Nghiên cứu vi khuẩn lactic phân lập từ một số sản phẩm lên men

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng việc lên men bằng vi sinh vật để chế biến và bảo quản thực phẩm. Công nghệ lên men thực phẩm đã được khởi xướng cách đây ít nhất 6000 năm (Hol zapfef, 2000). Lên men lactic là một trong những ứng dụng vi sinh vật đầu tiên mà con người phát hiện được, người ta đã sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến và bảo quản sữa, thịt, cá, các loại rau, quả, … Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, hình cầu hay hình que, chúng lên men đường tạo ra sản phẩm chính là axit lactic. Trong quá trình lên men ngoài axit lactic chúng còn tạo ra các sản phẩm khác như các axit hữu cơ, diacetyl, enzyme, ester, … làm tăng hương vị, màu sắc, kết cấu, giá trị dinh dưỡng của sản phẩm. Một số chủng vi khuẩn lactic sản sinh ra bacterioxin có khả năng kháng lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh và được ứng dụng như một chất để bảo quản thực phẩm. Bên cạnh ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như trong y học, trong chăn nuôi để ủ chua thức ăn cho gia súc, trong các ngành công nghiệp hoá chất, vật liệu, dệt, xử lý môi trường, ... Hệ vi khuẩn lactic chủ yếu có trong các sản phẩm lên men như dưa chua, sữa chua, nem chua, tré, tôm chua, một số sản phẩm lên men tiêu hoá đông khô, … Các sản phẩm lên men, đặc biệt là sản phẩm lên men truyền thống phụ thuộc chủ yếu vào hệ vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu, dụng cụ, môi trường bên ngoài, tay nghề của người chế biến … làm cho chất lượng sản phẩm không ổn định. Việt Nam là nước có nền văn hoá ẩm thực phong phú và hấp dẫn, đặc biệt là các sản phẩm lên men truyền thống. Tuy nhiên việc sản xuất chủ yếu theo phương pháp thủ công nên chất lượng sản phẩm chịu ảnh hưởng của yếu tố bên ngoài rất nhiều. Do đó, nghiên cứu để tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn lactic có khả năng lên men mạnh sẽ góp phần làm nâng cao và ổn định chất lượng sản phẩm. Để góp phần nhỏ trong hướng nghiên cứu vi khuẩn lactic làm cơ sở cho việc nâng cao chất lượng của các sản phẩm lên men truyền thống, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu vi khuẩn lactic phân lập từ một số sản phẩm lên men”. Qua đó, bước đầu phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh axit lactic mạnh, khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men của chúng, từ đó có thể ứng dụng để sản xuất một số sản phẩm lên men.

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng việc lên men bằng vi sinh vật để chếbiến và bảo quản thực phẩm Công nghệ lên men thực phẩm đã được khởi xướngcách đây ít nhất 6000 năm (Hol zapfef, 2000) Lên men lactic là một trong nhữngứng dụng vi sinh vật đầu tiên mà con người phát hiện được, người ta đã sử dụng

vi khuẩn lactic để chế biến và bảo quản sữa, thịt, cá, các loại rau, quả, …

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, hìnhcầu hay hình que, chúng lên men đường tạo ra sản phẩm chính là axit lactic.Trong quá trình lên men ngoài axit lactic chúng còn tạo ra các sản phẩm khácnhư các axit hữu cơ, diacetyl, enzyme, ester, … làm tăng hương vị, màu sắc, kếtcấu, giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Một số chủng vi khuẩn lactic sản sinh rabacterioxin có khả năng kháng lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh và được ứngdụng như một chất để bảo quản thực phẩm Bên cạnh ứng dụng trong công nghệthực phẩm, vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhaunhư trong y học, trong chăn nuôi để ủ chua thức ăn cho gia súc, trong các ngànhcông nghiệp hoá chất, vật liệu, dệt, xử lý môi trường,

Hệ vi khuẩn lactic chủ yếu có trong các sản phẩm lên men như dưa chua,sữa chua, nem chua, tré, tôm chua, một số sản phẩm lên men tiêu hoá đông khô,

… Các sản phẩm lên men, đặc biệt là sản phẩm lên men truyền thống phụ thuộcchủ yếu vào hệ vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu, dụng cụ, môi trường bênngoài, tay nghề của người chế biến … làm cho chất lượng sản phẩm không ổnđịnh Việt Nam là nước có nền văn hoá ẩm thực phong phú và hấp dẫn, đặc biệt

là các sản phẩm lên men truyền thống Tuy nhiên việc sản xuất chủ yếu theophương pháp thủ công nên chất lượng sản phẩm chịu ảnh hưởng của yếu tố bênngoài rất nhiều Do đó, nghiên cứu để tuyển chọn ra những chủng vi khuẩn lactic

có khả năng lên men mạnh sẽ góp phần làm nâng cao và ổn định chất lượng sảnphẩm

Để góp phần nhỏ trong hướng nghiên cứu vi khuẩn lactic làm cơ sở choviệc nâng cao chất lượng của các sản phẩm lên men truyền thống, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu vi khuẩn lactic phân lập từ một số sản phẩm lên

men” Qua đó, bước đầu phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn

lactic có khả năng sản sinh axit lactic mạnh, khảo sát một số điều kiện ảnh hưởngđến quá trình lên men của chúng, từ đó có thể ứng dụng để sản xuất một số sảnphẩm lên men

Phần 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I VI KHUẨN VÀ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN

Vi khuẩn (Bacteria) là một trong ba nhóm của vi khuẩn thật (Eubacteria)thuộc vi sinh vật nhân nguyên thuỷ (Prokaryotes)

Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau.Đường kính của vi khuẩn thay đổi trong khoảng 0,2 - 2,0 µm, chiều dài cơ thểkhoảng 2,0 - 8,0 µm Vi khuẩn có nhiều hình dạng như hình cầu, hình que, hìnhdấu phẩy, hình xoắn, hình có cuống, hình có sợi, … Ngoài ra, còn có thể gặp cáchình dạng khác của vi khuẩn như hình khối vuông, khối tam giác, khối ngôi sao,

… Hình thái và cách sắp xếp tế bào là một trong những tiêu chuẩn để phân loại vikhuẩn [11, 20]

Mỗi tế bào vi khuẩn đều có kích thước rất nhỏ bé và rất nhẹ (Escherichia coli có kích thước 2,0 x 0,5µm) [11].

