ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU ĂN SỐNG. LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người 10 Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn 15 Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa v

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־

Tạ Thị Yến

ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH

CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE

TRONG RAU ĂN SỐNG TẠI MỘT SỐ QUẬN NỘI THÀNH HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội – 2019

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־־

Tạ Thị Yến

ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VÀ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH

CỦA VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE

TRONG RAU ĂN SỐNG TẠI MỘT SỐ QUẬN NỘI THÀNH HÀ NỘI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

Hướng dẫn 1: PGS.TS Chu Hoàng Hà

Hướng dẫn 2: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo

Hà Nội - 2019

dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Chu Hoàng Hà và PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này hoàn toàn trung thực

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Học viên

Tạ Thị Yến

thực phẩm quốc gia dưới sự dẫn dắt của:

PGS.TS Chu Hoàng Hà – Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ

PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia

Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Chu Hoàng Hà và PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn thạc sĩ

Xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các đồng nghiệp trong khoa Vi sinh vật – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ,

hỗ trợ tôi trong khoảng thời gian thực hiện luận văn

Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên của Học Viện Khoa học và Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập tại học viện

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình thân yêu của tôi, cảm ơn bạn bè những người đã luôn sát cánh bên tôi, chia sẻ và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Người viết

Tạ Thị Yến

tắt Tiếng Anh đầy đủ Tiếng Việt đầy đủ

ADN Deoxyribonucleic acid axit Deoxyribonucleic

AmpC Plasmid-mediated AmpC

clavulanic CTL cefotaxime + clavulanic acid cefotaxime kết hợp axit

clavulanic CAC ceftazidime + cloxacillin ceftazidime kết hợp cloxacillin CTC cefotaxime + cloxacillin cefotaxime kết hợp cloxacillin CLSI Clinical Laboratory Standard

Ủy ban châu Âu về thử nghiệm

độ nhạy cảm với kháng sinh

ISO International Standard

hệ 1, cefazoline Omp Outer membrane porin Porin màng ngoài

OmpA Outer membrane protein A protein A màng ngoài vi khuẩnPAI Pathogenicity island Vùng gây bệnh

UTI Urinary tract infection Vi khuẩn lây nhiễm đường tiết

niệu WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

Bảng biểu Nội dung Trang Bảng 1.1 Sự phân bố của họ vi khuẩn đường ruột

Bảng 2.1 Kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ 40

Bảng 2.3 Vi khuẩn sinh enzym AmpC β-lactamase 42 Bảng 2.4 Xác định vi khuẩn sinh enzym Carbapenemase 42

Bảng 2.5 Trình tự mồi của gen mã hóa enzym β-lactamase 44 Bảng 3.1 Mật độ vi sinh vật log CFU/g theo loại hình kinh

Hình 1.1 Phân nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae 8 Hình 1.2 Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người 10

Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn 15 Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật 16 Hình 1.6 Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn 17 Hình 1.7 Cơ chế tác động lên tế bào của kháng sinh 18 Hình 1.8 Con đường lây nhiễm và phát tán mầm bệnh ra cộng

Hình 1.10 Con đường lây truyền Enterobacteriaceae lên người 29 Hình 2.1 Địa điểm lấy mẫu tại một số Quận nội thành Hà Nội 36 Hình 2.2 Rau ăn sống được bày bán tại các chợ và siêu thị 36 Hình 2.3 Nguyên lý cơ bản định danh vi khuẩn bằng hệ thống

Hình 3.1 Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trung bình trong rau ăn sống 51 Hình 3.2 Kháng sinh đồ trên chủng vi khuẩn đối chiếu 53 Hình 3.3 thế hệ 1, 2 Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng với cephalosporin 53-54 Hình 3.4 hệ 1, 2 và 3Vi khuẩn Enterobacteriaceae kháng Cephalosporin thế 54 Hình 3.5 Khuẩn lạc phân lập trên môi trường Macconkey 57 Hình 3.6 Vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactam

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 HỌ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE 7

1.1.1 Enterobacteriaceae 7

1.1.2 Sự phân bố của Enterobacteriaceae 8

1.1.3 Khả năng gây bệnh của Enterobacteriaceae 9

1.1.3.1 Viêm màng não và viêm nhiễm hệ Thần kinh 10

1.1.3.2 Nhiễm trùng đường tiết niệu 10

1.1.3.4 Gây bệnh đường ruột 11

1.2 KHÁNG SINH 12

1.2.1 Lịch sử ra đời kháng sinh 12

1.2.1.1 Cephalosporin 13

1.2.1.2 Các kháng sinh β-lactam khác 14

1.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh 14

1.2.2.1 Kháng kháng sinh 14

1.2.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn 18

1.2.3 Hiện tượng kháng cephalosporine ở vi khuẩn gram âm 22

1.2.4 Enzym β-lactamase 23

1.2.4.1 Enzym β-lactamase phổ rộng 25

1.2.4.2 β-lactamase AmpC 27

1.2.4.3 Carbapenemase 28

1.3 THỰC PHẨM – NGUỒN CHỨA ENTEROBACTERIACEAE 29

1.3.1 Rau ăn sống – vật chủ chứa Enterobacteriaceae 30

1.3.2 Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau trên thế giới 32

1.3.3 Tình hình nhiễm Enterobacteriaceae trong rau tại Việt Nam 34

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU 37

2.2.1 Dụng cụ 37

2.2.2 Thiết bị 37

2.2.3 Hóa chất 38

2.2.4 Chủng chuẩn 38

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.3.1 Chuẩn bị và xử lý mẫu 38

2.3.2 Phương pháp định lượng Enterobacteriaceae 39

2.3.3 Phương pháp khoanh giấy kháng sinh 39

2.3.3.1 Thử tính kháng kháng sinh β-lactam 39

2.3.3.2 Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 40

2.3.4 Kỹ thuật MALDI – TOF định danh vi sinh vật 43

2.3.5 Phương pháp xác định gen kháng kháng sinh 44

2.4 CHỦNG ĐỐI CHỨNG 45

2.6 XỬ LÝ KẾT QUẢ 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 ĐÁNH GIÁ SỰ LƯU HÀNH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE TRONG RAU SỐNG 47

3.1.1 Đánh giá tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Enterobacteriaceae trong rau sống 47 3.1.2 Đánh giá mật độ nhiễm Enterobacteriaceae theo loại hình kinh doanh 49

3.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CEPHALOSPORIN VÀ KHẢ NĂNG SINH ENZYM β-LACTAMASE CỦA VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE 52

3.2.1 Đánh giá khả năng kháng kháng sinh cephalosporin 52

3.2.2 Đánh giá sự lưu hành vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 57

3.3 ĐỊNH DANH VI KHUẨN ENTEROBACTERIACEAE SINH ENZYM β-LACTAMASE VÀ XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG KHÁNG SINH 64

3.3.1 Định danh vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh enzym β-lactamase 64

3.3.2 Xác định gen mã hóa enzym β-lactamase 67

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 75

4.1 KẾT LUẬN 75

4.2 KIẾN NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

MỞ ĐẦU

Enterobacteriaceae là vi khuẩn gây bệnh đường ruột phổ biến trên toàn thế giới Bệnh lây truyền qua thực phẩm gây ra bởi Enterobacteriaceae đang là

mối quan tâm của cộng đồng toàn cầu Hầu hết các vụ bùng phát dịch

Enterobacteriaceae trên người có liên quan đến việc tiêu thụ sản phẩm thực

phẩm mang nguồn bệnh [1] Hai vấn đề chính trong dịch tễ về vi khuẩn

Enterobacteriaceae tại các nước phát triển và đang phát triển trong nửa sau của thế kỷ 20 là sự bùng phát của các ca bệnh do Enterobacteriaceae lây truyền qua thực phẩm lên người và các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae

kháng nhiều kháng sinh Trong thế kỷ 21, tình trạng kháng kháng sinh đã trở nên được quan tâm trên toàn cầu với sự kháng carbapenem và cephalosporin

thế hệ 3 của các vi khuẩn Enterobacteriaceae [2]

