luận văn thạc sĩ nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm

Lumbrokinase có tác dụng trực tiếp thủy phân fibrin, làm tan cục máu đông, trong khi các chất hoạt hóa khác vẫn đang được sử dụng như tPA tisue plasminogen activator để có tác dụng phải

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thị Thu Hương

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYME LUMBROKINASE TỪ GIUN QUẾ LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN SẢN PHẨM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2020

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thị Thu Hương

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH ENZYME LUMBROKINASE TỪ GIUN QUẾ LÀM NGUYÊN LIỆU TẠO THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

VÀ XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ NHIỄM VI SINH VẬT

TRONG QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN SẢN PHẨM

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 8420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 TS Đỗ Thị Tuyên

2 TS Nguyễn Thị Trung

Hà Nội - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp với đề tài “Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm” là công trình

nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khoa học khác Nếu như không đúng như nêu trên tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về luận văn của mình

Người cam đoan

Nguyễn Thị Thu Hương

LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập và nghiên cứu, để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên - Trưởng phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học, người thầy đã lên ý tưởng, định hướng nghiên cứu và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Thị Trung – Trưởng phòng đào tạo, Học viện Khoa học và Công nghệ không những đã chỉ dạy cho tôi rất nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện và luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi hoàn thiện luận văn

Luận văn được thực hiện bằng kinh phí của dự án phát triển sản phẩm

thương mại cấp viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam “Phát triển sản phẩm lumbrokinase chất lượng cao làm nguyên liệu thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị chống tắc nghẽn mạch máu” do TS Đỗ Thị Tuyên làm chủ nhiệm

Xin gửi lời cảm ơn tới các quý thầy cô của Học viện Khoa học và Công nghệ

đã chỉ dạy và truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức trong quá trình học tập tại Học viện Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới tất cả các anh chị em cán bộ, học viên, sinh viên phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học đã luôn giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các đồng nghiệp yêu quý của tôi tại Khoa Vi sinh – Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung Ương đã luôn hỗ trợ, tạo điều kiện cho tôi trong công việc để tôi yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và người thân luôn ở bên động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Do kiến thức và thời gian còn hạn chế nên luận văn còn nhiều khiếm khuyết, rất mong được sự đóng góp chỉ bảo thêm của các thầy cô, đồng nghiệp và bạn bè để luận văn của tôi được hoàn thiện hơn

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hương

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2 1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 2 2 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2 3 Công thức các môi trường nuôi cấy vi sinh vật 25

Bảng 2 4 Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh 27

Bảng 2 5 Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 2 6 Thành phần gel polyacrylamide 12,5% 35

Bảng 2.7 Lượng vi khuẩn gram âm dung nạp mật có trong chế phẩm 36

Bảng 2 8 Hướng dẫn đọc kết quả kit API 20 E 40

Bảng 3 1 Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu được bằng kết tủa phân đoạn 43

Bảng 3 2 Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme tủa amonium sulphate 45

Bảng 3 3 Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn enzyme sau khi qua cột sephadex G100 48

Bảng 3 4 Tóm tắt quá trình tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế 51

Bảng 3 5 Hoạt tính thủy phân casein của các mẫu trước và sau khi tinh sạch 51

Bảng 3 6 Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm enzyme lumbrokinase 52

Bảng 3 7 Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) của sản phẩm sau 54

Bảng 3 8 Tổng số vi nấm (CFU/g) của sản phẩm sau thời gian bảo quản 55

Bảng 3 9 Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm LK theo dược điển Việt Nam 5 dành cho thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Cơ chế hoạt hoá plasminogen 9

Hình 1 2 Vai trò của antiplasmin trong cơ chế điều hòa cục máu đông 9

Hình 1 3 Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất 13

Hình 1 4 Cơ chế hoạt động của lumbrokinase 14

Hình 2 1 Đường chuẩn plasmin 32

Hình 2 2 Đường chuẩn BSA 33

Hình 2 3 Đường chuẩn tyrosine 34

Hình 3 1 (A) Hình ảnh giun quế Perionyx escavatus sử dụng trong nghiên cứu; (B) Hoạt tính thủy phân đĩa fibrin của mẫu dịch nghiền 42

Hình 3 2 (A) Hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu được bằng kết tủa phân đoạn; (B) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch bằng kết tủa phân đoạn 44

Hình 3 3 (A) Điện di đồ mẫu enzyme tủa amonium sulphate ; (B) Hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme tủa amonium sulphate pha loãng 10 lần 46

Hình 3 4 Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex G100 47

Hình 3 5 Hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex G100 47

Hình 3 6 Điện di đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex G100 49

Hình 3 7 (A) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch qua cột cut – off ; (B): Hình ảnh đánh giá bằng phần mềm dolphin 1D 50

Hình 3 8 Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm lumbrokinase mẻ 1 ở thời điểm ban đầu 53

Hình 3 9 Tổng số vi sinh vật hiếu khí trên môi trường thạch casein đậu tương ở nồng độ 10-3 của sản phẩm mẻ 2 sau bảo quản 3 tháng ở nhiệt độ phòng 54

Hình 3 10 Tổng số vi nấm trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở nồng độ 10-1 của sản phẩm mẻ 1 sau bảo quản 1 tháng ở 40C 55

Hình 3 11 Hình ảnh mẫu thử trong môi trường tăng sinh Enterobacteria –Mossel 56 Hình 3 12 Mẫu thử trên môi trường muối mật violet-red 57

Hình 3 13 Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường Mac-Conkey agar 58

Hình 3 14 Hình ảnh tế bào vi sinh vật trên môi trường Mac-conkey ở 58

Hình 3 15 Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch Levine - eosin - xanh methylen 59

Hình 3 16 Hình ảnh vi sinh vật trên kit API 20E 59

Hình 3 17 Kết quả kit API 20 E trên phần mềm API WEB 60

Hình 3 18 Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch muối Manitol 61

Hình 3 19 Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch muối xylose – lysin – desoxycholat 62

Hình 3 20 Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch xanh brilliant 62

Hình 3 21 Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường 63

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ

APS Ammonium persulfate

BSA Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

CFU Colony forming unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc)

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

OD Optical density (Mật độ quang học)

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TCA Trichloroacetic acid

t-PA Tisue plasminogen activator

TEMED N, N, N', N'-Tetramethylethylenediamine

u-PA Urokinase plasminogen activator

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

MỤC LỤC 1

MỞ ĐẦU 3

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 CÁC BỆNH TẮC MẠCH MÁU NÃO 5

1.1.1 Sơ lược tình hình chung về bệnh tắc nghẽn mạch máu 5

1.1.2 Khái niệm và nguyên nhân bệnh tắc nghẽn mạch máu 5

1.1.3 Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối 7

1.1.4 Một số thuốc điều trị huyết khối 10

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE 12

1.2.1 Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase 12

1.2.2 Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới 14

1.2.3 Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam 17

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI 18

CHƯƠNG 2 23

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Các dung dịch và đệm 23

2.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 25

2.1.5 Chủng vi sinh vật 27

2.1.6 Máy móc và thiết bị 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô 28

2.2.2 Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase 29

2.2.3 Xác định hoạt tính thủy phân fibrin 31

2.2.4 Xác định hàm lượng protein 32

2.2.5 Xác định hoạt tính thủy phân casein 33

2.2.6 Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide 34

2.2.7 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 35

2.2.8 Định danh vi khuẩn bằng Kit API 20 E 39

2.2.9 Xử lý số liệu 41

CHƯƠNG 3 42

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU TỪ GIUN QUẾ PERIONYX ESCAVATUS 42

3.2 NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH LUMBROKINASE 43 3.2.1 Tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ 43

3.2.2 Tủa phân đoạn bằng kết tủa muối amonium sulphate 44

3.2.3 Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel 46

3.2.5 Thử hoạt tính thủy phân casein 51

3.3 KIỂM TRA SỰ NHIỄM KHUẨN TRONG SẢN PHẨM ENZYME LUMBROKINASE KHI BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN KHÁC NHAU 53

