Phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Để có thể tạo được khối lượng lớn sinh khối NPV của các sâu hại với qui môcông nghiệp, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng thành công kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án này làtrung thực, không trùng lặp với các đề tài luận án nào khác và chưa được tác giảkhác công bố

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2.1.3 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng 121.2.1.4 Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng 181.2.1.5 Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 281.2.1.6 Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV 32

1.2.2.4 Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV 38

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang 442.4.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây

2.4.2 1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang 502.4.2.2 Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi 542.4.3 Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 602.4.3.1 Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào 602.4.3.2 Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 612.4.3.3 Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên sâu

3.2.1 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 78

3.2.1.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 783.2.1.2 Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm 883.2.2 Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân 923.2.2.1 Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV) 933.2.2.2 Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây

3.2.2.3 Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế

3.2.2.4 Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào 1073.3 Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm

3.3.2 Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước 1143.3.3 Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 1173.3.3.1 Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm 1173.3.3.2 Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới 1173.3.3.3 Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng 120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu,

ADN Axit Deroxyribo Nucleic

CV Coefficient of Variation (Hệ số biến động)

FBS Fetal Bovin Serum (Huyết thanh)

et al. Những người khác

MOI Multiplicity of Infection (Chỉ số lây nhiễm)

nnk Những người khác

NSNN Ngày sau nuôi nhân

NSLN Ngày sau lây nhiễm

NPV Nuclear Polyhedrosis Virus (Virus nhân đa diện)

OB Occlusion Bodies (Thể vùi)

PBS Photphatse Buffer Saline

PIB Polyhedral shaped inclusion Bodies (Thể vùi nhân đa diện)QCVN Qui chuẩn Việt Nam

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Mật độ sâu khoang phát sinh và tỷ lệ sâu chết do NPV trên các cây trồng

Bảng 3.2 Mức độ phổ biến của NPV ký sinh sâu khoang trên các cây trồng ngoài

Bảng 3.3 Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang ở các ngày sau lây

Bảng 3.4 Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang sau lây nhiễm của

Bảng 3.5 Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng

Bảng 3.6 Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng

Bảng 3.10 Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân trên môi trường có bổ sung

Bảng 3.11 Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân in vitro ở điều kiện thích hợp 86Bảng 3.12 Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân theo phương pháp tĩnh và lắc

Bảng 3.13 Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân với lượng 750ml môi trườngtrên bình lọc khuẩn 1000ml theo phương pháp tĩnh và lắc 91Bảng 3.14 Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào có mật độ khác

Bảng 3.15 Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào theo chỉ số MOI

Bảng 3.16 Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ lây nhiễm NPV khác nhau

97Bảng 3.17 Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang

Bảng 3.18 Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang

Bảng 3.19 Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang

Bảng 3.20 Mật độ tế bào sâu khoang và số thể vùi hình thành sau các ngày lây

Bảng 3.21 Hiệu lực trừ sâu khoang của các nguồn NPV được tạo ra từ lây nhiễm

Bảng 3.22 Số lượng thể vùi hình thành từ các nguồn NPV tạo ra từ lây nhiễm trên

Bảng 3.23 Hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh khối trên tế

Bảng 3.24 Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi sau tinh sạch theo các

Bảng 3.25 Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ 113Bảng 3.26 Thành phần phụ gia, chất lượng và liều lượng sử dụng chế phẩm NPV

Bảng 3.27 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV sau 6 ngày phun

Bảng 3.28 Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải của chế phẩm NPV trong

Bảng 3.29 Số lượng thể vùi hình thành trên sâu khoang trên bắp cải sau khi sử

Bảng 3.30 Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên bắp cải ngoài

Bảng 3.31 Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liềulượng khác nhau trên bắp cải ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội) 122Bảng 3.32 Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liềulượng khác nhau trên đậu tương ngoài đồng ruộng tại Mỹ Thành (Hà Nội) 124Bảng 3.33 Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên đậu tương tại

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.2 Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D) 8

Hình 3.1 Triệu chứng sâu non sâu khoang chết do NPV trên lạc và bắp cải 67Hình 3.2 Thể vùi NPV màu trắng đục hình thành và lắng đọng 69Hình 3.3 Lây nhiễm NPV trên sâu non sâu khoang trong phòng thí nghiệm 72Hình 3.4 Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a 77Hình 3.5 Thí nghiệm xác định môi trường nuôi nhân tế bào thích hợp A: Ban đầu;

Hình 3.6 Tế bào sâu khoang sau 6 ngày nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau

Hình 3.7 Tế bào sâu khoang sau 6 ngày đã nuôi nhân đợt tháng 11/2016 quan sát

Hình 3.8 Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân 6 ngày khi quan sát dưới kính hiển vi có

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là loài sâu ăn tạp thường gây hại trên

các đối tượng cây trồng cạn, phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và