Sự gia tăng về mức độ kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae là một

vấn đề quan ngại trên toàn cầu trong những thập kỷ gần đây bởi sự lạm dụng kháng sinh trong điều trị trên người và trong chăn nuôi Sự cùng tồn tại của nhiều loài vi khuẩn trong đường ruột của động vật và con người đã tạo điều

kiện cho việc truyền gen kháng kháng sinh giữa các loài vi khuẩn với nhau

Bên cạnh đó con đường đi của chuỗi thức ăn cũng góp phần làm gia tăng tỉ lệ

vi khuẩn kháng kháng sinh lên người [3]

Cũng như một số nước trên toàn thế giới, Việt Nam đang phải đối mặt với khó khăn trong quá trình điều trị do sự gia tăng tính kháng kháng sinh của

vi khuẩn gây bệnh Thực tế cho thấy hiện tượng dễ dàng mua bán kháng sinh cho điều trị bệnh ở người và sử dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam mà không cần đơn của thầy thuốc là một trong những nguyên nhân chính thúc đẩy tình trạng kháng kháng sinh [4]

Rau là nguồn thực phẩm phổ biến trong cuộc sống hằng ngày của người Việt Nam Theo báo cáo của Ngân hàng thế giới vào năm 2017, tỉ lệ tiêu thụ rau tại Việt Nam là 0,4 kg rau mỗi ngày trên người và tỉ lệ tiêu thụ rau tại Hà Nội là 2,800 tấn mỗi ngày Năng suất sản xuất rau tại Hà Nội là 600,000 tấn mỗi năm và trung bình là 1,644 tấn mỗi ngày Với sức tiêu thụ khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, Hà Nội phải sử dụng nguồn cung từ các tỉnh thành thuộc đồng

bằng sông Hồng như Vĩnh Phúc, Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Hòa Bình [5] Từ đó cho thấy rau là nguồn tiêu thụ chính cho nhu cầu ăn uống hằng ngày của người dân Hà Nội Cũng như các loại thực phẩm khác, rau ăn sống là nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và khả năng lây truyền vi khuẩn kháng lên người Tuy nhiên cho đến nay có rất ít báo cáo đã công bố về tình trạng vi khuẩn

Enterobacteriaceae trong rau ăn sống chứa các gen mã hóa enzym β-lactamase

có khả năng kháng kháng sinh β-lactam Đặc biệt hơn, tại Việt Nam chưa có công bố nào về tình trạng kháng kháng sinh của các vi khuẩn

Enterobacteriaceae trong rau ăn sống được bán tại các quán ăn

Để có những bằng chứng cụ thể về thực trạng ô nhiễm và kháng kháng

sinh của Enterobacteriaceae trong rau ăn sống, chúng tôi quyết định tiến hành

thực hiện luận văn “Đánh giá sự lưu hành và tính kháng kháng sinh của vi

khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại một số quận

nội thành Hà Nội”

Mục đích

1 Xác định được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống (Nhóm Enterobacteriaceae lên men glucose, nhóm Enterobacteriaceae lên men lactose – Coliform- và Escherichia coli),

và xác định tính kháng kháng sinh cephalosporin của các chủng vi khuẩn đã thu thập;

2 Xác định loài vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae sinh enzym lactamase phổ rộng, AmpC β-lactamase và carbapenemase và gen mã hóa enzym β-lactamase trong các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh

β-enzym β-lactamase đã thu thập

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên sản phẩm thực phẩm là rau ăn sống thu thập tại các loại hình kinh doanh là chợ, siêu thị và các quán ăn có phục vụ rau

ăn sống

Ý nghĩa khoa học

Luận văn đã cung cấp thêm số liệu về sự lưu hành và tính kháng kháng

sinh của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae trong rau ăn sống tại ba loại

hình kinh doanh là chợ, siêu thị và quán ăn có phục vụ rau sống

Luận văn là bước khởi đầu cho các nghiên cứu về thực trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn hiện diện trong thực phẩm

Ý nghĩa thực tiễn

Luận văn cung cấp bằng chứng thực nghiệm về tính kháng kháng sinh

của vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea trong rau ăn sống, qua đó cho thấy

thực tiễn hiện diện của các vi khuẩn kháng kháng sinh trong thực phẩm đang được tiêu thụ tại chợ, siêu thị và quán ăn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 HỌ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT ENTEROBACTERIACEAE

1.1.1 Enterobacteriaceae

Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae bao gồm một nhóm lớn các

vi khuẩn gram âm không tạo bào tử, thường có độ dài 1-5 μm, sinh trưởng trong

điều kiện kị khí và hiếm khí tùy ý (ngoại trừ Saccharobacter fermentans và một

số loài thuộc chi Yersinia và Erwinia) và có khả năng di chuyển bằng long, ngoại trừ chi Shigella và Tatumella Một đặc điểm chung của Enterobacteriaceae, giúp phân biệt với các vi khuẩn khác là thiếu cytochrome

C oxidase dẫn đến tạo phản ứng âm tính với oxidase, trừ Plesiomonas spp Enterobacteriaceae lên men nhiều loại carbohydrate, trong đó khả năng sản

xuất axit và sinh khí từ quá trình lên men glucose D là một đặc tính chẩn đoán quan trọng và thường được sử dụng là cơ sở để phát hiện và định lượng

Enterobacteriaceae Một số thành viên của Enterobacteriaceae (ví dụ Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter spp.và Klebsiella spp.) có thể

được phát hiện và định lượng dựa trên khả năng lên men lactose nhanh chóng (thường trong vòng 24-48 giờ) tạo ra axít và sinh khí Nhóm vi khuẩn này được gọi chung là vi khuẩn Coliform và thường được sử dụng như là các vi sinh vật chỉ điểm nhiễm phân bởi ngành công nghiệp thực phẩm và nước bởi vì môi trường sống bình thường của Coliform là đường tiêu hóa của động vật có vú [6]

Tên gọi họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae lần đầu tiên được

đề xuất bởi Rahn vào năm 1937, với chi Escherichia Sơ đồ phân loại của họ

vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae phức tạp và nhanh chóng thay đổi khi

áp dụng các kỹ thuật tiên tiến xác định loài vi khuẩn dựa trên trình tự axit

nucleic Số lượng chi và loài Enterobacteriaceae đã tăng từ 12 chi và 36 loài

năm 1974 lên ít nhất 34 chi, 149 loài và 21 phân loài trong năm 2006 [7] Năm

2011, họ vi khuẩn đường ruột đã tăng lên ít nhất 48 chi, 219 loài và 41 loài phụ Theo cơ sở dữ liệu phân loại của Thư viện Y khoa Quốc gia Hoa Kỳ vào năm

2015 thì có 63 chi đã được xác định với hơn 210 loài [1], tuy nhiên họ vi khuẩn

đường ruột Enterobacteriaceae có ý nghĩa lâm sàng chỉ bao gồm 20-25 loài, và

các loài khác thì không thường gặp Số lượng các chi và loài có thể được tăng lên theo thời gian dựa trên các số liệu chưa được công bố [7]

Enterobacteriaceae được xem là các vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh cung cấp

các bằng chứng về vệ sinh an toàn thực phẩm trong chuỗi thức ăn cũng như trong ngành công nghiệp thực phẩm Vi khuẩn thuộc họ đường ruột

Enterobacteriaceae được chia thành 3 nhóm, trong đó chủ yếu là nhóm vi khuẩn không lên men đường lactose bao gồm một số chi như Proteus, Cronobacter, Shigella; nhóm lên men lactose chậm hoặc do đột biến; nhóm còn

lại thường được phát hiện bởi khả năng lên men lactose nhanh chóng và gọi là

nhóm Coliform bao gồm các chi: Escherichia, Enterobacter, Klebsia, Serratia, Citrobacter (xem Hình 1.1) [6]

