XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS . LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Các phương pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .... DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CAN Acetonitrile Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Communities

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

NGUYỄN THỊ NHUNG

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ

TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG

LỜI CẢM ƠN

Bản khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm

An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với sự hướng dẫn của PGS.TS Lê Thị

Hồng Hảo

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS

TS Lê Thị Hồng Hảo đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và góp ý giúp

em hoàn thành khóa luận này Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị

Hà Bình đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An

toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn và các cán bộ khoa Độc

học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập và trong cuộc sống

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên

Hà Nội, ngày 07 tháng 11 năm 2016

Nguyễn Thị Nhung

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ 2

1.1.1 Giới thiệu về STX 4

1.1.2 Giới thiệu về NEO 4

1.1.3 Giới thiệu về GTX-1 5

1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML) 6

1.1.5 Những tác hại của độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ 7

1.2 Các phương pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 9

1.2.1 Các phương pháp thử sinh học 9

1.2.2 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA 10

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 10

1.2.4 Kỹ thuật điện di 12

1.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS) 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 16

2.2.2 Phương phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 17

2.2.3 Thẩm định phương pháp 23

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

2.3 Phương tiện nghiên cứu 26

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 26

2.3.2 Dung môi, hóa chất 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS 29

3.1.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy của thiết bị khối phổ MS/MS 29

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 33

3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 35

3.2.1 Chọn qui trình xử lí mẫu 35

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu 40

3.2.3 Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết 42

3.2.4 Khảo sát thể tích dung môi chiết 43

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 46

3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc 46

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 49

3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính 50

3.3.4 Độ chính xác (accuracy) của phương pháp phân tích (độ đúng và độ chụm) 52

3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP 3

Bảng 1.2: Một số nước đã đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) của các PSP 6

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định PSP 11

Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm việc 28

Bảng 3.1: Ion mẹ của từng chất 29

Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS 30

Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS 32

Bảng 3.4: Chương trình gradient 34

Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu 39

Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu 40

Bảng 3.7: Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết 42

Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung môi chiết 43

Bảng 3.9: Ion mẹ và ion con của STX, GTX-1, NEO 46

Bảng 3.10: LOD và LOQ của STX, GTX-1, NEO 50

Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các PSP 51

Bảng 3.12: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu Ngao 53

Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu Hàu 53

Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu thực tế trên địa bàn Hà Nội 54

DANH SÁCH H NH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của các độc tố PSP 2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của STX 4

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Neo 5

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của GTX-1 5

Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng 18

Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử 20

Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực 22

Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực 22

Hình 3.1: Sắc kí đồ mix PSP chuẩn 100 ng/mL chạy chương trình gradient 4 35

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 1Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình 2 theo tác giả Van De Riet 36

Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 2 37

Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 3 38

Hình 3.5:Sắc kí đồ các PSP 100 ng/mL trong quy trình 3 39

Hình 3.6: Sắc kí đồ quy trình không gia nhiệt khi thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL 41

Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt khi thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL 41

Hình 3.8: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình pha loãng đến hiệu suất thu hồi 42

Hình 3.9: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích chiết đến hiệu suất thu hồi 44

Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu 45

Hình 3.11: Phổ khối của các PSP 47

Hình 3.12: Sắc đồ mẫu trắng không có tín hiệu chất phân tích 47

Hình 3.13: Sắc đồ mẫu chuẩn ở mức 200 ng/mL 48Hình 3.14: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn ở mức 200 ng/mL 48Hình 3.15: Sắc kí đồ STX tại LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg trên mẫu) 49Hình 3.16: Sắc kí đồ NEO tại LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg trên mẫu) 49Hình 3.17: Sắc kí đồ GTX-1 tại LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg trên mẫu) 50Hình 3.18: Đường chuẩn STX theo diện tích pic 51Hình 3.19: Đường chuẩn GTX-1 theo diện tích pic 52Hình 3.20: Đường chuẩn NEO theo diện tích pic 52

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CAN Acetonitrile Acetonitril

AOAC Association of Official

Analytical Communities Hiệp hội các nhà phân tích chính

ASP Amnesic Shellfish Poisoning Độc tố nhuyễn thể gây mất trí

nhớ

CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí va chạm

CE Collision Energy Năng lượng va chạm

CUR Curtain Gas Khí màng

CXP Collision Cell Exit Potential Thế đầu ra

DP Declustering Potential Thế phân mảnh

DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning Độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy

d-SPE Dispersive solid phase

extraction Chiết phân tán pha rắn

Eq Equivalents Tương đương

ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử

FLD Fluoroscence detector Detector huỳnh quang

GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính

GS1 Ion Source Gas 1 Khí nguồn ion 1

GS2 Ion Source Gas 2 Khí nguồn ion 2

GTX-1 Gonyautoxins-1 Độc tố gonyautoxins-1

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HILIC Hydrophilic interaction liquid

chromatography Sắc kí lỏng tương tác thân nước

IS Ionspray Voltage Thế phun ion

LC-MS/MS Liquid chromatography tandem

mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

MBA Mouse bioassay Thử nghiệm sinh học trên chuột

ML Maximum level Giới hạn tối đa cho phép

MS Mass spectrometry Khối phổ

NEO Neosaxitoxin Độc tố neosaxitoxin

PSP Paralytic Shellfish poisoning Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi

RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

STX Saxitoxin Độc tố saxitoxin

TEM Ion source temperature Nhiệt độ nguồn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây việc nuôi trồng thủy sản nói chung và việc nuôi các loài hai mảnh vỏ nói riêng đã và đang phát triển rầm rộ ở nhiều địa phương ven biển nước ta Điều này đã góp phần vào việc phát triển ngành kinh tế biển, phục vụ cho nhu cầu thị trường tiêu thụ trong và ngoài nước, tăng thêm thu nhập, cải thiện đời sống cho nhiều hộ dân cư ven biển

Đô thị hóa, ô nhiễm môi trường làm môi trường biển ngày càng bị suy thoái tạo điều kiện cho sự xuất hiện và bùng nổ của các loài vi tảo biển độc hại Các loài thân mềm hai mảnh vỏ là đối tượng trung gian chính để gây ra hiện tượng ngộ độc ở người và các sinh vật bậc cao như chim biển, thú biển Đặc biệt

sự có mặt các nhóm độc tố độc tố gây liệt cơ PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Chính vì vậy, nghien cứu phát hiện các độc tố cần được quan tâm để giảm nguy

cơ ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như tính mạng của con người

Trong đề tài này tập trung nghiên cứu nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Độc tố này gây nguy hiểm đến sức khoẻ và tính mạng con người là do động vật nhyễn thể bị nhiễm và tích lũy độc tố PSP do

ăn phải tảo độc nhóm Dinoflagellates bao gồm loài Dinophysis spp, Aurocentum,

prorocentrumlima.Việc xác định một số độc tố nhuyễn thể gây liêt cơ là rất cần

thiết, là công cụ rất tốt phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra an toàn thực phẩm

Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp “Xác định đồng

thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS” Phương pháp hiện đại, có độ tin cậy và chính xác cao

Mục tiêu của thực hiện đề tài luận văn là:

- Xây dựng phương pháp xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/MS

- Sơ bộ đánh giá một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ tiêu thụ tại Hà Nội

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ

Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là một nhóm các alkaloid gây độc trên thần kinh STX là độc tố PSP được phát hiện sớm nhất vào năm 1957, và kể từ

đó đến nay đã có 57 dẫn xuất được mô tả [28]

Độc tố PSP là những độc tố thân nước và chịu được nhiệt độ cao nên khó

có thể bị phá hủy khi nấu ăn hay đun nóng [15], [18] Chúng có thể được chia thành 4 phân nhóm chính [8], [22], [28]:

Độc tố nhóm carbamate gồm: saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO), gonyautoxins (GTX1-4) có độc tính mạnh nhất

Độc tố nhóm decarbamoyl gồm: decarbamoyl saxitoxin (dcSTX), decarbamoyl gonyautoxins (dcGTX1-4) có độc tính trung bình, được báo cáo xuất hiện trong một vài động vật hai mảnh vỏ, nhưng ít được tìm thấy trong các loài tảo độc

Các độc tố nhóm N-sulfocarbamoyl như: B1 [GTX5], B2 [GTX6] and

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP

- Nguồn gốc: Sinh ra bởi vi sinh vật sống cộng sinh trên một sinh vật khác, gồm

californianeus

- Lý hóa tính: Các độc tố PSP không bị phân hủy bởi nhiệt ở môi trườngacid

nhưng không bền vững và dễ bị oxy hóa trong môi trường kiềm

- Tác hại: Các triệu chứng nhiễm độc PSP có thể xuất hiện sau khi ăn vài phút cho đến 10 giờ Triệu chứng bao gồm cảm giác tê ở môi, cổ, mặt, cùng cảm thấy như có kiến bò trong các ngón tay và ngón chân, nhức đầu, chóng mặt và buồn nôn, nói năng không còn mạch lạc, mạch đập nhanh, thở khó Trường hợp nặng

có thể dẫn đến tử vong do suy hô hấp

- Hệ số độc: Trong nhóm các độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ thì STX là độc tố mạnh nhất và ta quy ước nó có hệ số cao nhất là 1 Độc tố có độ mạnh thứ hai là GTX-1 và đến NEO Độc tố ít gây độc nhất là độc tố GTX-2

- Xâm nhập: qua đường ăn uống, hít thở

- Cơ chế tác dụng: Saxitoxin và các dẫn chất khác phong bế kênh Na+ của các tế bào thần kinh do đó chúng gây ảnh hưởng đến hoạt cả hoạt động thần kinh và các phản ứng của hệ cơ

1.1.1 Giới thiệu về STX

- Danh pháp thường: Saxitoxin

- Danh pháp quốc tế:

3a,4,8,9-tetrahydro-1H,10H-pyrrolo(1,2-c)purine-10,10-diol

(3aS-(3a-α,4-α,10aR*))-2,6-diamino-4-(((amino-carbonyl)oxy)methyl) Công thức cấu tạo:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của STX

- Công thức thu gọn: C10H17N7O4

- Khối lượng mol phân tử : 299.29 g/mol

1.1.2 Giới thiệu về NEO

- Danh pháp thường: Neosaxitoxin

- Danh pháp quốc tế:

[(3aS,4R,10aS)-5,10,10-Trihydroxy-2,6-diiminooctahydro-1H,8H-pyrrolo[1,2-c]purin-4-yl]methyl carbamate

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Neo

- Công thức thu gọn: C10H17N7O5

- Khối lượng mol phân tử : 315.286 g/mol

1.1.3 Giới thiệu về GTX-1

- Danh pháp thường: Gonyautoxins-1

- Danh pháp quốc tế: diimino-decahydropyrrolo[1,2-c]purin-9-yl}oxidanesulfonic acid

