Phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tt

Để đóng góp tư liệu khoa học về tiềm năng và khả năng nhân sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân, làm cơ sở cho việc phát triển chế phẩm sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại ở nước ta, việc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THANH HẢI HÀ

PH¸T TRIÓN SINH KhèI Virus NH¢N §A DIÖN (NPV) TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT

THUèC TRõ S¢U SINH HäC

Ngành : Công nghệ Sinh học

Mã số : 9420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2020

Công trình được hoàn thành tại

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Hoàng Đình Hoà

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Quốc gia Việt Nam

2 Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là một trong số các đối tượng sâu hại

quan trọng trên các cây trồng cạn, phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới

và á nhiệt đới Đây là một loài sâu ăn tạp, có thể sống và gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau (Kumari và Singh, 2009; Hong, 2002) Ở Việt Nam, sâu khoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều loại cây trồng, điển hình như các loại rau họ Thập tự, cà chua, nho, đậu tương, lạc, v.v (Viện Bảo vệ thực vật, 2003)

Để bảo vệ khỏi tác hại do sâu khoang, nông dân thường sử dụng nhiều loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật với liều lượng cao, để lại tồn dư độc hại trong sản phẩm gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng sản phẩm, ô nhiễm môi trường và tổn hại đến quần thể các loài sinh vật có ích trên đồng ruộng

Trên đồng ruộng, sâu khoang thường bị chết do virus nhân đa diện (NPV), là loài rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâu khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ (Kitajima, 1989; Kamakoff và Ward, 2007)

Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng phát triển sinh khối NPV trên tế bào phục vụ sản xuất chế phẩm NPV là cần thiết Lâu nay, việc phát triển sinh khối NPV vẫn theo phương pháp thủ công với qui mô nhỏ hẹp nên không thể sản xuất qui mô công nghiệp Để có thể tạo được khối lượng lớn sinh khối NPV, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất chế phẩm NPV (Granados

và Blissard, 2007; Goodman, 2008; Elanchezyan, 2009) Để đóng góp tư liệu khoa học

về tiềm năng và khả năng nhân sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân, làm cơ sở cho việc phát triển chế phẩm sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại ở nước ta, việc thực hiện

đề tài: “Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ

sản xuất thuốc trừ sâu sinh học“ là vấn đề cần thiết nhằm đáp ứng yêu cầu của thực

tiễn sản xuất nông nghiệp

2 Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài

2.1 Mục đích

- Trên cơ sở đánh giá tiềm năng ký sinh tự nhiên, tiến hành tuyển chọn chủng vi rút nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao trong phòng chống sâu khoang

- Xác định được kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại

- Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sẽ góp phần làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng trong phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

- Kết quả nghiên cứu tinh sạch thể vùi (OB) của NPV sâu khoang, thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng làm cơ sở định hướng tiêu chuẩn hoá chất lượng chế phẩm sinh học dựa trên số lượng thể vùi sau khi sản xuất

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- NPV sâu khoang: Được thu thập, phân lập và tuyển chọn từ sâu non sâu khoang chết do NPV ngoài đồng ruộng

- Tế bào sâu khoang: Do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp, là dòng tế bào phát triển từ tế bào gốc của mô phôi sâu khoang, đã được nuôi nhân qua 135 chu kỳ

- Sâu non sâu khoang: Được nuôi nhân bằng lá bắp cải sạch

4.2 Phạm vi nghiên cứu

- Đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên bắp cải, lạc, đậu tương

và khoai sọ ngoài đồng ruộng Thu thập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang

- Xác định điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

- Điều kiện lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào sâu khoang

- Kỹ thuật tinh sạch thể vùi, tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

5 Những đóng góp mới của luận án

- Lần đầu tiên cung cấp các dẫn liệu khoa học có hệ thống về khả năng phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tại Việt Nam

- Bổ sung các dẫn liệu khoa học mới về mức độ phổ biến của NPV trên sâu khoang hại bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ Phân lập, tuyển chọn được 3 chủng NPV có tiềm năng (TL.1a; TL.2a; TL.3a), trong số đó TL.1a có hoạt lực cao nhất trong gây chết sâu khoang (80%) và hình thành thể vùi (2,6 x 108 OB/10sâu)

- Bước đầu xác định được kỹ thuật tinh sạch thể vùi NPV Phát triển được 2 chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước (NPV-1 và NPV-2) có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang hại trên bắp cải (80,51- 82,29%) và đậu tương (96,92%)