Hình 1.1 Phân nhóm trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [6]

1.1.2 Sự phân bố của Enterobacteriaceae

Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae được

phân bố rộng rãi trong tự nhiên và môi trường Một số loài là mầm bệnh ở người

và động vật, trong khi một số loài khác gây bệnh cho cây cối và côn trùng Môi

Lên men lactose chậm  hoặc do biến đổi 

Không lên menlactose  

Lên men lactose  

h h hó

trường sống tự nhiên của một số chi thuộc họ Enterobacteriaceae và có nguồn

gốc phân lập từ môi trường tự nhiên, thực phẩm và con người được đưa ra

trong Bảng 1.1 Do sự phân bố rộng rãi của họ vi khuẩn Enterobacteriaceae do

đó không thể tránh khỏi một số thành viên của họ Enterobacteriaceae sẽ xâm nhập vào chuỗi thức ăn, gây ra sự hư hỏng thực phẩm và mang mầm bệnh [8] Bảng 1.1 Sự phân bố của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae [8]

Chi Sự phân bố và vị trí phân lập

Citrobacter Phân người, mẫu bệnh phẩm, nước thải, đất, nước, thực

phẩm

Enterobacter Phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đất, nước ngọt (sông, suối),

rau, nước thải, phân người, mẫu bệnh phẩm và đường hô hấp

Escherichia Đường tiêu hóa của người và động vật máu nóng nước, thực

phẩm và đất thông qua sự nhiễm phân)

Klebsiella

Đường tiêu hóa và đường hô hấp ở người và các động vật khác, phân, đất, nước, hoa quả và rau, ngũ cốc và các mẫu bệnh phẩm ở người

Proteus Đường tiêu hóa ở người và động vật, đất, nguồn nước ô

nhiễm

Salmonella Người và động vật, thực phẩm, nước, môi trường

Serratia Mẫu bệnh phẩm, khu vực sản xuất, đất, nước, môi trường,

đường tiêu hóa của động vật có móng

Shigella Đường tiêu hóa của người và linh trưởng

Yersinia Phân bố rộng rãi ở người và động vật, thực phẩm, đất và

nước

Leclercia  Thực phẩm, nước, máu

1.1.3 Khả năng gây bệnh của Enterobacteriaceae

Enterobacteriaceae gây ra các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa và

nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết,viêm phổi, nhiễm trùng vùng bụng hoặc vùng chậu, nhiễm trùng nơi phẫu thuật, viêm màng não và các áp xe khác nhau bao gồm nhiễm khuẩn vết thương (xem Hình 1.2) [1]

Hình 1.2 Các bệnh do vi khuẩn Enterobacteriaceae gây ra trên người [1]

Một số loài E coli có thể gây viêm màng não liên quan đến gram âm (viêm màng não sơ sinh E coli) ở trẻ sơ sinh với tỷ lệ tử vong có thể lên đến

40%, và những người sống sót thường bị di chứng thần kinh Sự sống sót của

vi khuẩn trong máu được tạo điều kiện bởi một màng bao axit polysialic antiphagocytic và protein A màng ngoài vi khuẩn (OmpA) Trong hệ thống thần kinh trung ương, vi khuẩn có thể gây ra phù nề, viêm và tổn thương thần kinh [1]

1.1.3.2 Nhiễm trùng đường tiết niệu

Nhóm vi khuẩn gây nhiễm trùng đường tiết niệu (UTI) là một trong những loài vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm trùng ở người, gây các triệu chứng

bệnh nghiêm trọng và tốn kém về kinh tế cho việc chữa trị Escherichia coli

gây nhiễm trùng đường tiết niệu (UPEC) chiếm khoảng 80% các ca UTIs, gây viêm bàng quang ở bàng quang và viêm thận thận cấp tính ở thận [1]

Loài Enterobacteriaceae phổ biến khác có liên quan đến UTIs là Klebsiella pneumoniae Loài này gây nhiễm trên các nhóm bệnh nhân đặc

trưng, như bệnh nhân đái tháo đường hoặc bàng quang rối loạn chức năng và

ống thông tiểu K pneumoniae, một tác nhân gây bệnh phổ biến trên các bệnh

nhân do nhiễm trùng bệnh viện, có một số yếu tố quyết định độc lực, bao gồm khả năng bám dính, hoạt tính phân giải ure và các hệ thống bất hoạt sắt [1]

1.1.3.3 Nhiễm khuẩn huyết

Nhiễm khuẩn huyết là một biến chứng chính của nhiễm trùng

Enterobacteriaceae vì nó có thể dẫn đến nhiễm trùng huyết nặng với suy nội

tạng cấp tính và sốc nhiễm trùng Trong những năm gần đây, bệnh nhiễm khuẩn

E coli đã tăng lên và ở Anh, loài này hiện chiếm hơn 30% bệnh nhiễm khuẩn

huyết ở những người trên 75 tuổi [1] Cũng có sự gia tăng đáng kể về nhiễm

khuẩn huyết do các mầm bệnh gram âm khác gây ra như Leclercia adecarboxylata L adecarboxylata ngoài gây nhiễm khuẩn huyết có thể gây

nhiễm trùng vết thương, đặc biệt trên các bệnh nhân mắc các bệnh nguyên phát như ung thư, bệnh bạch cầu, suy thận và xơ gan [9] Nguồn chủ yếu của nhiễm khuẩn huyết là các vi khuẩn gây bệnh đường tiết niệu Các nguồn lây nhiễm máu cổ điển khác bao gồm đường tiêu hóa, liên quan đến cả mầm bệnh đường ruột cụ thể và vi khuẩn đường ruột cơ hội, có thể chuyển từ lòng ruột sang máu trong vật chủ với các tình trạng tiềm ẩn (ví dụ như khối u rắn tiêu hóa, viêm túi mật hoặc điều trị ức chế miễn dịch) [1]

1.1.3.4 Gây bệnh đường ruột

Các mầm bệnh gây bệnh đường ruột quan trọng nhất là Salmonella enterica, một số phân typ thuộc loài E coli, Shigella và Yersinia Mặc dù các

Enterobacteriaceae khác đôi khi có liên quan đến nhiễm trùng đường tiêu hóa,

nhưng ý nghĩa lâm sàng đôi khi gây tranh cãi (ví dụ đối với Plesiomonas shigelloides hoặc Klebsiella pneumoniae liên quan đến tiêu chảy) [1]

chọn lọc và phân lập vi khuẩn Haemophilus influenzae, được cho là nguyên

nhân gây ra bệnh cúm Theo thời gian, Fleming đã chứng minh rằng penicillin

có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn và thậm chí là diệt khuẩn Tuy nhiên trong giai đoạn này penicillin đã không được sử dụng rộng rãi Tiếp đó, sulfonamidochrysoidine (KI-730, prontosil), được tổng hợp bởi các nhà hóa học Josef Klarer và Fritz Mietzsch và đã được thử nghiệm bởi nhà vi khuẩn học người Đức Gerhard Domagk về hoạt tính kháng khuẩn trên các loại bệnh khác nhau [10] Trong các khoảng thời gian tiếp theo, rất nhiều họ kháng sinh và thế

hệ kháng sinh mới ra đời, nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh trên người và động vật (xem Hình 1.3) [11]

Hình 1.3 Lịch sử ra đời các loại kháng sinh [11]