3.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm 53

3.3.2 Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật 56

3.3.3 Tìm vi khuẩn gây bệnh 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

KÊT LUẬN 65

KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 1

PHỤ LỤC 2

PHỤ LỤC 3

PHỤ LỤC 4

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

MỞ ĐẦU Rối loạn tim mạch và mạch máu dẫn đến khoảng 26 triệu ca tử vong mỗi năm trên toàn thế giới Các rối loạn tim mạch và não không chỉ có tỷ lệ tử vong cao trên toàn cầu mà còn dẫn đến các biến chứng sau đó như tan huyết khối có thể ảnh hưởng xấu hoặc đe dọa tính mạng như nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch não và huyết khối tĩnh mạch [1] Trên 80% các ca tử vong xảy

ra tại các nước có thu nhập thấp và trung bình Tại các nước đang phát triển bệnh tim mạch ngày càng gia tăng cùng với sự phát triển của xã hội [2] Tại Việt Nam, theo thống kê của hội tim mạch, có khoảng 16% dân số mắc các bệnh tim mạch và đột quỵ Có nhiều nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch như: cao huyết áp, tràn mạch máu não, xơ cứng động mạch Trong số các bệnh nhân bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhưng

bị các di chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% bệnh nhân sống và làm việc bình thường Nguyên nhân chủ yếu là do cục máu đông gây tắc động mạch và cản trở lưu thông máu, do đó việc làm tan cục máu đông đóng vai trò rất quan trọng trong việc điều trị các bệnh này Việc nghiên cứu, bào chế các thuốc để phục vụ điều trị các bệnh tim mạch là nhiệm vụ cấp thiết và vô cùng quan trọng Các thuốc tan huyết khối hiện nay chủ yếu là nhập ngoại, một số dạng

là thuốc tiêm, gây khó khăn cho người sử dụng, giá thành cao và có nhiều tác dụng phụ không mong muốn, nên việc nghiên cứu, bào chế tạo ra một sản phẩm sử dụng đường uống, an toàn, hiệu quả, giá thành rẻ là nhu cầu cấp thiết

Mihara và cs (1991) đã nghiên cứu và thu nhận thành công một enzyme

có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm 6

izozyme được đặt tên chung là lumbrokinase Lumbrokinase có khả năng thủy phân rất mạnh các sợi fibrin - một loại protein có trong máu để làm tan cục máu đông Lumbrokinase được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng làm thuốc uống vì có thể hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin nội sinh [3], [4], [5] Một ưu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều trị bệnh tắc nghẽn mạch thông dụng khác là không có tác dụng phụ, không gây chảy máu hệ thống

Lumbrokinase có tác dụng trực tiếp thủy phân fibrin, làm tan cục máu đông, trong khi các chất hoạt hóa khác vẫn đang được sử dụng như tPA (tisue plasminogen activator) để có tác dụng phải hoạt hóa plasminogen thành plasmin, sau đó plasmin mới có khả năng thủy phân fibrin, ngoài ra lumbrokinase cũng có tác dụng hoạt hóa như tPA Nhờ có tác dụng kép như vậy nên lumbrokinase cho hiệu quả cao

Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu

tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm” với mục tiêu tạo ra được sản phẩm lumbrokinase

chất lượng cao và đánh giá độ an toàn của sản phẩm Với đề tài trên, chúng tôi tập trung giải quyết các vấn đề sau:

(1) Nghiên cứu phương pháp tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng

(2) Tạo nguyên liệu và xác định chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm lumbrokinase trong quá trình tạo sản phẩm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 H ỘI CHỨNG TẮC MẠCH MÁU NÃO

1.1.1 Sơ lược về hội chứng tắc nghẽn mạch máu

Hội chứng tắc nghẽn mạch máu (huyết khối) gây ra rối loạn tim mạch

và tai biến mạch máu não là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Liên đoàn tim mạch thế giới đưa ra thống kê cứ ba người thì

có một người tử vong trong đó có một người tử vong vì bệnh tim mạch Ở Mỹ

cứ 29 giây có một người bị bệnh mạch vành, và cứ 1 phút thì có một người tử vong Tử vong do bệnh tim mạch chiếm 42% toàn bộ các ca tử vong, phí tổn

do bệnh này chiếm 128 tỉ USD mỗi năm Theo thống kê của Hội Đột quỵ Mỹ,

cứ mỗi 45 giây trôi qua, trên thế giới có ít nhất một người bị đột quỵ Và cứ 3 phút trôi qua, thế giới lại có một người tử vong do đột quỵ Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 200.000 người bị đột quỵ, khoảng 50% trong số đó tử vong Nếu như trước đây, đột quỵ thường gặp ở những người tuổi từ 50 trở lên thì hiện nay, bệnh ngày càng trẻ hóa Theo thống kê tại các bệnh viện, tỷ

lệ đột quỵ ở người trẻ tuổi đang có xu hướng tăng lên, trung bình khoảng 2% mỗi năm

Hiện nay trên thế giới số người chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ các bệnh tim mạch và tai biết mạch máu não ngày càng gia tăng, nhất là các nước đang phát triển Ngoài ra còn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch máu não như: tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi Nguyên nhân chủ yếu của các bệnh trên là do các cục máu đông làm tắc nghẽn mạch máu Do đó để hạn chế thấp nhất tỉ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim mạch gây ra, các nhà khoa học đã đi theo hướng xử lý các huyết khối hình thành trong thành mạch Và việc làm tan cục máu đông đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch

1.1.2 Khái niệm và nguyên nhân của hội chứng tắc nghẽn mạch máu

Hội chứng tắc nghẽn mạch máu là một chứng bệnh cục máu đông được

tạo thành do fibrin bị đóng cục lưu giữ trong mạch gây tắc mạch và cản trở lưu thông máu Hội chứng huyết khối tác động lên cả hệ thống tĩnh mạch (thuyên tắc - huyết khối tĩnh mạch) và hệ thống động mạch (huyết khối động mạch do xơ vữa) [6]

Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch

Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch, là sự tắc nghẽn tĩnh mạch do máu cục máu đông, là bệnh tim mạch phổ biến thứ ba ở những nước phương Tây Hàng năm có 0,1% dân số thế giới mắc bệnh này Biểu hiện phổ biến nhất của thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch là huyết khối tĩnh mạch sâu, hiện tượng này xảy ra khi có một cục máu đông hình thành trong lòng các tĩnh mạch sâu của chi dưới Đây là một bệnh lý phổ biến ở những bệnh nhân lớn tuổi nằm liệt giường, những bệnh nhân sau phẫu thuật không thể cử động trong một thời gian dài cũng như những bệnh nhân vừa trải qua một cuộc đại phẫu, hay phẫu thuật chỉnh hình Bệnh này cũng có thể xảy ra ở những bệnh nhân có bệnh di truyền dẫn đến đông máu bất thường, xảy ra ở người già, những phụ nữ trẻ cũng không miễn nhiễm, đặc biệt trong thời kì sinh đẻ [7] Hậu quả nghiêm trọng nhất của huyết khối tĩnh mạch sâu là thuyên tắc động mạch phổi Tắc mạch phổi xảy ra khi cục máu đông hay một mảnh của nó bong ra và di chuyển đến phổi và gây ra tình trạng tắc nghẽn mạch máu phổi Thuyên tắc phổi là bệnh lý rất nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong rất cao

Huyết khối động mạch do xơ vữa

Huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra khi cục máu đông hình thành trên nền của một mảng xơ vữa ở thành động mạch Khi mảng xơ vữa bị vỡ ra, tại những chỗ đó máu sẽ bị hoạt hóa và đông cục gây tắc động mạch [6] Đây

là một bệnh rất nguy hiểm vì nếu cục máu đông này phát triển và làm tắc nghẽn hoàn toàn, động mạch bị tổn thương, thì máu qua động mạch này sẽ ngừng chảy và mô bên dưới do động mạch này cung cấp máu sẽ rơi vào nguy

cơ bị thiếu máu, đôi khi dẫn đến hậu quả là đe dọa tính mạng người bệnh Nếu huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra tại những động mạch cung cấp máu cho tim, hiện tượng này tạo ra hội chứng động mạch vành cấp hoặc

những cơn đau tim Tương tự, nếu bệnh lý này xảy ra tại những động mạch cung cấp máu cho não thì những cơn đột quỵ do thiếu máu cục bộ sẽ xảy ra Bệnh động mạch ngoại biên xảy ra khi huyết khối động mạch do xơ vữa tác động lên các động mạch chi dưới Bệnh huyết khối động mạch do xơ vữa đang gia tăng chủ yếu do lối sống hiện đại của chúng ta.

