Nghiên cứu lai tạo giống nấm linh chi chủng DT với giống nấm linh chi bản địa tại gia lai bằng hệ sợi

Kiểm tra phép lai: Các tổ hợp lai được kiểm tra bằng sự hiện diện của các mấu liên kết clamp conection vì khi hai dòng đơn nhân lai được với nhau sẽ hình thành sợi nấm song nhân thứ cấp

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

THIỀU THẢO MINH

NGHIÊN CỨU LAI TẠO GIỐNG NẤM LINH CHI CHỦNG DT VỚI GIỐNG NẤM LINH CHI BẢN ĐỊA

TẠI GIA LAI BẰNG HỆ SỢI

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

THIỀU THẢO MINH

NGHIÊN CỨU LAI TẠO GIỐNG NẤM LINH CHI

CHỦNG DT VỚI GIỐNG NẤM LINH CHI BẢN ĐỊA

TẠI GIA LAI BẰNG HỆ SỢI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu trong luận văn là trung thực Những kết luận khoa học của luận văn chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào

Tác giả luận văn

Thiều Thảo Minh

NGHIÊN CỨU LAI TẠO GIỐNG NẤM LINH CHI CHỦNG DT VỚI GIỐNG NẤM LINH CHI BẢN ĐỊA TẠI GIA LAI BẰNG HỆ SỢI

Học viên: Thiều Thảo Minh Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Tóm tắt - Mục đích của nghiên cứu này là lai giống chủng DT với các chủng mọc tự nhiên tại Gia Lai

bằng cách giao phối hệ sợi đơn nhân của chúng, nhằm tạo ra chủng lai mới có nguồn gốc bản địa thích

nghi với môi trường, cho năng suất và chất lượng cao Chủng nấm linh chi mọc tự nhiên trên cây Lim

xẹt (Peltophorum tonkinensis) đã chết tại Khu bảo tồn thiên nhiên Kon Chư Răng huyện Kbang và trên cây Dẻ (Quercus lanata) đã chết tại Vườn Quốc Gia Kon Ka Kinh, huyện Mang Yang, tỉnh Gia

Lai đã được thu thập, nhân giống và nuôi trồng Dựa vào phương pháp phân tích hình thái bằng trực quan và kính hiển vi quang học cùng với phương pháp phân tích giải trình tự vùng IT, đã xác định

được 2 giống linh chi thu thập được là G2, G3 thuộc loài Ganoderma lingzhi Đã khảo sát các đặc

điểm nuôi trồng trên môi trường cơ chất là mùn cưa gỗ cao su và thu nhận bào tử 3 giống nấm linh chi

để phân lập gây nảy mầm bào tử đơn nhân Trong quá trình lai tạo, bước đầu đã tách thành công 36 dòng đơn nhân của 3 giống linh chi nghiên cứu là hồng linh chi DT (G1), hồng chi Kbang (G2) và hồng chi Mang Yang (G3)

Từ khóa – nấm linh chi; dòng đơn nhân; giao phối, lai

RESEARCH ON BREEDING GANODERMA LIGNZHI DT STRAIN

WITH THE INDOGENOUS GANODERMA LIGNZHI OF GIA LAI

PROBINCE THROUGH MYCELIUM

Abstract – The present study aims at crossing DT strains with the naturally occuring strains in Gia Lai

by conjugating their monokaryotic mycelium, to produce novel hybrid in which have indigenous origin of adapting to environment readily, providing the high yield and qualities The strains of

naturally occuring reishi mushroom (Ganoderma) which grown on plant Peltophorum tonkinensis died

at the Natural Conversation Area Kon Chu Rang – Kbang district, and on nut trees (Quercus lanata) at

Kon Ka Kinh National Park – Mang Yang district in Gia Lai province, have been isolated, propagated and cultivated The identification of both these indigenous Ganoderma strains has been carried out by

the methods of visually shape analysis combined with the optical microscope and ITS sequence analysis These resulting varieties respectively, are known as G2 and G3 belong to Ganoderma lingzhi

species After the cultivation on substate of the rubber wood sawdust was characterised, the spores of

three Ganoderma varieties consisting of Red Reishi DT (G1), Red Reishi Kbang (G2) and Red Reishi

Mang Yang (G3), have been collected to isolate and cause monokaryotic spores to germinate The early steps in the breeding process have successfully separated 36 monokaryons from them.

Keywords: Breeding, Monokaryon, Ganoderma, Hybrid, Reishi mushroom.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

6 Cấu trúc của luận văn 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Đa dạng sinh học và hệ thống học nấm linh chi Ganodermataceae 4

1.1.1 Lịch sử và tình trạng phân loại Ganodemataceae 4

1.1.2 Hình thái học các loài trong họ Ganodermataceae 5

1.1.3 Sinh thái học và sự phân bố họ Ganodermataceae 7

1.2 Vòng đời của các loài nấm thuộc Basidiomycota 8

1.3 Di truyền giới tính các loài nấm thuộc Basidiomycota 10

1.3.1 Đồng tản (Honothallism) 11

1.3.2 Dị tản (Heterothallism) 11

1.4 Khái quát về các phương pháp cải tiến giống nấm 13

1.4.1 Phương pháp tuyển chọn 13

1.4.2 Phương pháp lai 14

1.4.3 Phương pháp chuyển gen 17

1.5 Phân nhóm các dòng đơn bội của các loài dị tản tứ cực 18

1.6 Các nghiên cứu liên quan đến các loài thuộc chi Ganoderma ở Việt Nam 19

1.7 Các nghiên cứu liên quan đến lai giống nấm linh chi trên thế giới 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Sơ đồ thí nghiệm 22

2.2 Đối tượng nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phân loại bằng đặc điểm hình thái 23

2.3.2 Phân loại dựa trên trình tự vùng ITS 23

2.3.3 Khảo sát đặc điểm nuôi trồng 25

2.3.4 Thu thập, gây nảy mầm bào tử và phân lập các dòng đơn bội 28

2.3.5 Nghiên cứu lai tạo giống nấm linh chi DT với các giống nấm linh chi bản địa 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 30

3.1 Thu thập và phân loại các giống nấm 30

3.1.1 Thu thập nấm linh chi bản địa tại Gia Lai 30

3.1.2 Phân loại bằng đặc điểm hình thái 32

3.1.3 Phân loại dựa trên trình tự vùng ITS 37

3.2 Khảo sát đặc điểm nuôi trồng 42

3.2.1 Tốc độ dòng hóa cơ chất 42

3.2.2 Hiệu suất chuyển hóa sinh học 42

3.3 Phân lập các dòng đơn bội 43

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC

QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI LUẬN VĂN (Bản sao)

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

1.4 Vai trò của các nhân tố bắt cặp đối với sự hình thành mấu nối 19

3.8 Kết quả BLAST trình tự vùng ITS của chủng nấm Kbang với

3.13 Nuôi trồng các giống nghiên cứu tại khu vực riêng để thu bào tử 44

3.16 Nồng độ pha loãng và nảy mầm của bào tử nấm Linh chi giống

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nấm linh chi là một trong những thảo dược thiên nhiên được xếp vào loại thượng dược Giá trị dược liệu của nấm linh chi đã được ghi chép trong các thư tịch cổ của Trung Quốc cách nay hơn 4000 năm (Zgao, J.D., 1940) Từ những kinh nghiệm lưu truyền trong dân gian, loài người đã biết sử dụng nấm linh chi theo nhiều cách khác nhau

Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, nấm linh chi đã được chứng minh là có tác dụng hữu ích trong việc điều trị bệnh, như: giải độc và bảo vệ tế bào gan, hạ đường máu, thanh trừ các gốc tự do, chống lão hoá và làm giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư, tim mạch, cao huyết áp, tiểu đường cũng như hạn chế phát triển các khối u, suy nhược thần kinh… [5, 6]

Hiện nay, nấm linh chi không còn khan hiếm như trước do con người có thể áp dụng khoa học kỹ thuật để nuôi trồng và nhân rộng trong môi trường nhân tạo trên cơ chất là phế phụ liệu trong nông nghiệp giàu cellulose (mùn cưa, bã mía, bông thải) [2]

Ở nước ta nhiều tổ chức, cơ sở đã tiến hành nghiên cứu nuôi trồng, chế biến và thăm

dò các hoạt chất sinh học có trong nấm linh chi, bao gồm các nhóm: axit béo, steroid, alkaloid, polysaccharide, adenosine … Trong đó thành phần có tác dụng dược tính quý đặc trưng cho nấm linh chi phần lớn thuộc nhóm triterpenoid [1], [31]

Gia Lai có nhiều loại nấm mọc hoang dã trong tự nhiên và là tỉnh có khí hậu phù hợp để trồng các loại cây công nghiệp Đây là nguồn nguyên liệu rất thích hợp làm

cơ chất nuôi trồng nấm nói chung và nấm linh chi nói riêng nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng và bảo tồn tính đa dạng của nấm linh chi trong tự nhiên

Trong những năm gần đây, có nhiều nhiệm vụ khoa học và công nghệ, nhiều nghiên cứu nhằm hỗ trợ phát triển nghề nấm tại địa phương sản lượng nấm hiện nay vẫn còn thấp, chưa đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường, đặc biệt là nấm linh chi Một phần nguyên nhân là do chưa xác định được chủng loại giống thích hợp với điều kiện khí hậu tại địa phương Hơn nữa, số chủng loại nấm linh chi được nuôi trồng phổ biến

không nhiều, chủ yếu là nhập nội và tuyển chọn ngoài tự nhiên Vì vậy việc “Nghiên cứu lai tạo giống nấm linh chi chủng DT với giống nấm linh chi bản địa tại Gia Lai bằng hệ sợi” nhằm đa dạng hóa các chủng loại nấm linh chi, lai tạo và tuyển chọn

được các chủng nấm mới có nguồn gốc bản địa, thích nghi tốt với môi trường, cho năng suất và chất lượng cao