1.2.1.1 Cephalosporin

Họ kháng sinh cephalosporin được phát hiện đầu tiên vào năm 1945, tuy nhiên phải mất gần 2 thập kỷ để đưa các kháng sinh này vào điều trị Một thập

kỷ sau phát hiện ban đầu, các chất cephalosporin đã được phân lập và xác định

là sản phẩm lên men của nấm mốc Các nhà khoa học tại Oxford, bao gồm Florey và Abraham, với các thiết bị đầy đủ đã nghiên cứu ra đặc điểm cấu trúc của các cephalosporin, như họ đã làm đối với penicillin một thập kỷ trước đó

Ba chất cephalosporin P, N, và C đã được xác định Mỗi sản phẩm đều hoạt động kháng khuẩn nhưng chỉ cephalosporin C kháng cả vi khuẩn gram âm và gram dương cephalosporin C đã trở thành nền tảng để phát triển các dòng cephalosporin tiếp theo Dược phẩm cephalosporin đầu tiên là cephalothin, đã được giới thiệu để sử dụng lâm sàng vào năm 1964 Và đến nay đã có hơn 20 thuốc kháng sinh cephalosporin được sử dụng trong điều trị Cephalosporin là một trong những họ kháng sinh được các nhà điều trị kê toa rộng rãi nhất vì độc tính thấp và khả năng hoạt động phổ rộng của chính kháng sinh này [12]

Về phân loại, cephalosporin gồm 5 thế hệ, dựa vào phổ hoạt động của kháng sinh (xem Bảng 1.2) Thế hệ đầu hoạt động cephalosporin tập trung chủ yếu vào các vi khuẩn gram dương Các thế hệ thứ hai thuốc đã tăng cường hoạt động chống trực khuẩn gram âm nhưng duy trì mức độ khác nhau của hoạt động đối với cầu khuẩn gram dương Các cephalosporin thế hệ thứ ba đã tăng lên rõ rệt tiềm năng chống lại vi khuẩn gram âm Tuy nhiên, đối với một số hợp chất trong nhóm 3, hoạt động chống lại cầu khuẩn gram dương lại giảm Trong nhóm thế hệ thứ ba, một vài hợp chất, chẳng hạn như ceftazidime và ceftolozane,

được xem xét riêng biệt cho hoạt động chống lại P aeruginosa Thế hệ thứ tư

có phổ hoạt động rộng nhất trong năm nhóm Các loại thuốc thứ ba và thứ tư kết hợp cũng được gọi là Cephalosporin rộng phổ Nhóm thứ năm được gọi là cephalosporin kháng tụ cầu kháng methicillin bao gồm ceftaroline và ceftobiprole [12]

Bảng 1.2 Các thế hệ kháng sinh cephalosporin Thế hệ 1 Thế hệ 2 Thế hệ 3 Thế hệ 4 Thế hệ 5

cephazolin cefamandole cefoperazone cefepime ceftaroline cephalothin cefonicid cefotaxime cefpirome ceftobiprolecephapirin cefuroxime ceftazidime

ceftraexone moxalactam

1.2.1.2 Các kháng sinh β-lactam khác

Ngoài họ cephalosporin, penincillin, bốn loại kháng sinh carbapenems imipenem, meropenem, ertapenem, và doripenem hiện đang được đưa vào trong điều trị tại một số nước phát triển như Mỹ Carbapenem hoạt động kháng nhiều vi khuẩn gram dương, gram âm kị khí và hiếu khí bởi sự thâm nhập hiệu quả của carbapenem thông qua màng ngoài tế bào, có ái lực cao với các protein liên kết penicillin, và sự ổn định của chúng chống lại hầu hết các enzym β-lactamase phổ rộng (ESBLs) lớp A và enzym β-lactamase lớp C (AmpCs) [13]

-1.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh

1.2.2.1 Kháng kháng sinh

Kháng sinh đã được con người phát hiện và đưa vào quá trình trị liệu từ giai đoạn bắt đầu của loài người Thuốc kháng sinh cơ bản đã được xác nhận bởi cơ quan quản lý của Mỹ như là loại thuốc được sản xuất bởi một loài sinh vật để ức chế sự tăng trưởng hoặc để giết chết một loài vi sinh vật khác Dưới tác dụng của kháng sinh, một số chủng vi khuẩn đã dần thích nghi và kháng lại các kháng sinh Sự xuất hiện của các mầm bệnh kháng nhiều loại thuốc khác nhau đã làm gia tăng lo ngại về những hậu quả và tác động của hiện tượng này lên sức khỏe con người và quá trình điều trị bệnh trên người

Sự kháng thuốc được định nghĩa là sức đề kháng của vi khuẩn đối với một tác nhân kháng khuẩn mà trước đây chúng chỉ biểu hiện sự nhạy cảm Đầu tiên hiện tượng kháng kháng sinh của vi khuẩn là quá trình tiến hóa tự nhiên, sau đó hiện tượng kháng thuốc ngày càng gia tăng trong các loài vi sinh vật gây bệnh bởi sử dụng sai thuốc kháng sinh và sự lây lan toàn cầu của vi khuẩn kháng thuốc, chủ yếu ảnh hưởng đến bệnh nhân có hệ miễn dịch kém hoặc sức khỏe yếu Sự kháng thuốc đã tiêu tốn nhiều chi phí hơn trong quá trình chữa trị

và trong hoạt động nghiên cứu về ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh Một loạt các loại thuốc kháng sinh đã bị kháng bởi các vi sinh vật gây bệnh trong những thập kỷ gần đây, nhân tố kháng thuốc có thể được tạo ra và lan truyền từ

vi sinh vật này sang vi sinh vật khác, từ loài vi khuẩn này sang loài vi khuẩn khác theo nhiều cách khác nhau [10]

Thông qua hoạt động chuyển gen, ví dụ, integron, nhân tố axit nucleic (ADN) di động có thể bắt giữ và mang các gen, được vận chuyển bởi các gen

nhảy (transposon), cho phép các vi sinh vật gây bệnh trao đổi cơ chế kháng kháng sinh (xem Hình 1.4) Một trường hợp đề kháng tự nhiên được thấy

thường xuyên bởi các tỷ lệ đột biến tự nhiên trong gen nằm trên nhiễm sắc thể

mà sau đó nhân tố đột biến được lan truyền bởi sự nhân lên của vi khuẩn Một

trong những cơ chế kháng là sự tích hợp của ADN trên hệ gen từ vi khuẩn chết

và plasmid của các tế bào sống, mà cũng có thể xảy ra với integrons đến từ phẩy khuẩn Đột biến xảy ra tất cả các thời điểm, thay đổi nucleotid duy nhất

có thể làm thay đổi gen và chuyển gen kháng lên vi sinh vật Các plasmid từ

một loại vi khuẩn, với bất kỳ integron, có thể dễ dàng chuyển sang vi khuẩn

khác thông qua chuyển gen ngang bởi sự tiếp hợp [10]

Hình 1.4 Nhân tố liên quan đến khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn [10]

Vật liệu di truyền được trao đổi giữa các vi sinh vật qua ba con đường

chính: (i) Tải nạp ADN, ví dụ: từ Streptococcus mitisto sang Streptococcus pneumoniae, (ii) biến nạp, ví dụ kháng Methycillin trong Staphylococcus aureus đã được phân lập trong các mẫu phân ở các trang trại và cơ sở giết mổ;

và (iii) sự tiếp hợp, ví dụ là các plamid chịu trách nhiệm cho sự phổ biến toàn

cầu của các gen mã hóa enzym carbapenemase hoặc β-lactamase, đặc biệt phổ

biến trong các vi khuẩn gram âm và tụ cầu (xem Hình 1.5) [14]

Hình 1.5 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền giữa vi sinh vật [14]