Tế bào của vi khuẩn được bao bọc bởi thành tế bào với thành phần đặctrưng là peptidoglycan Dựa vào cấu trúc và thành phần hoá học của thành tế bào

mà vi khuẩn được chia làm 2 loại là vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.Thành tế bào giúp duy trì hình dạng, bảo vệ tế bào đối với một số điều kiện bấtlợi Ở một số vi khuẩn bên ngoài thành tế bào còn có một lớp bao nhầy hay còngọi là giáp mạc Đó là một lớp vật chất dạng keo có độ dày nhất định Thànhphần chủ yếu của bao nhầy là polisaccharit ngoài ra còn có polipeptit và protein[1, 7]

Màng tế bào của vi khuẩn đựoc cấu tạo bởi 2 lớp photpholipid và cácprotein nằm ở phía trong, phía ngoài hay xuyên màng Màng tế bào của vi khuẩncấu tạo theo mô hình khảm lỏng [11]

Bên trong màng tế bào vi khuẩn là tế bào chất Tế bào chất là phần vậtchất dạng keo có chứa các protein, acid nucleic, hydratcacbon, lipid, ribosome

70S, …Trong tế bào chất của vi khuẩn còn có thể gặp các chất dự trữ ( hạtglycogen, hạt PHB (poly - β - hydroxybutyrate), …), hạt cacboxixom, … [1]

Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nênkhông có hình dạng cố định Đó là một nhiễm sắc thể duy nhất dạng vòng chứamột sợi AND xoắn kép còn gắn với màng tế bào chất Nhiều vi khuẩn còn chứaAND ngoài nhiễm sắc thể Đây là những sợi AND xoắn kép, dạng vòng kín, cókhả năng sao chép một cách độc lập và gọi là plasmid Thể nhân là cơ sở vật chấtchứa thông tin di truyền của vi khuẩn [11]

Một số vi khuẩn có khả năng di chuyển là nhờ chúng có các tiên mao.Tiên mao là những sợi lông dài được cấu tạo bởi các phân tử protein là flagellin,mọc ở mặt ngoài vi khuẩn Không phải mọi vi khuẩn đều có tiên mao Tiên maoquyết định khả năng và phương thức di động của vi khuẩn Số lượng và vị trí gắncủa tiên mao trên tế bào vi khuẩn có giá trị trong phân loại vi khuẩn Ở một số vikhuẩn có khuẩn mao (tiêm mao, nhung mao) là những sợi lông rất mảnh, rất ngắnmọc quanh bề mặt vi khuẩn; chúng có tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể

Có một loại khuẩn mao đặc biệt gọi là khuẩn mao giới tính, chúng có thể nối liềngiữa hai vi khuẩn và làm cầu nối để truyền vật chất di truyền từ thể cho sang thểnhận [11, 20, 43]

Vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng rất lớn, tốc độ này phụ thuộc vào điều kiệndinh dưỡng, nhiệt độ, mức độ hiếu khí và nhiều yếu tố khác Một số vi khuẩn vàocuối thời kì sinh trưởng phát triển sẽ sinh ra trong tế bào một thể nghỉ có dạnghình cầu hay hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử Mỗi tế bào chỉ hìnhthành một bào tử do đó bào tử của vi khuẩn không phải là cơ quan sinh sản mà cóthể coi như một hình thức bảo vệ đặc biệt hay hình thức sống tiềm sinh, chuyển

từ trạng thái hoạt động sang trạng thái nghỉ Chỉ có một số chi vi khuẩn có khả

năng sinh bào tử như Clostridium, Bacillus, Sporasarcina, Desulfotomaculum, …

[1]

Vi khuẩn sinh sản chủ yếu theo phương thức sinh sản vô tính bằng cáchtrực phân, từ một tế bào mẹ cho ra hai tế bào con Ngoài ra một số loài vi khuẩn

cũng tồn tại phương thức sinh sản hữu tính nguyên thuỷ, hai tế bào có sự khácbiệt nhau về di truyền tiếp hợp với nhau đưa tới sự tái tổ hợp di truyền [11, 25].

II VI KHUẨN LACTIC

1 Sơ lược về tình hình nghiên cứu vi khuẩn lactic

Quá trình lên men axit lactic để chế biến, bảo quản thực phẩm cũng được

sử dụng từ lâu Axit lactic lần đầu tiên được tách ra từ sữa bò lên men bởi nhàhoá học Thuỵ Điển Scheele vào năm 1780

Năm 1875 Pasteur đã chứng minh việc làm chua sữa là kết quả hoạt độngcủa một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic [11]

Đến năm 1878 Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và

đặt tên là bacterium lactis (hiện nay gọi là Streptococcus lactis) và từ đó nhiều

loài vi khuẩn lactic khác nhau đã được phân lập Công nghiệp lên men sản xuấtaxit lactic có thể nói đã được hình thành từ năm 1881 [11]

Năm 1919, Orla-Jensen là người đầu tiên nghiên cứu và phân loại có hệthống vi khuẩn lactic [33]

Sau này rất nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về vi khuẩn lactic trong cácsản phẩm khác nhau như thịt, rượu vang, sữa, …

Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic và những ứng dụng của chúngtrên thế giới và trong nước