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Giống nấm linh chi ký hiệu DT, được công nhận là giống quốc gia năm 2005 Nhập từ Trung tâm Công nghệ Sinh học thực vật Hà Nội và các giống nấm linh chi mọc hoang dã thu thập tại tỉnh Gia Lai

Các giống nấm linh chi mọc hoang dã tại tỉnh Gia Lai được thu thập, định danh, phân loài, nuôi trồng nhân tạo để khảo sát một số đặc điểm về năng suất quả thể và tốc

độ lan sợi trên nguyên liệu mùn cưa gỗ cao su Thu thập bào tử và gây nảy mầm để phân lập hệ sợi đơn bội của các giống nấm trên nhằm nghiên cứu lai tạo

4 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp tách dòng đơn nhân:

Các quả thể thành thục ở giai đoạn sinh trưởng thích hợp cho việc phóng bào tử được thu nhận bào tử Bào tử thu được pha loãng nhiều lần bằng nước cất đã khử trùng, sau đó trải đều trên bề mặt đĩa petri môi trường PGA, ủ ở nhiệt độ thích hợp Mỗi bào tử mọc thành một khuẩn lạc và được tách riêng thành từng dòng đơn nhân làm nguyên liệu lai ban đầu [8]

Phương pháp lai:

Cấy hai dòng đơn nhân trên cùng một đĩa petri, sau một thời gian quan sát nơi tiếp xúc của hai dòng đơn nhân, nếu hình thành gờ nổi rõ thì tách riêng phần gờ nổi vào ống nghiệm

Kiểm tra các dòng đơn bội bằng cách quan sát hệ sợi nấm dưới kính hiển vi Sợi nấm đơn bội không có mấu liên kết (clamp conection)

Kiểm tra phép lai:

Các tổ hợp lai được kiểm tra bằng sự hiện diện của các mấu liên kết (clamp conection) vì khi hai dòng đơn nhân lai được với nhau sẽ hình thành sợi nấm song nhân (thứ cấp) và hình thành các mấu liên kết Nếu tổ hợp nào hình thành các mấu liên kết thì chắc chắn là con lai của hai dòng đơn nhân

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu thu thập được một số chủng nấm linh chi mọc tự nhiên tại tỉnh Gia

Lai Nuôi trồng nhân tạo để khảo sát một số đặc điểm về năng suất ra quả thể và tốc độ lan sợi trên nguyên liệu mùn cưa gỗ cao su

Xây dựng bộ sưu tập các dòng đơn bội nấm linh chi để từ đó lai với chủng nấm linh chi ký hiệu DT nhằm tạo ra chủng nấm linh chi lai có nguồn gốc bản địa, thích nghi tốt với môi trường, cho năng suất và chất lượng cao của giống nấm linh chi ký hiệu DT, đã được công nhận là giống quốc gia năm 2005

Góp phần làm phong phú chủng loại nấm nuôi trồng

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo ra các chủng nấm linh chi mới có khả năng thích nghi tốt với môi trường,

có năng suất và chất lượng cao nhằm giảm giá thành sản xuất, phục vụ cho nhu cầu cải thiện sức khoẻ của người dân, từ đó góp phần thúc đẩy nghề trồng nấm ở địa phương phát triển

6 Cấu trúc của luận văn

Luận văn gồm có những chương mục sau:

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đa dạng sinh học và hệ thống học nấm linh chi Ganodermataceae

Họ nấm Linh Chi Ganodermataceae Donk được công nhận rộng rãi cho đến nay

khoảng gần 200 loài, bao gồm trong 5 chi: Ganoderma Karst., Amauroderma Murr.,

Tomophagus Murr., Humphreya Stey và Haddowia Stey (Nhóm Tores-Tores et al.,

2006 ở Mexico đề nghị tới 6 chi) Khu hệ Linh Chi ở Việt Nam hiện được ghi nhận

hơn 50 loài thuộc Ganoderma, Amauroderma, Haddowia [3], [7]

1.1.1 Lịch sử và tình trạng phân loại Ganodemataceae

Mở đầu, năm 1881, Karsten đã đề xuất chi Ganoderma nhưng chỉ với một loài

không có bất cứ sự thay đổi nào

Năm 1905, Murrill công bố chi Amauroderma

Năm 1933, lần đầu tiên nhóm nấm này được Donk đưa ra để tiến hành xếp loại phân họ Ganodermatoideae

Năm 1948, Donk đưa ra họ Ganodermataceae, đến năm 1964, ông công nhận 2

chi: Ganoderma và Amauroderma (những chi này năm trong phân họ Polipoideae)

Cùng lúc đó, năm 1965, Cuningham đã đặt chi Elfvingia trong phân họ

Fomitoideae

Năm 1972, Steyaert công nhận 5 chi: Ganoderma, Amauroderma, Haddowia

steyaert, Humphreya steyaert và Magoderma steyaert

Đến năm 1973, Pegler cũng công nhận chi: Ganoderma, Amauroderma và

Elfvingia

Năm 1980, Ryvardern và Johansen công bố 4 chi: Ganoderma, Amauroderma,

Haddowia và Humphreya

Vào năm 1981, Julish công bố danh pháp của chi Ganoderma bao gồm 2 họ:

- Ganodermataceae: Ganoderma, Amauroderma và Humphreya

- Haddowiaceae: Haddowia

Năm 1983, Corner công nhận 5 chi: Ganoderma, Amauroderma, Haddowia,

Humphreya và Trachyderma Ông không chấp nhận chi Magoderma vì cho rằng nó

đồng nghĩa với chi Amauroderma

Đến 1983, Ainsworth và Bisby đã liệt kê họ Ganodermataceae gồm có 3 chi:

Amauroderma, Ganoderma và Humphreya với 105 loài

Trong những năm gần đây, các tác giả Trung Quốc đã mô tả 53 loài [38]

1.1.2 Hình thái học các loài trong họ Ganodermataceae

1.1.2.1 Đặc điểm vĩ mô

Laccate (láng bóng): Đặc điểm này có sự khác nhau ở mũ và cuống nấm Theo

quan niệm truyền thống, ở các loài dưới chi (subgen), như Ganoderma, bề mặt của mũ nấm thì láng bóng, còn ở Amauroderma thì không láng bóng Tuy nhiên, ở một vài loài thuộc chi Amauroderma, như A.austrofujianense, A.leptopus, vv…, vẫn láng bóng Trong khi đó, nhiều loài ở dưới chi Ganoderma như G.mongolicum lại không

dụng để phân lớp Ganoderma Năm 1979, Zhao và cộng sự đã đề xuất phân chia dưới chi của Ganoderma thành hai nhóm, tức là:

Nhóm Ganoderma có mô thịt kép: màu trắng, hơi trắng hay màu gỗ ở lớp trên

(upper layer), nhưng lúc nào cũng nâu, hơi nâu hay nâu vàng gần lớp ống (tube layer)

Sự phân định ranh giới giữa hai lớp này có thể có khác biệt hoặc hoặc đôi khi không rõ ràng

Nhóm Phaeonema: màu sắc mô thịt nấm có sự thống nhất từ nâu đến nâu đậm

một số nhà nghiên cứu nấm đã bỏ quên tầm quan trọng của nó, họ chỉ mô tả thể quả có cuống hoặc không có cuống Điều này thường dẫn đến khó khăn trong việc phân loại loài Việc mô tả chính xác cuống nấm là cần thiết trong việc giới hạn phân loại [38].

1.1.2.2 Đặc điểm vi mô

Cấu tạo vỏ tán nấm: Cấu tạo vỏ tán nấm là đặc điểm dễ nhận biết trong phân

loại Ganodermatacea Trước đây, chủ yếu tìm thấy ở chi Ganoderma và chi

Amauroderma, nhưng sau này, hiếm khi thấy ở chi Amauroderma Dựa trên đặc điểm

cấu trúc khác nhau của vỏ tán nấm, Ganoderma có thể được phân chia rõ ràng thành 3

dưới chi:

Ganoderma: Cấu tạo thể quả chi này gồm có tầng thượng bì hay lớp vỏ bên

ngoài và tầng bì

Elfvingia: Ở chi này, phần vỏ tán nấm có một lớp lông (tầng lông hay vỏ lông)

hoặc có một mô bất định (irregular tissue)

Trachyderma: Ở chi này cũng có một mô bất định

Dĩ nhiên, ở đây cũng có những ngoại lệ, đặc điểm này sẽ có sự khác nhau ở những mẫu khác nhau về độ tuổi của những loài riêng rẽ Và từ đó, chúng cho ra những dạng cấu trúc khác nhau Tuy nhiên, đặc điểm này vẫn rất hữu dụng cho việc định danh một số lượng lớn các loài

Hệ sợi nấm: Trong họ này, hệ sợi nấm thường ở dạng trimitic (dạng ba sợi nấm), thỉnh thoảng ở dạng dimitic (dạng hai sợi nấm)

Sợi nguyên thủy (generative hyphae): Trong suốt, có màng mỏng, dạng phân nhánh, có vách ngăn hoặc không, có mấu

Sợi cứng (skeletal hyphae): Có màu sắc, dài, có sự phân nhánh hoặc có dạng gai nhỏ, có màng dày

Sợi bện (binding hyphae): Thường không màu, ở dạng phân nhánh

Hệ sợi nấm ở Ganoderma và Amauroderma có những sự khác biệt chính sau:

Ganoderma: Ở một số loài, sợi bện có dạng Bovista, nó là sản phẩm của sợi

nguyên thủy hoặc sợi cứng như ở Ganoderma lucidum và G.ungulatum Một số ít loài

có mô thịt xám xen giữa là các sợi cứng (ở dạng biến đổi và có tế bào sinh sản kéo dài)

như Ganoderma mirabile (Lloyd) Humphrey và G.oregonese - Murr

Amauroderma: Không có sợi bện dạng Bovista Nhưng, nhiều loài có sợi cứng

xen giữa (intercalary skeletal) như Amauroderma rugosum và A.calcigenum (Berk)