Sự hình thành tính kháng của vi khuẩn lên kháng sinh đã được ghi nhận sớm nhất vào giai đoạn đầu của kỷ nguyên kháng sinh Trong vòng 20 năm qua,

sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và khả năng kháng của chúng đã liên tiếp phát triển Nguyên nhân chính là sự thiếu hiểu biết của người

sử dụng về kháng sinh, dẫn đến lạm dụng kháng sinh trong điều trị Rõ ràng, tự dùng thuốc ảnh hưởng đến hiệu quả của liệu pháp điều trị và gây nguy hiểm cho sức khỏe người bệnh cũng như nguy hại đến cộng đồng Sự lạm dụng kháng sinh đã gây ra áp lực chọn lọc tự nhiên cho vi khuẩn và thúc đẩy quá trình tiến hóa nhanh của vi khuẩn Hơn nữa, các hợp chất trong hệ sinh thái và điều kiện môi trường sống cũng góp phần tạo áp lực chọn lọc bổ sung lên vi sinh vật Bên cạnh đó, nguyên nhân khác thúc đẩy hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn

là việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích trị bệnh và kích thích tăng trưởng Hiện nay, kháng kháng sinh đã là vấn đề toàn cầu, và các nước phát triển hiện đã xây dựng các chương trình để hạn chế tình trạng kháng kháng sinh Ví dụ, ở các nước Bắc Âu, đã nghiên cứu việc sử dụng hợp lý thuốc kháng

sinh, cùng với loại bỏ các chất kích thích tăng trưởng cho động vật nuôi Từ năm 2006, các nước Liên minh châu Âu khác đã và đang áp dụng các biện pháp tương tự để hạn chế sử dụng kháng sinh trong nông nghiệp [10]

1.2.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn

Có rất nhiều cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn, trong số đó năm cơ chế thường thấy nhất là: enzym ức chế hoạt động của kháng sinh, biến đổi trong protein liên kết penicillin (PBP), đột biến Porin, bơm đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào và thay đổi mục tiêu của kháng sinh (thay đổi thành tế bào) (xem Hình 1.6) [10]

Hình 1.6 Các cơ chế kháng thuốc phổ biến của vi khuẩn [10]

Để ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, kháng sinh có xu hướng tác động lên mục tiêu cụ thể như ức chế tổng hợp protein cụ thể, tổng hợp ADN và ARN, can thiệp vào sự tổng hợp thành tế bào, phá vỡ các cấu trúc màng thấm, và ức chế sự tổng hợp chất chuyển hóa thiết yếu (xem Hình 1.7) [15] Do cấu trúc sinh học khác nhau của kháng sinh, các mục tiêu tấn công của kháng sinh có thể khác nhau tùy thuộc vào từng đối tượng vi khuẩn đang tiếp xúc với chính

kháng sinh Ví dụ, penicillin và cephalosporin ức chế vi khuẩn tổng hợp vách

tế bào bằng cách can thiệp tới các enzym liên quan đến tổng hợp lớp peptidoglycan; trong khi tetracycline và streptogramin ức chế vi khuẩn bằng cách phá vỡ sự tổng hợp protein Một vi khuẩn được xem là kháng với một kháng sinh đặc biệt khi các kháng sinh không còn hiệu quả để điều trị một căn bệnh gây ra bởi một tác nhân gây bệnh của vi khuẩn đặc biệt [16]

Hình 1.7 Cơ chế tác động lên tế bào của kháng sinh [15]

Enzym ức chế hoạt động của kháng sinh

Cơ chế kháng phổ biến nhất của vi khuẩn là enzym ức chế Cơ chế này được dựa trên một số chiến lược để thay đổi cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn: thủy phân, một loại phản ứng xảy ra chủ yếu với các kháng sinh β-lactam; thay đổi các nhóm chức năng (acyl, phosphoryl, thiol, nucleotidil, ADP-ribosyl, glycosyl), xảy ra với rất nhiều chất kháng khuẩn, chẳng hạn như mminoglycoside, chloramphenicol, rifamycin, và lincosamide; và oxi hóa khử , xảy ra với tetracycline, rifamycin, và streptogramin Hơn nữa enzym có thể sửa đổi các hợp chất kháng khuẩn, β-lactamase là một vấn đề lớn trong việc

điều trị các vi khuẩn gram âm Enzym β-lactamase bao gồm enzym penicillinases, chống lại các kháng sinh penicillin, hoặc enzym AmpC cephalosporinases (ví dụ, MOXs, MIR, FOX) Có nhiều enzym β-lactamase phổ rộng (ví dụ, SHV-1, TEM-1, TEM-2, CTX), có khả năng thủy phân các penicillin và các cephalosporin và kháng lại các chất ức chế lactamase (ví dụ, axit clavulanic, sulbactam và tazobactam) Nhóm enzym kháng penicillin và cephalosporin, bao gồm cefotaxime và ceftazidime; Hơn nữa, nhiều vi khuẩn sản sinh enzym TEM và SHV còn đồng kháng với tetracycline, sulfonamides,

và aminoglycosid Phần lớn các vi khuẩn sinh enzym CTX-M kháng với fluoroquinolones Cuối cùng, enzym carbapenemases (ví dụ, IMP, VIM, KPCs, OXAs), là các enzym có khả năng bất hoạt tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam [10]

Biến đổi các protein liên kết penicillin (PBP)

PBPs là protein quan trọng có liên quan trong việc xây dựng các peptidoglycan, là thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn Các enzym này xúc tác các sợi glycan và liên kết ngang giữa các chuỗi glycan Các vị trí hoạt động của sợi glycan là mục tiêu của kháng sinh β-lactam Các hợp chất này bắt chước sợi peptit đôi D-Ala-D-Ala trong peptidoglycan và tạo thành một phức acyl-enzym rất ổn định, dẫn đến enzym bị bất hoạt Khi các PBP thay đổi vị trí hoạt động, thì các kháng sinh β-lactam sẽ để mất hoặc làm giảm ái lực của chúng với các protein mục tiêu, dẫn đến sự kháng thuốc [10]

Biến đổi Porin

Vi khuẩn gram âm có một lớp màng bên ngoài vách tế bào, màng ngoài, trong đó bao gồm một lớp lipid kép Các thành phần chính của lớp đôi này là lipopolysaccharide, là hợp chất kị nước, nên các hợp chất ưa nước rất khó khăn

để đi qua Do đó, porins hoặc porins màng ngoài (OMP), là các protein hỗ trợ trong việc thông qua các chất hòa tan thấm qua màng lipid kép Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng của thuốc để vượt qua porins, chẳng hạn như hình dạng, kích thước Có một số porins điển hình, chẳng hạn như OmpF, OmpC,

và OmpE Mỗi loài vi khuẩn sản xuất các porins cụ thể và sự mất mát hoặc giảm hoạt động của một hoặc nhiều OMP là một yếu tố góp phần phổ biến

trong việc xây dựng sức đề kháng (ví dụ, mất OprD) của P aeruginosa đối với

Imipenem và Meropenem Ở các loài khác, mất OmpF có thể dẫn đến các sinh vật kháng với nhiều loại kháng sinh (đa kháng) Trong một số chủng vi khuẩn,

sự giảm hoặc mất ái lực của thuốc với các protein (porin), dẫn đến mất khả năng để vượt qua các màng ngoài và không thể xâm nhập vào tế bào Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng áp lực chọn lọc tác dụng bởi việc sử dụng kéo dài thuốc kháng sinh là một yếu tố quan trọng trong sự xuất hiện của vi khuẩn

đa kháng và việc sửa đổi các porins là một yếu tố quan trọng sự hình thành đa kháng thuốc [10]

Protein bơm

Một cơ chế hiệu quả cao của kháng kháng sinh là sự sản sinh hệ thống protein bơm kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn Tất cả các thành viên của họ protein này bao gồm 3 dạng không thay đổi sau: Dạng A, đóng vai trò như cửa vào và ra của tế bào chất, kiểm soát sự di chuyển của các chất nền đến và đi từ các tế bào chất; dạng B, đó là tham gia vào các khớp nối năng lượng; và dạng