1.1.3 Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối

Sinh lý học hoàn chỉnh của sự hình thành cục máu đông fibrin là một quá trình tương đối dễ hiểu Một cục máu đông hoặc huyết khối bao gồm các

tế bào máu được chứa trong một ma trận của protein fibrin Huyết khối hoặc tiêu sợi huyết là quá trình điều hòa enzyme để hòa tan cục máu đông Trong tuần hoàn động vật có vú, enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình tiêu sợi huyết là plasmin, một protease serine giống như trypsin [8]

Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu Khi thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che phủ bởi cục máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết Quá trình đông máu diễn ra gồm một chuỗi các phản ứng theo kiểu bậc thang bao gồm ba giai đoạn: (1) giai đoạn hình thành phức hợp prothrombinase qua hai con đường nội sinh và ngoại sinh, (2) giai đoạn hình thành thrombin từ prothrombin và (3) giai đoạn tạo thành mạng lưới fibrin từ fibrinogen tạo thành cục máu đông [9]

Hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần là tế bào (tiểu cầu) và protein (các yếu tố đông máu) Khi rối loạn một trong hai yếu tố trên đều ảnh hưởng đến quá trình đông máu Phản ứng đông máu ngay lập tức được kích hoạt khi tổn thương xảy ra làm tổn hại đến nội mạc mạch máu Bước đầu của quá trình đông máu, tiểu cầu tạo nút chặn để cầm máu vết thương sau đó các yếu tố đông máu có trong huyết tương sẽ đáp ứng một loạt các phản ứng tạo

ra sợi huyết, củng cố nút chặn tiểu cầu Sợi huyết được tạo thành đó là do quá trình tạo fibrin từ fibrinogen hòa tan trong huyết tương Tiểu cầu cùng với sợi huyết tạo thành cục máu đông gắn vào thành mạch máu để ngăn ngừa sự mất máu và giúp liền vết thương

Ngược với quá trình đông máu là quá trình tan huyết khối, giúp tái lưu thông tuần hoàn máu Có hai cơ chế tan huyết khối là: cơ chế thủy phân fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin và cơ chế thủy phân trực tiếp fibrin

Với sự có mặt của chất hoạt hóa, plasmin có hoạt tính thủy phân fibrin được sản xuất từ plasminogen không hoạt động có trong hệ thống tuần hoàn Sự chuyển đổi sinh hóa của plasminogen không hoạt động thành plasmin liên quan đến sự phân cắt protein do các chất kích hoạt plasminogen khác nhau [10]

Cơ chế thủy phân fibrin thông qua hoạt hóa plasminogen chỉ xảy ra khi tuyệt đối cần thiết và theo một quy trình rất kĩ càng, lúc đầu chỉ ở khu trú ở khu vực có cục máu đông (tức là nơi có fibrin) Bình thường khi máu đang lưu thông thì không có sự xuất hiện của plasmin Khi có cục máu đông lập tức xảy ra quá trình kích hoạt plasminogen, như vậy fibrin chính là tác nhân chủ yếu và quan trọng nhất để khởi phát cho sự hoạt hóa plasminogen và từ đó dẫn đến quá trình tiêu fibrin Các chất hoạt hóa (t-PA, urokinase, streptokinase…) đều thực hiện việc hoạt hóa bằng cách cắt phân tử plasminogen qua mối liên kết với arginine (acid amin số 561) và valine (acid amin số 562) Plasminogen bị cắt thành hai chuỗi: chuỗi A là chuỗi nặng, trọng lượng phân tử 6.000 kDa, và chuỗi B là chuỗi nhẹ, trọng lượng phân tử

là 2.600 kDa, hai chuỗi được kết nối với nhau bằng một cầu disulfua Về mặt cấu trúc plasmin chỉ khác plasminogen ở chỗ có hai chuỗi, trình tự acid amin vẫn giống nhau, và có cầu disulfua nối hai chuỗi nên trọng lượng phân tử và tính kháng nguyên vẫn như nhau Plasmin sau khi được tạo ra xúc tác cho quá trình cắt fibrin thành các sản phẩm tan được gọi là sản phẩm thoái giáng của fibrin (FDPs), các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với thrombin làm chậm quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin nên làm chậm tạo thành cục máu đông (Hình 1.1)

Hình 1 1 Cơ chế hoạt hoá plasminogen Trong các chất hoạt hóa plasminogen thì t-PA có vai trò quan trọng, nó thường phát huy tác dụng sớm nhất và mạnh nhất, hiệu lực hoạt hóa tăng lên rất nhiều khi có mặt của fibrin Trong máu người bình thường plasmin tồn tại song song với yếu tố ức chế là antiplasmin, nó có nồng độ cao gấp 30 lần so với plasmin, có tác dụng ngăn chặn việc tác động của plasmin tới việc phân hủy các protein trong huyết tương [11] Hai yếu tố hoạt hóa plasminogen tự nhiên trong máu là urokinase (u-PA) và yếu tố hoạt hóa mô (t-PA), hoạt động tiêu sợi huyết được kiểm soát bởi các chất ức chế plasmin (a1- antiplasmin, a2- macroglobulin), các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (PAL-I: plasminogen activator inhibitor -1, một chất ức chế nhanh tác dụng của t-PA

và u-PA) [12] Nhờ cơ chế trên mà cơ thể giữ được sự cân bằng, ổn định, không có sự đông máu hoặc chảy máu bất thường (Hình 1 2)

Hình 1 2 Vai trò của antiplasmin trong cơ chế điều hòa cục máu đông

Cơ chế tan huyết khối thông qua sự thủy phân trực tiếp fibrin an toàn hơn cơ chế thủy phân bằng quá trình hoạt hóa plasminogen vì plasmin liên quan đến hệ thống cầm máu của cơ thể, nếu lượng plasmin được tạo ra mất cân bằng với lượng antiplasmin thì sẽ rất nguy hiểm với các vết thương chảy máu, có thể gây ra chảy máu ồ ạt và nguy hiểm đến tính mạng Ngoài các yếu

tố lumbrokinase, t-PA, u-PA không có yếu tố nào có thể thủy phân trực tiếp fibrin mà đều phải thông qua quá trình hoạt hóa plasminogen [1]

1.1.4 Một số thuốc điều trị huyết khối

Hiện nay nhu cầu về các thuốc điều trị huyết khối ngày càng tăng cao

do bệnh nhân mắc các bệnh liên quan đến tim mạch, huyết khối trên thế giới ngày càng gia tăng theo tốc độ phát triển của xã hội và lối sống hiện đại

Việc điều trị các bệnh huyết khối chủ yếu tập trung vào việc kìm hãm

sự tạo thành fibrin hoặc sử dụng các nhân tố tác động vào sự chuyển hóa plasminogen thành plasmin

1.1.4.1 Các thuốc có bản chất hóa học

Các thuốc điều trị huyết khối có bản chất hóa học thường được sử dụng

là coumarin và heparin, các thuốc này có tác dụng kìm hãm sự tạo thành cục fibrin [2] Heparin có tác dụng tức thời nên nhanh chóng ngăn cản sự phát triển của huyết khối, nó có thể tác dụng kéo dài trong vòng 3-4 giờ trước khi

bị phá hủy bởi heparinase trong máu Khi tiêm heparin với liều 0,5-1 mg/kg trọng lượng cơ thể có thể kéo dài thời gian đông máu tới trên 30 phút Coumarin khi được tiêm vào cơ thể sẽ cạnh tranh với vitamin K ở những vị trí hoạt động trong các phản ứng enzyme dẫn đến tạo thành bốn yếu tố II, VII,