{4-[(carbamoyloxy)methyl]-5,10,10-trihydroxy-2,6 Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của GTX-1

- Công thức thu gọn: C10H17N7O9S

- Khối lượng mol phân tử : 411.34848g/mol

1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML)

- Mức tối đa cho phép (ML) là giới hạn của độc tố PSP , được phép tồn tại về mặt pháp lí hoặc xem như có thể chấp nhận được ở trong nhuyễn thể hai mảnh

vỏ, mà không gây hại cho người sử dụng

Bảng 1.2: Một số nước đã đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) của các

PSP như sau [13]:

Đất nước/

Vùng lãnh thổ Sản phẩm Độc tố Mức cho phép

Australia Động vật có vỏ Saxitoxin 80 µg/100g Canada Nhuyễn thể PSP <80µg/100g Châu Âu Nhuyễn thể PSP 80µg/100g Guatemala Nhuyễn thể Saxitoxin 400 MU/100g HongKong Động vật có vỏ PSP 400 MU/100g Nhật Nhuyễn thể PSP 400 MU/100g Hàn Quốc Nhuyễn thể Gonyautoxins 400 MU/100g

c Động vật có vỏ PSP, NSP, DSP,

ASP 40-80 µg/100g

Na Uy Tất cả PSP 40-80 µg/100g Panama Nhuyễn thể PSP 400 MU/100g Singapore Nhuyễn thể Saxitoxin 80 µg/100g

M Nhuyễn thể PSP 80 µg/100g

Nhận xét: Hiện nay Việt Nam chưa đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) của các PSP Vậy chúng tôi chấp nhận giá trị ML bằng 80 µg/100g là giá trị ML của M và nhiều nước khác

1.1.5 Những tác hại của độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ

 Ảnh hưởng đến động vật giáp xác thân mềm

Thủy triều đỏ là tên gọi khi vùng biển có hiện tượng nở hoa bùng phát của tảo Khi tảo nở hoa gây ảnh hưởng xấu đến hàng loạt động vật giáp xác thân mềm như nghêu, trai, sò vẹm, hàu Những đợt bùng phát tảo nở hoa xảy ra ở cửa sông, mặt biển nhanh chóng tích tụ những đám hoa Sự nở hoa của tảo có khi làm nước biển có màu đỏ, có khi màu xanh, màu xám… Đa số các loài tảo nở hoa làm môi trường xấu đi, làm giảm lượng oxi hòa tan trong nước làm cho động vật biển chết hàng loạt [14]

Ở Việt Nam, hiện tượng thủy triều đỏ xuất hiện chủ yếu ở khu vực vùng biển Nam Trung Bộ Trong đó Bình Thuận là nơi hiện tượng này xảy ra thường xuyên, hàng năm từ tháng 3 đến tháng 9 Gần đây, trong khoảng tháng 3-6/2012

ở Cát Bà Hải Phòng cũng đã xuất “thủy triều đỏ”, tuy nhiên loại tảo này có tên Noctiluca scintillans không sinh độc tố, nên không có nguy cơ gây độc cho người [11]

 Ảnh hưởng của tảo độc trong ao tôm

Trên các ao nuôi tôm sú Penaeus monodon và P orientalis ở Đài Loan, Trung Quốc và Malaysia có nhiều giống tảo nở hoa do môi trường giàu ding dưỡng bao gồm: Euglena spp, Noctiluca scintillan, Alexdrium tamarense, Chattonella spp, chúng gây ra tình trạng thiếu oxy máu, tiết ra độc tố PSP, ASP làm giảm sinh trưởng ở tôm, gây bệnh, hoặc trực tiếp gây chết tôm

Ở Việt Nam, tảo độc Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực Vân Phong thuộc vùng biển Khánh Hòa đã làm chết khoảng 20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính khoảng 6 tỷ đồng

 Ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

Ở người, nhiễm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là do ăn phải nhuyễn thể chứa độc tố này Nhuyễn thể bị nhiễm và tích lũy các loại độc tố này là do ăn tảo độc

Dấu hiệu đầu tiên của sự nhiễm độc trên người xuất hiện khoảng 5-30 phút sau khi ăn nhuyễn thể bị nhiễm với các triệu chứng: cảm giác kim châm hoặc tê nhẹ đến liệt cơ hô hấp hoàn toàn Trong trường hợp nặng có thể tử vong do liệt cơ hô hấp, xảy ra trong vòng từ 2-12h sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc PSP

Mỗi năm, các trường hợp ngộ độc do PSP vẫn được ghi nhân trên toàn thế giới

Từ năm 1970 có khoảng 1.600 trường hợp ngộ độc do PSP đã được báo cáo, dặc biệt là ở Bắc M và Châu Âu Bên cạnh đó, có thêm khoảng 900 trường hợp ngộ độc PSP được ghi nhận ở các vùng trên thế giới mà trước đó PSP chưa được biết đến

Ở Nhật, trường hợp ngộ độc đầu tiên được ghi nhận vào cuối những năm 1960 Ở Malaysia, Philippin và Indonesia, các ca ngộ độc đầu tiên được báo cáo vào những năm 1970 và đầu những năm 1980 Trong suốt 20 năm qua, dường như có

sự gia tăng các vụ ngộ độc PSP do việc nuôi và tiêu thụ nhuyễn thể được mở rộng

 Nhóm nhuyễn thể được xác định trong những vụ ngộ độc PSP gồm chủ yếu động vật thân mềm hai mảnh vỏ gồm vẹm, ngao, hàu, điệp và sò Cần chú ý: do PSP tích lũy trong nhuyễn thể nên chúng có thể gây ngộ độc cho người cả khi không có hiện tượng thủy triều đỏ Tác dụng độc lên động vật