6 Cấu trúc luận án

Luận án gồm 142 trang, với các phần: mở đầu, nội dung (gồm 3 chương), kết luận và đề nghị, với 33 bảng số liệu và 14 hình Tham khảo 121 tài liệu, trong đó có 19 tài tiếng Việt và 102 tài liệu tiếng Anh

cao của ruột giữa làm vỏ protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các thể hoạt động (virion) xâm nhiễm vào nhu mô ruột giữa Sau đó lây nhiễm sang các mô bào khác

của cơ thể Sau 2-3 ngày sâu ngừng ăn và chết sau 5- 7 ngày (Sajap et al., 2000)

Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các mô, tế bào sống của cơ thể côn trùng (Kalmakoff và Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009;

Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007)

Vì vậy, cần nghiên cứu và có sự hiểu biết đầy đủ về điều kiện phát triển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV trên tế bào trên cơ sở sử dụng các chủng NPV

có hoạt lực cao đã được tuyển chọn để phát triển sinh khối NPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại (Elanchezhyan, 2009)

1.2 Tổng quan tài liệu

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

1.2.1.1 Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là đối tượng

sâu hại quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Kumari và

Singh, 2009; Hong, 2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al., 2000) Sâu có thời gian

phát dục khá dài, khả năng sinh sản lớn, nên dễ phát sinh gây hại nặng cho cây trồng (Hong, 2002, Nagamandla và Shantanu, 2018)

1.2.1.2 Nghiên cứu về NPV trên sâu hại

Virus nhân đa diện (NPV) là nhóm virus lớn và có hiệu quả gây chết cao đối với các loài côn trùng Đặc biệt, các loài NPV rất chuyên tính và hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có xương sống, chúng tồn tại dưới dạng các thể vùi (OB)

có kích thước 1-7µm và khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa Chúng là những tác

nhân sinh học rất hữu ích trong phòng trừ sâu hại cây trồng (Farrar et al., 1999)

1.2.1.3 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng

Lynn (2002) đã tổng kết thành qui trình chung cho việc nhân sinh khối tế bào côn trùng qua 11 công đoạn với các yêu cầu cụ thể khác nhau cho từng công đoạn nuôi nhân, các loại vật liệu và thiết bị, các bước thực hiện phát triển sinh khối tế bào Kết quả nghiên cứu triển sinh khối tế bào côn trùng đã được thể hiện qua các công bố của

nhiều nhà khoa học (Granados et al., 2007, Lynn, 2002, Weiss et al., 1981, 1996, Sudeep et al., 2005 và Murhammer, 2007, v.v )

1.2.1.4 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối của tế bào côn trùng

Elanchezhyan (2009) và nhiều tác giả khác chỉ rõ các yếu tố quan trọng có liên quan đến nhân nuôi thành công tế bào côn trùng, như: chủng loại môi trường, huyết thanh, nhiệt độ và pH môi trường nhân nuôi, v.v Các nghiên cứu về điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào đã được thể hiện qua các công trình của Mishuhashi

(1994); Bhutia et al (2012); Lynn, (2003); Agathos (2007); Granados et al (2007);

Segura và Felio (2012) v.v

1.2.1.5 Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi

Các tác giả đều chỉ rõ để lây nhiễm NPV trên tế bào côn trùng nuôi nhân có hiệu quả cần quan tâm nghiên cứu làm rõ các điều kiện thích hợp cho lây nhiễm dựa trên chỉ số MOI, môi trường, huyết thanh, nhiệt độ và pH môi trường , v.v Nhiều

nghiên cứu công bố về vấn đề này thể hiện qua các công trình của Mclntosh et al (2003); Demir et al (2009); Knudson et al (1974); Petchprakob et al (2007); Jakubowska et al (2009) và nhiều tác giả khác

