Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn pasteurelia multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở bò tại huyện thạch thất hà nội và biện pháp phòng trị

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VƯƠNG THỊ CHUNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở BÒ TẠI HUYỆN THẠCH THẤT- HÀ NỘ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VƯƠNG THỊ CHUNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

VƯƠNG THỊ CHUNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG Ở BÒ

TẠI HUYỆN THẠCH THẤT- HÀ NỘI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

- Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực, kháchquan và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình khoa học nàokhác

- Mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện, nghiên cứu, viết luận vănnày đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn, sử dụng trong luận văn đượcghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Vương Thị Chung

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, BanChủ nhiệm Khoa thú y, phòng Đào tạo cùng các thầy giáo, cô giáo đã giảngdạy trong chương trình đào tạo thạc sĩ ngành Thú y, những người đã truyềnđạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại Nhàtrường, là những cơ sở quan trọng giúp tôi hoàn thành các nội dung của đề tài.Tôi xin được chân thành cảm ơn Thầy giáo PGS.TS Đặng Xuân Bình

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài vàhoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân, bạn bè của tôi đãluôn cổ vũ, động viên và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian thực tập vàhoàn thành đề tài tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 04 tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Vương Thị Chung

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Những hiểu biết về vi khuẩn Pasteurella multocida 3

1.1 Hình thái 3

1.2 Đặc tính nuôi cấy 3

1.3 Đặc tính sinh hóa 3

1.4 Sức đề kháng 6

1.5 Kháng nguyên 6

1.2 Những hiểu hiểu biết về bệnh Tụ huyết trùng ở bò

7 1.2.1 Dịch tễ học 7

1.2.2 Triệu chứng lâm sàng 10

1.2.3 Bệnh tích 10

1.2.4 Chẩn đoán bệnh 11

1.2.5 Phòng và trị bệnh Tụ huyết trùng ở bò 12

.1 3 Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng ở bò trên thế giới và Việt Nam 15

1.3.1 Trên thế giới 15

1.3.2 Việt Nam 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN

CỨU 20

2.1 Đối Tượng nghiên cứu 20

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.4 Nguyên vật liệu 20

2.4.1 Máy móc 20

2.4.2 Dụng cụ 21

2.4.3 Môi trường - Hóa chất - Nguyên liệu 21

2.5 Phương pháp nghiên cứu 21

2.5.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 21

2.5.2 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng 22

2.5.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn Pasteurella multocida 22

2.5.4 Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được 25

2.5.5 Phương pháp thử kháng sinh đồ 25

2.5.6 Phương pháp PCR (theo Nagai et al., 1994) 26

2.5.7 Thử nghiệm phác đồ điều trị 29

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Tình hình chăn nuôi trâu bò tại huyện Thạch Thất, thành phố Hà Nội 30

3.2 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất năm 2018 - 2019 31

3.2.1 Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất năm 2018 và 2019 31

3.2.2 Tỷ lệ bò mắc bệnh Tụ huyết trùng theo tháng trong năm 2018 và 2019 34

3.2.3 Tỷ lệ bò mắc bệnh do bệnh Tụ huyết trùng theo lứa tuổi 37

3.2.4 Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng ở bò mắc bệnh Tụ huyết

trùng bò 39

3.2.5 Tình hình tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùng cho bò của huyện Thạch Thất 41

3.3 Phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của Pasteurella multocida trong bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất 42

3.3.1 Kết quả phân lập và xác định đặc tính sinh vật hóa học của Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe và từ các mẫu bệnh phẩm của trâu, bò nghi mắc bệnh 42

3.3.2 Kết quả xác định đặc tính sinh vật hóa học của Pasteurella multocida từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe và từ các mẫu bệnh phẩm của trâu, bò nghi mắc bệnh 45

3.3.3 Kết quả giám định vi khuẩn Pasterulla multocida bằng kỹ thuật PCR 48

3.3.4 Kết quả xác định độc lực của các chủng Pasteurella multocida phân lập được 49

3.3.5 Kết quả thử kháng sinh đồ các chủng Pasteurella multocida phân lập được 51

3.4 Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng bò, đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất 52 3.4.1 Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh Tụ huyết trùng bò 52

3.4.2 Đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

1 Kết luận 57

2 Đề nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Phụ lục 68

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

P multocida Pasteurella multocida

DNA: deoxyribonucleic acid

PCR: Polymerase Chain Reaction

TLMBC: Tỷ lệ mắc bệnh chung

Cs: Cộng sự

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH

Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida 6 Bảng 2.1 Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida 27 Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR phát hiện Pasterella multocida 27

Bảng 3.1 Kết quả điều tra tổng đàn trâu, bò phân bố trên địa bàn huyện Thạch

Thất, thành phố Hà Nội 30 Bảng 3.2 Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất trong 2

năm 2018 và 2019 32 Bảng 3.3 Tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng ở bò theo các tháng trong năm tại

huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019 34 Bảng 3.4 Tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi tại huyện Thạch Thất năm

2018 và 2019 theo lứa tuổi 37 Bảng 3.5 Triệu chứng lâm sàng, chủ yếu của bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi

tại huyện Thạch Thất 40 Bảng 3.6 Tổng hợp kết quả tiêm phòng vắc xin Tụ huyết trùngcho bò của

huyện Thạch Thất năm 2018 và 2019 41

Bảng 3.7 Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ mẫu dịch ngoáy mũi bò

khỏe tại huyện Thạch Thất 43

Bảng 3.8 Kết quả phân lập Pasteurella multocida từ bò nghi mắc bệnh Tụ

huyết trùng tại huyện Thạch Thất 44 Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi

khuẩn Pasteurella multocida phân lập được 46

Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn

Pasterulla multocida phân lập được 47

Bảng 3.11 Kết quả giám định vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phản ứng

PCR

48

Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn Pasteurella

multocida phân lập được trên chuột bạch 49

Bảng 3.13 Kết quả kháng sinh đồ của các chủng Pasteurella multocida phân

lập được 51 Bảng 3.14 Kết quả điều trị bệnh Tụ huyết trùng bò tại huyện Thạch Thất 56

tại huyện Thạch Thất trong 2 năm 2018 và 2019 35 Hình 3.3 Biểu đồ tình hình bệnh Tụ huyết trùng ở bò nuôi tại huyện Thạch Thất

năm 2018 và 2019 theo lứa tuổi 38

Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ dương tính với Pasteurella multocida từ mẫu dịch

ngoáy

mũi bò khỏe tại huyện Thạch Thất 43

Hình 3.5 Biểu đồ tỷ lệ dương tính với Pasteurella multocidatừ bò nghi mắc

bệnh Tụ huyết trùng tại huyện Thạch Thất 44

1

1 Đặt vấn đề

MỞ ĐẦU

Những năm qua ngành chăn nuôi ở nước ta đã và đang có những bướcphát triển đáng kể, nhằm cung cấp sức kéo, thịt và sữa Tuy nhiên, ngànhchăn nuôi bò vẫn luôn phải đối mặt với những thách thức và khó khăn như:dịch bệnh, bệnh truyền nhiễm và bệnh ký sinh trùng, trong đó có bệnh Tụhuyết trùng Bệnh Tụ huyết trùng ở bò thể bại huyết (Hemorrhagic

Septicemia) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, do cầu trực khuẩn Pasteurella

multocida thuộc các type A, B, D, E gây ra hiện tượng tụ huyết, xuất huyết ở

một số vùng trong cơ thể, chủ yếu là phổi, tim và có thể cả ruột Vi khuẩn xâmnhập vào máu gây bại huyết toàn thân

Bệnh Tụ huyết trùng bò có ở khắp nơi trên thế giới Ở Việt Nam, bệnh

có thể gặp khắp các tỉnh thành, thường xảy ra lẻ tẻ, mang tính địa phương.Theo các báo cáo tổng kết công tác thú y hàng năm của các địa phương và kếtquả nghiên cứu của Đặng Xuân Bình và cs (2010); tại tỉnh Hà Giang năm