PSP có thể gây độc lên nhiều động vật khác như cá, chim, ếch, gà, chuột, thỏ, chó mèo Trong các thí nghiệm trên động vật, PSP làm chết thú thử nghiệm do gây liệt hệ thống hô hấp Ngoài ra, PSP thể hiện tác dụng độc lên hệ thần kinh

cơ, hệ thần kinh trung ương, hệ thống tim mạch và ở liều 1 µg/kg trọng lượng cơ thể đã gây tăng huyết áp

 Hấp thụ và thải các độc tố PSP trong cơ thể thủy sản

Trong quá trình lọc thức ăn, các tế bào và bào tử của tảo giáp đã chuyển vào thực quản dạ dày của nhuyễn thể hai mảnh vỏ Nội tạng của nhuyễn thể chỉ chiếm 30% tổng khối lượng của mô mềm nhưng lại chứa đến 96% tổng độc tố Trong

cơ thể động vật nhuyễn thể, các độc tố tập trung nhanh chóng trong nội tạng và sau giảm dần Thành phần các độc tố không giống nhau mà biến đổi theo thời gian và vị trí trong động vật Cơ khép vỏ không tích lũy độc tố mà thực tế cho thấy đã làm bất hoạt độc tố Ống tiêu hóa, màng, tuyến sinh dục và mô mang giữ lại độc tố với trọng lượng khác nhau giữa các mô và giữ các loài Sau khi hấp thụ

và phân bố, các độc tố có thể bị biến đổi Các loài hai mảnh vỏ có cách xử lý và phản ứng với PSP khác nhau và sự nhạy cảm của chúng với độc chất này cũng khác nhau, ví dụ: vẹm tích lũy các độc tố PSP nhiều hơn hàu trong cùng hoàn cảnh Các nghiên cứu nuôi trong phòng thí nghiệm cho thấy vẹm hấp thụ dễ dàng các độc tố của tảo giáp nhưng với lượng độc tố tương đương như thế thì hàu ngừng lọc

1.2 Các phương pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Có hai nhóm phương pháp chính để xác định các độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bao gồm nhóm phương pháp sinh học và nhóm phương pháp hoá học:

1.2.1 Các phương pháp thử sinh học

Thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA) vẫn là phương pháp thử nghiệm chính trong hầu hết các chương trình giám sát ngộ độc thủy sản MBA được sử dụng phổ biến trên thế giới trong hơn 50 năm qua và là phương pháp chính thức của AOAC

PSP trong mẫu được chiết tách bằng dung dịch HCl 0,1N, dịch chiết được tiêm vào chuột theo tỷ lệ 1 mL dịch/20 g chuột, quan sát biểu hiện của chuột trong vòng 60 phút và xác định thời gian chết của chuột Dựa vào thời gian chết của chuột tra bảng Sommer sẽ xác định được giá trị đơn vị chuột (MU), từ đó tính được nồng độ độc tố PSP trong mẫu [23], [30]

Tác giả Đào Việt Hà – Viện Hải Dương Học Nha Trang [1] đã tiến hành thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA.AOAC 1990) để xác định hàm lượng độc

tố PSP trong nghêu Meretrix lyrata tại một số vùng nuôi trọng điểm khu vực Cần Giờ Tác giả đã tiến hành tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng (Swiss wiss) (có trọng

lượng 20g ± 2g) 1 mL dịch chiết thô, sau đó theo dõi triệu chứng và thời gian chết của chuột (nếu xảy ra) Tính toán độc lực tổng dựa theo phương pháp AOAC, 1990 Kết quả cho thấy, hàm lượng độc tố PSP ở tất cả các mẫu đều dưới mức độ phát hiện của phương pháp MBA (36 µg/100g, với hệ số CF = 0.18)

- Ưu điểm: thời gian thực hiện nhanh, có khả năng đánh giá được tổng các độc tố và không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp

- Nhược điểm là độ nhạy thấp, không thể tự động hóa, không định danh chính xác loại chất độc, bị ảnh hưởng bởi các đặc tính động vật và đặc biệt là vấn

đề đạo đức [22], [23] Do đó, nhóm phương pháp này hiện nay không còn đáp ứng được nhu cầu và dần được thay thế bằng các phương pháp hoá học

1.2.2 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA

ELISA (Enzym-linked immunosorbent assay) là một kĩ thuật sinh hóa để phát hiện kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu xét nghiệm, và thường được quan sát bởi sự thay đổi màu sắc Usleber và cộng sự bằng cách sử dụng các kháng thể đa dòng đã phát triển thành công kit thử nghiệm cho STX Giới hạn phát hiện là 4 ng/g mô nhuyễn thể [26]

- Ưu điểm: Dễ thực hiện và thời gian phân tích ngắn

- Nhược điểm: chi phí mua kit thử đắt, không có khả năng định danh và phân loại các thành phần của độc tố PSP Do đó, khi phát hiện mẫu thử dương tính phải dùng phương pháp sắc ký để kiểm tra [23]