Torrend Sợi cứng xen giữa có thể tiếp tục như một sự móc nối giữa các sợi cứng hoặc sợi nguyên thủy

Haddowia longipes: Cấu trúc sợi nấm giống như Amauroderma, và ở

Humphreya coffeatum thì giống Ganoderma

Các đặc điểm liên quan đến hệ sợi này là: Vách ngăn, đường kính của sợi nấm, vv… rất khó để giúp phân chi và nhóm, bởi dưới ảnh hưởng của các nhân tố môi trường, đặc điểm của sợi nấm không thể kiểm tra Ở một loài riêng rẽ, ta có thể tìm thấy sự khác biệt rõ ở đường kính sợi nấm và sự phân chia vách ngăn nhờ có sự khác biệt về độ tuổi cũng như về dinh dưỡng

Đảm và bào tử đảm: Đảm có đa dạng về kích thước cũng như hình dáng từ dạng chùy điển hình đến dạng quả lê, hoặc có nhiều dạng khác, và chúng thường to khỏe hơn Dạng trung gian thường thấy ở các mẫu giống nhau

Chi Ganoderma: Bào tử có dạng trứng hoặc hình trứng - trái xoan (ellipsoid-

ovoid), đôi khi có dạng hình trụ và luôn có đỉnh cụt Màng bào tử không dày đồng đều, với phần đỉnh luôn dày hơn phần nền, rất dễ nhận thấy với lớp màng kép

Lớp màng ngoài trong suốt và mỏng

Lớp màng trong thường có màu và dày hơn, có thể có gai nhỏ hoặc không

Chi Amauroderma: bào tử có dạng hình cầu hoặc gần cầu, đôi khi có dạng hình

trụ Màng bào tử dày đồng đều

Bào tử Haddowia có dạng mào kép theo chiều dọc, với cơ ngang nhỏ nối với màng nguyên sinh chất Trong khi đó, ở Humphreya, bào tử có chóp với hoa văn dạng

mắt lưới [38]

1.1.3 Sinh thái học và sự phân bố họ Ganodermataceae

Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và loại cây chúng bám là rất quan trọng đối với sự phát triển của bào tử đảm Trong đó, nhiệt độ và độ ẩm là quan trọng nhất, sự kết hợp giữa nhiệt độ cao và lượng mưa dồi dào cung cấp một điều kiện thích hợp cho sự phát triển của bào tử

Dựa trên các nhân tố khí hậu và hình thái, các loài Ganodermataceae ở Trung Quốc được đặt trong 4 nhóm sau:

Các loài nhiệt đới và cận nhiệt đới: Một số lượng lớn của phân loại phát triển

mạnh ở nhiệt độ và độ ẩm cao (như G.hainanense, G.atrum và toàn bộ các loài thuộc chi Amauroderma)

Nhiều loài phát triển mạnh ở các vùng nhiệt với lượng mưa tương đối nhỏ (như

G.sinense và G.lucidum)

Một số loài lại thích hợp ở những vùng có nhiệt độ thấp với lượng mưa rất nhỏ

(như G.tsugae và G.mongolicum)

Những loài khác có ngưỡng chịu đựng nhiệt độ và lượng mưa phạm vi rộng và

phân bố rộng khắp trên thế giới (như G.applanatum)

Việc ra thể quả của Ganoderma thường thích hợp với ánh sáng gián tiếp và bắt gặp ở các khu rừng thưa, nhưng thể quả của Amauroderma gặp ở các khu rừng rậm rạp

và hầu như chúng cũng không thích ánh sáng mặt trời Các loài Ganoderma hầu như phổ biến trên thế giới, nhưng Amauroderma thì phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới ở cả hai nửa địa cầu

Ở Trung Quốc, các loài Ganoderma thường ra thể quả ở khu vực thuộc khoảng

vĩ độ 450B và 250B Khu vực Đông Bắc của Trung Quốc, như tỉnh Heilongjiang, loài

G.tsugae chiếm ưu thế, còn G.lucidum phân bố không quá tỉnh Jilin; ở thung lũng sông

Vàng, G.lucidum lại chiếm ưu thế; còn ở thung lũng sông Yangtze, G.sinense chiếm

ưu thế, dù nó không có ở phía Bắc của khu vực này Ngày nay, loài G.sinense chỉ có

thể thấy ở các tỉnh từ Zhejiang, Jiangxi, Hunan, Guangxi, Fujian và Haina;

G.mongolicum và G.subumbraculum thì chỉ thấy ở tỉnh Hebei và khu vực Mông Cổ;

trong khi đó G.applanatum là một loài khá phổ biến ở Trung Quốc

Dựa vào các số liệu đã được ghi nhận, các loài Amauroderma chỉ phân bố dọc đường địa lý nằm ở các khu vực phía Nam của Trung Quốc, còn Haddowia và

Humphreya chỉ thấy ở tỉnh Hainan [38]

1.2 Vòng đời của các loài nấm thuộc Basidiomycota

Hầu hết các loài nấm nuôi trồng hiện nay, bao gồm các loài Ganoderma, đều

thuộc nghành Basidiomycota (ngoại trừ nấm cục thuộc nghành Ascomycota) Các loài thuộc nghành này có đặc điểm chung là cấu tạo bởi các sợi nấm (ngoại trừ nấm men)

và hình thành bào tử bên ngoài nhờ những tế bào ngoài cùng hình chùy, gọi là đảm Mỗi sợi nấm được phân chia bởi các vách ngăn tạo thành các khoang nối tiếp nhau, mỗi khoang đó là một tế bào của sợi nấm Các loài nấm trong nghành này rất đa dạng

về hình thái, vòng đời và di truyền giới tính Tuy nhiên, hầu hết các loài vẫn có những đặc điểm chung trong vòng đời của chúng

Pha đơn bội đồng nhân Pha song dị nhân Pha lưỡng bội Chu kỳ vô tính Chu kỳ vô tính

Hình 1.1 Vòng đời cơ bản của các loài nấm Basidiomycota [13]

Vòng đời cơ bản của các loài nấm thuộc Basidiomycota gồm 9 giai đoạn: (1) – Bào tử đảm nảy mầm; (2) – hình thành các sợi nấm đồng nhân; (3) – Dung hợp nguyên sinh chất; (4) – Hình thành sợi nấm song dị nhân; (5) – Hình thành quả thể; (6) – Hình thành đảm ở tai nấm trưởng thành; (7) – Dung hợp nhân; (8) – Quá trình giảm phân; (9) – Hình thành 4 bào tử đảm

Các bào tử nảy mầm tạo thành các sợi nấm đồng nhân và trong mỗi khoang của sợi nấm có 1 nhân Khi hai sợi đồng nhân có kiểu di truyền tương hợp nhau tiếp xúc nhau thì dẫn đến sự dung hợp vách tế bào và nguyên sinh chất, sự kiện dung hợp này được gọi là plasmogamy Sau khi dung hợp, các nhân sẽ di chuyển và bắt cặp với nhau

và tạo thành sợi nấm song dị nhân với mỗi khoang của sợi nấm chứa hai nhân khác nhau Khi tai nấm trưởng thành, chỉ tại một số tế bào đặc biệt, nằm ở ngoài cùng, gọi

là đảm, sự dung hợp 2 nhân mới xảy ra và làm các tế bào đảm từ dạng song nhân chuyển sang dạng lưỡng bội, sự kiện này được gọi là karyogamy Đảm lưỡng bội tiếp tục trải qua sự giảm phân tạo ra 4 đơn nhân mới và những đơn nhân này sẽ di chuyển vào trong các bào tử đảm nằm trên cuống đảm Cuối cùng, vòng đời các loài

Basidiomycota sẽ hoàn thành khi các bào tử được phát tán vào môi trường

Các sợi nấm đồng nhân và song dị nhân có thể trải qua hoặc không trải qua chu

kỳ sinh sản vô tính bằng cách tạo các bào tử vô tính – oidia (bào tử vách mỏng) hoặc chlamydospores (bào tử vách dày) Nếu bào tử vô tính là đơn nhân thì sẽ tái tạo lại sợi nấm đồng nhân bố mẹ; nếu bào tử vô tính là song nhân thì sẽ hình thành lại sợi nấm song dị nhân

1.3 Di truyền giới tính các loài nấm thuộc Basidiomycota

Năm 1904, Blakeslee đã chứng minh có sự phân chia giới tính ở nhóm nấm Mucorales (lớp Zygomycetes) và mô tả rằng những bào tử tiếp hợp chỉ hình thành khi

có sự lai chéo giữa hai sợi nấm khác nhau kiểu bắt cặp [10] Tuy nhiên, theo Chang và Miles thì phải đến những năm 1920, giới tính của các loài thuộc Basidiomycota mới được khám phá bởi Bensaude và Kinep [14] Khám phá này được hai nhà khoa học

phát hiện trong khi theo dõi phản ứng bắt cặp của những đơn bào tử nấm Corprinus

fimetarius và Shizophyllum commune Bensaude đã mô tả: Các sợi nấm đồng nhân nảy

mầm từ bào tử đảm chỉ có những cấu trúc vách ngăn đơn giản, còn các sợi nấm song

dị nhân của quả thể thì có cấu trúc mối nối (lamp connection – c.c) (hình 1.2)

Bensaude cũng chứng minh rằng chỉ một số kiểu bắt cặp của các sợi đơn nhân mới có thể hình thành mấu nối Trong khi đó nghiên cứu của Kniep lại nhấn mạnh: Sự bắt cặp thành công của các sợi đơn nhân liên quan đến hai nhân tố bắt cặp A và B, chỉ khi hai dòng đơn bội dị hợp ở cả 2 nhân tố A và B tiếp xúc nhau thì mới tạo sợi nấm

có mấu nối

Hình 1.2 Hình thái hệ sợ nấm dị nhân và sợi nấm đồng nhân[14]