IX, X Sau khi tiêm 12 giờ hoạt tính đông máu giảm xuống còn 50%, sau 24 giờ còn khoảng 20%, sau khoảng 3 ngày chấm dứt điều trị với coumarin thời gian đông máu sẽ trở lại trạng thái bình thường [9]

Vào đầu những năm 1950, aspirin được sử dụng trong việc ngăn ngừa nhồi máu cơ tim [13], tuy nhiên vai trò của nó trong việc điều trị cấp tính không được chứng minh Các thuốc heparin, atropine, papaverine và nitroglycerin cũng thường xuyên được sử dụng để ngăn ngừa hoặc làm giảm

co thắt mạch vành Như vậy, cho đến những năm 1950, các phương pháp điều trị chỉ là giảm nhẹ chứ không phải điều trị [14], [15]

1.1.4.2 Các thuốc có bản chất enzyme

Hiện nay, các enzyme tiêu sợi huyết được sản xuất bởi các vi sinh vật, rắn, giun đất, côn trùng, thực vật và các sinh vật khác đang được sử dụng thành công trong việc điều trị cục máu đông, đặc biệt là phân hủy trực tiếp fibrin với chi phí thấp hơn và ít tác dụng phụ [16]

Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất để điều trị nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch 1 enzyme có khả năng chuyển hóa plasminogen thành plasmin Các enzyme đang được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị là streptokinase (từ vi khuẩn α- haemolytic Streptococcus), urokinase (từ nước tiểu của người) và tPA (chất hoạt hóa plasminogen của mô) tái tổ hợp [16]

Streptokinase: là một protein có khối lượng phân tử 47 kDa, do liên cầu khuẩn tan huyết I nhóm A sinh ra Nó tác động theo một cơ chế phức tạp với cả plasminogen liên kết và không liên kết với fibrin trong tuần hoàn để tạo thành một phức hợp hoạt hóa Phức hợp này biến đổi plasminogen còn dư thành plasmin bằng cách thủy phân liên kết L-arginine-L-valine, có tác dụng tiêu fibrin và có thể làm tan các cục máu đồng trong lòng mạch Streptokinase được sử dụng để điều trị thuyên tắc mạch phổi và tĩnh mạch sâu Bên cạnh những ưu điểm trên thì streptokinase cũng có những tác dụng phụ khi sử dụng lâu dài như đau cơ, buồn nôn, sốt, hạ huyết áp, loạn nhịp tim [17], [18]

Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên được chiết xuất từ môi

trường lên men của vi khuẩn Bacillus natto Nattokinase làm tan fibrin gấp 4

lần plasmin nội sinh trong cơ thể Nattokinase giúp duy trì và tăng cường khả năng phân hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng ngừa các bệnh liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim, thiếu máu lên não, đột quỵ [19], [20]

t-PA: là yếu tố hoạt hóa mô, có thể sản xuất bằng con đường tái tổ hợp nhưng giá thành cao Đầu tiên t-PA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy phân fibrin

[21], [22] Tác dụng phụ của t-PA là gây chảy máu như ở nơi tiêm, đường tiêu hóa, trong não, hạ huyết áp [6]

Urokinase: được tổng hợp bởi tế bào biểu mô hình ống trong thận người và thu được trong nước tiểu, do đó việc sản xuất và khai thác lâm sàng

bị hạn chế (2300 lít nước tiểu mới thu được 29 mg urokinase tinh khiết) [23] Enzyme này cũng hoạt động như một chất hoạt hóa plasminogen, thủy phân liên kết ester ở L-valine và L-arginine [18] Nó thường được dùng để tiêu hủy huyết khối tại chỗ, điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch sâu Tác dụng phụ của urokinase là giảm huyết áp, loạn nhịp, sưng quanh hố mát, chảy máu ở nơi chấn thương xuyên da [24]

Mặc dù việc sử dụng các enzyme này trong điều trị đã thu được những kết quả tích cực, tuy nhiên vẫn tồn tại một số vấn đề phát sinh trong quá trình điều trị như giá thành cao (t-PA tái tổ hợp, urokinase), khó xác định liều phù hợp (streptokinase), sốt, tăng chảy máu, tạo kháng nguyên, không hiệu quả khi uống qua đường miệng [25]

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE

1.2.1 Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase Lumbrokinase là tên gọi chung chỉ một nhóm gồm 6 isozyme có tác dụng thủy phân fibrin, làm tan cục máu đông Khối lượng phân tử trung bình của lumbrokinase từ 25 đến 32 kDa [1] Lumbrokinase là những chuỗi polypeptide đơn giàu asparagine hoặc aspartic acid, rất ít proline và lysin, không chứa thành phần đường Chúng được xếp vào serine protease kiềm giống trypsin Tuy nhiên chúng giàu asparagine và aspartic acid hơn so với các serine protease khác đã biết

Lumbrokinase (LK) được tìm thấy trong ruột, dịch mô và dịch ruột của rất nhiều loài giun đất Chúng có tác dụng tiêu sợi huyết mạnh, người ta giải thích sự có mặt của nó trong các loại giun là do chúng cần để tiêu hóa thức ăn

là những mảnh vụn thực vật và các chất hữu cơ trong đất nên chúng sản xuất enzyme LK như một serine protease [1]

Ưu điểm lớn nhất của enzyme thủy phân fibrin từ giun đất là có thể hấp thụ qua đường ruột vào máu Khi vào trong máu, enzyme này vừa có tác dụng hoạt hóa hệ thống thủy phân fibrin, vừa có hoạt tính plasmin hòa tan trực tiếp fibrin Đây chính là những cơ sở của các nghiên cứu ứng dụng enzyme thủy phân fibrin từ giun đất làm thuốc uống chữa bệnh tim mạch [18], [19], [3]

Từ việc phân tích protein của các loài giun đất cho thấy, cấu trúc bậc 3

của các isoenzyme lumbrokinase từ loài L rubellus có rất nhiều điểm giống nhau so với các protein từ loài E fetida ở các xoắn α, nếp gấp β và các đoạn

cuộn xoắn [1] Một phần trình tự acid amin của LK giống với trình tự amino acid cùng vị trí của các serine protease tương tự trypsin bao gồm: elastase, yếu tố đông máu IX, trypsin, kallikrien và chymo trypsin [18] (Hình 1.3)

Hình 1 3 Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất

Giống như các yếu tố hoạt hóa mô t-PA khác, LK cũng có cơ chế hoạt động là kích hoạt sự chuyển hóa plasminogen tạo thành plasmin và phân hủy trực tiếp fibrin mà không phân hủy các protein huyết tương khác bao gồm plasminogen và albumin (Hình 1.4) Các enzyme LK có hoạt động tiêu sợi huyết rất mạnh mẽ, ổn định trong pH rộng và sự ổn định cao chống lại sự thay đổi nhiệt độ Chúng là serine protease kiềm giống trypsin nhưng được đánh giá có sự ổn định và khả năng chịu đựng dung môi cao hơn Vilhardt (1986) bằng phản ứng miễn dịch đã chứng minh 10-15% LK được hấp thụ hoàn toàn qua các mô và đường ruột Do vậy LK được đánh giá cao hơn các chất khác trong hoạt động phân hủy các cục máu đông [3], [4]

Hình 1 4 Cơ chế hoạt động của lumbrokinase

Khả năng hấp thu lumbrokinase qua thành ruột non trên thỏ cũng đã được chứng minh Lumbrokinase tinh khiết pha trong dung dịch đệm Krebs-Henseleit ở các nồng độ khác nhau lần lượt là 0,5; 1,0; và 2,0 mg/ml đã được đưa vào bên trong niêm mạc ruột của thỏ trong các khoảng thời gian khác nhau (30, 60, 120 phút) Xác định khả năng tiêu sợi huyết bằng cách lấy dịch bên ngoài niêm mạc ruột thỏ sau các khoảng thời gian và nhỏ lên đĩa fibrin theo dõi vòng hoạt tính Kết quả cho thấy, sau hai giờ theo dõi, vòng hoạt tính trên đĩa fibrin đạt 21,798 ± 11,0; 22,118 ± 0,4; 11,8 ± 31,977 mm2 Khi nhỏ trực tiếp lumbrokinase ở các nồng độ khác nhau lên đĩa fibrin, diện tích vòng hoạt tính lần lượt là 148,3; 253,5; 276,2 mm2 tương ứng với 14,7; 8,7 và 11,5% lumbrokinase được chuyển từ bên trong ra bên ngoài niêm mạc ruột non Điều đó chứng tỏ rằng, lumbrokinase được hấp thu hiệu quả qua thành ruột non vào máu và thích hợp làm nguyên liệu sản xuất thuốc trị tắc nghẽn mạch máu qua đường uống [5]