Năm 2011, Sook Jong Rhee và cộng sự nghiên cứu về tầm quan trọng của

vi khuẩn lactic trong thực phẩm lên men châu Á [38]

Năm 2007, Nguyễn Thế Trang, Trần Đình Mấn đã nghiên cứu ứng dụng

của chủng Pediococcus pentosaceus HN02 để sản xuất chế phẩm bảo quản cá

[13]

Năm 2008, Nguyễn Thế Trang và Trần Đình Mấn nghiên cứư về đặc điểmphân loại của hai chủng vi khuẩn lactic HN11 và HN34 sinh tổng hợp L+(-) axitlactic phân lập tại Việt Nam [14]

Năm 2008, Mai Đàm Linh và cộng sự đã nghiên cứu đặc điểm sinh họccủa các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn Hà Nội [8]

Năm 2011, Nguyễn Hoài Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọnmột số chủng vi khuẩn lactic từ nem chua truyền thống để làm giống khởi độngnem chua probiotic [12]

Năm 2012, Nguyễn Thi Diễm Hương, Đỗ Thị Bích Thuỷ đã nghiên cứu

một số tính chất có lợi của chủng Lactobacillus fermentum DC1 phân lập từ sản

phẩm dưa cải Huế [15]

Hiện nay một hướng trong nghiên cứu vi khuẩn lactic là nghiên cứu khảnăng tạo thành chất kháng khuẩn để ứng dụng chúng trong sản xuất probiotic

2 Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic

Trong tự nhiên vi khuẩn lactic thường gặp trong đất, không khí, nướcnhưng chủ yếu ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm như: các loại rau quả, thịt,

sữa, các sản phẩm của sữa, Các loài Lactobacillus còn tìm thấy ở dạ dày, ruột

non, ruột già và âm đạo

Các vi khuẩn lactic không giống nhau về mặt hình thái nhưng về mặt sinh

lý chúng có chung những đặc điểm đặc trưng Các vi khuẩn lactic được xếp vào

Vi khuẩn lactic đều là những vi khuẩn Gram dương, không tạo thành bào

tử (kể cả Sporolactobacillus inulinus) và hầu hết không di động Tế bào vi khuẩn

lactic không chứa cytocrom và enzyme catalase tuy nhiên chúng vẫn có thể sinhtrưởng khi có mặt oxigen Vi khuẩn lactic là bọn sống từ kị khí tới vi hiểu khí[11]

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khá phức tạp Không một đại diệnnào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiếtchứa glucose và NH4+ Đa số chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin, tiamin,axit pantotenic, iotin, …) và các amino axit Vì vậy môi trường nuôi cấy vi khuẩnlactic khá phức tạp Vi khuẩn có khả năng lên men tạo axit lactic bằng cách phângiải nguồn hydrat cacbon có trong môi trường [1,11]

Vi khuẩn lactic có khả năng trao đổi chất kém Có thể là do hậu quả của sựchuyển hoá sinh trưởng trong sữa hoặc trên môi trường giàu chất dinh dưỡng vàchất sinh trưởng chúng đã mất đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đổi Tuynhiên chúng lại có khả năng mà đa số các vi khuẩn khác không có , đó là khảnăng sử dụng lactose Việc sử dụng được lactose cũng có thể được xem như một

sự thích nghi với các điều kiện tồn tại trong đường ruột của động vật có vú [1]

3 Cơ chế của quá trình lên men vi khuẩn lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hoá kị khí đường với sự tích luỹ axitlactic trong môi trường Có hai kiểu lên men lactic là lên men lactic đồng hình vàlên men lactic dị hình

3.1 Lên men lactic đồng hình

Quá trình lên men lactic đồng hình tạo ra sản phẩm chủ yếu là axit lacticPhương trình chung của quá trình lên men:

Một số loài vi khuẩn lên men đồng hình: Lactococus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricum (thường được sử dụng làm giống khởi động trong lên men sữa), Pediococcus sp (thường sử dụng trong lên men xúc xích), Tetragenococcus (dùng

trong lên men nước đậu nành), … [10, 36]

C6H12O6

CH3CHOHCOOH

Hình 1.1 Quá trình lên men đồng hình

3.2 Lên men lactic dị hình

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men kị khí phức tạp hơn nhiều sovới lên men lactic điển hình Ngoài acid lactic chúng còn tạo ra trong môi trườngcác sản phẩm phụ như acid acetic, rượu ethylic, CO2, H2O, một số chất thơm nhưeste, điacetyl…[7]

Phương trình của quá trình lên men:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + CO2

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme của con đường EMP(aldolase, triosophotphate isomerase) nên giai đoạn đầu của sự phân giải xảy ratheo con đường pentosephosphate, tức là qua glucose - 6 - phosphate, 6 -phosphogluconat và ribulose-5-phosphate Chất này nhờ một epimease đượcchuyển thành xilulose - 5 - phosphate Sau đó dưới tác dụng của phosphoketolasephân giải xilulose - 5 - phosphate thành gliceraldehyde - 3 - phosphate (AlPG) vàacetylphosphate AlPG sẽ bị oxi hoá thành axit lactic, quá trình này xảy ra giốngnhư trong sự lên men đồng hình; còn acetylphosphate có thể chuyển hoá thànhethanol và acid acetic [11]

Một số loài vi khuẩn lên men lactic dị hình: L mesenteroides subsp cremoris, Leuconostoc lactis (trong lên men sữa), Leuconostoc kimchii ( dùng trong lên men rau), Oenococcus oeni (sử dụng trong lên men rượu), Lactobacillus sanrancis-censis (được sử dụng trong lên men bánh mì), … [36]