1.2.1.6 Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV

Kanokwan et al (2004) đã thực hiện tinh sạch thể vùi tinh bằng cách ly tâm với

tốc độ 5.000 vòng/phút để loại bỏ môi trường nuôi nhân, sau đó ly tâm lại bằng nước

cất Tipadee et al., (1988) tinh sạch thể vùi NPV sâu xanh áp dụng phương pháp ly tâm

tốc độ 2500 vòng/phút trong 10 phút, sau đó 16.000 vòng/phút trong 90 phút

Theo Shapiro et al (2008), các thành phần như Bentonite, Kaolin, bột tan và khoáng sét thường được sử dụng để tạo chế phẩm dạng bột thấm nước Mushobozi et

al (2004) xác định công nghệ đơn giản nhất để tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước là

sử dụng kaolin hoặc khoáng sét được nghiền với độ mịn để phun rải dễ dàng khi pha

loãng Theo Grzywacz, et al (1996), chế phẩm phải đảm bảo tổng lượng thể vùi phun

rải cho 1 ha cây trồng đạt từ 9 x 1010 đến 1 x 1012 OB/ha

1.2.2 Nghiên cứu ở trong nước

1.2.2.1 Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là sâu hại

quan trọng trên các cây trồng cạn đã được một số cơ quan, nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ những năm 1970 Các công trình nghiên cứu đã công bố tập trung vào đặc điểm sinh học, sinh thái học và biện pháp phòng trừ sâu khoang bằng thuốc hoá

học và các biện pháp canh tác, như: Viện Bảo vệ thực vật (2000, 2001, 2003, 2006), Nguyễn Duy Nhất (1970), Lê Văn Trịnh (1996), v.v

1.2.2.2 Nghiên cứu NPV trên sâu hại

Việc điều tra tiềm năng gây chết sâu hại của NPV và phân lập tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực trừ sâu cao đã được thể hiện qua các công trình công bố của các tác

giả Nguyễn Văn Cảm et al (1996), Trương Thanh Giản et al (1996), Hoàng Thị Việt

et al (2002), Trịnh Thị Xuân (2016), Trần Văn Hai (2010), v.v

1.2.2.3 Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng

Hoạt động nghiên cứu tế bào côn trùng ở Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ năm

2011 với công trình công bố của Lê Văn Trịnh và Lê Thanh Hải Hà (2011) trong việc phát triển dòng tế bào sâu khoang

1.2.2.4 Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV

Việc phát triển sinh khối NPV bằng cách lây nhiễm virus trên sâu hại, được nêu

rõ trong các công trình nghiên cứu của Nguyễn Văn Cảm et al (1996), Trương Thanh Giản et al (1996), Hoàng Thị Việt et al (2000) và Nguyễn Thị Hai (2005), v.v

1.2.2.5 Nghiên cứu tạo dạng và sử dụng chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại

Việc tạo chế phẩm dạng dịch thể và bột khô nghiền từ sâu non chết bệnh đã được nghiên cứu Kết quả nghiên cứu thể hiện qua các công trình đã công bố của các

tác giả Nguyễn Văn Cảm et al (1996); Trương Thanh Giản et al (1996), v.v

Nhận xét chung:

Virus nhân đa diện (NPV) là tác nhân sinh học hữu ích, phổ biến trên đồng ruộng và có tiềm năng cao trong phòng trừ sâu hại, được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Ở nước ngoài, việc nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng, phát triển sinh khối virus để phòng trừ sâu hại đã thực hiện với các qui mô khác nhau Tại Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu và phát triển sinh khối NPV bằng cách lây nhiễm NPV trên sâu non rồi nghiền, lọc tạo chế phẩm vào những năm 1990- 2005

Vì vậy, việc nghiên cứu nuôi nhân tế bào, tuyển chọn chủng virus nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao để lây nhiễm trên tế bào nhân nuôi, sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại là yêu cầu cấp thiết, có tính thời sự trong sản xuất nông sản an toàn, hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hoá học, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái ở nước ta

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Các loại môi trường nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV do công

ty Invitrogen Life Technologies cung cấp, như: Excell 420- 14419C serum free (Sigma), Schneider (Sigma), TC - 100 BML-TC/10 (Sigma), TNM- FH (Sigma), IPL-41 (Sigma), Grace (Gibco), huyết thanh Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco), Photphatse Buffer Saline pH 7,2 (1X) (PBS) (Gibco), Trypan blue 0.4%, Trypsin- EDTA 10X (Gibco), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), Tryphto broth, và các loại kháng sinh, v.v

2.1.2 Dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu:

- Các dụng cụ nuôi nhân tế bào: bình cổ vếch có nắp lọc khuẩn loại 25cm2, 75

cm2, 250 cm2, 250ml và 1000ml (Corning SPL- Hàn Quốc) Hộp nhân nuôi, đánh giá

tế bào Multiple Well Plates loại 12 giếng (Corning- Mỹ), v.v

- Dụng cụ, vật liệu nuôi sâu sâu khoang: lồng nuôi sâu, chậu nhựa, đĩa petri, bô can, ống tuýp, pank, kéo, chổi lông, giấy thấm và bông thấm nước, v.v