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao sử dụng detector huỳnh quang (HPLC-FLD) là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong phân tích các PSP

và AOAC 2005:06

Ưu điểm của phương pháp là có độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc cao Nhược điểm là tốn thời gian vì các PSP phải được dẫn xuất hóa trước cột hoặc sau cột để phân tích bằng detector huỳnh quang Ngoài ra, việc xác định PSP phức tạp hơn do sự chồng chéo các sản phẩm oxi hóa các chất tương tự PSP trong trường hợp oxi hóa trước cột

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định PSP

+ Kênh B: acid octanesulfonic và heptanesulfonic 7 mmol/L, ammonium photphat 48 mmol/mL, tetrahydrofuran 1% và ACN 10% trong nước

+ Oxi hóa trước cột + Tốc độ dòng 1 mL/phút + Bước sóng kích thích: 330 nm + Bước sóng phát xạ: 390 nm

LOD = 0,035 (µg/g) LOQ = 0,07 (µg/g)

+ Cột Angilent Zorbax Bonus RP (3,5 µm; 4,7 x

150 mm) + Kênh A: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 5,5

mM trong nước (pH = 7,1) + Kênh B: Heptane sulfonat 11 mM, H3PO4 16,5

mM, methylnitril 11,5% trong nước (pH = 7,1) + Oxi hóa sau cột

+ Tốc độ dòng 0,8 mL/phút + Bước sóng kích thích và phát xạ: 330 nm và 390

nm

µg/g LOQ = 0,051 µg/g

Độ thu hồi: 88% – 113%

Llewellyn

[20]

- Nền mẫu: Hàu, sò, hến

- Điều kiện sắc kí + Cột Supelcosil LC-18 (5 µm; 4,6 x 15 mm) + Kênh A : ammonium formate 0,1 M

+ Kênh B : ammonium forrmate 0,1 M trong 5%

ACN/H2O (pH = 6) + Oxi hóa trước cột + Tốc độ dòng 2 mL/phút + Bước sóng kích thích: 330 nm + Bước sóng phát xạ: 390 nm

LOD = 0,02 µg/g LOQ = 0,06 µg/g

Độ thu hồi: 70 – 104%

1.2.4 Kỹ thuật điện di

Điện di mao quản (CE) là một k thuật tương đối mới đã được phát triển

và ứng dụng trong lĩnh vực phân tích độc tố Điện di mao quản là một k thuật tách các chất trong dung dịch lỏng dựa trên sự di chuyển khác nhau của các phân

tử chất mang điện tích trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của điện trường tạo

bởi điện áp cao thế (15 – 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản Các độc tố này di chuyển qua cột khi điện áp cao được áp vào và có thể được phát hiện khi chúng

đi qua một detector UV hoặc huỳnh quang K thuật này được áp dụng cho các hợp chất mang điện, và thậm chí khi không có điện tích nó có thể hợp chất bẫy trong mixen mà sau đó sẽ di chuyển

Wright và cộng sự (1989) [29] áp dụng một hệ thống CE cùng với một máy dò huỳnh quang để xác định STX K thuật này cho phép phát hiện các STX

ở cấp µg /kg Mặc dù khối lượng tiêm là nhất thiết phải nhỏ (1-10 nL), giới hạn phát hiện lý thuyết cho các mẫu nằm trong khoảng pg/kg Những nhược điểm hiện nay với k thuật là không xác định được độc tố hỗn hợp

Thibault và cộng sự (1991) đã áp dụng một phương pháp CE cho các mẫu sinh vật biển Sự phân tách của Neo và STX đã đạt được và sử dụng phép đo phổ

UV với giới hạn phát hiện cỡ 1,5 µg/mL Các tác giả cho rằng k thuật CE-UV

có thể áp dụng cho việc kiểm tra thường xuyên các chất độc trong các chiết xuất

tự nhiên, nhưng giới hạn phát hiện hiện nay là quá cao để có thể sử dụng trong các chương trình giám sát

1.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS)

Gần đây phương pháp sắc kí lỏng tương tác ưa nước kết hợp với detector

2 lần khối phổ cho độ nhạy, độ đặc hiệu cao khi phân tích các PSP MS/MS)

(HILIC-Liyang uo [31] đã sử dụng kĩ thuật QuEChERS (nhanh, dễ dàng, giá rẻ, hiệu quả, bền và an toàn) cho việc tách chiết, làm sạch và phát hiện 10 độc tố PSP trong thực phẩm biển bằng HILIC-MS/MS ở chế độ ESI dương

- Nền mẫu: nhuyễn thể + cá

- Dung môi chiết: ACN/H2O (90:10, v/v)

- Làm sạch: d-SPE (chất hấp phụ HLB và than hoạt tính GCB)

- Điều kiện sắc kí:

+ Cột: TSK-gel Amide-80®

(3 µm; 2,0 x 150 mm)

+ Kênh A: HCOOH 0,1% trong ammonium formate 2 mmol/L + Kênh B: HCOOH 0,1% trong ACN

+ Chạy theo chương trình gradient

Kết quả: Các nghiên cứu ở ba mức thêm chuẩn PSP trong khoảng

8,1-225,5 µg/kg cho độ thu hồi trung bình từ 71,3% đến 104,6% với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 15,8%

Mattarozzi [21] đã tối ưu hóa phương pháp xử lý mẫu bằng kĩ thuật QuEchERS để phân tích độc tố PSP bằng phương pháp HILIC-MS/MS