(A) - Sợi nấm có mấu nối, (B) – Sợi nấm chỉ có vách ngăn

Dikaryon – thể song nhân C.c – Mấu nối (clamp conection)

Từ những khám phá đầu tiên này, nhiều công trình nghiên cứu về di truyền giới tính của các loài nấm thuộc Basidiomycota được phân thành hai kiểu di truyền giới tính: đồng tản (homothallism) và dị tản (heterothallism) Trong đó, hai yếu tố quyết định kiểu di truyền giới tính là: Sự phân bố các nhân vào bào tử đảm sau quá trình giảm phân và các nhân tố quy định sự bắt cặp [20] Ngoài ra, kiểu di truyền giới tính không thể phân biệt được bằng hình thái bên ngoài của quả thể hay của hệ sợi nấm

1.3.1 Đồng tản (Honothallism)

Các nấm di truyền giới tính theo kiểu đồng tản có đặc điểm chung là sợi nấm nảy mầm từ một đơn bào tử có khả năng hình thành quả thể trong điều kiện nuôi trồng thích hợp Các loài nấm thuộc nhóm này lại phân chia thành hai nhóm nhỏ khác nhau

là đồng tản sơ cấp và đồng tản thứ cấp [20]

1.3.1.1 Đồng tản sơ cấp (Primary Homothallism)

Di truyền kiểu đồng tản sơ cấp có đặc điểm là mỗi sợi đơn bào tử chứa một nhân, sợi nấm nảy mầm từ các đơn bào tử đều có khả năng hình thành quả thể Ví dụ

điển hình cho loài nấm có kiểu di truyền giới tính này là nấm rơm Volvariella volvacea

[20]

1.3.1.2 Đồng tản thứ cấp (Secondary Homothallism)

Di truyền kiểu đồng tản thứ cấp là kiểu di truyền trong đó các đơn bào tử đều mang hai nhân và chỉ những bào tử mang hai nhân khác nhau kiểu bắt cặp mới sinh ra sợi nấm có khả năng hình thành quả thể Di truyền giới tính kiểu này tương tự với kiểu

dị tản lưỡng cực, chỉ khác nhau ở quá trình phân chia các nhân sau giảm phân vào các bào tử đảm, ở loài dị tản lưỡng cực thì mỗi nhân sẽ di chuyển vào mỗi bào tử đảm khác nhau, trong khi ở loài đồng tản thứ cấp thì hai nhân di chuyển vào cùng một bào

tử đảm [20]

Ví dụ điển hình cho kiểu di truyền giới tính này là nấm mỡ Agaricus bisporus

Số lượng bào tử sinh ra trên mỗi đảm của nấm A.bisporus rất khác nhau: 81% đảm

mang 2 bào tử, 18% đảm mang 3 bào tử, 1% đảm mang 4 bào tử Những bào tử này có thể mang hai nhân khác kiểu bắt cặp, cũng có thể mang hai nhân cùng kiểu bắt cặp vì

sự phân bố các nhân sau giảm phân là ngẫu nhiên, vì thế không phải tất cả các bào tử sinh ra đều có thể hình thành quả thể [10]

1.3.2 Dị tản (Heterothallism)

Di truyền giới tính kiểu dị tản là kiểu di truyền trong đó đơn bào tử luôn mang một nhân, khi nảy mầm sẽ tạo ra sợi nấm đồng nhân và sợi nấm này không thể tự hình thành quả thể Biểu hiện đặc trưng của các loài dị tản là khi hai sợi nấm đồng nhân tương hợp tiếp xúc nhau thì sẽ dung hợp và sẽ tạo ra sợi nấm song dị nhân (song nhân)

có khả năng hình thành quả thể Cho đến nay các nghiên cứu về di truyền giới tính của các loài nấm thuộc Basidiomycota cho thấy gần 90% các loài có kiểu di truyền dị tản [20]

Những nghiên cứu di truyền cho thấy sự tương hợp này được quy định bởi một vùng gen chứa nhiều gen có chức năng quy định kiểu bắt cặp của các dòng đơn bội và vùng gen này được gọi là nhân tố bắt cặp [26] Dựa trên sự khác biệt của nhân

tố bắt cặp, các loài dị tản được chia thành 2 nhóm khác nhau là dị tản đơn nhân tố và

dị tản nhị nhân tố

1.3.2.1 Dị tản đơn nhân tố (Unifactorial Heterothallism)

Những loài nấm thuộc nhóm dị tản đơn nhân tố là những loài mà sự tương hợp của các dòng đơn bội được quy định bởi một nhân tố bắt cặp Hai dòng đơn bội của các loài dị tản đơn nhân tố tương hợp nhau khi nhân tố bắt cặp của chúng có kiểu allen khác nhau Hệ thống bắt cặp dạng này được gọi là hệ thống tương hợp lưỡng cực Di truyền giới tính dị tản đơn nhân tố còn được gọi là di truyền dị tản lưỡng cực [20]

Bào tử sinh ra sau giảm phân của các loài nấm này có thể phân thành hai nhóm khác nhau về nhân tố bắt cặp Trong các loài nấm thuộc Basidiomycota dị tản thì có khoảng 25% loài là thuộc nhóm dị tản lưỡng cực Ví dụ cho các loài thuộc nhóm nấm

này là Agaricus bitorquis và Philiota nameko [20]

1.3.2.2 Dị tản nhị nhân tố (Bifactorial Heterothallism)

Những loài nấm thuộc nhóm dị tản nhị nhân tố là những loài mà sự tương hợp của các dòng đơn bội được quy định bởi hai nhân tố bắt cặp A và B Hai dòng đơn bội tương hợp với nhau chỉ khi có khác biệt ở cả hai nhân tố A và B Hệ thống bắt cặp dạng này được gọi là hệ thống tương hợp tứ cực Di truyền giới tính dị tản nhị nhân tố còn được gọi là di truyền dị tản tứ cực [20]

Đặc điểm di truyền giới tính của nhóm nấm này được mô tả như sau:

Hình 1.3 Di truyền giới tính kiểu dị tản tứ cực[14]

Các bào tử đảm sinh ra sau quá trình giảm phân sẽ có 4 kiểu di truyền giới tính (hay 4 kiểu bắt cặp): AxBx, AxBy, AyBx, AyBy Có 6 trường hợp bắt cặp có thể xảy

ra giữa các dòng đơn bội của đơn bào tử, tuy nhiên chỉ có 2 trường hợp bắt cặp là có thể tạo ra hệ sợi dị nhân (heterokaryon) mang cấu trúc mối nối hoàn chỉnh, đó là khi hai dòng đơn bội khác nhau ở cả hai nhân tố A và B (AxBx, và AyBy, AxBy và AyBx) bắt cặp với nhau Quá trình bắt cặp giữa các dòng đơn bội bị chi phối hoàn toàn bởi hai nhân tố bắt cặp [14]

Trong 90% các loài Basidiomycota dị tản thì các loài dị tản tứ cực chiếm đến 65%

1.4 Khái quát về các phương pháp cải tiến giống nấm

Mặc dù, có nhiều phương pháp cải tiến giống được sử dụng, nhưng cơ bản có thể phân chúng thành 3 nhóm phương pháp chính, đó là: phương pháp tuyển chọn, phương pháp lai và phương pháp chuyển gen

1.4.1 Phương pháp tuyển chọn

Đầu tiên, các giống nấm có những đặc điểm mong muốn sẽ được tuyển chọn từ

tự nhiên hoặc từ môi trường nuôi trồng nhân tạo Các giống nấm này sẽ được bảo quản

và tiếp tục tuyển chọn trong quá trình nuôi trồng để giống nấm ngày một tốt hơn Phương pháp cải tiến giống này chủ yếu dựa trên các đặc điểm hình thái quả thể hay năng suất nuôi trồng của các giống nấm Mặc dù, được ứng dụng một thời gian khá dài trước khi có những hiểu biết về di truyền giới tính của các giống nấm nuôi trồng, nhưng những thành công của phương pháp cải tiến này lại rất hạn chế Nguyên nhân là

do khả năng xuất hiện các thường biến mang những ưu điểm vượt trội thường rất thấp

Hơn nữa, các thường biến này hầu hết là kết quả đột biến của một vài gen đơn lẻ Các gen này có thể phục hồi hoặc tiếp tục biến đổi khi có những thay đổi nhỏ trong điều kiện nuôi trồng hay khi cấy chuyền liên tục trong sản xuất giống Kết quả là chất lượng và năng suất nuôi trồng của các giống nấm này thường không ổn định [12]

1.4.2 Phương pháp lai

Đây là phương pháp cải tiến chủ yếu trong nghành nấm Hầu hết các giống nấm cải tiến hiện nay đều được tạo ra bằng phương pháp này Phương pháp lai có thể chia thành 2 nhóm khác nhau, đó là: Lai truyền thống và dung hợp tế bào trần

1.4.2.1 Phương pháp lai truyền thống

Phương pháp này ra dời vào những năm 1980, dựa trên đặc tính bắt cặp của hệ sợi nấm và có thể áp dụng cho cả hai nhóm nấm đồng tản và dị tản Trong đó, nếu xét

về nguồn gốc của đối tượng lai, phương pháp lai có thể chia làm hai kiểu, đó là Tự lai (self - mating) và lai chéo (cross - mating) Tự lai là lai giữa hai dòng của 1 giống bố

mẹ, lai chéo là lai giữa hai dòng của hai giống bố mẹ khác nhau [12]

Nếu xét về đặc điểm di truyền của đối tượng lai thì phương pháp cũng chia làm hai kiểu Đó là lai giữa hai dòng đơn bội và lai bắt cặp di - mon

Lai bắt cặp di – mon là lai giữa một sợi nấm song nhân (dikaryon) và một sợi nấm đơn nhân (monokaryon) Cách lai này mô phỏng lại hiện tượng bắt cặp di – mon

ở các loài Basidiomycota, được các nhà nấm học Canada Buller phát hiện vào năm

1931 [11]