LK cũng đã được chứng minh mặc dù có khả năng phân hủy protein nhưng không gây ra phân hủy hồng cầu, cũng không gây ra sự tập kết tiểu cầu

tự phát bởi Shim và cộng sự năm 1998 [26]

Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh được nhiều đặc tính có lợi của LK trong việc chống viêm, chống oxy hóa, chống xơ hóa, chống vi khuẩn, chống ung thư [27], [28]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về LK nhưng chủ yếu là tách chiết enzyme này từ những loài giun đất

Loài giun đất Lumbricus rubellus đã được phát hiện tại Nhật, có khả

năng thủy phân mạnh fibrin Năm 1991, Mihara và cs đã tách chiết được

enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, một

thành phần chính để chữa những cơn sốt và nhận ra rằng enzyme này gồm có

6 isozyme, ông đã đặt tên chung cho 6 enzyme này là lumbrokinase Các phân đoạn nhóm tác giả thu được là F-I-0, F-I-1, F-I-2, F-II, F-III-1, F-III-2 bằng quá trình tủa amonisulphate 60% và qua quá trình tinh sạch bằng các cột sephadex G200, DEAE-cellulose, sephadex G75, toyopearl HW-55 cân bằng với 30% amonisulphate, cột sắc ký ái lực sepharose, sephadex G97 Đây là những enzyme bền nhiệt và thích ứng với khoảng pH rộng, pH tối ưu 7-9 [29]

Năm 1998, Shim và cs đã tách chiết và tinh sạch thành công LK từ giun

đất Lumbricus rubellus bằng cách tủa dịch thô bằng muối amonisulphat 30%

và 60%, sau đó tinh sạch qua cột DEAE-cellulose, cột sepharose 6B, thu được enzyme lumbrokinase có khối lượng phân tử 34,2 kDa, không phụ thuộc vào các ion kim loại, bền nhiệt và có phạm vi pH tối ưu rất rộng [26]

Một số nghiên cứu cho rằng các enzyme thủy phân fibrin có thể hòa tan cục máu đông và hạn chế được khả năng vón cục [30], [31] Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu đều vẫn là đi vào tách chiết, tinh sạch, đánh giá tính chất

lý hóa và ứng dụng lâm sàng của enzyme thủy phân fibrin từ giun đất L

rubellus, L bimastus, E fetida hoặc E andrei [5], [32], [33] Một số tác giả

thử nghiệm tác dụng chống tắc nghẽn mạch ở mức độ sâu trên động vật thí nghiệm, nghiên cứu biến đổi hóa học nhằm mục đích làm enzyme bền hơn, nghiên cứu các đặc tính và biến đổi hóa học của enzyme khi đưa vào cơ thể [18]

Từ năm 2002 đến 2003, các nhà khoa học Trung Quốc cũng tách chiết

được enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ loài giun E fetida Họ đã

chứng minh rằng các enzyme này có thể sử dụng làm thuốc uống thay thế một

số thuốc chữa bệnh tim mạch rất đắt trên thị trường hiện nay như urokinase và tPA [34], [35]

Đến năm 2004, Cho và cs đã tinh sạch được 6 phân đoạn lumbrokinase

(F1 đến F6) từ giun đất L rubellus có hoạt tính thủy phân fibrin bằng phương

pháp tủa muối amoni sulfate và sắc ký cột Hoạt tính thủy phân protein trên

cơ chất casein của 6 isoenzyme này đạt được từ 11,3-167,5 U/mg xếp theo thứ tự hoạt tính F2>F1>F5>F6>F3>F4 Hoạt tính thủy phân fibrin của 6 phân đoạn này trên đĩa fibrin đạt được từ 20,8-207,2 U/mg xếp theo thứ tự tương ứng F6>F2>F5>F3>F1>F4 Khối lượng phân tử của các isozyme được xác định bằng điện di SDS-PAGE tương ứng là 24,6 (F1); 26,8 (F2); 28,2 (F3); 25,4 (F4); 33,1 (F5) và 33,0 kDa (F6) Nhiệt độ tối ưu của 6 isozyme là 50C,

và pH tối ưu trong vùng pH 4-12 Bốn isozyme (F1-F4) hoàn toàn bị ức chế bởi PMSF Hai enzyme F5-F6 hoàn toàn bị ức chế bởi aprotinin, N-p-torsyl-L-lysine chloromethyl ketone, N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone, soybean trypsin inhibitor, lima bean trypsin inhibitor và leupeptin [36]

Sun và cs (2006) đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của lumbrokinase chống lại chứng thiếu máu cục bộ cơ tim ở chuột và tiến tới nghiên cứu cơ chế của nó LK đã làm giảm chứng nhồi máu cơ tim phụ thuộc vào các liều khác nhau Tốc độ hạn chế của LK ở các liều 20, 40 và 80 mg/kg thể trọng tương ứng là 7,7%; 34,6% và 46,2% Các nghiên cứu về điện tâm đồ cho rằng, khi dùng LK ở nồng độ 10 và 50 µl ở +10 mV, dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim đã giảm rõ ràng tương ứng từ -14,42±1,5 pA/pF tới -11,33±1,4 pA/pF (giảm tới 21,4%, có ý nghĩa thống kê với p<0,01) và -9,92 ± 1,31 pA/pF (giảm 36,5%, có ý nghĩa thống kê với p<0,01) Cơ chế chống chứng thiếu máu cục bộ làm giảm dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim ở tâm thất chuột nhắt trắng [37]

Năm 2015, Lee và cs đã đánh giá hiệu quả điều trị của LK trong tái tạo thần kinh ngoại biên trên chuột bằng cách sử dụng mô hình tổn thương thần kinh tọa được xác định rõ ở chuột bị tiểu đường do tiêm streptozotocin Nhóm nghiên cứu đã thấy rằng liệu pháp LK có thể cải thiện lưu lượng máu tuần hoàn của chuột và thúc đẩy tái tạo sợi trục trong ống dẫn cao su silicon sau khi chuyển dây thần kinh, điều trị bằng LK cũng có thể cải thiện các chức năng thần kinh cơ với hiệu suất dẫn truyền thần kinh tốt hơn, ngoài ra LK cũng có thể kích thích bài tiết interleukin -1, yếu tố tăng trưởng thần kinh, yếu

tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu và biến đổi yếu tố tăng trưởng β trong bệnh đái tháo đường bị cắt bỏ đoạn thần kinh [38]

Năm 2016, Tang và cs cũng đã tách LK từ giun đất Pheretima

Praepinguis bằng phương pháp tủa muối và nghiên cứu tính chất enzyme

Nhóm tác giả đã thử hoạt tính của LK bằng phương pháp đĩa thạch casein, thu được hoạt tính tương đối cao, hoạt tính của LK trong môi trường trung tính hoặc hơi kiềm cao hơn, có khả năng chịu nhiệt độ cao, hoạt tính enzyme đạt cao ở nhiệt độ dưới 600C và phạm vi thích nghi nhiệt độ rộng [39]

Cũng trong năm 2016, Tingming và cs cũng đã tách chiết lumbrokinase

từ giun đất bằng cách sử dụng cột sợi rỗng cut – off 50 kDa và 6 kDa sau khi nghiền đồng thể giun để thu dịch thô, sau đó tinh chế qua cột sephadex G75, thu được ba phân đoạn protein có độ tinh khiết cao, một trong số ba phân đoạn này đã được thử cho hoạt tính tiêu sợi huyết cao [40]