AlPG Pyruvate Lactate

Glucose Xilulose-5P Pentosophosphoketolase

Acetaldehyde Ethanol Acetyl-P Acetyl-ScoA

Axit acetic

Hình 1.2 Quá trình lên men lactic dị hình

* Lên men lactic dị hình ở Bifidobacterium: Vi khuẩn lactic dị hình

Bifidobacterium bifidum có dạng chữ V hay chữ Y (bifidus tiếng Hi Lạp có nghĩa

là bị chia đôi, bị phân cắt), là thành viên trong khu hệ đường ruột của trẻ sơ sinh,

trước hết là các trẻ nuôi bằng sữa mẹ Vi khuẩn này cần N-acetilglucosemin chỉ

có trong sữa người mà không có trong sữa bò Các đại diện thuộc chiBifidobacterium là những vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt, không chịu khí và cầnmột khí quyển chứa CO2 (10% CO2) để sinh trưởng Bifidobacterium chuyển hóaglucose theo phương trình:

2 C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH + 3 CH3COOH

Bifidobacterium lên men glucose qua con đường phụ phosphoketolase,không chứa aldolase cũng như glucose-6-phosphat-dehydrogenase, song lại chứacác phosphoketolase hoạt động, phân giải fructose-6-phosphat và xilulose - 6-phosphat thành acetylphosphate và eritro-4-phosphate hoặc glixeraldehyde-3-phosphate Glixeraldehyde-3-phosphate sẽ tiếp tục biến đổi để tạo thành axitlactic [1]

4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ngoài đảm bảo đầy đủ các chất dinhdưỡng mà còn phải không chứa các độc tố và cho hiệu suất thu hồi sản phẩm lớn.Mỗi nguồn dinh dưỡng không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn màcòn ảnh hưởng không nhỏ đến sự thu hồi sản phẩm và bảo quản chế phẩm sinhkhối sau này

Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng khá phức tạp Mỗi loại vi khuẩnlactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau Quá trình lên men lacticcủa vi khuẩn lactic chịu tác động của nhiều yếu tố như: nguồn carbon, nguồnnitrogen, pH, nhiệt độ, hàm lượng NaCl, thời gian nuôi cấy, …

4.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng phát triểncũng như quá trình tạo ra axit lactic của vi khuẩn lactic Lựa chọn thời gian phùhợp sẽ thu được lượng axit lớn nhất

4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vikhuẩn Mỗi loài vi sinh vật có yêu cầu nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển củachúng Vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ phát triển khá rộng từ 10oC - 40oC.Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều làm ức chế hoạt động của các enzyme, làmđình trệ các phản ứng trao đổi chất, ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và pháttriển của vi khuẩn Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ tối thích trong khoảng 25oC

- 35oC, loại ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40oC - 45oC, loại ưa lạnh có thể pháttriển ở nhiệt độ 5oC Khi gia nhiệt từ 60oC - 80oC thì hầu hết các vi khuẩn lactic

bị chết sau 10 - 30 phút

Nhiệt độ lên men ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và chất lượngsản phẩm Ở nhiệt độ 0 - 4oC sự lên men lactic không bị đình chỉ mà diễn rachậm Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại vi khuẩn là 35 - 42oC nhưng nhiệt độ nàycũng kích thích hoạt động của nhiều sinh vật lạ

4.3 Ảnh hưởng của pH

Mỗi loài vi sinh vật có một pH thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển.Các loài vi khuẩn lactic khác nhau có khả năng tạo thành axit lactic khác nhaunên khả năng chịu axit cũng khác nhau tuỳ loại Vi khuẩn lactic có thể phát triểntrong khoảng pH từ 4,4 - 9,3 Trong quá trình lên men tạo ra axit lactic làm cho

pH của môi trường giảm Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men lactic, axitlactic sinh ra có tác dụng ức chế các vi sinh vật khác nhưng sau đó khi hàm lượngaxit lactic quá lớn sẽ gây ức chế chính vi khuẩn lactic Tốc độ phát triển cũngnhư lượng sản phẩm trao đổi chất sẽ giảm khi axit lactic tạo ra quá nhiều Vì vậy,trong quá trình sản xuất người ta luôn điều chỉnh pH về khoảng tối ưu để vikhuẩn lactic phát triển Mỗi loại vi khuẩn lactic có các khoảng pH tối thích khác

nhau, dao động trong khoảng 4,5 - 6,5 Lactobacillus có pH tối ưu 5,6 - 6,2, Pediococcus 5,5 -6,5, pH < 4 vi khuẩn lactic ngừng hoạt động (Trần Minh Tâm,

1998) Ngoài ra, một số loài có thể phát triển trong môi trường axit mạnh hoặc

kiềm mạnh như loài Lactobacillus fermentum có thể chịu được pH =3 Theo

Giraud và công sự (1991), đối với vi khuẩn Lactobacillus plantarum A6, sự giảm

pH sẽ làm giảm sự chuyển hoá cơ chất

4.4 Ảnh hưởng của oxygen

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kị khí không bắt buộc Do đó, oxi không ảnhhưởng lớn đến quá trình lên men lactic tuy nhiên trong điều kiện thiếu oxi thì vikhuẩn lactic hoạt động tốt hơn, quá trình lên men lactic thuận lợi hơn (Trần MinhTâm, 1998) Sự hiện diện của oxygen sẽ làm tăng hoạt động của các vi khuẩn gâythối và các vi khuẩn khác làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm Vì vậy, quátrình lên men lactic thường được tiến hành trong điều kiện kị khí

4.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Cacbon là nguyên tố đóng vai trò quan trọng đối với mọi sinh vật Nguồncacbon được dùng để tham gia cấu tạo nên tế bào vi sinh vật vừa cung cấp nănglượng cho hoạt động sống của chúng Vi khuẩn lactic phân giải các hyđrat carbontạo ra axit lactic Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat carbon như:glucose, fructose, galactose, các loại đường đôi (saccharose, lactose, mantose),các polysaccharit (tinh bột, detrin, …) Nguồn carbon tốt nhất là cácmonosaccharit và disaccharit Khả năng gây lên men và tốc độ lên men các loại