- Các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: buồng cấy vô trùng, máy lắc N-Biotek (Hàn Quốc), máy ly tâm từ 3000- 9.000 vòng/phút, tủ nuôi tế bào Binder (Mỹ), tủ lạnh sâu -960C và kính hiển vi soi nổi Zeiss (Đức), v.v

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm trong phòng được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Đấu tranh Sinh học (Viện Bảo vệ thực vật), phường Đức Thắng, Bắc Từ Liêm, Hà Nội Các thí nghiệm đồng ruộng tiến hành tại Đông Anh và Mỹ Đức (Hà Nội)

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 9/2014 đến tháng 12/2019

2.3 Nội dung nghiên cứu

1- Điều tra, thu thập và tuyển chọn chủng NPV sâu khoang có hoạt lực cao 2- Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân

3- Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang

Theo phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (1997)

và QCVN 01-38:2010/BNNPTNT Phân lập tuyển chọn chủng NPV theo phương pháp

của Grzywacz et al (1996)

Tiến hành điều tra, thu thập sâu khoang trên bắp cải và lạc tại Đông Anh (Hà Nội), lạc và khoai sọ tại Yên Phong (Bắc Ninh) Sâu thu được đem về phòng đánh giá

và phân lập, tuyển chọn chủng NPV Trong quá trình phân lập kết hợp với xác định hiệu quả gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi của virus Từ đó lựa chọn chủng có tiềm năng phục vụ các nghiên cứu tiếp theo

2.4.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân

2.4.2 1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang

Theo phương pháp của các tác giả Lynn và Shapiro (1998), Lynn (2002) và qui

trình hướng dẫn của Invitrogen Life Technologies (2002) Đề tài tập trung nghiên cứu

xác định điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang như: chủng loại môi trường, pH, nhiệt độ, tỷ lệ bổ sung huyết thanh FBS

Xác định khả năng phát triển sinh khối tế bào ở điều kiện thích hợp, khi nhân nuôi với lượng 150ml môi trường trên bình cổ vếch 250ml và 750ml môi trường trên loại bình nuôi nhân có dung tích 1 lít

2.4.2.2 Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi

- Phá vỡ vỏ bọc protein của thể vùi để giải phóng thể hoạt động của vi rút theo

phương pháp của Tipvadee et al (1988) Lây nhiễm NPV trên tế bào theo phương pháp của Lynn (1998; 2003), Grzywacz et al (1996), v.v Các thí nghiệm xác định khả

năng lây nhiễm tạo thể vùi NPV sâu khoang, như: chỉ số lây nhiễm MOI, mật độ tế bào, môi trường, pH, nhiệt độ, tỷ lệ bổ sung huyết thanh FBS Đánh giá hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh khối trên tế bào

- Xác định mật độ tế bào và số lượng thể vùi theo phương pháp của Lynn (2002) bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu Neubauer dưới kính hiển vi

- Giải trình tự gen của NPV theo phương pháp phân tích PCR và so sánh với

ngân hàng Genbank của Maeda et al (1990)

2.4.3 Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

2.4.3.1 Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào

Tinh sạch thể vùi NPV bằng cách ly tâm dựa theo phương pháp củacác tác giả

Shapiro và Shepard (2007), Kanokwan et al (2004) và Sajap et al (2000)

2.4.3.2 Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

Phát triển chế phẩm dạng bột thấm nước tiến hành dựa theo phương pháp của

Shapiro et al (2008) và Cisneros et al (2002) với thành phần phụ gia gồm 60% bột tan

và 40% bột khoáng sét

2.4.3.3 Đánh giá hiệu lực gây chết sâu khoang của chế phẩm tạo được

Theo phương pháp nghiên cứu đánh giá sâu, bệnh, cỏ dại và chuột hại cây trồng của Viện Bảo vệ thực vật (2000) và TCVN 12561:2018 Thí nghiệm tiến hành qua các bước trong phòng thí nghiệm, ngoài nhà lưới và trên đồng ruộng