- Nền mẫu: trai

- Dung môi chiết: HCOOH 0,1%

- Làm sạch: d-SPE (chất hấp phụ polymeric ABS Elut – NEXUS)

+ Chạy theo chương trình gradient

Kết quả: Phương pháp cho giới hạn phát hiện của các PSP là 3 µg/kg,

giới hạn định lượng là 7 µg/kg; hiệu suất thu hồi trong khoảng từ 98 – 109% tại mức thêm chuẩn LOQ và mức giữa đường chuẩn xây dựng

Aversano [10] đã tiến hành phân tích các độc tố PSP bằng phương pháp HILIC-MS Nhóm tác giả đã tiến hành khảo sát dung môi pha động và lựa chọn cột HILIC với các điều kiện như sau:

- Nền mẫu: Trai, sinh vật phù du

- Dung môi chiết : ACN/H2O chứa HCOOH 0,1%

- Điều kiện sắc kí:

+ Cột: TSK-gel Amide-80® (4,6 µm; 2,0 x 250 mm)

+ Kênh A: H2O chứa ammonium format 2 mM, HCOOH 3,6 mM (pH = 3,5)

+ Kênh B: ACN/H2O (95/5, v/v) chứa ammonium format 2 mM, HCOOH 3,6 mM (pH = 3,5)

+ Chạy theo chương trình gradient

Kết quả: Có khả năng tách tốt với các độc tố STX, dcSTX, NEO Tuy

nhiên các GTX không tách hoàn toàn khi đi qua cột Amide - 80 do hiện tượng dính píc

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổLC-MS/MS có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau mà phương pháp sắc kí lỏng thường không làm được

Với những ưu điểm trên, chúng tôi đã chọn phương pháp sắc kí lỏng hai lần khối phổ để nghiên cứu xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ: Saxitoxin (STX)

và Neosaxitoxin (NEO) và Gonyautoxin-1 (GTX-1)

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ gồm Saxitoxin (STX), Neosaxitoxin (NEO) và Gonyautoxin-1 (GTX-1)

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu được đặt ra như sau:

 Tối ưu hóa điều kiện xác định một số độc tố gây liệt cơ bằng phương

pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS), cụ thể:

 Xây dựng quy trình tách chiết chất phân tích

 Thẩm định phương pháp:

 Độ đặc hiệu / chọn lọc của phương pháp

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu

- Thời gian lấy mẫu: Từ 01/10/2015 – 20/04/2016

- Địa điểm lấy mẫu: chợ Hà Đông, chợ Mơ, chợ Phùng Khoang, chợ Long Biên, chợ Nghĩa Tân…

- Khối lượng mẫu: 1 kg/mẫu

- Lọc lấy phần thịt, để ráo nước và đồng nhất mẫu bằng máy xay mẫu HR2118 Philips

- Bảo quản ở tủ lạnh sâu -20oC trong thời gian thực nghiệm

2.2.2 Phương phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

Cấu trúc của hệ thống LC-MS/MS

2.2.2.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bộ phận này có nhiệm vụ tách chất phân tích Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

tích khối

Detector/

Lưu giữ số liệu

Rất quan trọng ESI Phân tích từ

Cột APCI Phân tích tứ cực

Hệ thống dung môi APPI Phân tích tứ cực chặp ba

Phân tích bẫy ion

Phân tích thời gian bay

Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha ngược (RP-HPLC) [2], [4]

 Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó làcác silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN ), pha động là các dung môi hữu cơ không phân cực như: n-hexan, toluene Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay

ít phân cực

 Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp Một

số loại Detector dùng trong HPLC như: Detector quang phổ hấp thụ phân tử VIS, Detector huỳnh quang RF, Detector độ dẫn Khối phổ (MS) cũng đóng vai trò như một detector đặc biệt của HPLC

UV-2.2.2.2 Máy khối phổ (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [4]

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết

bị phân tích và bộ phận phát hiện

 Nguồn ion

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Một số kĩ thuật ion hóa thường được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric pressure chemical ionization – APCI)

a) Ion hóa phun điện tử (ESI)

Kĩ thuật ion hóa phun điện tử bao gồm ba quá trình cơ bản sau:

+ Tạo thành các giọt mang điện tích

+ Làm giảm kích thước của các hạt, và phân nhỏ các hạt

+ Quá trình hình thành pha hơi các ion

Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử

Có 2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm

 Loại hình thành ion dương

o Phù hợp nhất cho phân tích các loại thuốc có tính bazo

o Thường hình thành nên ion [M+H]+

o Cũng có thể hình thành ion [M+nH]n+

, [M+Na+]+

 Loại hình thành ion âm

o Thích hợp nhất cho sự phân tích các loại thuốc có tính axit

o [M-H]-

, [M-nH]Đây là kĩ thuật ion hóa mềm, có độ nhạy cao Kĩ thuật này ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit,

n-polyetilen glycocol, và các chất phân cực có khối lượng phân tử nhỏ

b) Ion hoá hoá học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization: APCI)

Hỗn hợp khí này đến một vùng có áp suất khí quyển, và xảy ra sự ion hoá hoá học khi va chạm với 1 dòng ion dương (H2, CH4, H2O ) hoặc âm để biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hay các mảnh ion qua sự bắn phá bởi dòng electron mang năng lượng Mỗi phân tử khí có thể tạo ra các ion dương khác nhau làm tác nhân cho ion hóa hóa học