C, định hướng vị trí và đề xuất hướng vận chuyển Các protein đặc trưng nhất trong họ này là protein vận chuyển tetracycline (TetB), đã được tìm thấy trong

E coli [10]

Sửa đổi phân tử mục tiêu của các kháng sinh

Hầu hết các kháng sinh ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein đều nhằm vào các ribosome mục tiêu và sự khác biệt giữa cấu trúc của ribosome này cho các hành động chọn lọc của thuốc kháng sinh trong vi khuẩn, vi khuẩn

cổ và các tế bào nhân chuẩn Ngay cả giữa các loài, sự thay đổi nhỏ trong cấu trúc ribosome có thể dẫn đến sự tương tác đặc hiệu mang tính chất của loài lên kháng sinh Do đó các kháng sinh nhắm vào ribosome là chất diệt khuẩn rất mạnh Tuy nhiên, qua nhiều thập kỷ sử dụng, các tác nhân gây bệnh đã trở nên

đề kháng với thuốc kháng sinh ức chế sự tổng hợp protein Một cơ chế đáng chú ý của sự kháng là việc sửa đổi các mục tiêu của kháng sinh Ví dụ, những thay đổi nhỏ trong một chuỗi axit amin, dẫn đến thay đổi cấu trúc protein đủ để cản trở kháng sinh Các báo cáo đầu tiên của sự thay đổi cấu trúc ribosome

trong đột biến erythromycin kháng E coli mô tả sự thay đổi protein ribosome,

đáng chú ý là các protein L4 và L22 [10]

1.2.3 Hiện tượng kháng cephalosporine ở vi khuẩn gram âm

Escherichia coli và Acinetobacter spp là tác nhân gây bệnh quan trọng

ở người Các trường hợp nhiễm khuẩn nặng do các vi sinh vật nói trên thường được điều trị bằng cephalosporin phổ rộng (ESC) Tuy nhiên, trong hai thập kỷ qua, hoạt động điều trị đã phải đối mặt với sự gia tăng nhanh chóng các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi sự kháng cephalosporin phổ rộng của các chủng vi khuẩn gây bệnh do sự hình thành enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL), plamid trung gian AmpCs và các enzym carbapenemase Tình trạng này làm hạn chế đáng kể quá trình điều trị và gây nguy hiểm đến sức khỏe con người Gia cầm được xem như là nguồn chứa các vi khuẩn gram âm đa kháng thuốc Chính việc

sử dụng tự do các kháng sinh trong chăn nuôi đã góp phần vào sự thích nghi và tính chọn lọc của vi khuẩn trong quá trình kháng lại kháng sinh cephalosporin

phổ rộng của vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae Ngày

nay, sự phổ biến của thức ăn có nguồn gốc từ động vật có chứa các vi khuẩn

Enterobacteriaceae và E coli mang gen kháng kháng sinh cephalosporin phổ rộng (đặc biệt là các chủng vi khuẩn có chứa gen CTX-M và CMY-2 AmpC

mã hóa enzym β-lactamase) đã gây ra lo ngại cho việc điều trị bệnh Hơn nữa, gần đây với sự xuất hiện các chủng vi khuẩn kháng carbapenem (vi khuẩn đường ruột sản sinh VIM-1, NDM-1 hay OXA-23) đang là mối quan tâm lớn của cả cộng đồng [17]

Việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y đã góp phần vào việc lựa chọn và lây lan của các vi khuẩn gram âm đa kháng kháng sinh, đặc biệt là

E coli và Klebsiella pneumoniae kháng cephalosporin phổ rộng đã được phân

lập trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và từ môi trường nước Nguy cơ trước mắt của tình trạng này là sự lây truyền các chủng vi khuẩn kháng cephalosporin phổ rộng hay ESBL từ thực phẩm lên người do tiêu thụ thực phẩm có mang mầm bệnh, hơn nữa sự lây lan từ người sang người qua chất thải (phân) thông qua môi trường và bệnh viện cũng được xem là môi trường lý

tưởng cho sự phát tán các mầm bệnh kháng kháng sinh ra cộng đồng thông qua

hệ thống nước thải (xem Hình 1.8) [16, 17, 18]

Hình 1.8 Con đường lây nhiễm và phát tán mầm bệnh ra cộng đồng [19]

1.2.4 Enzym β-lactamase

Sự kháng kháng sinh β-lactam trong các vi khuẩn gây bệnh gram âm có

xu hướng liên quan đến sự sinh enzym β-lactamase Báo cáo tổng hợp gần đây

về β-lactamase theo cấu trúc và chức năng cho thấy có hơn 950 enzym với cấu trúc tự nhiên được mô tả Các enzym này tồn tại dưới dạng β-lactamases đặc

trưng cho cá thể, ví dụ là loài Klebsiella oxytoca, enzym có thể được tạo ra bởi

các thành phần ngoài nhiễm sắc thể với tám enzym β-lactamase khác nhau xuất hiện trong một cá thể Mối quan tâm lớn của các nhà nghiên cứu là khả năng thay đổi ngày càng tăng của vi khuẩn để sản sinh các enzym β-lactamase phân giải tất cả các kháng sinh β-lactam [2]

β-lactamase gồm 4 nhóm chính có thể được xác định dựa trên các đặc tính của kháng sinh: penicillinase, cephalosporinase kiểu AmpC, β-lactamases phổ rộng (ESBLs) và carbapenemases (xem Hình 1.9), ESBLs, cephalosporinase có thể thủy phân cephalosporin phổ rộng như cefotaxime

hoặc ceftazidime Các vi khuẩn Enterobacteriacease sản sinh ra các enzym này

với khả năng thuỷ phân hầu hết các kháng sinh penicillin và cephalosporin, dẫn đến việc sử dụng kháng sinh carbapenem thường xuyên hơn Tuy nhiên, các báo cáo cũng cho thấy các vi khuẩn gram âm sinh enzym carbapenemases cũng đạt được tỷ lệ cao Enzym carbapenemase này có tỷ lệ bất hoạt cao đối với kháng sinh carbapenems, các kháng sinh lactam phổ rộng đang được sử dụng

để chống lại vi khuẩn gram sinh enzym β-lactamase [2]

Hình 1.9 Các nhóm enzym β-lactamase [2]

Dựa trên sự phân loại của Ambler, enzym β-lactamase có thể được phân loại vào bốn lớp, lớp A đến D, dựa trên axit amin chuỗi giống nhau và cấu trúc phân tử Lớp A, C, D gồm các cấu trúc giống penicillin và liên quan đến protein liên kết penicillin Các lớp này khác nhau bởi trọng lượng của protein liên kết penicillin Lớp B β-lactamase, mặc dù cũng thủy phân vòng β-lactam, nhưng cấu trúc không liên quan đến các protein liên kết penicillin Các enzym β-lactamase thường thấy trong điều trị lâm sàng là lớp A hoặc lớp C Loại A enzym thủy phân thường ưu tiên penicillin, nhưng cũng có thể phân giải

cephalosporin hoặc carbapenemase Thông thường họ các enzym β-lactamase

bị ức chế bởi axit clavulanic.Tuy nhiên điểm đột biến có thể khiến các enzym kháng với các chất ức chế hoặc mở rộng phổ hoạt động bao gồm các cephalosporin thế hệ thứ ba và aztreonam (gọi là β-lactam phổ rộng) Lớp enzym β-lactamase C ưu tiên thủy phân cephalosporin và không bị ức chế bởi axit clavulanic Các β-lactamase thường được mã hóa trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid Enzym loại B là các enzym hoạt động phổ rộng, và có thể thủy phân tất cả các kháng sinh β-lactam trừ aztreonam [20]