Năm 2017, Mahendra và cs đã nghiên cứu và thu nhận thành công một

enzyme phân hủy fibrin từ giun đất Ấn Độ Pheretima posthumous có trình tự acid amin tương đồng với lumbrokinase P2 của giun đất Lumbricus rubellus

bằng phương pháp tủa muối amonium sulphate và sắc ký trao đổi ion Trọng lượng phân tử protein thu được là 29,5 kDa bằng maldi-TOF/MS Enzyme thể hiện khả năng phân giải protein tối đa 1,2 U/ml với hoạt tính riêng là 17,65 U/mg ở pH 8,0 và nhiệt độ là 400C Nghiên cứu cho thấy enzyme có hoạt động phân giải protein trong phạm vi pH rộng từ 4 đến 12 và nhiệt độ từ 20 đến 600C [41]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam Việt Nam là quốc gia có khí hậu nóng ẩm, rất phù hợp cho sự sinh sản

và phát triển của rất nhiều loài giun, vì vậy số lượng các loài giun rất đa dạng [42] Nhờ việc ứng dụng sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có nhiều công trình nghiên cứu các sản phẩm chống đông máu đăc biệt là các sản phẩm tách chiết từ các loài giun trong nước

Trên cơ sở khai thác và tìm kiếm nguồn enzyme thủy phân fibrin ở một

loài giun đất Việt Nam (nhánh đề tài KC04-17: “Nghiên cứu các giải pháp

công nghệ sinh học sản xuất các chế phẩm y sinh học đặc thù để bảo vệ sức khỏe nhân dân từ nguồn tài nguyên sinh vật Việt Nam” năm 2002-2004),

Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự (2006) đã thực hiện đề tài cấp cơ sở viện

Công nghệ sinh học: “Tách dòng và tìm điều kiện biểu hiện gen mã hóa cho

enzyme lumbrokinase từ giun quế” Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã

sàng lọc được các loài giun đất có hoạt tính thủy phân fibrin cao và bước đầu

tìm cách nhân dòng trình tự gen mã hóa LK từ loài giun quế Perionyx

excavatus

Lý Thị Bích Thủy và cs (2006) đã tinh sạch enzyme có hoạt tính thủy

phân fibrin từ P excavatus và đánh giá được một số tính chất của nó [43]

Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2008) cũng đã tách chiết và tinh sạch

enzyme thủy phân fibrin từ P excavatus và tách chiết được 8 phân đoạn có

hoạt tính thủy phân fibrin cao [44]

Nguyễn Văn Rư (2015) đã tinh sạch lumbrokinase từ giun quế

Peryonyx excavatus bằng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng ethanol 50%,

80% và sắc ký lọc gel sephadex G75, đã xác định được hoạt độ enzyme của chế phẩm và khảo sát được một số đặc tính sinh học và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme như nhiệt độ, pH, các ion kim loại đặc biệt là khả năng hòa tan cục máu đông và fibrin invitro, ngoài ra nghiên cứu của tác giả cũng

đã tạo được bột đông khô lumbrokinase có hoạt độ protease 30,60 IU/mg dùng để làm nguyên liệu sản xuất enzyme làm thuốc [45]

Hầu hết các nghiên cứu trong nước mới chỉ tập trung vào nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hoá của LK

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI

Hiện nay trên thị trường các thuốc và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh huyết khối đang có xu hướng phát triển rất mạnh để đáp ứng nhu cầu điều trị các căn bệnh nguy hiểm này Song song với việc nghiên cứu phát triển các chế phẩm mới thì việc giám sát chất lượng thuốc để đáp ứng đúng các yêu cầu và bảo vệ sức khỏe cho người bệnh là công tác quan trọng hàng đầu

Các chế phẩm đăng kí dưới dạng thuốc phải đáp ứng các yêu cầu của dược điển Việt Nam hiện hành (dược điển Việt Nam 4, dược điển Việt Nam 5) hoặc các dược điển hiện hành trên thế giới theo quy định của ngành kiểm nghiệm Các chỉ tiêu về vi sinh vật được yêu cầu theo dược điển là xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, xác định tổng số nấm men và mốc, tống số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật, xác định sự có mặt của một số vi khuẩn gây

bệnh như Escherichia coli, Staphhylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Candida albicans trong 1 g chế phẩm, xác định Salmonella trong

10 g chế phẩm

Các chế phẩm đăng kí dưới dạng thực phẩm chức năng phải đáp ứng đầy đủ các yêu cầu của các tiêu chuẩn TCVN và các tiêu chuẩn ISO, các tiêu chuẩn cũng tương tự như trong dược điển Việt Nam 5 với các chỉ tiêu: xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, xác định tổng số nấm men và mốc và định danh một số vi sinh vật gây bệnh không được phép có mặt trong chế phẩm [46]

Tuy nhiên các công bố về các nghiên cứu về chỉ tiêu vi sinh trong các chế phẩm này còn rất hạn chế

Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men thu nattokinase tái tổ

hợp trong Bacillus subtilis và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ

ngăn ngừa sự hình thành huyết khối” do PGS.TS Trần Cát Đông làm chủ nhiệm vừa được Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM nghiệm thu năm 2018

Nhóm nghiên cứu đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu nattokinase, xây dựng quy trình bào chế viên nang thực phẩm chức năng chứa nattokinase đạt tiêu chuẩn cơ sở theo Dược điển Việt Nam IV Công thức viên nang cứng nattokinase 1.000 FU với hệ tá dược gồm calci carbonat, MCC PH101, mannitol, talc, magnesi stearat, aerosil, povidone K30, natri croscarmellose đã được xây dựng Trong đó, tỷ lệ calci carbonat, MCC PH101, mannitol đã được khảo sát và tối ưu hóa với phần mềm Design Expert® v 11.0.0 để giúp ổn định hoạt tính nattokinase và pH của viên nang đạt 8,5 Quy trình bào chế được lưa chọn là phương pháp xát hạt từng phần đảm bảo cho enzym không bị mất hoạt tính bởi ẩm và nhiệt trong quá trình

bào chế Viên nang nattokinase đạt các tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam

IV về độ đồng đều khối lượng, độ rã, độ hòa tan, pH, định tính và định lượng Tuổi thọ của viên nang nghiên cứu trên 24 tháng, khi theo dõi ở các điều kiện khác nhau Đánh giá sinh khả dụng và tác động dược lý của sản phẩm cho thấy, thử nghiệm độc tính cấp trên chuột (LD50 > 100.000 FU/kg thể trọng), không có chuột chết Thử độc tính bán trường diễn, sau khi cho chuột uống nattokinase liều 2.000 FU/kg và 4.000 FU/kg liên tục trong 60 ngày không gây độc tính trên chuột, chuột tăng trọng bình thường, các chỉ số xét nghiệm huyết học và đa số thông số sinh hóa đều nằm trong giới hạn bình thường [47]

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu đã xây dựng mô hình gây huyết khối cảm ứng với carragenan trên chuột nhắt trắng, khảo sát được tác động ngăn ngừa huyết khối đối với viên nang chứa nattokinase cho hiệu quả ngăn ngừa huyết khối tương tự nattokinase thương mại Đồng thời nhóm đã tiến hành đăng ký giải pháp hữu ích với sản phẩm đăng ký là “Quy trình lên men thu nhận vượt

mức nattokinase tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis” [47]

Giai đoạn 2011- 2015, nhóm nghiên cứu của viện Công nghệ sinh học

do cố PGS TS Quyền Đình Thi và ThS Lê Thanh Hoàng đã nghiên cứu sản xuất thành công chế phẩm lumbrokinase tái tổ hợp Trong nghiên cứu này

enzyme lumbrokinase đã được nhân dòng từ giun đất Eisenia fetida và biểu hiện trong Pichia pastoris với hoạt tính đạt >3000 IU/mg protein Chế phẩm

lumbrokinase tái tổ hợp ở liều 200 mg/kg có tác dụng tốt trong điều trị nhồi máu não trên mô hình thực nghiệm, làm giảm mức độ tổn thương vận động (cả vận động cưỡng bức và vận động tự nhiên), làm tăng khả năng phối hợp vận động khi thử trên rotarod, tăng khả năng ghi nhớ và học tập khi thử trên

mê lộ nước Thuốc tác dụng tốt cả trong giai đoạn cấp (3 ngày đầu sau gây nhồi máu) và trong dùng điều trị kéo dài Các tác dụng này của Lumbrokinase tái tổ hợp tương đương với thuốc chuẩn Boluoke (lumbrokinase) của Canada