2008 đã có 276 con trâu, 157 con bò chết vì bệnh Tụ huyết trùng, tương tựnhư vậy, tại tỉnh Cao Bằng trong năm 2008 đã có 455 con trâu, bò chết vànăm 2009 có gần

400 con trâu bò chết do bệnh Tụ huyết trùng Theo thông báo của Cục thú y,hiện nay ở Việt Nam có đến 30 đến 35 tỉnh thành có bệnh Tụ huyết trùng trâu,

bò chúng gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi, Bệnh xảy ra quanh năm,nhưng thường bùng phát vào mùa mưa, lúc khí hậu nóng ẩm, và những lúcgiao mùa thời tiết thay đổi đột ngột, sức đề kháng trâu, bò giảm sút và giếtchết nhiều trâu, bò

Huyện Thạch Thất là địa phương có nhiều hộ nuôi bò, đặc biệt là cácxãvùng đồi gò bán sơn địa và các xã miền núi như: Tiến Xuân, Yên Bình, YênTrung, Tình hình bò mắc bệnh Tụ huyết trùng thường xuyên xảy ra và gâythiệt hại cho người chăn nuôi tại địa phương Vấn đề tìm được loại kháng sinhphù hợp giúp điều trị bệnh hiệu quả là đòi hỏi rất cấp thiết Xuất phát từ yêu

cầu của thực tiễn sản xuất, căn cứ vào cơ sở khoa học và năng lực của cơ quan

nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số đặc tính sinh

học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất - Hà Nội và biện pháp phòng trị”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định đặc điểm dịch tễ, sự lưu hành của vi khuẩn Pasteurella

multocida ở bò khỏe và bò nghi mắc bệnh Tụ huyết trùng bệnh Tụ huyết trùng

bò tại các xã thuộc huyện Thạch Thất - Hà Nội

- Giám định đặc tính sinh vật hóa học, yếu tố gây bệnh của vi khuẩn

Pasteurella multocida phân lập được.

- Lựa chọn được phác đồ điều trị bệnh Tụ huyết trùng hiệu quả tại địa phương

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

+ Ý nghĩa khoa học:

- Bổ sung tư liệu về đặc điểm dịch tễ bệnh Tụ huyết trùng ở bò huyệnThạch Thất (Hà Nội) vào bản đồ dịch tễ học của bệnh khu vực các tỉnh phíaBắc Việt Nam

- Bổ sung tư liệu về kết quả phân lập, giám định đặc tính sinh vật hóa

học, yếu tố độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được.

+ Ý nghĩa thực tiễn:

- Cơ sở để lựa chọn kháng sinhcó hiệu quả điều trị cao Góp phần khốngchế bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại huyện Thạch Thất, thành phố Hà Nội

- Kết quả nghiên cứu phục vụ cho công tác phòng chống bệnh của cán

bộ thú y cơ sở và người chăn nuôi bò địa phương

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Những hiểu biết về vi khuẩn Pasteurella multocida

1.1 Hình thái

Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ 2 đầu tròn, kích thước từ

0,6 - 2,5µm x 0,2 - 0,4 µm, vi khuẩn không có lông, không di động, không hình thành nha bào và bắt màu Gram âm (Smith JE., 1959)

Trong cơ thể bệnh, vi khuẩn hình thành giáp mô nhưng khó quan sát vàkhi nhuộm vi khuẩn có hiện tượng bắt màu sẫm hơn ở hai đầu tế bào nên

P.multocida được gọi là vi khuẩn lưỡng cực (Smith JE., 1959).

Hình thái và kích thước của vi khuẩn có thể thay đổi tuỳ thuộc vào cácđiều kiện nuôi cấy khác nhau (Rimler R.B., 1992) Trong máu động vật, hìnhthái của vi khuẩn thường đồng nhất, còn khi phát triển trong môi trường nhântạo vi khuẩn thường đa hình thái, hình trứng, hình cầu hoặc hình que Khi nuôicấy trong môi trường có cho thêm carbonhydrate, vi khuẩn thường kết lạithành chuỗi dài (Rosenbusch C T, Merchant I A., 1939)

1.2 Đặc tính nuôi cấy

P multocida là vi khuẩn yếu khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp 370C, pHthích hợp từ 7,2-7,4 Mọc chủ yếu trên các môi trường nuôi cấy thông thường,môi trường có bổ sung huyết thanh hoặc máu thì vi khuẩn mọc tốt (NguyễnNhư Thanh và cộng sự, 2001) Tuy nhiên không mọc trên thạch MacConkey.Môi trường nước thịt: sau 24 giờ nuôi cấy, môi trường đục vừa, mùi tanhđặc biệt như mùi nước dãi khô, lắc có vẩn như sương mù rồi lại mất, đáy ống

có cặn nhày, trên mặt môi trường có màng mỏng

Môi trường thạch thường: sau 24 giờ nuôi cấy trên mặt thạch hình thànhkhuẩn lạc dạng S nhỏ, trong suốt, long lanh như giọt sương Nuôi lâu khuẩn

lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường P multocida có thể phát triển

thành khuẩn lạc dạng S, dạng R hay dạng M trong môi trường này Khuẩn lạcdạng S (Smooth) là khuẩn lạc trơn, bóng láng, mặt vồng, có dung quang sắccầu vồng, là dạng khuẩn lạc có độc lực mạnh, vi khuẩn thuộc dạng khuẩn lạcnày thường

tạo thành lớp giáp mô nhiều hơn khuẩn lạc dạng xù xì Khuẩn lạc dạng R(Rough) thường dẹt, có rìa nhám xù xì, trơn nhám, có dung quang màu xanh,

có độc lực yếu hơn Khuẩn lạc dạng M (Mucoid) ướt nhày, có kích thước tonhất, rìa khuẩn lạc nhẵn, dung quang sắc cầu vồng yếu hơn dạng S Hình dạngkhuẩn lạc có thể thay đổi, khi nuôi cấy lâu ngày khuẩn lạc tăng kích thước,nhớt và dính chặt vào mặt thạch, còn khi cấy chuyển nhiều lần thì giáp mômất đi, kích thước khuẩn lạc nhỏ lại, không màu và trong suốt

Môi trường thạch máu: vi khuẩn không gây dung huyết, phát triển tốt,khuẩn lạc to hơn thạch thường Đây là môi trường dùng để nhân và giữ giống

vi khuẩn (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001)

Đặc trưng của vi khuẩn P multocida là khuẩn lạc có mùi thơm ngọt và

không gây dung huyết

Môi trường thạch - huyết thanh - huyết cầu tố: là môi trường dùng đểphân lập, giám định, xác định độc lực của vi khuẩn Môi trường này, khuẩnlạc hình thành có hiện tượng tán sắc (iridescent) Khi xem khuẩn lạc dướikính hiển vi hai thị kính với độ phóng đại thấp (x20) và góc chiếu phản quangcủa ánh sáng đèn điện 450, tùy theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc củakhuẩn lạc khác nhau.Vi khuẩn có độc lực cao thì khuẩn lạc của chúng quansát thấy 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn có màu xanh lơ hay xanh lá mạ;1/3 diện tích khuẩn lạc có màu vàng ánh kim hay màu da cam; gọi là khuẩnlạc Fg (Greenish Fluorescent) Vi khuẩn có độc lực vừa biểu hiện 2/3 diện tíchkhuẩn lạc về phía đèn có màu vàng ánh kim hay màu da cam, gọi là khuẩn lạc

Fo (Orange Fluorescent) Vi khuẩn có độc lực yếu, khuẩn lạc của chúngkhông có hiện tượng tán sắc, không màu gọi là Nf (Not Fluorescent)

Hiện tượng tán sắc của khuẩn lạc thấy rõ sau nuôi cấy 24 giờ, chúng sẽmất đi nếu để qua 72 giờ nuôi cấy

Môi trường nước thịt pepton: sau cấy 24 giờ vi khuẩn làm đục môitrường, vài ngày sau môi trường trở nên trong, dưới đáy có cặn nhày, lắc khótan

Để nuôi cấy vi khuẩn chế tạo vắc xin người ta thường sử dụng môitrường cơ bản có thêm đường sucrose, peptone và chất chiết men bia Theo

Namioka và Murata (1961), môi trường nuôi cây tốt nhất cho vi khuẩn P.

multocida là

Yeast extract Pepton-L-Cystin (YPC) có thêm sucrose và natri sulfite(Na2SO3) Đây là môi trường giúp cho sự tái tạo giáp mô của vi khuẩn vàcũng là môi trường phân lập, giữ giống và nhân giống Môi trường Hottinger

cũng rất tốt cho vi khuẩn Pasteurella phát triển.