1.2.4.1 Enzym β-lactamase phổ rộng

Nhóm enzym β-lactamase phổ rộng (ESBL), là enzym có tác dụng kháng cephalosporin thế hệ ba và thế hệ 4, carbapenem và monobactam Hiện tượng kháng các kháng sinh trên đã được ghi nhận vào thập niên 1980, tại Đức, năm

1983, ca bệnh đầu tiên đã được mô tả là có sự xuất hiện vi sinh vật sản sinh

enzym β-lactamase Vi khuẩn sinh enzym ESBL thường đa kháng do các gen

qui định tính kháng lên các loại kháng sinh khác nhau đều nằm trên cùng 1 plasmid Một số vi khuẩn sinh enzym ESBL kháng với nhóm aminoglycosides, 4-quinolon Bên cạnh đó nhiều vi khuẩn sinh enzym beta-lactamase phổ rộng đang hoạt động chống lại hầu hết các kháng sinh β-lactam, bao gồm oxyimino-betalactams, ceftazidime, ceftiofur, aztreonam, có thể bị bất hoạt bởi axit clavulanic [21]

Nhóm enzym ESBL được phân loại dựa trên cấu tạo, kết cấu phân tử của enzym và nhóm kháng sinh mà các enzym này ức chế Năm 2010, dựa trên cấu trúc phân tử, các enzym β-lactamase được chia làm 4 nhóm: nhóm 1 (lớp C) bao gồm các enzym kháng cephalosporin; nhóm 2 (lớp A và D) bao gồm ESBL

và các enzym carbapenemase; nhóm 3 gồm metallo-β-lactamase; nhóm 4 là các enzym penicillinase kháng axit clavulanic [21]

ESBL còn được định nghĩa là các enzym β-lactamase có thể bị ức chế bởi axit clavulanic, tazobactam hoặc sulbactam, và được mã hóa bởi các một

số gen có thể được trao đổi giữa các vi khuẩn như sau:

Enzym SHV

Tập hợp các enzym SHV của nhóm β-lactamase dường như được bắt

nguồn từ Klebsiella spp Khởi nguồn của tập hợp enzym SHV, là SHV-1, tìm thấy đầu tiên trong chủng vi khuẩn gây bệnh K pneumoniae Trong nhiều chủng K pneumoniae, các gen mã hóa SHV 1, LEN-1, cư trú trên các nhiễm sắc thể của vi khuẩn, sau đó được kết hợp vào một plasmid và đã phát tán gen

này đến các vi khuẩn đường ruột khác SHV-1 kháng với penicillin phổ rộng như ampicillin, tigecycline và piperacillin Các enzym SHV-1 β-lactamase chịu trách nhiệm trong 20% trường hợp kháng ampicillin liên quan đến plasmid

trong K pneumonia [22]

Enzym TEM

Enzym TEM-1, lần đầu tiên được báo cáo từ một chủng E coli phân lập

vào năm 1965, có khả năng kháng kháng sinh tương tự như enzym SHV-1 TEM-1 có khả năng thủy phân penicillin và cephalosporin thế hệ đầu tiên nhưng không thể tấn công các cephalosporin oxyimino Tuy nhiên sau đó đã xuất hiện các biến thể TEM đầu tiên gia tăng hoạt động chống lại các cephalosporin phổ rộng là TEM-3 TEM-3, lần đầu được báo cáo vào năm

1989, là enzym TEM β-lactamase đầu tiên hiển thị các kiểu hình ESBL Hiện nay các biến thể của TEM ngày càng mở rộng về số lượng và phổ biến trong các vi khuẩn đường ruột [22]

Enzym CTX

Một nhóm enzym β-lactamase mới là CTX, ưu tiên thủy phân cefotaxime

Nhóm enzym này đã được tìm thấy trên một số chủng vi khuẩn như Salmonella Typhimurium, E coli và một số loài Enterobacteriaceae khác Đây là nhóm

enzym không liên quan rất chặt chẽ với TEM hoặc SHV β-lactamase CTX-M

β-lactamase được cho là bắt nguồn từ gen trên nhiễm sắc thể trong loài Kluyvera spp., một tác nhân gây bệnh cơ hội của thuộc vi khuẩn Enterobacteriaceae được

tìm thấy trong môi trường Protein CTX-M đã được phát hiện vào cuối những năm 1980 và ngày nay hơn 100 biến thể đã được giải trình tự [21]

khuẩn lạc P aeruginosa từ bệnh viện ở Ankara, Thổ Nhĩ Kỳ Sự tiến hóa của

enzym ESBL OXA có nhiều điểm tương đồng với sự tiến hóa của enzym ESBL SHV- và TEM [22]

Các enzym ESBL khác

Một số enzym ESBL khác như PER, GES, BES, CME, SFO, GES, PSE

đã được tìm thấy và phân lập trên vi sinh vật gây bệnh ở khắp nơi trên thế giới [23]

1.2.4.2 β-lactamase AmpC

AmpC β-lactamase chủ yếu là các enzym được mã hóa bởi gen nằm trên

nhiễm sắc thể tạo ra tính kháng với penicillin, cephalosporin phổ hẹp, lactam, và cephamycin và không nhạy cảm với các chất ức chế-lactamase như nhóm axit clavulanic Sự sản sinh AmpC trong trực khuẩn gram âm thường bị

oxymino-ức chế Tuy nhiên, sự gia tăng tạm thời trong sản xuất enzym AmpC (gấp 10 đến 100 lần) có thể xảy ra với sự hiện diện của kháng sinh β-lactam ở các loài

sau đây: Enterobacter, Citrobacter freundii, Serratia, M morganii, Providencia và P aeruginosa Quá trình sản xuất β-lactamase của AmpC trở

lại mức thấp sau khi ngừng tiếp xúc với kháng sinh, trừ khi đột biến tự phát xảy

ra ở locus ampD của gen, dẫn đến sự sản xuất vĩnh viễn enzym ở những loài này Sử dụng Cephalosporin thế hệ thứ ba trong điều trị bệnh do Enterobacter

spp là cơ hội cho vi khuẩn lựa chọn và sản sinh các đột biến, dẫn đến sự xuất hiện hiện tượng kháng kháng sinh trong quá trình điều trị [22]

Hơn 20 enzym AmpC qua trung gian plasmid, có nguồn gốc từ các gen được mã hóa bởi nhiễm sắc thể trong Enterobacteriaceae hoặc Aeromonas spp.,

đã được tìm thấy trong E coli, K pneumoniae, Salmonella enterica và Proteus mirabilis [22] Thành viên thường gặp nhất của nhóm này là enzym beta- lactamase CMY 2 trong vi khuẩn Salmonella phân lập từ động vật, gia cầm và trên vi khuẩn Shigella, E coli O157 từ các vụ dịch [24]

1.2.4.3 Carbapenemase

Carbapenemase là tập hợp gồm các enzym có Serin trong vị trí hoạt động

và enzym Metallo β-lactamase (MBLs) mà sử dụng ít nhất 1 nguyên tố kẽm cho hoạt động phân giải kháng sinh

Các enzym carbapenemases Serine lần đầu tiên được xác định vào giữa

những năm 1980 với số lượng hạn chế trên vi khuẩn E coli, nhưng bây giờ đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới Điều quan trọng nhất là enzym Klebsiella pneumoniae carbapenemase - KPCs, được các plasmid truyền phát tán khắp các loài vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae và các loài vi khuẩn không sản

sinh enzym này Hai enzym tương đương về sinh hóa KPC-2 và KPC-3 là phổ biến nhất, sự khác biệt giữa các isoenzym này là sự thay thế amino axit đơn (His272 đổi thành Tyr) [22]

Enzym Metallo-β-lactamases (MBLs) hiện nay được tìm thấy trên toàn cầu do sự lan truyền bởi plasmid ở nhiều loài vi khuẩn Hơn 80 MBL khác nhau