Năm 2018, nhóm nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Hoàng và cộng sự cũng đã xác định độc tính cấp và bán trường diễn của lumbrokinase tái tổ hợp Kết quả cho thấy lumbrokinase không gây độc trên động vật thực nghiệm Giá

trị LD 50 của lumbrokinase tái tổ hợp trên chuột nhắt trắng qua đường tiêu hoá khi theo dõi 7 ngày là không xác định được, 100% chuột sống sót sau 7 ngày uống lumbrokinase với liều lượng 50 mg/kg thể trọng Sản phẩm lumbrokinase tái tổ hợp không gây ảnh hưởng đến chức năng gan của thỏ thí nghiệm cũng như hình ảnh vi đại thể của tế bào gan chuột sau khi uống chế phẩm 45 ngày [48]

Các nghiên cứu về quy trình kiểm tra giám sát chất lượng các thuốc và thực phẩm chức năng điều trị các bệnh huyết khối cũng đã được công bố

Năm 2010, Nguyễn Thanh Thảo - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã nghiên cứu và xây dựng thành công phương pháp xác định hoạt tính của streptokinase trong chế phẩm chứa đồng thời hai enzyme là streptokinase

và streptodornase bằng phương pháp đo vòng ly giải trên đĩa thạch agarose Phương pháp có độ đúng, độ lặp lại cao và độ tuyến tính nằm trong khoảng từ

9 đến 28050 đơn vị streptokinase/ml Phương pháp này có tác dụng thiết thực trong việc đánh giá chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp cả hai enzyme này với trang thiết bị và các hóa chất thông dụng, kỹ thuật không phức tạp, có thể thực hiện được ở các cơ sở kiểm nghiệm cấp tỉnh, thành phố và các doanh nghiệp [49]

Năm 2019, Nguyễn Thị Hằng và cs đã tiến hành thẩm định quy trình xác định hoạt tính enzyme nattokinase bằng phương pháp đo quang Các kết quả thực nghiệm của nhóm tác giả chứng minh rằng quy trình xác định hoạt lực nattokinase bằng phương pháp đo quang có độ đặc hiệu, độ chính xác và

độ đúng nằm trong giới hạn cho phép về thẩm định phương pháp phân tích các hoạt chất sinh học, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ enzyme đem phản ứng và chênh lệch độ hấp thụ của hỗn hợp enzyme cơ chất sau phản ứng trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,69 đến 1,34 FU/ml Từ đó cho thấy rằng có thể áp dụng phương pháp đo quang để xác định hoạt lực của nattokinase trong các chế phẩm có chứa enzyme này [50]

Mặc dù cả trong nước và trên thế giới đều đã có nhiều công trình nghiên cứu về lumbrokinase cả chế phẩm tự nhiên lẫn chế phẩm tái tổ hợp, tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu dừng lại ở mức độ tinh sạch, thử hoạt tính

và đánh giá các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme này Các nghiên cứu về độ ổn định và các phương pháp kiểm nghiệm các chế phẩm này còn hạn chế Xuất phát từ tình hình đó chúng tôi triển khai nghiên cứu đề tài này nhằm mục tiêu tạo chế phẩm lumbrokinase chất lượng cao và an toàn, góp phần vào công tác sản xuất các chế phẩm thuốc và thực phẩm chức năng phục vụ hỗ trợ điều trị các bệnh huyết khối, một căn bệnh rất nguy hiểm và đáng quan tâm hiện nay

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu

Giun quế (Perionyx escavatus) được thu mua từ trang trại giun quế

GHT - Phú Cường – Sóc Sơn – Hà Nội

2.1.2 Hóa chất

Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm đều là các hóa chất tinh khiết, của các hãng uy tín trên thế giới Một số hóa chất chính được kê ở bảng 2.1

Bảng 2 1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất và enzyme Hãng sản xuất (nước)

Acrylamide, temed, bộ thuốc nhuộm Gram, thuốc thử N,

N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid

Merck (Đức)

Acetone, butanol, ethanol, methanol, amonium sulphate Xilong (Trung Quốc)

SDS, thrombin, plasmin, fibrinogen Sigma (Mỹ)

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Schalau (Tây Ban

Nha)

Cột cut off 10 kda và 50 kDa Millipore (Đức)

2.1.3 Các dung dịch và đệm

Các loại dung dịch và đệm dùng trong thí nghiệm đều được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn, có thành phần và nồng độ theo bảng 2.2

Bảng 2 2 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

Dung dịch APS 10% ammonium persulfate

Dung dich Bradford gốc 100 ml 95% ethanol, 350 mg coomassie brilliant blue

pH 7,2 working Pha loãng dung dịch đệm pH 7,2 gốc 800 lần

Dung dịch đệm hoạt hóa túi

phosphate 20 mM Pha loãng đệm potassium phosphate 1 M 50 lần

Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v)

methanol; 10% (v/v) acid acetic

Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acid acetic

Đệm điện di protein 20 mM tris HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,8

Đệm 5x tra mẫu protein 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 0,313 M

tris HCl, pH 6,8; 10% SDS; 10% β-mercaptoethanol

2.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Các môi trường nuôi cấy đều được pha dựa trên công thức chuẩn của

Dược Điển Việt Nam 5 và một số Dược Điển nước ngoài [51], [52] Công

thức pha chế môi trường theo bảng 2.3

Bảng 2 3 Công thức các môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường thạch

casein đậu tương

Casein thủy phân bởi pancreatin 15,0 g; bột đậu tương thủy phân bởi papain 5,0 g; natri chloride 5,0 g; thạch 15,0 g, nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2

Môi trường lỏng

casein đậu tương

Casein thủy phân bởi pancreatin 17,0 g; dikali hydrophosphate 2,5 g; bột đậu tương thuỷ phân bởi papain 3,0 g; glucose 2,5 g;

natri chloride 5,0 g; nước tinh khiết 1000 ml; pH sau khi hấp tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2

1000 ml; pH sau tiệt khuẩn 7,2± 0,2 Đun sôi trong 30 phút và

Môi trường thạch

muối - manitol

Casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g; thạch 15,0 g; pepton 5,0 g; đỏ phenol 0,025 g; cao thịt bò 1,0 g; natri clorid 75,0 g; D- manitol; 10,0 g; nước cất 1000 ml; pH sau khi tiệt khuẩn 7,4 ± 0,2

Peptone 5,0 g; đường trắng 10,0 g; cao men bia 3,0 g; đỏ phenol

80 mg; casein thủy phân bởi pancreatin 5,0 g; lactose 10,0 g; xanh brilliant 12,5 g; natri chloride 5,0 g; thạch 20,0 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml pH sau khi tiệt khuẩn 6,9 ± 0,2

Môi trường thạch –

sắt – ba đường

Casein thủy phân từ pancreatin 10,0 g; sắt (II) amonisulfat 0,3 g; peptone 20,0 g; natri chloride 5,0 g; lactose 20 g; natri thiosulfat 0,3 g; đường trắng 10,0 g; thạch 12,0 g; D-glucose monohydrate 1,0 g; đỏ phenol 0,025 g; nước tinh khiết vừa đủ 1000 ml pH sau khi tiệt khuẩn 7,3 ± 0,2

2.1.5 Chủng vi sinh vật

Bảng 2 4 Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh

Staphylococcus aureus ATCC 6538

Biologic (Mỹ)