Chất phân tích và dung môi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa hơi ở nhiệt độ cao khoảng 500C Một điện thế cao từ 3 – 5kV tạo ra các electrron và ion hóa chất phân tích

Đây cũng là một kĩ thuật ion hóa mềm APCI được sử dụng để phân tích các chất có khối lượng phân tử trung bình Kĩ thuật này có thể bắn phá ở 2 chế độ: ion âm và ion dương

 Bộ phân tích tứ cực chặp ba (triple Quadrupole Analyser)

Gồm ba tứ cực ghép nối với nhau Máy tứ cực gồm 4 thanh cực ghép song song nối với nhau từng đôi một đối diện nhau, tạo thành hai cặp, sau đó chúng nối với điện áp một chiều tạo thành 2 cặp dương và âm Ngoài điện áp một chiều, hai cặp điện cực còn được nối với điện áp xoay chiều Tổ hợp điện áp này đặc biệt là điện áp xoay chiều sẽ thay đổi theo chu kỳ để quét khối lượng các ion

Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực Một số ion có tỷ số m/z xác định cộng hưởng với thế xoay chiều xác định

có thể đi thẳng qua khoảng không đến detector Trong khi đó các ion khác không

sẽ có qu đạo không ổn định va chạm với các cực và bị giữ lại ở đó Tuy nhiên

để thu được tất cả các ion ta quét điện áp theo chu kỳ từ zero đến một điện áp nhất định tăng dần sau đó lại trở lại zero, lần lượt các ion sẽ vượt qua được tứ cực cũng có khối lượng từ nhỏ đến lớn để đến detector

Máy tứ cực chặp ba:

Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực Trong đó:

bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions) Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến Sau

đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3

Q3: Bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện

 Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Có hai loại bộ phận phát hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron (electron multipler) và bộ phận phát hiện nhân quang (photo multipler)

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có độ nhạy cao Một ion đập vào bề mặt dinod làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinod tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thành dòng các electron (1-106

)

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron Số lượng các photon tỷ lệ với cường độ tín hiệu

Sử dụng phương pháp xác nhận (confirmation method) là một cách rất tốt

để đảm bảo tính đặc hiệu của phương pháp Hội đồng châu Âu quy định cách tính

điểm IP (điểm nhận dạng – indenfication point) đối với các phương pháp khác

nhau để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất

2.2.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lượng (LOQ)

- Khái niệm [5], [6]

Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ nhất có thể

được phát hiện với mức tin cậy xác định

Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong

mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có

độ chính xác mong muốn

- Xác định: Dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N)

Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

Đường chuẩn: là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng

đo được và nồng độ các chất phân tích

- Xác định:

Đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu và nồng độ Vẽ đường thẳng tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa tín hiệu và nồng độ chất phân tích

2.2.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Độ lặp lại (độ chụm): là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) [6]

Trong đó:

- xi : Nồng độ tính được của lần thử nghiệm thứ i

- : Nồng độ trung bình tính được của N lần thử nghiệm

- N: Số lần thử nghiệm

Độ đúng của phương pháp: là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa các giá

trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận

là đúng

Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so

với giá trị lý thuyết

Trong đó:

- R: độ thu hồi (%)

- C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn (ng/mL)

- Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ng/mL)

+ Thiết bị sắc ký lỏng của Shimadzu Mode 20 AD-UFLC

+ Đầu dò khối phổ: Triplequard 5500 của AB Sciex (M )

 Micropipet loại 200 µL, 1000 µL, 5000 µL thay đổi thể tích được

và đầu côn tương ứng

2.3.2 Dung môi, hóa chất

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Methanol, acetonitril (Merck)

- Acid formic, acid acetic, natri hydroxyd, acid trichloracetic (TCA) (Merck)

- Nước cất 2 lần

- Chất hấp phụ C18, GCB được cung cấp bởi công ty Agilent, M

- Tất cả các dung dịch (trừ trường hợp sử dụng nguyên trạng dung môi loại tinh khiết sắc ký) đều được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi đưa vào hệ thống sắc kí

* Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Chuẩn STX, NEO, GTX-1 là vật liệu chuẩn được chứng nhận của NCR, Canada

- Các chuẩn PSP được sử dụng của Canada là các chuẩn vật liệu chứng nhận

- Chuẩn STX dạng Saxitoxin Dihydrochloride nồng độ 66,3 µmol/L, khối lượng phân tử 372,2g/mol, tương đương với hàm lượng 24,7 µg/mL

- Chuẩn Neo nồng độ 65,6 µmol/L, khối lượng phân tử 315,1g/mol, tương đương với hàm lượng 20,5 µg/mL

- Chuẩn GTX-1 nồng độ 60,4 µmol/L, khối lượng phân tử 411,4g/mol, tương đương với hàm lượng 24,8 µg/mL

- Dung dịch chuẩn trung gian 1000 ng/mL: Lấy chính xác một thể tích các chuẩn STX, NEO, GTX-1lần lượt là 40,5; 48,8; 40,3 µL và thêm 870 µL

dung môi HCOOH 0,1%, đậy nắp, lắc đều Chuẩn trung gian được bảo quản ở nhiệt độ khoảng 4C, có thể giữ được trong 6 tháng

Các dung dịch chuẩn xây dựng đường chuẩn: Pha dãy dung dịch dùng để xây dựng đường chuẩn như ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm việc

