KN bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 19671968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

Trang 1

HPLC

Trang 2

ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High performance liquid

chromatography-HPLC

Trang 3

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anhcủa phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High PerformanceLiquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc kýlỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở pháttriển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nayphương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá caonhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích

.Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm

đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nó

hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần

cho phép định tính và định lượng

Trang 4

1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử )

2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột :

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký

và lọai sắc ký

• Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận

hoặc pha đảo

• Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion.

• Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

• Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử.

Trang 5

Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột,chúng ta cần có một pha động

Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợpchất phân tích A,B,C Vào cột phân tích ,kết quả các chất

A,B,C Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết

định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các

Trang 6

Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa

rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (

F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lựcF1,F2,F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định còn F3 làyếu tố ảnh hưởng không lớn

Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột F2 là lực kéo củapha động đối với chất phân tích ra khỏi cột

Trang 7

Thời gian A B

Pha động

Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau ,Kết

quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau

và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới đây )

Trang 8

3 - Phân loại sắc ký :

Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loại như sau :

Sắc ký hấp phụ :

Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh

đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo

chất tan ra khỏi cột Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động

học của chất hấp phụ Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ :

+ Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực

+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha

động phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi.

Trang 9

Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha

Trang 10

Kết quả của quá trinh tách các chất được Detector phát hiện

ghi thành sắc ký đồ

Trang 11

tr1

t’r1

to : Thời gian lưu chết

t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B

tr1: Thời gian lưu chất A tr2 : Thời gian lưu chất B

Trang 12

4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm

mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị

cực đại.

Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thìthời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đãchọn Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tínhcác chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :

+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh

+ Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào

pH của pha động

Trang 13

Trong một phép phân tích nếu Tr nhỏ quá thì sự tách kém,còn nếu Tr quá lớn thì peak bị giãn và độ lặp lại của Peakrất kém ,thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiềuvấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá chất, độ chính xáccủa phép phân tích kém Để thay đổi thời gian lưu chúng tadựa vào các yếu tố trên đã trình bày

4.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity Factor

K’ = ( Tr - t0)/ t0Nếu K’ nhỏ thì Tr cũng nhỏ và sự tách kém Nếu K’ lớn thì Peak bị giãn Trong thực tế K’ từ 1- 5 là tối

ưu

Trang 14

4.3 - Độ chọn lọc  :

Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi

02 chất A ,B có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năngtách,mức độ tách biểu thị ở Độ chọn lọc 

 = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng

Trang 15

4.2 S ố đĩ a lý thuy ế t N:

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện

sắc ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp

pha tĩnh có chiều cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một

khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động học được

thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động

Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :

+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt phatĩnh

+ Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha động

+ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột

Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng

định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được

xác định.

Trang 16

4.2 Số đĩa lý thuyết N:

Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau :

N = 5,54 ( Tr / W0,5)2

Tr : Thời gian lưu của chất phân tích

W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak

Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ

Trang 17

4.3 Độ phân giải R : ( Resolution )

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên

một điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của 02 Peak cạnh nhau phải

được tính theo công thức sau:

R= 2( t’RB - t’RA)/ (wA + wB)

Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gauss) thì độ phân giải tối thiểu

để 02 Peak tách là R =1.0 Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp

Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán diện tích Peak

sẽ không chính xác ,lúc này phải tìm cách tăng R theo 03 cách sau:

* Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động

(Thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay đổi cường độ ion nếu là

Trang 18

• Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn

nhiều pha động ,độ nhạy sẽ kém Để khắc phục ta

có thể thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi

• Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình

Gradient dung môi mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng

các yêu cầu trong quá trình phân tích

Trang 19

4.4 Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)

Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak trên

Peak dạng đối xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan

tâm đến hệ số không đối xứng T,

Trang 20

• Khi T  2.5 thì phép định lượng được chấp nhận

• Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định, vì vậy phép định lượng

cần phải thay đổi các điều kiện sắc ký để làm cho Peak cân đối hơn theo các cách sau :

+ Làm giảm thể tích chết tức là đoạn nối từ cột đến Detector

+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải tăng

lên

+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng mẫu hay giảm

thể tích tiêm mẫu

Trang 21

Detector

Trang 22

Trong đó :

1: Bình chứa dung môi pha động

2: Bộ phận khử khí

3: Bơm cao áp

4: Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)

5: Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt ) 6: Detector ( nhận tín hiệu )

7: Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC.