1.3 Đặc tính sinh hóa

Mỗi vi khuẩn có một phản ứng sinh hóa đặc trưng, vì vậy bước đầu cầngiám định các đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn nghiên cứu Đa số các

chủng vi khuẩn P multocida có khả năng lên men không sinh hơi đường

galactose, glucose, mannose, sorbitol, mannit, sozbit, xylose và sucrose Vi

khuẩn P multocida không lên men đường lactose, maltose, arabino, rammo, salixin, dunxin, adonit P multocida không làm tan chảy gelatin, không mọc

trên môi trường khoai tây, không làm đông vón sữa

Các chủng vi khuẩn P multocida có khả năng sinh indol và khi thay đổi

thành phần của môi trường cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh indol sớm hay

muộn.Vi khuẩn P multocida sẽ mất đặc tính sinh indol khi cấy chuyển nhiều

lần trên môi trường nhân tạo Nhưng chúng sẽ có lại đặc tính này khi tăngcường giống bằng cách tiêm truyền cho bản động vật Ngoài ra vi khuẩn nàycòn cho kết quả catalazavà oxydaza dương tính

Nhiều nghiên cứu đã cho biết đặc tính sinh hóa của các chủng

P.multocida được phân lập từ các vùng khác nhau: Phùng Duy Hồng Hà

(1990) đã nghiên cứu về khả năng lên men đường của P multocida phân lập

từ gia cầm bị bệnh Tụ huyết trùng tại Việt Nam, chúng có đặc tính hoá thôngthường như lên men glucose, sucrose Riêng đường sorbitol có 3 chủng luôncho phản ứng âm tính,

3 chủng luôn cho phản ứng dương tính, 26 chủng còn lại cho kết quả thay đổi,

lúc âm lúc dương Nghiên cứu P.multocida trên lợn của Úc và Việt Nam của

Trần Xuân Hạnh (2002) cho thấy khoảng 24,1% dương tính với đườnglactose và 100% dương tính với đường sorbitol

Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa chung của Pasteurella multocida

(Theo Smith JE, 1959)

Theo Hoàng Ðăng Huyến (2004) nghiên cứu về đặc tính sinh hóa của vi

khuẩn P multocida phân lập từ trâu, bò tại Bắc Giang và Phạm Thị Phương

Lan và cộng sự (2012) xác định đặc tính sinh hóa các chủng vi khuẩn này tại

hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng đều cho biết 100% các chủng P Multocida đều

lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose, galactose và sorbitol,không lên men đường lactose,mantose, arabinose

1.4 Sức đề kháng

Vi khuẩn P multocida có sức đề kháng yếu với các chất sát trùng thông

thường, chúng không thể tồn tại lâu ngoài cơ thể động vật, ánh sáng mặt trời

và sức nóng P multocida có thể tồn tại trong đất ẩm, nền chuồng, trên đồng

cỏ đến hàng tháng, có khi hàng năm P multocida bị tiêu diệt trong vài

xác định P Multocida có 4 loại kháng nguyên vỏ và được ghi lại theo số La

mã

là I, II, III và IV

Carter (1955) cũng xác định được 4 nhóm kháng nguyên K đánh theochữ cái in hoa là A, B, C và D dựa vào phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu(Indirect Haemagglutination Test - IHA) Đến năm 1961, bằng phản ứngngưng kết Carter đã xác định thêm type mới đặt tên là E, tác giả đề nghị bỏtype C và bổ sung thêm type F vào năm 1963

- Kháng nguyên thân (O)

Kháng nguyên thân lipopolysaccharide của vi khuẩn P multocida được

Pirosky thông báo vào năm 1938 Kháng nguyên thân có 2 nhóm đặc hiệu vàkhông đặc hiệu Các chủng khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên thân Chỉ

có serotyp B hầu như đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên thân Khángnguyên thân có 2 hệ thống phân loại là phân loại theo Namioka và Murata(1961), kháng nguyên thân có 12 yếu tố và phân loại theo Heddleston (1972),kháng nguyên thân có 16 yếu tố

Lipopolysaccharide là kháng nguyên thân quan trọng, có khả năng tạođáp ứng miễn dịch cao và đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịchdịch thể (Ryu H.I., Kim C.J., 2000)

1.2 Những hiểu biết về bệnh Tụ huyết trùng ở bò

1.2.1 Dịch tễ học

a Loài mắc bệnh

Trong tự nhiên hầu hết các loài gia súc, gia cầm, loài có vú và loài chimđều mẫn cảm với bệnh Theo Lignieres (1900) ít nhất có 6 dạng bệnh tụ huyếttrùng khác nhau: Ở gà, trâu, bò, lợn, cừu, dê, ngựa và chó, cả 6 dạng bệnh nàyđều thấy ở thỏ Bệnh thấy ở trâu, bò, lợn, thỏ, chó, mèo, hươu, ngựa, chồn, khỉ,

dê và cừu (Carter, 1959) Bệnh còn thấy ở bò rừng, nai, sơn dương, lợn rừng,thỏ rừng, voi, lạc đà và báo tuyết ở Hymalaya (De Alwis, 1982) Nhiều tác giả

đã khẳng định: Nơi nào có bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thì ở đó người ta cũngphát hiện bệnh này ở động vật hoang dã De Alwis (1982) cho rằng loài vậtcảm nhiễm mạnh nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu, bò trong đó trâu mẫncảm hơn bò Ở Việt

Nam, trâu dễ bị nhiễm và mắc bệnh nặng hơn bò.Trâu, bò rừng cũng mắcbệnh

(Đoàn Thị Băng Tâm, 1987) Trâu thường chết khi gặp thể quá cấp hoặc cấptính

Trong phòng thí nghiệm, mức độ mẫn cảm của động vật thí nghiệm

với vi khuẩn P multocida thuộc serotype B:2 giảm dần theo thứ tự thỏ, chuột

bạch, trâu bò, chuột lang, bồ câu, lợn, ngựa, cừu và cuối cùng là dê Chó, gà,vịt không mẫn cảm (Bain R.V.S et al., 1982) Ngoài ra, một số bệnh Tụhuyết trùng cũng đã được thông báo trên lạc đà và hươu

Một số ổ dịch Tụ huyết trùng trâu bò có thể xảy ra đồng thời với bệnh

Tụ huyết trùng ở lợn và ngựa Tại Quảng Ninh đã xác nhận xác lợn rừng chếttrong ổ dịch Tụ huyết trùng trâu, bò (Bùi Quý Huy, 1988).Năm 2002, tạiKontum có ghi nhận một ổ dịch Tụ huyết trùng ở trâu, bò và lợn Ổ dịch bắtđầu xảy ra ở lợn, sau đó lây sang cho trâu bò (Trần Xuân Hạnh, 2002)

b Tuổi mắc bệnh

Với động vật mẫn cảm bệnh xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi, tuy nhiênnhững con đang bú mẹ ít mắc hơn những con trưởng thành De Alwis (1984)cho biết mức độ cảm nhiễm của động vật non mạnh hơn động vật già, kết quảnghiên cứu của tác giả cho thấy ở bò và trâu tỷ lệ mắc bệnh ở lứa tuổi dưới 6tháng là