Buller đã mô tả hiện tượng này như sau: Khi một sợi nấm đơn nhân tiếp xúc với một sợi nấm song nhân thì sợi nấm đơn nhân sẽ được song nhân hóa theo một trong ba trường hợp sau:

(1)- Di – mon tương hợp hoàn toàn: Cả hai nhân của sợi song nhân đều tương hợp với nhân của sợi nấm đơn nhân, khi đó 1 trong 2 nhân của sợi song nhân sẽ di chuyển đến bắt cặp với nhân của sợi đơn nhân, biến sợi đơn nhân thành sợi song nhân

(2)- Di – mon tương hợp bán phần: Chỉ 1 trong 2 kiểu nhân của sợi song nhân tương hợp với nhân của sợi đơn nhân, khi đó kiểu nhân tương hợp của sợi song nhân

di chuyển đến bắt cặp với nhân của sợi đơn nhân biến sợi đơn nhân thành sợi song nhân

(3)- Di – mon không tương hợp: Cả hai nhân của song nhân đều không tương hợp với nhân của sợi đơn nhân thì vẫn xảy ra sự dung hợp của hai sợi nấm, nhưng các nhân chỉ trao đổi qua lại tại các tế bào tiếp xúc nhau và tế bào đơn nhân tại đó chuyển thành tế bào song nhân

Trong 3 trường hợp bắt cặp Di – mon chỉ có trường hợp (1) và (2) là sợi nấm

đơn nhân sẽ hình thành mấu nối khi được song nhân hóa [24]

Giai đoạn đầu, khi các phương pháp nhận diện tổ hợp lai chưa phát triển, việc nhận diện hoàn toàn dựa trên sự hình thành cấu trúc mấu nối nên phương pháp lai chỉ

có thể áp dụng cho các giống nấm có mấu nối ở sợi dị nhân (heterokaryon) Ngày nay, cùng với tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều công cụ sinh học phân tử đã được phát triển như: các marker DNA, các marker isozyme, hay các kỹ thuật AFLP, RFLP, RADP đã giúp cho việc phân biệt các thể đồng nhân (homokaryon) và các thể dị nhân (heterokaryon) dễ dàng hơn Nhờ những công cụ này, hiện nay phương pháp lai chéo đã có thể ứng dụng cho các giống nấm không có cấu trúc mấu nối như nấm Rơm

V volvacea và nấm Mỡ A.bisporus [34]

Ngành nuôi trồng nấm hiện nay có khá nhiều giống nấm thương mại hóa thành công có nguồn gốc từ lai tạo bằng phương pháp lai truyền thống Trong đó, có những giống lai đã góp phần thúc đẩy ngành nuôi trồng nấm phát triển vượt bậc như các

chủng nấm Mỡ A bisporus Horst Ul, U3 được tạo ra bởi Fritsche tại Hà Lan năm 1978 [22] hay chủng nấm Flammulina velutipe M-50 được Kitamoto và cộng sự tạo ra tại

Nhật Bản năm 1985 [12] Các chủng nấm Horst U1 và U3 đã giúp ngành nuôi trồng nấm Mỡ phát triển thành một ngành công nghiệp tại Châu Âu như ngày nay Trong khi

đó, giống nấm F velutipe M-50 đã đưa loại nấm này từ một loài hoang dại, khó trồng

trở thành một trong những loại nấm được trồng với quy mô công nghiệp nhiều nhất ở các nước Đông Á

Từ thực tế nghiên cứu, các nhà lai tạo học đã ghi nhận một số đặc điểm chính của phương pháp lai truyền thống như sau:

* Đặc tính hình thành quả thể sớm luôn là tính trạng trội Các tổ hợp lai chéo biểu hiện sự đa dạng về hình thái, đặc tính nuôi trồng và năng suất hơn các tổ hợp tự lai [14]

* Phương pháp lai chéo thường được sử dụng khi muốn cải tạo cơ bản các đặc tính quan trọng của giống nấm như năng suất hay hình thái tai nấm Các giống năng suất cao được lai với các giống có hình thái đẹp để tạo ra các giống nấm mới mang nhiều ưu thế lai Trong khi đó, phương pháp tự lai thì có thể tạo ra những cải tiến nhỏ hiệu quả như các đặc điểm về hình thái [12]

* Sự biểu hiện tính trạng của tổ hợp lai vẫn bền vững trong những điều kiện khắc nghiệt [20]

Khả năng bảo quản giống an toàn và lâu dài: Khi giống lai bị nhiễm virus hay

bị thoái hóa có thể tạo mới hoàn toàn tổ hợp lai từ các dòng bố mẹ đơn nhân [20]

Mặc dù, hiện nay có nhiều phương pháp lai tạo mới hiện đại hơn, nhưng

phương pháp lai truyền thống với nhiều ưu điểm như quy trình thực hiện đơn giản, ít tốn kém, các giống lai tạo ra ổn định di truyền, vẫn là phương pháp yêu thích của hầu hết các nhà lai tạo nấm

1.4.2.2 Phương pháp dung hợp tế bào trần

Quy trình lai tạo giống nấm bằng phương pháp dung hợp tế bào trần gồm các bước như sau: Phân lập các tế bào trần đơn nhân, dung hợp các tế bào trần, tái tạo sức sống cho các tổ hợp lai dị nhân, tuyển chọn và đánh giá khả năng hình thành quả thể

và các dặc tính mong muốn của các tổ hợp lai thành công Với phương pháp này, các

tế bào có thể tiếp xúc và trao đổi vật chất di truyền với nhau mà hoàn toàn không bị giới hạn bởi hàng rào di truyền tự nhiên, một vấn đề thường hay gặp trong các phương pháp lai truyền thống Kết quả là tỉ lệ dung hợp thành công luôn rất cao, tự dung hợp giữa các tế bào khác chủng cùng loài, đến các tế bào khác loài cùng chi, thậm chí là giữa các tế bào khác chi với nhau [12]

Mặc dù quá trình dung hợp các tế bào trần hoàn toàn không bị chi phối bởi các nhân tố bắt cặp nhưng sự hình thành và phát triển quả thể của tổ hợp lai thì bị chi phối bởi sự tương hợp loài Ví dụ như các tổ hợp lai được tạo ra bằng phương pháp dung

hợp tế bào trần giữa các loài Pleurotus tương hợp nhau (P ostreatus + P ostreatus,

P.ostreatus + Pleurotus florida, P.florida + P.sajor - caju, P.ostreatus + P sajor-caju)

mang những đặc tính tương tự như những tổ hợp lai được tạo bằng phương pháp lai chéo: hệ sợi nấm dị nhân tạo mấu nối hoàn chỉnh trên môi trường CM (complete media) bán rắn, hình thành quả thể sớm và cho năng suất cao khi nuôi trồng trên môi trường cơ chất mạt cưa bổ sung cám gạo Trong khi đó, các tổ hợp lai giữa những loài

không tương hợp nhau (P.cornucopiae + P.florida, P cornucopiae + Pleurotus

salmoneostramineus, P florida + P sajor-caju, P florida + P salmoneostramineus,

P ostreatus + P sajor-caju, P salmoneostramineus + P sajor-caju, P sajor-caju + P sapidus) khi nuôi cấy trên môi trường MM (minium media) cho hệ sợi nấm phát triển

rất chậm và hình dạng sợi nấm bị méo mó Khi chuyển sang môi trường CM (complete media) thì các tổ hợp lai phân chia thành 3 dạng: tổ hợp lưỡng bội, tổ hợp dị nhân ổn định và tổ hợp đồng nhân Các tổ hợp dị nhân trong trường hợp này tạo hệ sợi phát triển chậm hơn các tổ hợp dị nhân của những loài tương hợp nhau Ngoại trừ một vài

tổ hợp dị nhân, thì tất cả các tổ hợp lai giữa những loài không tương hợp đều hình thành hệ sợi nấm không mấu nối cũng như không thể tạo quả thể trên môi trường CM (complete media) dạng bán rắn hay dạng lỏng Tuy nhiên, khi nuôi các tổ hợp này trên môi trường mạt cưa bổ sung 20% cám gạo và cảm ứng chu kỳ sáng tối thì chúng đều

có thể hình thành nụ nấm Những nụ nấm này đều được cấu tạo bởi các sợi nấm có

mấu nối, ngoại trừ các nụ nấm của tổ hợp P cornucopiae + P florida và P florida +

P salmoneostramineus không có mấu nối ở hệ sợi Và tất cả các nụ nấm mà hệ sợi của

chúng không có mấu nối đều không thể phát triển thành tai nấm trưởng thành, ngoại

trừ các nụ nấm của tổ hợp P florida + P salmoneostramineus Khi các nụ nấm có mấu

nối và các tai nấm trưởng thành của các tổ hợp lai này được phân lập và nuôi cấy cho thấy sợi nấm mới có sức sống mạnh hơn sợi nấm ban đầu của tổ hợp lai và tất cả chúng đều hình thành mấu nối [12]

Các nghiên cứu dung hợp tế bào trần cũng cho thấy kỹ thuật này có thể dung hợp thành công các dòng đơn bội của hai giống nấm cùng loài hay khác loài, tương hợp hay không tương hợp, nhưng chỉ những tổ hợp lai của các giống nấm có quan hệ sinh học gần nhau thì mới có khả năng hình thành quả thể Trong khi đó, việc lai các giống có quan hệ xa nhau thì có ý nghĩa đối với các nghiên cứu di truyền học

Hiện nay, có khá nhiều giống nấm lai tạo bằng dung hợp tế bào trần đã được thương mại hóa thành công Ví dụ như giống nấm Bào ngư P72 của Hàn Quốc, tên là

“Wonhyeongneutaribeosus”, được phân phối cho nông dân nuôi trồng rất thành công vào năm 1990 So với các giống bố mẹ thì giống này có sự khác biệt trong hình thái như mũ nấm lớn hơn, cuống nấm to và dài hơn [12]