8: In dữ liệu

Hệ thống HPLC

Trang 24

2. Bộ khử khí Degasse :

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lạitrong dung môi pha động Nếu như trong quá trình phân tích màdung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sauđây sẽ xảy ra

Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ

làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi

Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể loại trừ hếtđược thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (Bị Error) khi

đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tíchsai

Trang 25

-Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất

tối đa 412 Bar Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút

-Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2 Piston để thay phiên nhau đẩy dung môiliên tục

Trang 26

4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection):

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp khôngngừng dòng chảy Với dung tích của loop là 5 - 100l

Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủcông( tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu tự động( Autosample)

thước và kích cỡ hạt )

Trang 27

-Với chất nhồi cột cỡ  = 1.8 -5 m có thể dùng cột ngắn(3-10 cm ) và nhỏ ( đường kính trong 1-4.6 mm)loại cột này cóhiệu năng tách cao.

- Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận)hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớpmỏng hữu cơ ( pha đảo ), ngoài ra người ta còn dùng các loạihạt khác như : Nhôm Oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion

* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có

nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được

đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column)

Trang 28

6 - Detector :

- Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà

người ta sử dụng loại Detector thích hợp và phải thoả mãn

điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân

tích

A=k.CTrong : A là tín hiệu đo được (Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; Cường độ phát xạ ,cường độ điện thế

,độ dẫn điện ;độ dẫn nhiệt ;chiết suất )

C Nồng độ chất phân tích

k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn

Trang 29

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các loại Detector sau :

+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV

+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV -VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang đây là loại thông dụng nhất

+ Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang Là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất +Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array ,ELSD (Detector tán

xạ bay hơi ) các Detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất

- Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là :

+ Detector điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ dẫn ,điện lượng ) + Detector chiết suất vi sai : Detector khúc xạ ( thông thường dùng đo các chất đường )

Trang 30

7 Bộ phận ghi tín hiệu

- Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang

+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản cóthể vẽ sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của Peak ,chiều cao

+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính

nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của Peak nhưtính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tích đồng thời

xử lý ,tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như :nồng độ, RSD,

8 In kết quả :

+ Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phầnmềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ

Trang 31

Muốn có một kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc

ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu Các điều kiện đó bao gồm :

Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình

dung môi Nếu là chương trình rửa giải Gradient.

Chọn Ðiều kiện sắc ký

Trang 32

Hệ thống trang bị:

- Loại Detector:

- Van tiêm mẫu,thể tích tiêm

- Hệ đường dẫn.

- Các yếu tố khác : nhiệt độ ,độ nhạy của

detector bước sóng phân tích

Trang 33

1 Lựa chọn pha tĩnh

- Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần và tính chấtcủa các chất có trong mẫu phân tích ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp

có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau

Chúng ta thông thường dùng 02 loại cột pha thuận ( NP)

và cột pha đảo ( RP) Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khácnhư cột CN

,cột NH2 ,

Trang 34

Chọn Ðiều kiện sắc kýCột pha thuận ( NP): Silicagel trung tính

Pha tĩnh :Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân

cực hay ít phân cực Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa

các nhóm OH phân cực ưa nước

Ví dụ cột Lichrosorb Si 40,Si 60 Cấu tạo cột như sau :

O Si O Si O Si O

Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực

hay ít phân cực như : Methanol,Benzen,Acetonitril,Chloroform

Trang 35

Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel đã Alkyl hóa )

Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân cực ,các chất phâncực có thể tạo cặp Ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bịAlkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các mạch Carbonvòng ( Phenyl- tương đương cột Phenyl ) vì thế nó ít phân cực hayphân cực rất ít

Ví dụ như cột Lichrospher RP 8 ODS , Cột Nucleosil 18

Trang 36

Pha động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có

phân cực như :Methanol, Acetonitril, nước hay các loại dung

dịch đệm ,hỗn hợp của các dung môi-đệm

Pha động có thể làm thay đổi :

+ Độ chọn lọc+ Thời gian lưu+ Hiệu năng tách của cột+ Độ phân giải

+ Tính đối xứng của Peak

Trang 37

Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau :

+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( vd giá trị pH : 2.5< pH <8.5)

+ Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột ,hay pha động có sẵn trong cột Vd : đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column)

+ Pha động phải bền vững theo thời gian : càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất

là chúng là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gian phân tích mẫu ).

+ Phải có độ tinh khiết cao : dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết

phân tích

+Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.

Định dạng
Số trang	59
Dung lượng	1,92 MB
File đính kèm	KN bằng HPLC.rar (2 MB)

KN bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp chuẩn hóa điện tích