3,5%, trong khi đó trâu, bò ở lứa tuổi từ 6 tháng đến 2 năm là 30 - 32%, ngượclại trâu, bò trên 2 năm tuổi tỷ lệ mắc bệnh chiếm từ 3 - 5% toàn đàn Nghiêncứu cũng cho thấy tỷ lệ chết của trâu, bò trong mỗi ổ dịch là 84% và 91% tậptrung vào lứa tuổi 6 tháng đến 18 tháng Bò 1 - 3 tuổi dễ mắc hơn bò già vàkhi mắc thì tỷ lệ chết cao hơn Bò càng béo, khỏe, trẻ càng dễ mắc bệnh và tỷ

lệ chết cao Mức độ cảm nhiễm của động vật non mạnh hơn động vật già (DeAlwis M C L, 1984) Bê dưới 6 tháng tuổi ít mắc bệnh

Trâu, bò càng béo, khỏe, trẻ càng dễ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao Bê, nghédưới 6 tháng tuổi ít mắc bệnh (Bùi Quý Huy, 1998) Cao Văn Hồng (2002) tạiĐắk Lắk cũng cho thấy lứa tuổi cảm nhiễm với bệnh nhất là dưới 36 thángtuổi Hoàng Đăng Huyến (2004) cho biết tại Bắc Giang trâu, bò nhỏ hơn 2năm tuổi mẫn cảm với bệnh nhất

c Nguồn bệnh và phương thức truyền lây

Nguồn lây bệnh tụ huyết trùng là những trâu, bò, lợn và gia cầm bị bệnh

và mang trùng Trong cơ thể gia súc khỏe mạnh, P.multocida thường tồn tại ở

đường hô hấp trên nhưng đây không phải là quan hệ cộng sinh Khi sức đềkháng của cơ thể giảm, vi khuẩn tăng độc lực và tác động gây bệnh Cho đếnnay không rõ là vi khuẩn tồn tại bằng cách truyền lần lượt trong một số cá thểcủa một quần thể hay nó còn tồn tại lâu dài một số con Có nhiều cách lâybệnh khác nhau: Nhiễm qua đường hô hấp, đường tiêu hóa, qua vết xước trên

da, bệnh có thể lây từ con ốm sang con khỏe qua tiếp xúc Bệnh lây lan doviệc giết mổ gia súc ốm, chó mèo và một số côn trùng hút máu như ruồi,mòng… cũng có thể là vật môi giới truyền mầm bệnh đi xa (Nguyễn VĩnhPhước, 1978) Trong giai đoạn đầu của bệnh, khi con vật còn đi lại được, vikhuẩn từ nước dãi, phân, nước tiểu được bài ra xung quanh Ổ dịch rộng hayhẹp tùy theo điều kiện tồn tại của vi khuẩn và sức miễn dịch của đàn (PhanThanh Phượng, 1994)

d Phân bố và mùa vụ mắc bệnh

Bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt làcác nước thuộc châu Á và châu Phi Tại châu Á vi khuẩn gây bệnh thườngthuộc serotype B:2 và ở châu Phi là serotype E:2 (Carter G R., 1982) Tại Ấn

Độ P multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò phân lập được thuộc

serotype A:1 và A:3, A:1,3, A:4, B:2, D:1(Kumar A.A et al., 1996; 2004) Ởmột số nước tồn tại cả hai serotype B:2, E:2 như Sudan và Ai Cập

Tỷ lệ trâu bị bệnh là 45,2%; tỷ lệ bò bị bệnh (15,8%) thuộc về Sri-Lanka,một trong những nước có tỷ lệ trâu bò nhiễm bệnh cao nhất thế giới Tại vùngPunjab thuộc Pakistan, tỉ lệ trâu bò mang trùng là 11%, tỷ lệ trâu bệnh là 9%

và tỷ lệ tử vong lên tới 78%; ở bò tỷ lệ tương ứng có thấp hơn 4%, 2,5% và62% Bò thường bị bệnh vào mùa mưa, các mùa khác tỷ lệ bò bị bệnh Tụhuyết trùng chiếm rất nhỏ (Sheikh M.A et al., 1996) Carter (1982) đã nghiêncứu và phát hiện bệnh Tụ huyết trùng ở bò tại Nhật Bản, bệnh không thànhdịch và biểu hiện dịch tễ không điển hình

Nghiên cứu tại Namibia cho thấy, bệnh Tụ huyết trùng xảy ra ở trâuthường xuyên và nhiều hơn ở bò, đặc biệt là những vùng ẩm ướt, có nhiều

đầm lầy, tập tính đằm mình của trâu càng tạo điều kiện cho khả năng gây

nhiễm của P.multocida (Voigts A et al., 1997) Tại Cameroon, bệnh tụ huyết

trùng trâu, bò lần đầu tiên được phát hiện tại vùng Maga ở giống bò Zebu.Khi phân lập thấy vi khuẩn gây bệnh thuộc serotype B:2, serotype này ít phổbiến tại châu Phi

Ở Việt Nam bệnh có ở khắp nơi, có tính chất lẻ tẻ địa phương Bệnhxảy ra rải rác quanh năm ở các vùng nóng ẩm, tập trung hơn vào mùa mưa

từ tháng 6 - 9 Theo thống kê của Cục thú y, hàng năm nước ta có 30 - 35tỉnh thành có bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò gây thiệt hại đáng kể Các tỉnhmiền Tây Nam Bộ do khí hậu nóng ẩm và nhiều đầm lầy nên bệnh xảy ranhiều hơn Hiện nay bệnh gặp nhiều ở các tỉnh miền núi như Lạng Sơn, LaiChâu, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Giang

1.2.2 Triệu chứng lâm sàng

Bệnh Tụ huyết trùng ở bò thường mắc ở ba thể gồm thể ác tính, cấp tính

và mạn tính (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2011) Thể ác tính hay thể quá cấp tính

có tần suất rất nhỏ Bò bị bệnh ở thể này phát bệnh rất nhanh, con vật độtnhiên lên cơn sốt cao 41-420C và trở nên hung dữ, điên loạn, đập đầu vàotường và chết trong vòng 24 giờ Với bê có thể có triệu chứng thần kinh nhưgiãy dụa ngã vật xuống rồi chết, có khi đang ăn chạy lồng lên, điên loạn, runrẩy, ngã xuống rồi lịm đi

Thể cấp tính xảy ra phổ biến ở trâu, bò Thời gian nung bệnh ngắn từ 1

- 3 ngày, con vật không nhai lại, mệt lả, bứt rứt, sốt cao đột ngột 40 - 420C.Xuất huyết niêm mạc mũi, mắt chảy nước mắt, nước mũi Các hạch lymphođều sưng, hạch dưới hầu sưng rất to, làm cho con vật lè lưỡi ra, thở khó nênđược gọi là bệnh “trâu, bò hai lưỡi” Hạch lympho trước vai, trước đùi sưng,thủy thũng làm con vật đi lại khó khăn Con vật thể hiện hội chứng hô hấp,thở mạnh do viêm màng phổi, tràn dịch màng phổi, có tụ huyết và viêm phổicấp Lúc sắp chết con vật nằm liệt, đái ra máu, thở khó khăn, niêm mạc cónhiều điểm xuất huyết đỏ thẫm Bệnh tiến triển 3 - 5 ngày Tỷ lệ chết 90 -100% Nếu con vật nhiễm trùng huyết thì chết trong vòng 24 - 36 giờ

Con vật bị bệnh ở thể cấp tính, nếu không chết, bệnh sẽ chuyển thànhmạn tính Bò bị bệnh thể hiện viêm ruột mạn tính: lúc ỉa chảy, lúc táo bón,viêm khớp làm cho con vật đi lại khó khăn, viêm phế quản và viêm phổi mạntính Bệnh tiến triển trong vài tuần, con vật có thể khỏi bệnh, các triệu chứngnhẹ dần nhưng thường gầy rạc và chết do kiệt sức.