Thể tích chuẩn trung gian (µL) 30 50 100 200 500 Thể tích dung môi (µL) 970 950 900 800 500 Nồng độ STX (ng/mL) 30 50 100 200 500 Nồng độ Neo (ng/mL) 30 50 100 200 500 Nồng độ GTX-1 (ng/mL) 30 50 100 200 500

(*) Trường hợp pha đường chuẩn trên nền mẫu thì thay thế bằng dịch chiết mẫu trắng

- Dung dịch chuẩn trung gian 1 µg/mL: Hút chính xác 40,5 µl chuẩn gốc STX vào lọ mẫu 1,8 mL và thêm 960 µL dung môi CH3COOH 1%, đậy nắp, lắc đều

- Dung dịch chuẩn trung gian 100 ng/mL: Hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn

1 µg/mL vào lọ mẫu 1,8 mL và thêm 900 µL dung môi CH3COOH 1%, đậy nắp, lắc đều

- Dung dịch chuẩn trung gian 50 ng/mL: Hút chính xác 50 µL dung dịch chuẩn 1 µg/mL vào lọ mẫu 1,8 mL và thêm 950 µL dung môi CH3COOH 1%, đậy nắp, lắc đều

- Các dung dịch chuẩn trung gian được bảo quản ở - 20oC có thể giữ được trong 1 tháng

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS

Để tìm được điều kiện chạy sắc ký tốt nhất cho một số độc tố gây liệt cơ thì trước tiên phải tìm được ion con định lượng và ion con định tính Do vậy ban đầu chúng tôi tìm các điều kiện tối ưu cho thiết bị khối phổ MS/MS

3.1.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy của thiết bị khối phổ MS/MS

3.1.1.1 Khảo sát ion mẹ và ion con

Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành kháo sát xác định các độc tố PSP bằng kĩ thuật ion hóa phun điện tử (ESI) với chế độ bắn phá ion dương Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, tiến hành tiêm dung dịch gồm STX, GTX-1, NEO 100ng/mL tiêm trực tiếp vào detector khối phổ để khảo sát Chọn chế độ khảo sát

tự động đối với từng chất để chọn được ion mẹ, ion con dùng để định lượng và định tính đối với từng chất

Ion mẹ của từng chất được chỉ ra ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Ion mẹ của từng chất Độc tố Khối lượng phân tử M (g/mol) Ion mẹ (m/z)

Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS

Độc tố Ion mẹ

(m/z)

Ion con (m/z)

+ DP (Declustering Potential): Thế đầu vào, thế áp vào màn chắn của bộ phận phân tích khối Nó có tác dụng bẻ gẫy cụm ion [M+H3O+]+ và khử nhiễu hóa học tạo thành, làm tăng độ nhạy của phép phân tích Tuy nhiên, thế này cũng được quá cao, vì nó sẽ bẻ gẫy luôn cả cấu trúc của phân tử ion mẹ

+ CXP (Collision Cell Exit Potential): Thế áp giữa bộ tứ cực Q2 và Q3 + CE (Collision Energy): Là năng lượng va chạm được tao ra do thế áp vào bộ tứ cực Q2, tạo ra năng lượng để phân mảnh ion mẹ

3.1.1.2 Tối ưu các điều kiện MS/MS

Để tối ưu hóa điều kiện MS/MS cho từng độc tố và cuối cùng đưa ra được các thông điều kiện mà tối ưu cho cả 3 chất phân tích, chúng tôi bơm hỗn hợp 3 chất chuẩn của PSP gồm STX, GTX-1, NEO 100ng/mL vào detector khối phổ để khảo sát Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lượng và định tính của từng chất

 Các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion

+ IS (IonSpray Voltage): Thế ion hóa, thế này được áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phân phân tích ion Thế này sẽ quyết định loại ion chuyển đến bộ phận phân tích khối Đối với loại ion dương 4000 – 5500V, ion âm (-) 3000- (-)4000V

+ GS1 (Ion Source Gas 1): Tạo áp suất khí hai bên đầu phun, có tác dụng làm cho sự hình thành nên các giọt được dễ dàng hơn Tốc độ khí của Gas 1 thường cao hơn so với Gas 2

+ TEM ( Temperature): Nhiệt độ của nguồn khí nóng thổi vào (Gas2) Nó thúc đẩy quá trình hóa hơi các giọt chất phân tích khi đi ra khỏi đầu phun

+ GS2 (Ion Source Gas 2): Tạo áp suất của luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình làm bay hơi dung môi, tăng hiệu quả của quá trình ion hóa

+ CUR (Curtain Gas): Luồng khí N2 tinh khiết được thổi vào khe giữa 2 màn chắn của bộ phận ion hóa và bộ phận phân tích phổ Nó có tác dụng đẩy các giọt dung môi và các phân tử trung hòa, để giữ cho Q0 (nguồn ion mẹ ) sạch hơnCác thông số của bộ phận phân phân tích khối:

+ DP, CE, CXP như đã giải thích ở trên

+ EP (Entrance Potential): Thế áp vào Q0

+ CAD (Collision Gas Pressure): Kiểm soát áp suất khí N2 trong bộ tứ cực Q2, thúc đẩy quá trình phân mảnh thứ cấp, ngoài ra còn có tác dụng làm mát các ion con và hướng chúng đến bộ tứ cực Q3

 Tự động khảo sát các thông số sau:

+ IS (V): 4000; 4500; 5000; 5500

+ TEM (oC) : 350; 400;450; 500

+ GS1 (psi):; 10;15; 25; 30

+ GS2 (psi): 8,0; 9,0; 10,0; 25; 30