đường ở các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì khác nhau Streptococcus lactis

lên men được glucose, lactose, galactose, maltose, dextrin mà không lên men

được saccharose Streptococcus cremoris lên men lactose tạo thành axit lactic

nhưng không lên men được saccharose, maltose và dextrin [21]

4.6 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Nitrogen cũng là một trong những nguyên tố đóng vai trò quan trọng đốivới mọi sinh vật, chúng là thành phần của protein, acid nucleic, … do đó nitrogen

có vai trò hêt sức quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của các vikhuẩn Mỗi loài vi khuẩn lactic có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Đa phần các

vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ

nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ một số ít loài vikhuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ như

Lactobacillus helveticus Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ

dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơphức tạp có chứa nitơ như cao thịt, cao nấm men, pepton, casein, …

4.7 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Dung dịch muối ăn ở nồng độ cao sẽ ức chế hoạt động của vi sinh vật lạcũng như vi khuẩn lactic Khi tiến hành muối chua ra quả cần phải tạo điều kiệncho vi khuẩn lactic phát triển và ức chế các vi sinh vật khác Do vậy cần sử dụngnồng độ muối không quá cao thường sử dụng muối ăn nồng độ 4-6% hoặc nướcmuối với nồng độ 6-10%

5 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic

Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic không chỉ tạo ra axit lactic màcòn tạo ra nhiều hợp chất hữu cơ khác như điacetyl, các axit hữu cơ, bacteriocin,các enzyme,… Các hợp chất này cho thực phẩm có màu sắc, mùi vị, hương thơmhấp dẫn và có thể chống lại một số vi khuẩn gây bệnh, gây hư hỏng giúp kéo dàithời gian bảo quản Do đó, vi khuẩn lactic đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vựckhác nhau: công nghiệp, nông nghiệp, y học, thực phẩm, môi trường, …

5.1 Trong công nghiệp

Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu axit lactic Axit lactic có vịchua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nướcuống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt Axit lactic còn dùng để sản xuất thức ănkiêng, thức ăn chống suy dinh dưỡng cho người già và trẻ em, … Nguyên liệudùng trong sản xuất axit lactic là mật bột, tinh bột và những nguyên liệu chứatinh bột (Lương Đức Phẩm, 2002) Trong công nghiệp để sản xuất axit lactic và

các loại lactat, người ta thưởng sử dụng loài vi khuẩn L delbruckii và loài L.

coagulans Hai loài vi khuẩn này đều thuộc loại vi khuẩn ưa nhiệt và có khả năng

tích luỹ nhiều axit lactic

Vi khuẩn lactic là một trong hai nhóm liên quan đến sản xuất rượu vang

đỏ và trắng (Nannelli et al., 1008) Chúng thường được dùng làm giống khởi

động để lên men rươu Vi khuẩn lactic đặc biệt là Oenococcus oeni (trước đây là Leuconostoc oenos) thực hiện quá trình lên men thứ cấp hoặc lên men malolactic

bằng cách decacboxyl axit L-malic thành axit L-lactic và CO2 Phản ứng nàycùng với hàng loạt các phản ứng khác xảy ra biến đổi hoàn toàn nước ép nhothành rượu [33] Trong một vài nghiên cứu trên dịch nước nho các tác giảFendant và Dole; Maret và Sozzi (1977,1979); Maret và sộng sự (1979) đã ghinhân lại sự có mặt của các loại vi khuẩn lactic lên men đồng hình thuộc giống

Lactobacillus (Lactobacillus pantarum, Lactobacillus casei) và một số vi khuẩn lên men dị hình (Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, …)

Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da,dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo [22]

5.2 Trong nông nghiệp và môi trường

Vi khuẩn lactic được dùng để ủ chua thức ăn gia súc Nhờ ủ chua mà thức

ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi mà vẫn không bị hao hụt về mặt chấtlượng dinh dưỡng Về mặt vitamin thì thức ăn sau khi ủ chua lại giàu vitaminhơn so với trước khi ủ Để tạo điều kiện cho lên men lactic xảy ra, lá các loại câylấy củ hoặc cỏ được nén chặt trong các hầm ủ, thêm rỉ đường để nâng cao tỉ lệC/N và tạo độ chua ban đầu bằng cách thêm axit formic hay axit vô cơ [11]

Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấmgây bệnh quan trọng trong nông nghiệp

Chế phẩm EM (effective microogranism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu

nó bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự đóng góp của vi khuẩn lactic Chếphẩm này có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ônhiễm môi trường

Vi khuẩn lactic còn được sử dụng để cải thiện nguồn nước ở các ao nuôitôm.

Vi khuẩn lactic được sử dụng để sản xuất probiotic giúp chữa một số bệnhcho con người Các tác dụng có lợi của thực phẩm có bổ sung các vi khuẩn sống(probiotic) đến sức khoẻ của con người, đặc biệt là các sản phẩm sữa cho trẻ emđang ngày càng được nghiên cứu bởi các chuyên gia y tế Các chế phẩm sinh học

có khả năng miễn dịch, chức năng tiêu hoá, hô hấp và có thể có tác động dáng kểtrong việc giảm bệnh truyền nhiễm ở trẻ em [37]

Một số ứng dụng của probiotic như: chống lại Helicoacter pylori - một tácnhân gây bệnh viêm dạ dày B, viêm tá tràng, ung thư dạ dày Một số thí nghiệmtrên động vật cho thấy rằng vi khuẩn lactic có thể ức chế sự tăng trưởng của tácnhân gây bệnh và giảm hoạt động của enzyme urease cần thiết cho các tác nhângây bệnh ở lại môi trường axit của dạ dày (Midolo và cộng sự, 1995; Kabir et al,1997; Aiba và cộng sự, 1998; Coconnier và cộng sự, 1998)