Khaleel et al (2014) đã nghiên cứu và khẳng định tác động của P.

Multocida lên não và nơ ron thần kinh của động vật mắc bệnh Điều này giải

thích trong nhiều trường hợp con vật mắc bệnh có biểu hiện thần kinh trướckhi chết

1.2.3 Bệnh tích

Bệnh tích đại thể của bệnh Tụ huyết trùng ở bò thể hiện đặc trưng và điểnhình ở thể bệnh cấp tính với hiện tượng tụ huyết và xuất huyết ở niêm mạcmắt, mũi, miệng Tổ chức liên kết dưới da đều tụ huyết màu đỏ thẫm và lấmtấm xuất huyết từng mảng Hệ thống hạch lâm ba sưng to, thủy thũng, xuấthuyết, rõ nhất là hạch lâm ba sau hầu, vai và trước đùi Ngoài ra phổi bị viêmthùy, các xoang có tương dịch

Khi nhuộm HE (Hematoxylin-Eosin) bệnh phẩm là cơ tim thấy các sợi cơ

mô liên kết tách rời nhau, có nơi xuất hiện dày đặc hồng cầu hoặc sợi cơ thoáihóa, xuất hiện các vi khuẩn hình que tại tổ chức liên kết Với bệnh phẩm làgan thì trung tâm thùy gan có nhiều điểm thoái hoá, gan tụ máu, tế bào kuffertăng sinh Bệnh phẩm là lách cũng có các thay đổi nghiêm trọng như trung tâmlympho bị teo, phần tủy đỏ có nhiều điểm hoại tử (Đỗ Tuấn Cương và cs,2004)

1.2.4 Chẩn đoán bệnh

- Chẩn đoán lâm sàng căn cứ vào điều kiện phát sinh, phát triển của bệnh,các biểu hiện đặc trưng về triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để chẩn đoánbệnh như sốt cao, có dấu hiệu thần kinh, tụ huyết và xuất huyết nặng hầu như

ở tất cả các tổ chức Hạch lympho vùng hầu, trước vai và trước đùi sưng to, cóbiểu hiện triệu chứng hô hấp rõ

- Chẩn đoán phân biệt: Phân biệt bệnh Tụ huyết trùng bò với bệnh bệnhnhiệt thán và bệnh ung khí thán trên bò Bệnh nhiệt thán tiến triển cũngnhanh, có sưng cổ nhưng ít thủy thũng hơn bệnh tụ huyết trùng; thịt xác độngvật bị nhiệt thán đen, ướt nhão, máu đen đặc khó đông, lá lách sưng to gấp2-3 lần, tổ chức lách nát nhũn như bùn Còn bệnh ung khí thán chỉ sưngtrong bắp thịt, ở giữa chỗ sưng thịt bị hoại tử màu đen nát, ấn tay vào cótiếng kêu lạo xạo.

+ Chẩn đoán phòng thí nghiệm:

+ Chẩn đoán vi khuẩn học ta có thể lấy bệnh phẩm là máu tim, gan, lách,tủy xương, phổi, hạch lympho, thận và dịch thủy thũng Tiến hành làm tiêubản nhuộm Gram hoặc Giemsa (nếu bệnh phẩm là máu) rồi tìm vi khuẩn.Phân lập vi khuẩn trên các môi trường thích hợp, quan sát tính chất mọc vàxác định các phản ứng sinh hóa cần thiết

Tiêm động vật thí nghiệm: dùng bệnh phẩm hoặc canh trùng đã có vikhuẩn mọc sau khi nuôi cấy bệnh phẩm tiêm dưới da hoặc phúc mạc chochuột bạch trong vòng 24 - 48 giờ Nếu bệnh phẩm có vi khuẩn Tụ huyếttrùng bệnh sẽ phát ra và giết chết chuột Mổ khám quan sát bệnh tích

+ Chẩn đoán huyết thanh học giúp ta xác định các serotype P.

multocida bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính, phản ứng ngưng

kết hồng cầu gián tiếp, phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch Nhưng kếtquả của phản ứng kém chính xác nên thường không sử dụng

+ Kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể kháng P multocida sau khi tiêm

phòng vắc xin hoặc kháng thể tự nhiên (Rajeswari Shome và cs, 2019)

+ Kỹ thuật PCR được sử dụng để chẩn đoán chính xác sự có mặt của

P multocida từ các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau (Townsend và cs, 1998;

Hunt và cs, 2000; Ranjan và cs, 2011; Jesse và cs, 2013) Tuy nhiên phươngpháp này yêu cầu người thực hiện có trình độ chuyên môn cao, kinh phí cao

1.2.5 Phòng và trị bệnh Tụ huyết trùng ở bò.

- Phòng bệnh

+ Do đặc tính gây bệnh của vi khuẩn Tụ huyết trùng ở bò là khi bò suygiảm sức đề kháng nên biện pháp phòng bệnh chủ động trước tiên cần đảmbảo vệ sinh chuồng trại, chăm sóc, nuôi dưỡng hợp lý kết hợp với tiêm phòngđịnh kỳ cho vật nuôi.

+ Phòng bệnh bằng vắc xin: Theo Johnson (1989) hiệu lực phòng bệnhcủa vắc xin còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố Do đặc tính của bệnh Tụ huyếttrùng bò thường xảy ra ở thể quá cấp tính nên điều trị kém hiệu quả, kết quảđạt được chỉ khi phát hiện bệnh và sử dụng kháng sinh sớm (Mosier, 1992).Trong trường hợp sử dụng kháng sinh ở giai đoạn cuối, khi con vật đã xuấthuyết chỉ làm tăng nhanh quá trình chết của chúng, cho nên việc phòng chốngbệnh phải coi trọng công tác tiêm phòng bằng vắc xin cho gia súc là chính (DeAlwis, 1992a) Cũng quan điểm đó, Abeynay và cs (1992) cho rằng tiêmphòng là biện pháp tích cực và hiệu quả nhất để khống chế và ngăn chặn bệnhnày

Gần đây, Abubakar M.A (2014) đã phát triển vắc xin tái tổ hợp chống

lại P multocida Vắc xin phổ rộng và mạnh hơn có thể đạt đượcthông qua việc xác định các chất kích thích miễn dịch của P multocida (Shivachandra và

csự,

2011) Do đó, đáp ứng miễn dịch và vai trò bảo vệ của các OMP của P

Multocida

tiếp tục được nghiên cứu

Rita, D.V và cs (2018) đã chế tạo thành công đoạn gen ABA392 thànhmột vec tơ biểu hiện protein, pET-30a Protein được biểu thị từ bản saoABA392/pET30a có khả năng miễn dịch và đã được thử nghiệm trên chuột.Protein tái tổ hợp này có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch và do đó có khảnăng được thử nghiệm là ứng cử viên vắc xin phù hợp trong các nghiên cứutrong tương lai Dự kiến rằng vắc xin tiểu đơn vị này sẽ đóng góp đáng kểtrong việc quản lý bệnh Tụ huyết trùng trâu bò trong tương lai

Hiện nay nước ta có sử dụng các loại vắc xin như vắc xin Tụ huyết trùngtrâu, bò keo phèn chủng Robert I, vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò nhũ dầuchủng P52, vắc xin Tụ huyết trùng chủng Iran, vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bònhũ hoá của Viện Thú y Quốc gia và vắc xin vô hoạt Tụ huyết trùng trâu, bòcủa Xí nghiệp Thuốc thú y Trung ương

Vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò keo phèn chủng Robert I là loại vắc xin

vô hoạt Ưu điểm của loại vắc xin này là liều tiêm thấp 2ml/con, thời gianmiễn dịch kéo dài, tỷ lệ miễn dịch cao Nhược điểm là sau khi tiêm một tỷ lệgia súc bị phản ứng phụ

Vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò nhũ dầu chủng P52 do Công ty thuốc thú

y Trung ương nghiên cứu sản xuất Vắc xin ở dạng vô hoạt, chất bổ trợ nhũdầu Vắc xin có liều tiêm thấp, an toàn cho động vật, có hiệu lực miễn dịch tốt

và thời gian miễn dịch kéo dài 12 tháng

Vắc xin Tụ huyết trùng chủng Iran là vắc xin ở dạng vô hoạt, chất bổ trợkeo phèn hydroxide aluminium Mỗi liều tiêm vắc xin là 2ml, độ dài miễn dịch

6 - 7 tháng Vắc xin an toàn cho động vật và có hiệu lực cao

Vắc xin Tụ huyết trùng trâu, bò nhũ hoá được Viện Thú y Quốc gianghiên cứu dùng chủng P52 có bổ trợ dầu maccon và montanit để sản xuất Vắcxin có dạng nhũ tương, liều tiêm 2ml/con, thời gian miễn dịch trên 12 tháng.Vắc xin vô hoạt Tụ huyết trùng trâu bò do Xí nghiệp Thuốc thú y Trungương sản xuất các chủng T2, T4 có nguồn gốc từ Trung Quốc Vắc xin có liềutiêm 2ml, miễn dịch cho trâu, bò 6 tháng, có thể phản ứng cục bộ nơi tiêm

Ở Việt Nam, Viện vắc xin Nha Trang cũng đã chế kháng huyết thanh đagiá tụ huyết trùng trên ngựa để điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu, bò và lợn.Liều lượng có thể sử dụng như sau:

- Trâu, bò: Liều tiêm phòng tiêm 30-50 ml/con, liều điều trị 60-100 ml/con

- Bê, nghé: Liều tiêm phòng tiêm 10 - 20 ml/con, liều điều trị 20 - 40 ml/con

- Lợn dưới 3 tháng tuổi: Liều tiêm phòng tiêm 10 - 20 ml/con, liều điềutrị 20 - 40 ml/con Lợn 5 tháng tuổi: Liều tiêm phòng tiêm 20 - 30 ml/con, liềuđiều trị 40 - 60 ml/con Lợn trên 5 tháng tuổi: Liều tiêm phòng tiêm 30-40ml/con, liều điều trị 60 - 80 ml/con

- Trị bệnh

Bệnh Tụ huyết trùng có thể điều trị bằng kháng sinh Sự mẫn cảm của

bò ở các địa phương khác nhau là khác nhau Muốn có hiệu quả điều trị caocần phải làm kháng sinh đồ Nói chung các chủng vi khuẩnTụ huyết trùng đềurất nhạy với streptomycin (Phan Thanh Phượng, 2000) Ngoài ra còn có thểđiều trị bằng các kháng sinh như gentamycine, ampicilline và tetracycline

Theo nghiên cứu của Azmat Jabeen et al, (2013) vi khuẩn Tụ huyếttrùng có 5 chủng A, B, D, E, F và 16 serotypes (1-16) Tác giả đã kiểm tra tính

kháng kháng sinh của P multocida bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch, kết quả thấy rằng P Multocida kháng với các kháng sinh augmentin,

amoxicillin and aztreonam và mẫn cảm cao với ceftiofur

Theo nghiên cứu của Yami Bote và cs (2017) tại Ethiopia trong thời gian

2016-2017 về độ mẫn cảm của các chủng P multocida với các loại kháng sinh, kết quả công bố phát hiện 13 trâu, bò dương tính với vi khuẩn P.

multocida chiếm tỷ lệ 3,39% trong tổng số 384 mẫu kiểm tra Kết quả kiểm tra

kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn phân lập được với các loại kháng sinh

cho thấy mức độ kháng và mẫn cảm rất khác nhau các chủng P Multocida với

các loại kháng sinh, cụ thể tỷ lệ mẫn cảm 15,4% với tetracycline, 61,5% vớistreptomycin; và tỷ lệ kháng 15,4% với streptomycin, clindamycin 69,2% vớitetracycline Kết quả khẳng định streptomycin, clindamycin là những thuốc có

thể sử dụng để điều trị bệnh do Pasteurella multocida.

1.3.Tình hình nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng ở bò trên thế giới và Việt

Nam

1.3.1.Trên thế giới

Bệnh Tụ huyết trùng được Bollinger phát hiện lần đầu tiên trên bò năm

1878 ở Munich (Đức) Những năm tiếp theo bệnh được phát hiện ở khắp mọinơi trên thế giới, trên nhiều loài gia súc, gia cầm Năm 1885, Kitt đã phân lậpđược vi khuẩn Khi nghiên cứu vi khuẩn Tụ huyết trùng gây bệnh ở các loàigia súc, các nhà khoa học thấy sự giống nhau về tính chất gây bệnh, tươngđồng kháng nguyên, nhưng khác nhau về tính gây bệnh cho các loài vật Năm

1887, Trevisan đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn là Pasteurella để ghi nhớ công

lao của

Louis Pasteur, người có nhiều đóng góp nghiên cứu phát hiện ra loại vi khuẩn

này (De Alwis, 1992) Vi khuẩn Pasteurella gây bệnh cho nhiều loài gia súc

nên tên của chúng được gắn với tên của loài vật mà chúng gây bệnh:

Pasteurella suiseptica gây bệnh ở lợn Pasteurella boviseptica gây bệnh ở bò Pasteurella oviseptica gây bệnh ở dê, cừu Pasteurella aviseptica gây bệnh ở

gà… Đến năm

1939, Rosenbush và Merchant đã đề nghị đặt tên cho vi khuẩn này là

Pasteurella multocida, để chỉ khả năng gây bệnh cho nhiều loài vật của chúng,

tên này đã được công nhận chính thức trên thế giới và sử dụng cho đến ngàynay Lignieres (1900) cho rằng: bệnh Tụ huyết trùng có ít nhất ở 6 loài vậtnuôi khác nhau Tuy nhiên, gần đây theo qui ước của tổ chức FAO(FAO/WHO/CIF, 1970), trong các tài liệu quốc tế về súc sản, hai thuật ngữ

này được dùng phân biệt, Haemorrhagic septicaemia dùng chỉ bệnh do P.

multocida thuộc serotype I Roberts gây ra, còn Pasteurellosis dùng chỉ bệnh

do vi khuẩn Pasteurella gây ra Ở Châu Á, bệnh Tụ huyết trùng trâu, bò do P.

multocida gây ra thường ở hai thể chủ yếu: Nhiễm trùng máu - xuất huyết

(Haemorrhagic septicaemia - HS) và viêm phổi ở bò (Bovine pneumonicpasteurellosis) Ngày nay, sau hơn một trăm năm kể từ khi phát hiện lần đầu,

P multocida vẫn là nguyên nhân gây bệnh Tụ huyết trùng cho nhiều loài gia

súc gia cầm Tuy có tính thích nghi gây bệnh trên các loài vật khác nhau,

nhưng P multocida đều có những đặc tính cơ bản giống nhau.

Cho đến nay bệnh gây thiệt hại nặng nề ở nhiều nước Châu Á, đặc biệt là

ở Ấn Độ, Pakistan, Sri lanka và các nước thuộc vùng Đông Nam Á Theo mộtnghiên cứu gần đây của nhóm tác giả người Camphuchia, 24% tổng số hộ giađình bị ảnh hưởng với tỷ lệ mắc bệnhTụ huyết trùng trên trâu, bò tại khu vựcnghiên cứu, trung bình là 10,1% và tỷ lệ tử vong là 28,8% Giải quyết vấn đềkiểm soát bệnh Tụ huyết trùng trên trâu, bò đòi hỏi phải tập trung vào nângcao kiến thức của nông dân về an toàn sinh học và tiêm phòng cho gia súc nênđược ưu tiên cho các bên liên quan quan tâm đến việc giải quyết vấn đề mất

an ninh lương thực trong khu vực và giảm nghèo (Kawasaki M và cs, 2015).Theo J a k e e n K E l - J a k ee v à cs (2016) nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng

do P multocida gây ra ở gia súc và trâu ở tại Ai Cập tháng 1 năm 2013 đến

tháng

3 năm 2014 từ các địa phương khác nhau Tổng số 88 chủng P multocida đã

được phân lập từ 256 mẫu bệnh phẩm mũi họng và mô phổi (34,4%) Những

con bê chết cho thấy tỷ lệ phân lập P multocida cao nhất, sau đó là những con

bê bị giết mổ khẩn cấp, những con bê bị bệnh sau đó rõ ràng là những con

khỏe mạnh Phương pháp phát hiện P multocida bằng kính hiển vi, phản ứng

sinh hóa và bằng phương pháp PCR

Tác giả Hossein Jamali và cs (2014) nghiên cứu xác định tỷ lệ lưu hành,

đặc tính và kháng kháng sinh của Pasteurella multocida phân lập từ bò ở Iran.