Với khả năng dung hợp tế bào hết sức hiệu quả, phương pháp dung hợp tế bào trần được đánh giá sẽ trở thành phương pháp cải tiến giống nấm quan trọng nhất trong tương lai, cũng như là một công cụ đắc lực trong các nghiên cứu về di truyền nấm bậc cao

Như vậy, có thể thấy rằng, dù là lai truyền thống hay lai bằng dung hợp tế bào trần thì ít nhất 1 trong 2 giống nấm bố mẹ sử dụng cho lai tạo phải ở dạng đơn bội và

sự tương hợp loài có vai trò quan trọng đối với sự hình thành và phát triển quả thể của

tổ hợp lai tạo ra Sự bắt cặp giữa các dòng đơn bội hay bắt cặp di - mon của phương pháp lai truyền thống hoàn toàn bị chi phối bởi hai nhân tố bắt cặp Trong khi đó, phương pháp dung hợp tế bào trần có thể vượt qua rào cản di truyền này

1.4.3 Phương pháp chuyển gen

Hiện nay, các công trình nghiên cứu chuyển gen vào nấm đã được thực hiện Tuy nhiên các nghiên cứu này chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá khả năng chuyển các vật liệu di truyền ngoại lai (như gen, chromosome hoặc nhân) vào các loài nấm bậc cao, hoặc dùng để nghiên cứu chức năng gen hay đặc điểm di truyền Cho đến nay, ngoài các giống nấm được chuyển nhân bằng dung hợp tế bào trần chưa có bất kỳ giống nấm chuyển gen nào được thương mại hóa

Các phương pháp chuyển gen được sử dụng bao gồm chuyển gen trực tiếp và

chuyển gen gián tiếp Các DNA trần có khả năng tự nhân lên hay tự chèn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ được đưa vào sợi nấm bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: vi tiêm, bắn gen, dung hợp tế bào trần [12], [32] Phương pháp chuyển gen

gián tiếp thì sử dụng vi khuẩn gram âm Agrobacterium tumefaciens chứa T-DNA để

đưa các gen ngoại lai vào hệ sợi nấm đồng nhân (homokaryon) hoặc sợi nấm dị nhân (heterokaryon) [23], [37]

1.5 Phân nhóm các dòng đơn bội của các loài dị tản tứ cực

Để nâng cao hiệu quả của quá trình lai trong việc lai tạo sử dụng phương pháp lai truyền thống, các dòng đơn bội thường được phải phân nhóm kiểu di truyền giới tính (phân nhóm kiểu bắt cặp) trước khi tiến hành công đoạn lai

Các đơn bào tử của cùng một giống bố mẹ được thu nhận, phân tách và lai ngẫu nhiên từng cặp với nhau, kết quả lai được đánh giá dựa trên sự hình thành mấu nối và hình thái của mấu nối [33]

Các bào tử sinh ra từ giống nấm bố mẹ thuộc loài dị tản tứ cực sẽ có 4 kiểu di truyền giới tính AxBx, AxBy, AyBx, AyBy, vì thế khi 2 dòng đơn bội của các đơn bào này lai ngẫu nhiên với nhau thì sẽ có 1 trong 4 trường hợp sau xảy ra:

Hai dòng khác nhau nhân tố A, giống nhau nhân tố B

Hai dòng khác nhau cả nhân tố A và B

Hai dòng giống nhau nhân tố A, khác nhau nhân tố B

Hai dòng giống nhau cả hai nhân tố A và B

Các nghiên cứu cho thấy hệ sợi nấm sinh ra sau khi lai có 3 dạng hình thái: sợi nấm không có mấu nối (A# B≠ hay A# B#), sợi nấm có mấu nối hoàn chỉnh (A≠ B≠) và sợi nấm có mấu nối giả - mấu nối không dung hợp vào tế bào liền kề với tế bào đỉnh (khi A≠ B#) Điều này liên quan đến hai nhân tố bắt cặp A và B, trong đó mỗi nhân tố chịu trách nhiệm các giai đoạn khác nhau, trong quá trình hình thành mấu nối Vai trò của các nhân tố bắt cặp được mô tả theo Hình 1.4 [26]

Hình 1.4 Vai trò của các nhân tố bắt cặp đối với sự hình thành mấu nối [26]

Có thể thấy rõ, nhân tố A chịu trách nhiệm với quá trình bắt cặp của nhân, hình thành mấu nối, phân chia các nhân vào tế bào ngọn và tế bào liền kề, phân vách ngăn tại mấu nối; nhân tố B chịu trách nhiệm với sự di chuyển các nhân và dung hợp mấu nối vào tế bào liền kề tế bào đỉnh [26]

1.6 Các nghiên cứu liên quan đến các loài thuộc chi Ganoderma ở Việt

Nam

Các nghiên cứu về chi Ganoderma trong nước phần lớn là các nghiên cứu về kỹ

thuật nuôi trồng, một số các nghiên cứu là về phân loại và khảo sát giá trị dinh dưỡng, cũng như tác dụng dược học của một số loài trong chi nấm này Trong khi đó, các nghiên cứu về lai tạo thì tôi chưa tìm thấy

Các nghiên cứu về kỹ thuật nuôi trồng thường tập trung vào phương pháp sản xuất meo giống (khảo sát các loại cơ chất nhân giống, nhiệt độ ủ tơ), phương pháp nuôi trồng (khảo sát các loại cơ chất trồng, sự ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng, vitamin, kim loại lên sự phát triển hệ sợi nấm )

Một số loài Linh chi bản địa được phát hiện và định danh bởi các nhà phân loại

học Việt Nam Như nhóm tác giả Lê Xuân Thám phát hiện loài Ganoderma

thanglongense Thám, sp.nov ở Bảo Lộc, Lâm Đồng [3]

1.7 Các nghiên cứu liên quan đến lai giống nấm linh chi trên thế giới

Năm 2005, Siu Wai Chiu và cộng sự đã tiến hành “Lai nhân tạo Ganoderma

lucidum và G.tsugae Murrill bằng kết hợp protoplast cho tính bền vững Kết quả, một

giống lai nhân tạo tốt đã được tạo ra bởi sự hợp nhất protoplast giữa một giống nuôi

trồng Ganoderma Tsugae và Ganoderma lucidum để mở rộng nhiệt độ sinh trưởng

thuận lợi cho sản xuất trong suốt cả năm Thí nghiệm được thực hiện bằng cách xác định tỉ lệ sống sót và tốc độ sinh trưởng của các giống lai giả định từ 18 - 400C, sau đó

một số đã được chọn Các giống lai nhân tạo này cũng có đặc tính chống lan truyền

các tế bào ung thư ruột kết từ cha mẹ G.lucidum trong một nghiên cứu invitro Chiết

xuất từ giống lai này đã làm hạ đường huyết nhanh chóng trên chuột Ngoài ra nó còn tăng cường sự phục hồi biểu hiện cytokine ở chuột được điều trị bằng streptozotocin

… Do đó nghiên cứu này cho thấy hiệu ứng miễn dịch của nấm linh chi trong cơ thể sống Cho thấy kết hợp protoplast để vượt qua sự không tương thích tự nhiên của hai

loài trong phức hợp loài Ganoderma lucidum

“Đánh giá các giống lai thu được từ Ganoderma lucidum bằng cách sử dụng kỹ thuật protoplast monokaryon”, Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition), năm 2010, nhóm tác giả LIN Jun-Hua [21] Các chủng monokaryon đã được phân lập bằng cách sử dụng kỹ thuật đơn nguyên protoplast và sau đó bắt cặp để có được chủng lai Tỉ lệ tăng trưởng hệ sợi, thời gian ra quả thể, năng suất và chất lượng của 3 giống lai và cha mẹ chúng đã được so sánh Các kết quả cho thấy quả thể của giống lai 1 xuất hiện sau 22 ngày nhanh hơn 3 ngày so với cha mẹ của

nó là Guangdong lingzhi và Ganoderma 5.75 tương ứng và năng suất của giống lai 1 cao hơn 178,5% so với Guangdong lingzhi, cao hơn 34,9% so với Ganoderma 5.75 So với 2 dòng bố mẹ giống lai 2 có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn 30% trong môi trường PDA triterpenoid của giống lai 2 cao hơn 198% so với Guandong lingzhi và 121,2% cao hơn Ganoderma 5.75 Kết quả chỉ ra rằng kỹ thuật này có giá trị và có thể được áp dụng trong việc lai giống của nấm linh chi

Năm 2016, Xiao-Ping Wu và cộng sự đã tạo ra các chủng Ganoderma lucidum

mới giàu polysaccharides và triterpenes bằng cách lai đơn bội các chủng thương mại

Mục đích của nghiên cứu này là để tạo ra chủng giống G lucidum giàu

polysaccharides và triterpenes bằng cách giao phối của monokaryons basidiospore của

hai giống thương mại, G lucidum JC và AL Bằng cách ủ các basidiospores mới thu

thập, 31 monokaryons đã được phân lập (19 từ chủng JC, và 12 từ AC), cho thấy sự khác biệt đáng kể trong sự tăng trưởng sợi nấm và hàm lượng polysaccharide và triterpene Lai giữa hai chủng tạo ra 83 trường hợp tương hợp loài Trong số các giống lai tạo ra, mười sáu chủng cho thấy sự phát triển trên môi trường tốt và đã được đánh giá về mặt quả thể Tất cả các giống lai được thử nghiệm đều tạo ra quả thể nhưng thay đổi đáng kể trong thời gian thu hoạch đầu tiên, năng suất, phân bố năng suất, và hình dạng và màu sắc Sự khác biệt đáng kể trong hàm lượng polysaccharide (từ 6,79 đến 18,21 mg/g trọng lượng khô) và hàm lượng triterpene (từ 5,90 đến 10,87 mg/g trọng lượng khô) cũng được quan sát thấy trong các giống lai Đáng chú ý là hàm lượng polysaccharides cao (16,63 mg/g trọng lượng khô) và triterpenes (10,50 mg/g trọng

lượng khô) đều có mặt trong chủng lai H-23, với hiệu quả sinh học đạt yêu cầu (19,41%) Phân tích DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) chỉ ra rằng H-23 là một chủng lai mới Giống lai này có thể thích hợp để sử dụng trong sản xuất thương mại của G lucidum để sản xuất các chế phẩm y tế và dược phẩm hiệu quả hơn Theo hiểu biết của tác giả, nghiên cứu này là báo cáo đầu tiên về sự phát triển của các dòng

