trong môi trường 1 dạng
lỏng
1 – 5: Protein chủng Ba VCM
1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy
6: Thang protein chuẩn
7 – 11: Protein chủng Ba VCM
1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy
1 – 5: Protein chủng Ba VCM 1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy 6: Thang protein chuẩn
Trang 15môi trường 1 (từ 36 giờ đến 72 giờ so với 36 giờ – 48 giờ )
Các kết quả trên cho thấy khoảng thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp protein PA của các chủng BaVCM1167 là 36 – 48 giờ, và sinh tổng hợp protein
PA tốt hơn khi được nuôi trong môi trường 2 dạng lỏng
3.2.1.3 Sản xuất protein kháng nguyên bảo vệ PA của chủng
pH sinh khối protein
Hình 3.6: Động thái quá trình lên men chủng BaVCM1167 ở nhiệt độ 37 o C
trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn sản xuất vaccine AVA
1 – 5: Protein chủng Ba VCM
1166 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ nuôi cấy
6: Thang protein chuẩn
7 – 11: Protein chủng Ba VCM
1167 sau 24, 36, 48, 60, 72 giờ
nuôi cấy