Đã phát hiện P multocida trong 141/169 trường hợp bò sữa và bò thịt Các chủng P multocida thuộc các nhóm huyết thanh A (126/141), D (12/141) và B (3/141) Trong số các chủng P multocida, tất cả đều mang các gen psl, ompH,

oma87, fimA, ptfA, nanB và nanH, 139/141 có hsf-2 và 115/141 pfhA vàtadD Các chủng được kháng kháng sinh với penicillin G (các chủng kháng43/141;

30,5%) và streptomycin (31/141; 22%)…

1.3.2 Việt Nam

Bệnh Tụ huyết trùng ở Việt Nam được phát hiện vào những năm cuốithế kỷ 19: Cudamie thông báo về bệnh ở trâu thuộc tỉnh Bà Rịa và LongThành năm 1868, sau đó Gemain (1869) phát hiện bệnh ở Gò Công, Yersinphát hiện bệnh ở các tỉnh miền Trung vào các năm 1889-1895 Năm 1901,Shein bằng phương pháp phân lập và tiêm truyền qua động vật thí nghiệm đã

xác nhận ổ dịch ở trâu, bò xảy ra ở Tây Ninh là do vi khuẩn Pasteurella

multocida (Phan Đình Đỗ và Trịnh Văn Thịnh, 1958) Theo Đoàn Thị Băng

Tâm (1987), tại Việt Nam bệnh thường xảy ra ở Nam Bộ và đặc biệt ở miềntây Nam Bộ, vào những năm 1910, 1919, 1920, 1933, 1935 dịch xảy ra rất lớn

và mạnh Bệnh gây thiệt hại và lây lan nhiều hơn ở những vùng đất trũng,thấp, khí hậu ẩm ướt Bùi Quý Huy (1998) cũng cho biết: Trước đây bệnh Tụhuyết trùng xảy ra mạnh ở các tỉnh phía Nam và xảy ra lẻ tẻ ở các tỉnh phíaBắc Trong những năm 70 có 80% số ổ dịch Tụ huyết trùng và 84% số thiệthại gia súc do bệnh Tụ huyết trùng thuộc về các tỉnh ở phía Nam Đến nhữngnăm 90 phân bố địa lý của bệnh nghiêng về các tỉnh phía Bắc, số địa phương

có dịch Tụ huyết trùng cũng tăng

lên nhiều, hàng năm có 20 - 25 tỉnh thông báo có bệnh lưu hành NguyễnThiên Thu (1996) đã nhận định bệnh tụ huyết trùng trâu, bò xảy ra thườngtrùng với những cơn mưa ở từng vùng và kéo dài đến hết mùa mưa.

Thống kê trong 10 năm từ 1986 - 1995 dịch bệnh Tụ huyết trùng ở bò lànguyên nhân gây chết hơn 70% số trâu, bò trong tổng số trâu, bò chết bệnhhàng năm Trong một số vụ dịch, nhiều hộ nông dân bị chết tới 4 - 5 con trâu,

bò, ảnh hưởng rất lớn đến sản xuất và kinh tế gia đình (Bùi Quý Huy,1988).Tại Sơn La số trâu, bò chết biến động từ 21 đến 155 con/tháng trong 13 năm

1980 đến 1993 (Dương Thế Long, 1994) Ở Vĩnh Phúc trong 3 năm 1997

-1999 đã có 212 ổ dịch Tụ huyết trùng trâu, bò với 1.610 con ốm và 557 conchết (Phan Huy Thụy, 2000) Theo điều tra của Trần Văn Chương (2004), từnăm 1999 - 2003, tỷ lệ mắc bệnh Tụ huyết trùng là 1,12% (chết 0,47%); tỷ sốchết là 41,93% Tại một số tỉnh phía Nam, dịch bệnh Tụ huyết trùng trâu, bòcũng là nguyên nhân gây chết hàng nghìn con trâu, bò mỗi năm như ở Long

An, Minh Hải, Kiên Giang, Bình Phước (Nguyễn Vĩnh Phước và cs, 1988)

Nhiều tác giả cũng đã đi sâu nghiên cứu đặc tính sinh vật hoá học của vi

khuẩn P.multocida, phương pháp chẩn đoán, phân lập và chế tạo vắc xin

phòng bệnh Trần Xuân Hạnh và Tô Thị Phấn (2007) tiến hành nghiên cứu

một số đặc tính của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ trâu, bò, lợn.

Phan Thanh Phượng (1986 - 1990) đã nghiên cứu, chế tạo và sử dụng vắc xinnhũ hoá bằng công nghệ lên men sục khí để phòng chống bệnh Tụ huyết trùngtrâu, bò, lợn và gia cầm có nhiều ưu việt hơn vắc xin cũ

Dương Thế Long (1995) đã phân lập được vi khuẩn P multocida gây

bệnh cho các loài vật nuôi (trâu, bò, lợn và gà) tại tỉnh Sơn La

Nguyễn Ngã (1996), Nguyễn Thiên Thu (1996) đã phân lập được vi

khuẩn P Multocida từ trâu, bò mang trùng ở khu vực miền Trung và xác định

tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn phân lập được vớichủng vắc xin Iran

Có nhiều nghiên cứu về bệnh Tụ huyết trùng tại các địa phương khácnhau như Bùi Văn Dũng (2000) nghiên cứu tình hình bệnh tụ huyết trùng và

vi khuẩn P multocida phân lập từ dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe ở tỉnh Lai

Châu

Hoàng Đăng Huyến (2004) nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, các yếu tố ảnhhưởng đến bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Bắc Giang

Nguyễn Đăng Minh (2005) nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh Tụ

huyết trùng và xác định tỷ lệ mang trùng Pasteurella ở đàn trâu, bò tỉnh Hà

Tây

Đỗ Ngọc Thúy và cs (2007) đã ứng dụng kỹ thuật PCR để xác định

Type các chủng vi khuẩn P multocida phân lập từ vật nuôi.

Phạm Thị Phương Lan và Đặng Xuân Bình (2012) đã nghiên cứu đặc

tính sinh vật hóa học của vi khuẩn P multocida gây bệnh Tụ huyết trùng trâu,

bò trên địa bàn hai tỉnh Hà Giang và Cao Bằng Kết quả cho thấy, các chủng

vi khuẩn P multocida phân lập được có đặc tính sinh vật hóa học đặc trưng

của loài: dạng cầu trực khuẩn, bắt màu gram âm, không gây dung huyết trênthạch máu, lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose, khônglên men đường lactose, mantose Sản sinh Indol, không di động và không sinh

H2S, độc lực mạnh, gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 8-48 giờ

Hiện tại, Viện Thú y đang thực hiện triển khai đề tài nghiên cứu sảnxuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh Tụ huyết trùng cho lợn, đây là hướngnghiên cứu của các nhà khoa học Việt Nam phù hợp với trình độ khoa họccủa các nước trong khu vực về lĩnh vực vắc xin phòng bệnh cho gia súc, giacầm Triển vọng tương lai ra đời các loại vắc xin phòng bệnh Tụ huyết trùng

có hiệu quả bảo hộ cao phục vụ thiết thực cho sự phát triển ngành chăn nuôi

bò nói riêng và các vật nuôi khác ở nước ta

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối Tượng nghiên cứu

- Đàn bò nuôi tại các hộ gia đình, gia trại và trang trại ở ba xã miền núi Tiến

Xuân, Yên Bình, Yên Trung - Huyện Thạch Thất (Hà Nội)

- Vi khuẩn Tụ huyết trùng (Pasteurella multocida).