G lucidum mới thông qua lai bằng phương pháp của các monokaryon có nguồn gốc từ

basidiospore [29]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Sơ đồ thí nghiệm

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Các giống nấm linh chi mọc tự nhiên được thu thập trên địa bàn tỉnh Gia Lai và chủng nấm linh chi ký hiệu DT được nhập từ Viện Di truyền Nông nghiệp Hà Nội

Thu thập quả thể nấm linh chi mọc tự

Phân lập mô tạo giống

Nuôi trồng tạo quả thể

Phân tích đặc điểm hình thái

Thu nhận bào tử

So sánh với

mô tả định danh

Khảo sát đặc điểm nuôi trồng

Gây nảy mầm, tạo các dòng đơn

bội

Bảng 2.1 Danh sách các giống nấm Linh chi thu thập

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân loại bằng đặc điểm hình thái

Các tai nấm được thu nhận từ nuôi trồng sử dụng để phân tích hình thái Phương pháp giải phẫu và phân tích mẫu nấm được thực hiện theo Largent [39], [15] Các cấu trúc được phân tích gồm: mặt trên tai nấm, mặt dưới tai nấm, lát cắt ngang tai nấm, bào tầng, cấu trúc sợi nấm, bào tử đảm Kết quả phân tích được so sánh với các

mô tả của các nhà phân loại học khác để xác định loài cho các giống nấm thu thập

Kích thước các cấu trúc đại thể được đo bằng thước Calip Kích thước các cấu trúc hiển vi được đo bằng thước đo micrometer của kính hiển vi

2.3.2 Phân loại dựa trên trình tự vùng ITS

Phân loại sử dụng các trình tự bảo tồn nằm trong gen mã hóa các RNA của ribosome (rDNA) Các gen rDNA có đến hàng trăm bản lặp lại, nằm cách nhau bởi các vùng không phiên mã NTS (non transcribed spacer), tạo thành một vùng phức hợp nằm trong nhân Thành phần một rDNA bao gồm: ba trình tự mã hóa 18S, 5,8S, 28S rRNA và hai vùng sao chép bên trong ITS1, ITS2 (internal transcribed spacer) nằm phân cách các trình tự mã hóa [9]

Hình 2.1 Cách sắp xếp và cấu tạo của rDNA [9]

Những vùng rDNA mã hóa RNA của các tiểu phần nhỏ SSU (small subunit RNA coding region) 18S-5,8S và của tiểu phần lớn LSU (large subunit RNA coding region) 28S chứa những trình tự bảo tồn, vì thế chúng được sử dụng để nghiên cứu phả

hệ [19] Tuy nhiên, do trình tự rDNA của các tiểu phần nhỏ 18S và 5,8S thì quá bảo tồn, nên thường không hiệu quả khi so sánh các loài với nhau [18] Trong khi đó, vùng LSU với 2 domain Dl, D2 phân kỳ nằm ở 600 - 900 base đầu tiên thì có thể định danh phần lớn các loài nấm dược liệu [17]

Vùng ITS (bao gồm các trình tự: ITS1 - 5.8S - ITS2) thì tiến hóa nhanh hơn vùng LSU Sự khác biệt trong trình tự ITS thể hiện rất rõ ở cấp độ chi và loài, ở cấp độ chủng thì rất ít khác biệt Với những đặc điểm chuyên biệt cho loài và khả năng thao tác dễ dàng, do có một lượng lớn các bản sao, vùng ITS được công nhận và sử dụng như một trình tự barcode phân loại loài cho cả giới nấm [9] Tuy nhiên, ở một số chi nấm thì ITS lại không chuyên biệt cho loài, nghĩa là, các loài di truyền gần nhau hay các loài thuộc cùng nhóm sinh học của chi nấm đó có cùng một trình tự ITS và điều này dẫn đến những kết luận sai trong xây dựng phát sinh loài [25]

Mặc dù, có khá nhiều trình tự gen được sử dụng để định danh, nhưng cho đến nay ITS vẫn được đánh giá là marker định danh hiệu quả nhất cho giới nấm và dữ liệu ITS cũng là một trong những dữ liệu phong phú nhất của GenBank hiện nay Kết quả thống kê đến tháng 01/2004 cho thấy có hơn 21.000 trình tự ITS của nấm có trên GenBank [28]

Trong nghiên cứu này do điều kiện không đủ phương tiện để làm thí nghiệm nên tôi đã chọn gửi các mẫu nấm linh chi đã thu thập được đi giải trình tự ITS và so sánh trên ngân hàng gen BLAST tại Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa – Quận Cái Răng, tp.Cần Thơ

2.3.3 Khảo sát đặc điểm nuôi trồng

Đặc điểm nuôi trồng của các giống nấm thu thập được khảo sát trên môi trường mạt cưa cây Cao su vì đây là nguồn nguyên liệu nông nghiệp dồi dào, luôn sẵn có tại Gia Lai và phù hợp với hầu hết các loại nấm Linh chi

Đặc điểm nuôi trồng của các giống nấm được đánh giá qua các thông số: Tốc

độ dòng hóa cơ chất nuôi trồng, hiệu suất chuyển hóa sinh học Thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại, mỗi lần khảo sát trên 10 bịch phôi/giống - kích thước 20 x 12cm, mỗi bịch chứa 1,2 kg cơ chất

2.3.3.1 Cách thực hiện

*Thu thập quả thể nấm linh chi mọc tự nhiên tại Gia Lai

Nấm linh chi mọc tự nhiên tại Gia Lai từ tháng 5 đến tháng 9 hàng năm trên cây

Dẻ (Quercus lanata) đã chết ở Khu bảo tồn thiên nhiên Kon Chư Răng huyện Kbang

và trên cây Lim xẹt (Peltophorum tonkinensis) đã chết ở Vườn Quốc Gia Kon Ka Kinh

huyện Mang Yang tỉnh Gia Lai

Vì nấm linh chi tự nhiên chỉ mọc vào mùa hè nên phải tranh thủ thu quả thể tươi nấm linh chi, gói trong giấy báo sạch theo từng cây riêng lẻ để bảo quản trong thời gian mang về phòng thí nghiệm, phân lập tạo giống nguyên chủng

*Tách phân lập giống nguyên chủng

Đây là kỹ thuật tách đoạn vô trùng hệ sợi song hạch của mô sinh dưỡng hoặc sinh thực nấm Chỉ cần chọn đúng vùng đang tăng trưởng mạnh ở thể quả là có thể thu nhận được giống thuần khiết một cách đơn giản, như sơ đồ minh họa dưới đây

Thông trường với quả thể nấm tươi (mới thu hái được vài ngày, nếu bảo quản trong tủ lạnh có thể giữ được hàng tháng), tiến hành rửa vài lần bằng nước sạch và sau

đó là nước vô trùng Khử trùng bề mặt mẫu bằng lau cồn hoặc dung dịch HgCl2 0,2% vài lần, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 2 – 3 lần Dùng dao mổ, lưỡi lam tách gọt bỏ phần mô bên ngoài, như vậy sẽ dần lộ ra lớp mô vô trùng bên trong, dễ dàng tách những mẫu nhỏ vài mm, nhanh tay cấy lên môi trường đã chuẩn bị sẵn

Đôi khi khéo tay chỉ cần dùng tán nấm tươi xé gọn để lộ lớp mô bên trong, tránh chạm tay vào, dùng dao mổ cắt những mẫu mô nhỏ bằng cỡ đầu tăm, cấy nhanh lên môi trường

Ủ trong tối các mẫu mô vừa cấy, khoảng 26 – 30o

C Sau 3 – 5 ngày hệ sợi sẽ bung mọc rất nhanh Sau 5 – 7 ngày khuẩn lạc hình thành rõ, dễ dàng tách nhân lên tiếp, để có số lượng giống thuần khiết lớn, đảm bảo cho lưu giữ và nhân giống sản xuất Thường hệ sợi nhân lên đạt 14 – 18 ngày là tốt nhất Trường hợp mẫu nhiễm khuẩn nặng, khó có giống thuần khiết ngay vì có thể các mẫu cấy bị nhiễm khuẩn

nhiều, song nếu tơ nấm phát triển được, ra lộ đôi chút thì cần nhanh chóng tách ngay lấy miền tơ nấm lộ ra cấy chuyển sang môi trường mới

Các chủng có tốc độ tăng trưởng không giống nhau, tạo thành các khuẩn lạc non màu trắng, xốp bông hình tròn Khi hệ sợi nấm phát triển, các vùng già (> 12 ngày trên môi trường thạch) thường tiết ra dịch vàng nâu, nâu xỉn Hệ sinh trưởng mạnh trong 7 – 12 ngày đầu, cụ thể là chủng Lim Hà Bắc mọc khá chậm (80 – 90 µm/h), song hệ sợi dày đặc, chứng tỏ chúng phân nhánh mạnh; chủng DaLat mọc nhanh (150 – 180 µm/h), chủng của Trung Quốc (TQ) đạt mức trung bình (110 – 160 µm/h) Chuyển tiếp cấy giống thuần khiết đang tăng trưởng mạnh sang môi trường hạt Hệ sợi

sẽ phát triển dày đặc trong 19 – 25 ngày tùy cỡ chai cơ chất hạt (500 – 1000 ml) Sau

25 ngày giống có thể dùng để sản xuất, hoặc cất trữ trong tủ lạnh (7 – 10oC), được 2 –