Một số bằng chứng sơ bộ cho thấy probiotic có thể ngăn ngừa hoặc trìhoãn sự khởi đầu của bệnh ung thư, điều trị tim mạch, giảm cholesterol trongmáu Chế phẩm probiotic còn có thể chữa bệnh viêm âm đạo do vi khuẩn [37]

5.4 Trong bảo quản và chế biến thực phẩm

Trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm, vi khuẩn lactic được sửdụng khá rộng rãi để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau như dưa chua, sữachua, nem, tré, xúc xích, pho mat, …

Việc bảo quản sữa bằng quá trình lên men đã được con người sử dụng từrất sớm trong lịch sử Thịt lên men đã được tạo ra từ thế kỉ 15 trước công nguyên

ở Babylon và Trung Quốc Phương pháp lên men rau được biết ở Trung Quốc vàthế kỷ thứ ba trước công nguyên

Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng đểlàm dưa chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả Trongmuối chua rau quả, trong điều kiện yếm khí, lên men lactic sẽ xảy ra một cách tự

nhiên, lúc đầu bởi Leuconostoc với sự tạo thành CO2 và về sau có sự tham

gia của Lactobacillus plantarum.

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rất phổ biến trong sản xuất sữa và các sảnphẩm từ sữa như: sữa chua, igaua, kefia, pho mat, … Để sản xuất sữa chuangười ta thường sử dụng một số loài vi khuẩn sinh axit lactic như:

Lactobacterium bulgaricus, L acidophilum, Streptococcus lactis hay S cremoris và một lượng vi khuẩn sinh hương như Streptococcus diacetylacis, Betacoccus citrovorus Một loại iagua đặc biệt có tên là sữa aciđophilus được sản xuất nhờ Lactobacillus acidophilus Trong sản xuất kefia và kumis người ta thường sử dụng vi khuẩn Streptococcus lactis và Lactobacillus caucaticus [1]

Một số loài vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh bacterioxin nên trongngành công nghiệp thực phẩm đã được ứng dụng nhiều Khả năng sinh tổng hợpbacteriocin của vi khuẩn lactic được biết nhiều ở một số chủng thuộc chiLactococcus, Pediococcus, Enterococcus, Lactobacillus, … Một số bacteriocin đã

và đang được nghiên cứu ứng dụng trong bảo quản các sản phẩm để chống lại

các vi khuẩn tạp nhiễm như Listeria, Clostridia, Bacillus spp., … [39] Hiện nay nisin là một bacteriocin được tổng hợp bởi Lactococcus lactis susp Vi khuẩn

lactic được ứng dụng rộng rãi nhất trong bảo quản thực phẩm

Bảng 1 Một số thực phẩm lên men ở châu Á [38]

Sản phẩm Quốc gia Nguyên liệu chính Vi sinh vật Cách sử dụng Hình thức / Bánh mì, mì lên men

Sri Lanka

Gạo Black gum

L mesenteroides

S faecalis

Làm phồng bánh

Bột mì

Thái Lan, Hàn Quốc, Nhật Bản

Rau lên men

Bắp cải Hàn Quốc, củ cải, một

số loại rau khác, muối

L mesenteroides

Lb brevis,

Lb plantarum

Salad, món ăn kèm

Lb plantarum

Salad, món ăn kèm

Burong

Lb brevis Pediococcus cerevisiae

Salad, món ăn kèm

Thịt và cá lên men

gạo, muối

Lb brevis, Streptococcus sp. Món ăn kèm

P cerevisiae,

Lb plantarum

Lb brevis

Thịt lợn gói trong lá chuối

Phần 2

ĐỐI TƯỢNG - THỜI GIAN - PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

I ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Một số chủng vi khuẩn lactic được phân lập các sản phẩm lên men như:

- Nước dưa chua: tự làm và mua ở chợ Tây Lộc

- Nem chua :

- Tôm chua: Bà Mai, Cao Bá Quát

- Sữa chua Vinamilk : Cửa hàng giới thiệu và bán sản phẩm Vinamilk, 168Nguyễn Trãi

- Tré: cửa hàng Đông Ba, 25 Đào Duy Anh

II THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Từ tháng 2/2013 đến tháng 5/2013

III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Phân lập và đếm số lượng tế bào

1.1 Môi trường phân lập [10,19,27]

Để phân lập vi khuẩn lactic chúng tôi sử dụng môi trường MRS agar bổsung thêm CaCO3

Môi trường sau khi pha chế được phân vào các bình tam giác và khử trùng

ở 1atm trong 20 phút Sau khi khử trùng, phân phối môi trường vào các hộp Petri

đã khử trùng trong tủ cấy vô trùng

Dùng pipette vô trùng (loại 1 ml) hút mẫu ở các độ pha loãng nhỏ vào bềmặt thạch đĩa chữa sẵn môi trường (lượng mẫu cho vào đĩa có thể là một giọt haymột lưưọng cụ thể) Dùng que gạt dàn đều mẫu trên bề mặt thạch Mỗi nồng độpha loãng cấy lên 3 đĩa Petri Sau đó bao gói cẩn thận và nuối cấy trong tủ ấm ởnhiệt độ 30oC trong 48 giờ Sau thời gian nuôi cấy chọn những khuẩn lạc mọcriêng rẽ và có tạo vòng trong suốt ở xung quanh để cấy chuyền sang ống thạchnghiêng Sau khi ống giống mọc tốt giữ giống trong điều kiện lạnh

1.3 Tính số lượng tế bào vi sinh vật [10, 19]

Xác định số lượng tế bào vi sinh vật trong 1g hoặc 1 ml mẫu bằng phươngpháp xác định gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạchđĩa

- Số lượng vi khuẩn trong 1 g mẫu khô tuyệt đối được tính bằng côngthức:

CFU/g = M.a.10n /W

Trong đó:

CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colonie Forming Unit)

W: trọng lượng khô tuyệt đối của 1 g mẫu phân lập

a: số giọt pipete của 1 ml mẫu

M: số lượng khuẩn lạc trung bình/ hộp Petri

10n : độ pha loãng mẫu

- Số lượng vi khuẩn trong 1ml mẫu được tính theo công thức:

N = M.A.P

Trong đó:

N: số lượng tế bào vi sinh vật (CFU/ml)

M: số lượng khuẩn lạc trung bình trong một đĩa Petri

A: số giọt trong 1 ml mẫu

P: độ pha loãng

(Để tăng độ chính xác, giá trị M thường lấy trung bình cộng của 3, 5 hoặc

7 hộp Petri của cùng một độ pha loãng)

2 Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic [27,43]

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng phân giải CaCO3

Trong môi trường thạch đĩa MRS có bổ sung CaCO3, vi khuẩn lactic khisinh trưởng và phát triển tạo ra axit lactic sẽ phân giải CaCO3 tạo thành vòngtrong suốt xung quanh vạch cấy Vòng càng lớn thì khả năng sinh axit càngnhiều

* Tiến hành:

Từ những chủng phân lập được tiến hành cấy vạch từng chủng lên môitrường MRS có bổ sung thêm CaCO3 và nuôi trong 60 giờ ở nhiệt độ 30oC Sau

đó, tiến hành đo kích thước vạch cấy (d) và vạch phân giải (D) Hiệu số giữa D

và d phản ánh khả năng tạo axit lactic của mỗi chủng

3 Quan sát hình thái của vi khuẩn lactic

Tiến hành nhuộn đơn các chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn được, quansát dưới kính hiển vi ở vật kính X 100

4 Phương pháp định lượng axit lactic [10, 27]

Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên men, thêm 20ml nước cất và 1 - 2giọt phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N

Lượng axit lactic có trong 10ml dịch lên men được tính bằng cách lấy số

ml NaOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ nhân với 0,009 (1ml dung dịch NaOHtương đương với 0,009g axit lactic)

5 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo axit lactic của các chủng

vi khuẩn lactic đã tuyển chọn

5.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trongmôi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) Sau các khoảng thời gian: 12,

24, 36, 48, 60, 72,84, 96 giờ, ly tâm (4000 vòng/10 phút) thu dịch lên men đểxác định axit tổng tích luỹ trong môi trường và đo OD bằng máy quang phổ kế ởbước sóng 610 nm để xác định sinh khối tạo thành

5.2 Ảnh hưởng của pH môi trường

Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trongmôi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) ở các độ pH khác nhau: 4,0; 4,5;5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8 pH môi trường được pha bằng đệm Mc Ilvaine Nuôi cấytrong khoảng thời gian tối ưu ở trên, sau đó ly tâm (4000 vòng/10 phút) thu dịchlên men để xác định axit tổng tích luỹ trong môi trường và đo OD bằng máyquang phổ kế ở bước sóng 610 nm để xác định sinh khối tạo thành

5.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon

Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trongmôi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) với các nguồn cacbon: glucose,fructose, lactose, saccharose, tinh bột, CMC, rỉ đường Nuôi cấy các chủng vikhuẩn trong khoảng thời gian và pH tối ưu, sau đó ly tâm (4000 vòng/10 phút)

để thu dịch lên men để xác định axit tổng tích luỹ trong môi trường và đo ODbằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610 nm để xác định sinh khối tạo thành.

5.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen

Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trongmôi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) với các nguồn nitrogen khácnhau: peptone, cao thịt, ure, KNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO2 Nuôi cấy cácchủng vi khuẩn trong khoảng thời gian và pH tối ưu, sau đó ly tâm (4000vòng/10 phút) để thu dịch lên men để xác định axit tổng tích luỹ trong môitrường và đo OD bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610 nm để xác định sinhkhối tạo thành

5.5 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl

Tiến hành nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) các chủng vi khuẩn lactic trongmôi trường MRS dịch thể (tỉ lệ phối giống 10%) ở các nồng độ NaCl khác nhau:1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trongkhoảng thời gian và pH tối ưu, sau đó ly tâm (4000 vòng/10 phút) để thu dịchlên men để xác định axit tổng tích luỹ trong môi trường và đo OD bằng máyquang phổ kế ở bước sóng 610 nm để xác định sinh khối tạo thành

6 Xây dựng đồ thị chuẩn sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic

Nuối cấy vi khuản lactic trong môi trường MRS dịch thể trong 72 giờ Lytâm (4000 vòng/10 phút) thu lấy sinh khối Dùng cân phân tích cân chính xác 2g

Lấy 1g cho vào chén cân, đêm sấy khô đến trọng lượng không đổi giữ cáclần cân Tính trọng lượng khô tuyệt đối của 1 g sinh khối

1 g sinh khối còn lại pha loãng trong nước vô trùng ở các độ pha loãngkhác nhau để đo mật độ quang ở bước sóng 610nm

7 Xử lý số liệu

Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học bằng phần mênMicrosoft Office Excel 2007

Phần 3.