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Xã Tiến Xuân,Yên Bình, Yên Trung - Huyện Thạch Thất (Hà Nội).+ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y, Khoa Thú y,Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 8 năm 2018 đến tháng 8 năm 2019

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết bệnh Tụ huyết trùng bò năm 2019

2018-theo mùa vụ, lứa tuổi tại huyện Thạch Thất - Hà Nội

- Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pasteurella multocida ở bò khỏe và bò

nghi mắc bệnh Tụ huyết trùng

- Xác định các đặc tính sinh vật hóa học, độc lực của vi khuẩn

Pasteurella multocida phân lập được.

- Lựa chọn được kháng sinh điều trị bệnh Tụ huyết trùng hiệu quả tại địa phương

2.4.Nguyên vật liệu

2.4.1 Máy móc

- Tủ lạnh âm 200C (Frigor) và âm 700C (Sanyo)

- Máy ly tâm (Mini spin)

- Máy votex (Ika)

- Máy chạy điện di (Scie-Plas)

- Máy chụp ảnh gel (Benchtop 3UV)

- Cân điện tử (AGN 200, Poland)

- Lò vi sóng (Panasonic)

- Máy PCR (Bio - rad)

- Box an toàn sinh học cấp II

- Tủ ấm

2.4.2 Dụng cụ

- Micropipet các loại từ 0,5µl đến 1000 µl (eppendorf)

- Đầu tip các loại từ 0,5µl đến 1000 µl (eppendorf)

- Ống PCR DNase/RNase free

- Ống eppendorf 1,5 ml DNase/RNase free

- Găng tay

- Dụng cụ đổ gel

2.4.3 Môi trường - Hóa chất - Nguyên liệu

- Bộ Kit tách chiết DNA: QIAamp DNA-69506

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1.Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học

Số liệu được thu thập theo phương pháp dịch tễ học hồi cứu Số liệuđược cung cấp bởi Trạm Chăn nuôi và thú y Thạch Thất, và điều tra trực tiếp

từ hộ chăn nuôi Mẫu điều tra và mẫu xét nghiệm được lựa chọn ngẫu nhiên

Một số công thức tính toán được sử dụng trong báo cáo gồm:

* Tỷ lệ mắc bệnh và chết trong năm nghiên cứu:

TLMB (%)= Số con mắc bệnh trong một thời kỳ

- Tỷ lệ mắc bệnh ở đàn đe dọa:

- Tỷ lệ tử vong/tổng đàn (TLTV)

ọa trong thời kỳ đó x 100

nh trong thời kỳ đó x 100

2.5.2 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng

Bò được xác định mắc bệnh Tụ huyết trùng dựa vào đặc điểm đặc trưng

về triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể như sau:

Bò sốt cao đột ngột 40-420C, niêm mạc mắt mũi đỏ sẫm Chảy nước mắt,

nước mũi Hạch hầu sưng, đi lại khó khăn do hạch lympho trước vai và trướcđùi sưng Bò thở mạnh và khó khăn

Trường hợp bò bị chết, mổ khám thấy thịt màu tím hồng, thấm nước.Hạch lympho sau hầu, vai và trước đùi sưng to và thủy thũng Tim sưng to,xoang bao tim, màng phổi, xoang ngực và xoang bụng đều có tương dịch(nước vàng) Phổi bị viêm cata hoặc viêm tơ huyết, viêm màng phổi, viêmngoại tâm mạc

2.5.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn Pasteurella multocida

* Phương pháp nuôi cấy phân lập

Mỗi mẫu được ria cấy trực tiếp lên các môi trường thông thường và đặcbiệt như nước thịt, thạch máu, thạch MacConkey, bồi dưỡng ở 370C trong 24giờ Sau khi vi khuẩn mọc, căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường đểchọn khuẩn lạc điển hình đem nuôi cấy lại trên các môi trường chọn lọc đểthuần khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hóa để giám định vi

khuẩn Khuẩn lạc của P multocida được xác định theo tiêu chuẩn của

Hedleston và cs (1966)

Phân lập Pasteurella multocida theo TCVN

* Phương pháp lấy mẫu:

- Dịch ngoáy mũi: Lấy dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe

- Bệnh phẩm: Lấy mẫu máu tim, gan, tủy xương bò nghi mắc bệnh tụhuyết trùng, được bảo quản lạnh đem về phòng thí nghiệm

Từ bò khỏe: Mẫu dịch ngoáy mũi: Dùng tăm bông đã được vô trùngngoáy sâu vào mũi họng của bò khỏe để lấy dịch tiết của mũi, họng Sau đócho vào một ống nghiệm vô trùng, đậy nút, ghi nhãn đánh số thứ tự, mẫu đượcbảo quản trong phích đá lạnh

Từ bò chết trong ổ dịch: Lấy xương ống chân, máu tim, phủ tạng bòmới chết trong các ổ dịch nghi bệnh Tụ huyết trùng với triệu chứng điển hình

ở thể cấp tính

* Phương pháp xác định tính chất sinh vật, hóa học của Pasteurella

multocida

* Kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

Lấy một phiến kính sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiếnkính, dùng que cấy lấy một khuẩn lạc điển hình, trộn đều vi khuẩn với giọtnước sinh lý Sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn Tiến hành nhuộmGram và kiểm tra hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi có độ phòng đại 1000lần

* Xác định tính chất sinh vật, hóa học của P multocida bằng cách thử

các phản ứng sinh hóa như: phản ứng Oxydaza, phản ứng Catalaza, phản ứngphân hủy Urea, phản ứng sinh Indol, khả năng lên men đường, khả năng sinh

Thạch máu ( Bloodagar), 370C/24h

Sơ đồ 2.1: Phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida

(Quin P.J et al (1994) [74])

2.5.4 Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập được

* Kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên chuột nhắt trắng

Sau khi nuôi cấy và tiến hành thuần khiết vi khuẩn phân lập được quacác môi trường nuôi chọn lọc, cấy chủng vi khuẩn thử lên môi trường BHI,bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinhđộc tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm

Sử dụng chuột nhắt trắng (18 - 22g/con) khỏe, mỗi chủng dùng tiêm 2chuột, liều tiêm xoang bụng 0,2ml/chuột Theo dõi chuột chết trong 72 giờ vàđến hết 7

Chuẩn bị canh trùng: Các chủng P multocida được cấy vào môi trường

BHI, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ Dùng pipet Pasteur lấy 0,1- 0,2 ml canhtrùng, nhỏ 3-5 giọt vào đĩa thạch, láng đều, để 3-5 phút cho khô mặt thạch.Dùng panh đặt và ấn nhẹ các giấy đã tẩm các loại kháng sinh lên mặt thạch đặtcách nhau 20mm Sau 15 phút thì lật úp đĩa thạch vào tủ ấm 370C Đọc kết quả

và đánh giá khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh bằng cách đođường kính vòng vô khuẩn Trong nghiên cứu này chúng tôi dùng giấy tẩmkháng sinh của hãng Oxoid (Anh) sản xuất, Code 1332 E Kết quả đánh giátheo bảng hướng dẫn của nhà sản xuất Khả năng mẫn cảm với kháng sinh củacác chủng phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên thạchđĩa và đánh giá theo tiêu chuẩn của Hội đồng Quốc gia Hoa Kỳ (1999)

* Phương pháp tiến hành như sau:

+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Muller Hinton

+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường thạchmáu ở 370C Lấy 1 khuẩn lạc hòa vào 1,5ml nước sinh lý để đạt được độ đục