3 tháng [3]

Hình 2.2 Quy trình tạo giống nấm linh chi [3]

- Quá trình nuôi trồng được xây dựng dựa trên tài liệu hướng dẫn nuôi trồng của Đinh Xuân Linh [2], trong đó các nguyên phụ liệu nuôi trồng được thay đổi để phù hợp với điều kiện nuôi trồng thực tế

- Cấy chuyền hệ sợi nấm từ môi trường thạch sang môi trường nhân giống dạng hạt để tạo giống sản xuất (thành phần môi trường nhân giống thể hiện ở Phụ lục 13) Ủ

tơ ở nhiệt độ 26 - 30°C, trong điều kiện tối, khoảng 18 - 25 ngày cho đến khi tơ nấm phát triển đầy chai Bảo quản giống ở nhiệt độ 26 - 28°C không quá 1 tháng kể từ lúc đầy tơ cho đến khi được sử đụng

- Tạo bịch phôi nuôi trồng với môi trường mạt cưa cây Cao su (thành phần môi trường mạt cưa cây Cao su thể hiện ở Phụ lục 14) Các bịch phôi được hấp khử trùng ở

1000C từ 8 – 10 giờ

- Cấy giống nấm vào các bịch phôi và ủ trong điều kiện tối, ở 28 – 300C

- Ghi nhận thời gian tơ nấm dòng hóa hoàn toàn cơ chất của mỗi bịch phôi (thời gian tơ nấm bao phủ hoàn toàn bịch phôi)

- Chuyển các bịch phôi đã đầy tơ vào nhà tưới để kích thích hình thành quả thể Bịch phôi được chăm sóc với các điều kiện: Ánh sáng 500 - 1000 lux, nhiệt độ 26 –

300C, tưới phun sương tự động, giữ độ ẩm từ 60 - 70%

- Khi nụ nấm đã hình thành thì tăng độ ẩm nhà tưới lên khoảng 70 - 80% Tùy theo từng giống mà thời gian trưởng thành của tai nấm có thể từ 39 - 70 ngày

- Khi trưởng thành, thì tiến hành thu hoạch Ghi nhận số lượng nấm thu hoạch của mỗi bịch phôi

2.3.3.2 Cách đánh giá các thông số

* Tốc độ dòng hóa cơ chất [35]

* Hiệu suất chuyển hóa sinh học (BE - Biological Efficiency)

Cách tính BE được phát triển từ ngành công nghiệp nuôi trồng nấm Agaricus bisporus của Châu Âu, trong đó nhấn mạnh: 1 pound nấm tươi thu hoạch từ 1 pound

cơ chất khô thì tương đương với 100% BE [27] Từ nguyên tắc đó, cách tính BE có thể được mô tả theo công thức [30]:

Trong đó, trọng lượng cơ chất khô của 1 bịch được xác định như sau: Sấy 1 bịch phôi đã hấp khử trùng ở 600C/10 - 12 giờ, đến khi trọng lượng không đổi Cân xác định trọng lượng cơ chất khô của 1 bịch phôi 1,2 kg Mỗi đợt khảo sát, lấy 3 mẫu trên 3 bịch phôi khác nhau để phân tích

* Phân tích thống kê

Quan sát, thu thập số liệu và xử lý kết quả bằng phần mềm Microsoft Excel (làm tròn 02 số sau dấu thập phân) Vẽ biểu đồ và đánh giá kết quả

2.3.4 Thu thập, gây nảy mầm bào tử và phân lập các dòng đơn bội

Sau khi có kết quả khảo sát đặc điểm nuôi trồng, đặc điểm cảm quan và kết quả phân tích đa dạng di truyền của các giống nấm, ba giống nấm sẽ được thu nhận bào tử, gây nảy mầm để phân lập nuôi cấy các dòng đơn bội làm nguyên liệu để lai giống sau này

*Thu nhận bào tử: Tiến hành thu nhận bào tử theo phương pháp của Emel

Karadeniz *, Fatma Esen Sarigullu and Isil Untac (2013) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện hiện có [16] Nên thu nhận bào tử trong giai đoạn 2 tuần đầu từ khi quả thể bắt đầu phóng bào tử, và tiến hành gây nảy mầm bào tử ngay sau khi thu nhận càng sớm càng tốt thì tỉ lệ bào tử nảy mầm cao hơn

Chọn một khu vực riêng cách ly, sạch để nuôi trồng thu nhận bào tử Khi quả thể bắt đầu giai đoạn phóng bào tử, chụp bao nilon đã được hấp khử trùng lên quả thể trong khoảng 2h Các bào tử từ tai nấm sẽ được phóng vào trong bao nilon Khéo léo dùng kẹp nhiệt kít miệng bao nilon chứa bào tử mang về phòng thí nghiệm

*Nuôi cấy đơn bào tử: (thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vô trùng)

dùng xilanh y tế vô trùng thể tích 10ml để hút 1 ml H2O2 3% , bơm vào bịch nilon chứa bào tử nấm linh chi ngâm trong thời gian 10 giây Sau đó dùng xilanh hút dịch huyền phù bào tử trong bịch nilon rồi pha loãng từng bậc 10 lần bằng nước cất đã hấp khử trùng trong ống nghiệm theo nồng độ giảm dần, chọn ra nồng độ 10-5 , 10-6, 10-7 để cấy trải trên đĩa petri chứa môi trường thạch nước Mỗi nồng độ cấy trải 100 đĩa petri

Dùng pipet man hút 0,1 ml cho vào các đĩa petri đã được đổ môi trường thạch nước hấp khử trùng sẵn, dùng que trang thấm cồn 700 đốt khử trùng dưới ngọn lửa đèn cồn, để nguội rồi giàn đều dung dịch trong đĩa (đĩa luôn được đặt gần ngọn lửa đèn cồn với khoảng cách thích hợp để hạn chế bị nhiễm thêm khuẩn tạp), dùng giấy báo gói các đĩa lại đem bỏ vào tủ ấm, điều chỉnh nhiệt độ thích hợp từ 26 – 300

C cho sự phát triển của bào tử

Sau 24-72h dùng kính hiển vi (ống kính 4x) soi xuyên qua đĩa thạch để tìm kiếm, nếu phát hiện thấy bào tử nảy mầm thì dùng bút đánh dấu vị trí các bào tử nảy mầm và hình thành các đốm nhỏ trên đĩa thạch, sau đó dùng kim nhọn vô trùng lấy hệ sợi cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường PDA để tiếp tục theo dõi Mỗi dòng được nuôi cấy trên 1 đĩa môi trường, tiếp tục theo dõi

Mục đích phân lập là để thu hệ sợi đơn bội nên cần thiết phải quan sát và can thiệp sớm các bào tử nảy mầm, nếu muộn các hệ sợi đơn bội ăn lan vào nhau sẽ tạo mấu liên kết (clamp conection)

*Các phương thức có thể theo dõi quan sát và xác định khuẩn lạc hay sợi tơ

phát sinh là của bào tử nấm Linh chi hay của nấm mốc như sau:

- Nếu là khuẩn lạc hay sợi tơ của nấm mốc thì sau khi nảy mầm hay phát sinh

48 – 72h sẽ sinh bào tử và làm chuyển đổi màu khuẩn lạc hay sợi tơ từ màu trắng sang màu đen hay xanh…, và phát triển nhanh Nhưng cũng có một số loài nấm mốc như

mốc trắng Mucor thì không có hiện tượng làm thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, bên

cạnh đó chúng ta có thể nhận dạng chúng qua các đặc tính sau: Sợi tơ trắng xóa, không dài, hình móc câu, thường ùng lên khỏi mặt thạch và rối như bông…

- Dựa vào sợi tơ cấy từ mô thịt để so sánh với sợi tơ vừa nảy mầm, quan sát và theo dõi để đưa ra kết luận chính xác về sợi tơ phát sinh từ bào tử Linh chi

- Lấy sợi tơ soi dưới kính hiển vi để quan sát hình thái, rồi đưa ra kết luận

- Kiểm tra sợi đơn bội bằng cách soi kính hiển vi để tìm mấu liên kết Nếu hệ sợi

là đơn bội thì không có mấu liên kết (clamp conection)

2.3.5 Nghiên cứu lai tạo giống nấm linh chi DT với các giống nấm linh chi bản địa

Thí nghiệm tiến hành dựa theo phương pháp của Xiao-Ping Wu và cộng sự (2016) bằng cách lai các dòng đơn bội của các chủng nấm linh chi [29]

Theo đó cấy từng cặp hai dòng đơn nhân, cách nhau 1 cm trên cùng một đĩa petri chứa môi trường PDA (một là của dòng đơn nhân của giống DT và một là của dòng đơn nhân của giống linh chi bản địa), nuôi ở môi trường có nhiệt độ từ 26-300C, không cần ánh sáng Sau một thời gian khoảng 7 ngày hoặc nhiều hơn, đến khi hệ sợi xen lẫn vào nhau Quan sát nơi tiếp xúc của hai dòng đơn nhân, nếu hình thành gờ nổi

rõ thì tách riêng phần gờ nổi vào đĩa petri chứa môi trường PDA khác để tiếp tục nuôi

Kiểm tra phép lai bằng cách quan sát hệ sợi nấm (ở vị trí hình thành gờ nổi) dưới kính hiển vi Nếu hệ sợi có hình thành mấu nối (clamp conenction) thì phép lai đã thành công Vì khi hai dòng đơn nhân lai được với nhau sẽ hình thành sợi nấm song nhân (thứ cấp) và hình thành các mấu liên kết Nếu tổ hợp nào hình thành các mấu liên kết thì chắc chắn là con lai của hai dòng đơn nhân

Đánh giá đặc điểm của các giống lai thu được như tốc độ lan sợi Nhân giống sản xuất để nuôi trồng, khảo sát các đặc điểm về hình thái, năng suất của chủng nấm lai thu được