2.5 Phương pháp tính toán, xử lý số liệu

Xử lý số liệu theo chương trình Irristat 4.0 và Statistix 8.2 trên Excel

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV trên sâu khoang

3.1.1 Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của NPV ngoài đồng

Qua 2 đợt điều tra trên bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ, mật độ sâu khoang phát sinh trên đậu tương: 2,71 con/m2, lạc: 1,65 con/m2, bắp cải: 1,52 con/m2 và khoai sọ: 0,93 con/m2 Trong đó, sâu trên bắp cải có tỷ lệ nhiễm NPV tới 21,67%, đậu tương:14,22%, lạc; 15,77% và trên khoai sọ là 16,82%

Hình 3.1 Triệu chứng sâu non sâu khoang chết do NPV trên lạc và bắp cải

Độ bắt gặp trên bắp cải có sâu chết bệnh chiếm 46,67% số điểm điều tra, trong

đó 31,11% số điểm sâu chết có thể vùi NPV với mức độ phổ biến là ++, số liệu tương ứng trên đậu tương là 53,33 (mức độ phổ biến+++) và 37,78% (++), trên lạc: 57,78 (+++) và 48,89% (++) và khoai sọ có 36,67 (++) và 26,67% số điểm điều tra với mức

độ phổ biến ++ Triệu chứng sâu khoang chết do NPV thể hiện qua Hình 3.1

3.1.2 Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao

Sau 4 chu kỳ phân lập đã chọn lọc được 3 chủng virus nhân đa diện (NPV) có tiềm năng cao, gồm các chủng có ký hiệu: TL.1a; TL.2a và TL3a có khả năng sinh thể vùi tương ứng đạt 2,9; 1,8 và 2,8 x 108 OB/10 sâu, hiệu lực gây chết sâu khoang đạt tương ứng 80,0; 80,56 và 80,0% (Bảng 3.5) Cả 3 chủng đã được lưu giữ, riêng chủng TL.1a được lựa chọn sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo do khả năng sinh thể vùi

và hiệu quả gây chết sâu khoang cao và ổn định qua các chu kỳ phân lập, tuyển chọn

Bảng 3.5 Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang

của các chủng NPV đã được lựa chọn

sau phân lập

Ký hiệu chủng

Số thể vùi hình thành (x 108 OB/10 sâu)

Hiệu quả trừ sâu (%)

Đánh giá hiệu quả gây chết sâu khoang và hàm lượng thể vùi hình thành của các chủng NPV được lựa chọn, xác định chủng TL.1a có hiệu lực gây chết sâu 80,0% và

số lượng thể vùi hình thành đạt 2,0 x 108 OB/10 sâu vào 10 ngày sau lây nhiễm (NSLN) Chủng TL.3a đạt tương ứng là 73,33% và 1,85 x 108 OB/10 sâu, chủng TL.2a đạt 68,33% và 1,60 x 108 OB/10 sâu (tương ứng)

Hình 3.4 Hình 3.4 Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a

A: Thể vùi (OB) với độ phóng đại 2000X B: Thể virus hoạt động (virion) với độ phóng đại 25.000X

Kết quả ảnh chụp thể vùi (OB) dưới kính hiển vi với độ phóng đại 600X cho thấy rõ (Hỉnh 3.4), thể vùi (OB) có hình dạng hình khối không đều và nổi rõ các thể hoạt động (virion) ở bên trong, có kích thước 150 x 350nm Thể hoạt động (virion) của NPV chụp dưới hiển vi điện tử (TEM) tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (Hà Nội), thể hoạt động (virion) với độ phóng đại 25.000X của chủng TL.1a có dạng hình trụ với kích thước 44,7 nm x 341nm Kết quả quan sát tương tự như với kết quả đã công bố của nhiều tác giả đã công bố, kích thước thể vùi (OB) thường nằm trong khoảng 240 x 400nm và của thể hoạt động (virion) từ 40- 70 x 320- 450nm

3.2 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi

3.2.1 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

3.2.1.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

- Xác định môi trường thích hợp nuôi nhân tế bào

Trong số 4 loại môi trường thí nghiệm, sinh khối tế bào phát triển tốt nhất trên môi trường Ex-Cell 420-14491C, sau 2 ngày nuôi nhân mật độ tế bào đạt tới 1,394x 1010 tế bào/ml Đến 6 ngày sau nuôi nhân, mật độ tế bào đạt cao nhất tới 1,884

x 1010 tế bào/ml, ở 10 NSNN, mật độ tế bào vẫn đạt 1,630 x 1010 tế bào/ml

Virion