Escherichia coli ATCC 8739

Salmonella tiphymurium ATCC 14028

Bảng 2 5 Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy Votex OSI

Máy li tâm lạnh Hettich Mikro 22R

Máy li tâm lạnh CF1 RXII

Hettich (Đức) Hitachi (Nhật Bản) Labomed (Mỹ) Tomy Kygyo, Hyrayama (Nhật) Faster (Ý)

Sanyo (Nhật) Toshiba (Nhật) Deawoo (Hàn quốc)

Sanyo (Nhật Bản)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô

Giun quế Perionyx excavatus được thu mua từ trại nuôi giun quế GHT -

Phú Cường – Sóc Sơn – Hà Nội Sau khi ngâm và rửa sạch nhiều lần bằng nước cất để loại hết các chất cặn bã trong đường tiêu hóa, lựa chọn những cá thể còn sống, khỏe mạnh, đang trong thời kì sinh sản, có đai sinh dục để sử dụng cho thí nghiệm

Nghiền đồng thể 100 g giun đã rửa sạch với 400 ml NaCl 0,9%, ly tâm

4000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trên Dịch trên tiếp tục được ly tâm

12000 vòng/phút, trong 15 phút, thu được dịch enzyme thô Sử dụng dịch enzyme thô này cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2 Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase

2.2.2.1 Phương pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ

Nguyên tắc của phương pháp này là khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm vì thế tạo ra kết tủa

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bốn loại dung môi là acetone, butanol, ethanol và methanol Sử dụng 5 ml dịch thô, thêm 20 ml dung môi (tỉ

lệ 1:4), tủa ở -200C trong 30 phút Ly tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, thu tủa Hòa tủa bằng đệm potassium phosphate 20 mM pH 7,4

2.2.2.2 Phương pháp tủa muối amonium sulphate

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa và sự khác nhau về khả năng kết tủa của các protein (trong đó có enzyme) ở một nồng độ muối xác định (tính theo % nồng độ bão hòa) để loại bỏ bước đầu protein tạp trong dịch enzyme thô ban đầu

Dịch enzyme thô được tủa muối amonium sulphate ở các nồng độ: 30%, 40%, 50%, 60% và 70%, các bước tủa và ly tâm được thực hiện ở 40C

Lượng muối amonium sulphate được thêm vào các dung dịch tủa được tính theo công thức [53]:

G = 515 x (X – X0)/100 – 0,27 x X Trong đó:

G: Số gram muối amonium sulphate cần thêm vào dịch enzyme

X: Độ bão hòa cần thiết

X0: Độ bão hòa cho trước

Tủa protein thu được hòa tan trong đệm potassium phosphate 20 mM,

pH 7,4 và được loại muối bằng phương pháp thẩm tích

Túi thẩm tích được hoạt hóa bằng đệm hoạt hóa túi thẩm tích sau đó cho dịch tủa thu được vào túi, đặt túi thẩm tích trong nước cất lạnh, khuấy nhẹ trên máy khuấy từ để loại muối, trong quá trình thẩm tích thay nước cất lạnh khoảng 2h/lần Toàn bộ quá trình thẩm tích được thực hiện ở 40C

Dịch enzyme sau khi tủa và thẩm tích loại muối được đo hàm lượng protein và xác định hoạt tính thủy phân fibrin Phân đoạn có hoạt tính riêng cao nhất sẽ tiếp tục được tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G100

2.2.2.3 Phương pháp sắc ký lọc gel sephadex G100

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng

ra, dựa trên mức độ di chuyển khác nhau của các phân tử đó trong hệ thống lưới phân tử của gel sắc ký

Mẫu được nạp vào đầu một cột có chứa các hạt làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao Sephadex là một loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100 μm, được tạo thành bởi liên kết ngang giữa dextran và epichlorohydrin Những phân tử nhỏ

có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn hơn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước Phân tử có kích thước trung bình có thể thỉnh thoảng đi được vào bên trong hạt sẽ rời cột ở vị trí giữa và những phân tử nhỏ sẽ phải đi đoạn đường dài hơn nên sẽ ra khỏi cột sau cùng [54]

Cột có kích thước 26 x 0,6 cm được cân bằng với đệm 20 mM potassium phosphate pH 7,4 Điều kiện sắc ký: Tốc độ dòng chảy 25 ml/giờ, thể tích mỗi phân đoạn 1,5 ml, thu được 24 phân đoạn các phân đoạn thu được được đo hàm lượng protein, xác định hoạt tính thủy phân fibrin, và điện

di trên gel polyacrylamide 12,5 %

2.2.2.4 Phương pháp tinh sạch bằng cột cut off

Sử dụng cột cut off 10 kDa và 50 kDa để tinh sạch mẫu Phân đoạn enzyme có hoạt tính riêng cao nhất sau khi qua cột sephadex G100 được chuyển lên cột cut off 10 kDa, ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút, thu toàn

bộ pha trên Phần dịch pha trên được chuyển lên cột cut off 50 kDa ly tâm

4000 vòng/ phút trong 15 phút để tách các protein có kích thước lớn hơn hoặc bằng 50 kDa ra khỏi hỗ hợp Sản phẩm sau đó được kiểm tra hàm lượng protein, xác định hoạt tính thủy phân casein, hoạt tính thủy phân fibrin và điện

di kiểm tra trên gel SDS-PAGE

2.2.3 Xác định hoạt tính thủy phân fibrin

Hoạt tính enzyme được xác định theo phương pháp đĩa fibrin của Astrup và Mullertz, sử dụng plasmin (yếu tố thủy phân fibrin có sẵn trong cơ thể người) làm chuẩn [55]

Nguyên tắc: Dựa trên sự thủy phân fibrin bằng LK tạo vòng tròn trong

suốt Đo đường kính, tính diện tích vòng phản ứng Hoạt tính thủy phân fibrin của LK được xác định dựa trên đường chuẩn plasmin

Chuẩn bị đĩa: Mỗi đĩa petri đường kính 10 cm chứa 10 ml dung dịch

fibrinogen tinh khiết trong NaCl 0,9% (nồng độ 0,2%) được ngưng kết bằng

15 µl thrombin (100 UI/ml) Chú ý, đĩa đặt ở vị trí phẳng, dung dịch được đổ cho đồng đều, tránh tạo bọt khí Đĩa được để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ để fibrin đông tụ hoàn toàn

Ủ phản ứng: Nhỏ từng giọt 10 μl dịch enzyme lên đĩa (giọt phải tròn), ủ

37oC trong 5 giờ Khi đông tụ, fibrin có màu trắng đục, do đó, các vùng bị thủy phân trở nên trong suốt, dễ dàng quan sát bằng mắt thường Sau 5 giờ, đo đường kính, tính diện tích vòng phản ứng Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình

Xây dựng đường chuẩn plasmin: Để xác định chính xác hoạt tính của

enzyme nghiên cứu cần xây dựng đường chuẩn hoạt tính Hoạt tính của enzyme thủy phân fibrin thường được so sánh với hoạt tính của plasmin, là enzyme thủy phân fibrin trong cơ thể Plasmin được pha trong đệm potassium phosphate 20 mM; pH 7,4 Nhỏ dung dịch enzyme lên đĩa fibrin (0,75- 2,4 IU), ủ 37oC trong 5 giờ, đo đường kính và tính diện tích vòng phản ứng

Đường chuẩn plasmin chỉ tuyến tính trong dải hoạt độ từ 0,75- 2,4 IU

Do đó, chúng tôi chọn dải này để xác định hoạt tính thủy phân fibrin của

enzyme trong quá trình thí nghiệm Đường chuẩn có phương trình : y= 49,215x + 24,493 (Hình 2.1) Trong đó, y là diện tích vòng phản ứng (mm2)

và x là hoạt tính enzyme (IU)

Hình 2 1 Đường chuẩn plasmin 2.2.4 Xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Bradford [56]

Nguyên tắc: protein phản ứng với coomassie brilliant blue sẽ tạo phức

hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch bovine serum albumin huyết thanh bò (Hình 2 2)

Tiến hành:

Ống thí nghiệm: 100 μl dịch mẫu được bổ sung 0,9 ml dung dịch

bradford working Hỗn hợp được đảo đều và so màu ở bước sóng 595 nm sau