đã được xác định trên toàn thế giới, với hơn 75% số enzym này xuất hiện như các enzym mã hoá từ plasmid Các họ chính của các MBL đã bao gồm enzym

IMP và VIM β-lactamase, ban đầu được tìm thấy trong P aeruginosa, nhưng bây giờ chúng đã được tìm thấy trong Enterobacteriaceae Việc sản xuất MBL trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae được ghi nhận từ năm 1994 khi IMP-1 mã hoá từ plasmid được xác định trong loài Serratia marcescens tại

Nhật Bản [22]

1.3 THỰC PHẨM – NGUỒN CHỨA ENTEROBACTERIACEAE

Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có thể

lây nhiễm lên thực phẩm theo con đường trực tiếp hoặc gián tiếp từ nhiều nguồn khác nhau hoặc tự chúng có thể đại diện cho hệ vi sinh vật tự nhiên của thực

phẩm Một số chi thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea thường xuất hiện rộng rãi và phổ biến trong thực phẩm bao gồm Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Yersinia, Escherichia, Proteus và Salmonella, có

thể xâm nhập vào chuỗi thức ăn hoặc có thể liên quan đến các loại thực phẩm thông qua nhiễm phân (xem Hình 1.10) [1, 24]

Ô nhiễm thực phẩm bởi mầm bệnh đường ruột (Enterobacteriaceae) có

thể xảy ra từ trang trại nếu nước thải của con người được sử dụng để bón cho đất hoặc nếu nước thải được sử dụng để tưới cho cây trồng Trái cây tươi và rau quả có thể trở nên bị ô nhiễm trước hoặc sau khi thu hoạch Những rủi ro như vậy sẽ tăng thêm nếu thực phẩm bị xử lý sai trong quá trình chế biến và chuẩn bị, trong chuỗi thức ăn các mầm bệnh có thể nhân lên theo cấp số nhân trong điều kiện thuận lợi [26]

Hình 1.10 Con đường lây truyền Enterobacteriaceae lên người [25]

1.3.1 Rau ăn sống – vật chủ chứa Enterobacteriaceae

Trong các sản phẩm thực phẩm thì con người có xu hướng tiêu thụ các sản phẩm tươi, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho cơ thể khỏe mạnh Trong các sản phẩm được tiêu thụ thì rau ăn sống là thực phẩm giàu dinh dưỡng cung cấp vitamin, khoáng và chất xơ, nên mức tiêu thụ các sản phẩm rau đã tăng lên trong thập kỷ gần đây Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới (WHO) việc tiêu thụ quá ít rau quả đã dẫn tới sự tử vong của 1,7 triệu người trên toàn thế giới WHO và tổ chức Nông Lương (FAO) cũng khuyến cáo con người cần

bổ sung ít nhất 400 g trái cây và rau mỗi ngày (không bao gồm các loại cây trồng có nguồn gốc tinh bột) để phòng tránh các bệnh mãn tính như bệnh tim, tiểu đường, béo phì và ngăn ngừa các bệnh khác do thiếu vi chất [27]

Rau ăn sống thường chứa các vi sinh vật không gây bệnh, nhưng trong quá trình trồng trọt, thu hoạch, vận chuyển và xử lý, sản phẩm có thể bị nhiễm mầm bệnh từ nguồn nước, chất thải của động vật và con người Hầu hết các sản phẩm này có thể tiêu thụ trực tiếp mà không cần chế biến thêm hoặc không cần

xử lý nhiệt, do đó các vi sinh vật gây bệnh có trong rau sống có thể là nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe của người tiêu dùng và nảy sinh vấn đề an toàn thực phẩm cần kiểm soát Sự nhiễm bẩn có thể là kết quả của việc xử lý đất với các chất hữu cơ phân bón, như bùn thải và phân chuồng, và từ nước tưới, cũng như

từ khả năng của mầm bệnh để tồn tại và phát triển trong rau Dịch tễ học của bệnh lây truyền qua thực phẩm đã thay đổi nhanh chóng trong những thập kỷ gần đây, ngay sau khi một số mầm bệnh chủ yếu của con người được công nhận

là lây lan từ các trang trại nuôi động vật, thì rau ăn sống đã nổi lên như một nguồn chứa nguy cơ mới để truyền các mầm bệnh lên người Bên cạnh đó mức tiêu thụ rau ăn sống cũng đã tăng lên trong những năm gần đây, song song đó,

kể từ đầu những năm 1990, các vụ ngộ độc liên quan đến việc tiêu thụ rau ăn sống cũng đã tăng lên nhanh chóng Hầu hết các báo cáo về triệu chứng dạ dày-ruột kết do ăn rau ăn sống đều có liên quan đến ô nhiễm vi khuẩn, đặc biệt là

với các thành viên họ Enterobacteriaceae [28]

Tiêu thụ rau ăn sống cũng là con đường mà qua đó con người tiếp xúc

với vi khuẩn gây bệnh mang gen kháng kháng sinh Ngoài ra, sự hiện diện của

vi khuẩn kháng kháng sinh trong rau ăn sống có thể góp phần làm lan rộng tính kháng kháng sinh giữa các quần thể vi khuẩn theo chiều ngang giữa các chủng,

loài và chi khác nhau Sự hiện diện của các gen kháng trên các yếu tố di truyền

di động tạo điều kiện cho sự phân bố và lan truyền tính kháng kháng sinh và việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh trong điều trị đã góp phần hình thành nhân

tố kháng trong vi khuẩn Việc sử dụng một lượng lớn thuốc kháng sinh trong nông nghiệp có thể dẫn đến việc thích nghi của các vi khuẩn kháng thuốc; bên cạnh đó sử dụng phân từ chăn nuôi động vật sang nông nghiệp hoặc sử dụng nước bị ô nhiễm để tưới rau cũng có thể lây lan vi khuẩn kháng bệnh cho rau trồng Từ đó lây lan sang người qua con đường tiêu thụ rau Do đó, sự hiện diện của vi khuẩn kháng thuốc trong rau ăn sống đã làm dậy lên mối nguy về an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng [28]

Một trong những mối quan tâm liên quan đến kháng kháng sinh trên toàn

thế giới là việc phổ biến các vi khuẩn gram âm đặc biệt là Enterobacteriaceae

có khả năng kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3 (3GCs) Khả năng kháng đối với 3GCs thường do sự sản sinh enzym β-lactamases phổ rộng (ESBLs) hoặc AmpC β-lactamases và thường liên quan đến các vi khuẩn

Enterobacteriaceae hiện diện trong phân như Citrobacter spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, và Klebsiella spp Những vi khuẩn này có thể tồn tại

trong đất nông nghiệp thông qua việc sử dụng phân chuồng gia súc hoặc nước

mặt bị nhiễm bẩn do tưới tiêu Vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae thuộc chi Kluyvera, Serratia và Rahnella có trong đất và nước, là dạng vi khuẩn tự

nhiên chứa enzym ESBL, là yếu tố quyết định về khả năng kháng 3GC Trong quá trình canh tác trong đất (thay đổi phân chuồng) và / hoặc khi được tưới bằng nước bị ô nhiễm, rau có thể có thể bị nhiễm vi khuẩn sinh enzym ESBL Đặc biệt, việc tiêu thụ rau ăn sống có thể dẫn đến việc nhiễm vi khuẩn kháng

3GC và trao đổi gen kháng kháng sinh với vi khuẩn đường ruột trong suốt quá

trình tiêu hóa, do đó có thể ảnh hưởng tới sức khoẻ cộng đồng Hiện nay có rất nhiều nghiên cứu về sự hiện diện của vi khuẩn đường ruột trên rau sống và tính kháng kháng sinh của các vi khuẩn này, tuy nhiên chỉ có một số ít vài nghiên

cứu tiến hành khảo sát sự hiện diện của Enterobacteriaceae kháng 3GC trên

rau [17, 28]