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

I PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC

1 Phân lập và xác định số lượng vi khuẩn lactic

Chúng tôi đã tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ 8 sản phẩm lên mentrên địa bàn thành phố Huế: nước dưa cải chua (tự làm, mua ở chợ), nem chua,tôm chua, nước củ cải muối chua, nước ớt chua, tré, sữa chua Vinamilk Tiếnhành phân lập các mẫu trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 và nuôi cấy ở

30oC trong 48 giờ Qua phân lập, chúng tôi đã tách được 75 chủng vi khuẩnlactic, kí hiệu là L1, L2, L3, …, L75 Tiến hành quan sát các khuẩn lạc vi khuẩnmọc trên môi trường thạch đĩa, chúng tôi nhận thấy khuẩn lạc vi khuẩn có nhữngdạng sau:

- Đa số khuẩn lạc có kích thước 0,5 - 1,5 mm, dạng tròn, trơn, láng, bờđều, nhô, màu trắng đục hoặc trắng sữa, một số khuẩn lạc có màu trắng tronghoặc vàng kem

- Ngoài ra, một số khuẩn lạc có kích thước 2 - 3 mm, tròn, trơn, màu trắngđục hoặc trắng sữa, một số ít khuẩn lạc có màu trắng trong hoặc màu kem

- Một số ít khuẩn lạc có kích thước khá lớn 3,5 - 4 mm, dạng tròn, màutrắng đục hoặc trắng trong, một số ít bờ không đều, khô

Các chủng vi khuẩn được cấy chuyền qua ống thạch nghiêng và bảo quảnlạnh ở 4 - 6oC để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Từ các mẫu nghên cứu, qua quá trình phân lập, chúng tôi đã xác địnhđược số lượng vi khuẩn lactic theo phương pháp ở mục 1.3 Kết quả được trìnhbày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Số lượng vi khuẩn lactic trong các mẫu sản phẩm lên men phân lập.

thu mẫu

Số lượng tế bào (CFU/g

CFU: Colonie Forming Unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

Từ kết quả ở bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy, trong 8 mẫu sản phẩm lên menphân lập, số lượng vi khuẩn có sự chênh lệch và khác biệt nhau rõ rệt, dao độngtrong khoảng 9,16.106 - 38,5.106

Nhìn chung, số lượng vi khuẩn trong các mẫu là khá lớn Trong đó, sốlượng vi khuẩn phân lập từ nước củ cải muối chua là lớn nhất 38,50.106 CFU/ml.Tiếp theo là mẫu nước dưa cải với số lượng vi khuẩn cũng rất lớn, 31,25.106

CFU/ml ở mẫu nước dưa cải tự làm và 29,17.106 CFU/ml ở mẫu nước dưa cảimua ở chợ Vì lên men lactic là quá trình chuyển hoá đường thành acid lactic nênhàm lượng đường có trong nguyên liệu đóng vai trò quan trọng Trong củ cảitrắng hàm lượng đường là khá cao 5,3% gồm các loại đường dễ hấp thụ (glucose,fructose) nên đây là điều kiện thuận lợi để vi khuẩn lactic phát triển Hàm lượngđường trong cải bẹ xanh cũng khá lớn khoảng 3% do đó mà số lượng vi khuẩntrong mẫu nước dưa tương đối cao Tuy nhiên trong 2 mẫu nước dưa cải thì mẫunước dưa tự làm lại có số lượng vi khuẩn lớn hơn so với mẫu nước dưa mua ởchợ Điều này có thể do trong mẫu nước dưa ở chợ, để kéo dài thời gian bảo quản

và làm cho sản phẩm có màu đẹp người ta đã bổ sung một số chất bảo quản vàchất tạo màu nên đã làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn lactic Trong các mẫulên men từ thực vật thì mẫu nước ớt chua có số lượng vi khuẩn thấp nhất 9,92.106

CFU/ml, nguyên nhân có thể do trong ớt lượng đường rất ít và do ớt có chấtcapcaisin gây cay nên không thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát triển.

So với các mẫu lên men từ thực vật thì các mẫu lên men từ động vật có sốlượng vi khuẩn thấp hơn Trong nem, tré, tôm chua thì acid lactic tạo ra là do quátrình lên men đường (cho vào khi chế biến) nhờ các vi khuẩn có trong nguyênliệu Số lượng vi khuẩn có trong nem chua là 27,08.106 CFU/g lớn hơn nhiều sovới tré là 14,46.106 CFU/g Điều này có thể do quá trình chế biến của 2 sản phẩmnày khác nhau, nem được làm từ thịt nạc tươi để lên men còn tré thì nguyên liệu

là thịt đầu heo đã qua sơ chế cùng với nhiều thành phần khác (tỏi, mè, riềng, …)nên số lượng vi khuẩn tồn tại trong tré cũng ít hơn nem

Sữa bò là nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng nên thuận lợi cho sự pháttriển của vi khuẩn lactic do đó số lượng vi khuẩn có trong mẫu sữa chuaVinamilk cũng ở mức cao 20,05.106 CFU/ml

Như vậy, số lượng vi khuẩn lactic từ các mẫu lên men khác nhau phụthuộc nhiều yếu tố, trong đó nguyên liệu ban đầu, kỷ thuật chế biến đóng vai tròquan trọng

2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh acid lactic mạnh

Để đánh giá khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic đãphân lập, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng vi khuẩn theo phương pháp cấyvạch trên môi trường thạch đĩa MRS có bổ sung CaCO3 (5 g/l) Những chủng vikhuẩn có khả năng sản sinh axit lactic sẽ tạo thành vòng trong suốt xung quanhkhuẩn lạc Khả năng sinh axit được xác định bằng hiệu số giữa vạch phân giải(D) và độ lớn của vạch cấy (d) Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Từ bảng kết quả 3.2 cho thấy, tỉ lệ số lượng các chủng vi khuản có khảnăng sinh acid ở cảc mức độ khác nhau chênh lệch nhau khá lớn Trong đó chủng

có khả năng sinh acid ở mức trung bình chiếm tỉ lệ lớn nhất 56 %, chủng có khảnăng sinh acid mạnh có tỉ lệ thấp nhất chỉ 8 %, các chủng sinh acid yếu chiếm36% và không có chủng sinh acid rất mạnh

Bảng 3.2 Khả năng sinh acid của các chủng vi khuẩn phân lập