á nhiệt đới Theo Kumari và Singh (2009); Hong (2002), sâu khoang có thể sống vàgây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau [1, 2] Ở Việt Nam, sâukhoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều loại cây trồng, điển hình như cácloại rau họ Thập tự, nho, đậu đỗ, cà chua, dưa chuột, rau muống, khoai sọ, thuốc lá,đậu tương, lạc, bông, đay, v.v (Viện Bảo vệ thực vật, 2003, 2006) [3, 98]

Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (2001), để bảo vệ cây trồngkhỏi tác hại do sâu khoang, nông dân thường phải sử dụng nhiều loại thuốc hóa họcbảo vệ thực vật với liều lượng cao [4] Sự lệ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóahọc đã làm tăng mức độ kháng thuốc của sâu khoang, gây khó khăn cho công tácphòng trừ và gây nhiễm bẩn thực phẩm, gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe ngườisản xuất và tiêu dùng sản phẩm, ô nhiễm môi trường và làm tổn hại đến quần thểcác loài sinh vật có ích trên đồng ruộng

Trên đồng ruộng, cũng như các loài côn trùng thuộc bộ Cánh phấn khác, sâukhoang thường bị chết do nhiễm NPV Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thựcvật (2001), khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, tỷ lệ sâu chết do bị nhiễm NPV(Nuclear Polyhedrosis Virus) từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậutương và 0,3- 1,9% trên lạc [4]

Rohrmann và George (2011), Kitajima (1989); Kamakoff và Ward (2007) đãxác định NPV lây nhiễm, gây chết trên sâu khoang là loài vi rút nhân đa diện(Nuclear Polyhedrosis Virus- NPV) thuộc họ Baculoviridae và thuộc nhóm vi rútsinh thể vùi (Oclusion Bodies - OB), mỗi thể vùi có thể chứa tới 200 thể vi rút hoạtđộng (virion) hình que có vỏ ngoài protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng vòngxoắn kép Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kích thước từ 0,15-15µm NPV sâu khoang rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâukhoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của nó [5, 6, 7]

Vì vậy, việc khai thác sử dụng và nghiên cứu khả năng phát triển sinh khốiNPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học NPV là cần thiết, nhằm đáp ứng yêu cầuphòng trừ sâu khoang hại trên các cây trồng nông nghiệp Sử dụng chế phẩm sinhhọc NPV còn góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sảnxuất nông sản an toàn, chất lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loàisinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng Đồng thời, thông qua việc sử dụngchế phẩm sinh học này trong việc phòng trừ sâu khoang, sẽ góp phần bổ sung nguồn

vi sinh vật có ích NPV vào đồng ruộng

Lâu nay, việc phát triển sinh khối NPV vẫn tiến hành theo phương pháp thủcông với qui mô nhỏ hẹp Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm NPV

của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng (Nguyễn Văn Cảm et al., 1996) [8] Theo cách này, việc sản xuất chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại khó thực

hiện với qui mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn cá thể của một loài sâuhại phục vụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn, phải có đủ nhàxưởng, trang thiết bị và việc nuôi sâu phải tiến hành trong điều kiện vô trùng

Để có thể tạo được khối lượng lớn sinh khối NPV của các sâu hại với qui môcông nghiệp, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng thành công

kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV

phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp (Granados et al., 2007;

Goodman, 2008; Elanchezyan, 2009) [9, 10, 11] Đến nay, nhiều nước như: Mỹ, HàLan, Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v đã và đang ứng dụng để sản xuất, cungcấp cho thị trường nhiều loại chế phẩm NPV có hiệu lực cao trong phòng trừ sâu hạicây trồng Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển sinh khối NPV trên cơ sở ứngdụng kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng là vấn đề còn rất mới, kết quảthu được mới dừng lại ở bước khởi đầu và còn rất hạn chế

Việc thực hiện đề tài: ”Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học”được tiến hành nhằm đóng

góp tư liệu khoa học về tiềm năng của NPV và khả năng lây nhiễm, phát triển sinhkhối virus trên tế bào sâu khoang nhân nuôi, làm cơ sở cho việc phát triển chế phẩmsinh học phục vụ phòng trừ sâu hại ở nước ta, góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ

sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loài sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng.

2 Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài

2.1 Mục đích

- Trên cơ sở đánh giá tiềm năng ký sinh tự nhiên, tiến hành tuyển chọn chủng

vi rút nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao trong phòng chống sâu khoang

- Xác định được kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại

- Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân

đa diện (NPV) trên tế bào sẽ góp phần làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng trong pháttriển sinh khối NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học

- Kết quả nghiên cứu tinh sạch thể vùi (OB) của NPV sâu khoang, thửnghiệm tạo chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước có hiệu quả cao trongphòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng làm cơ sở định hướng tiêu chuẩn hoá chấtlượng chế phẩm sinh học dựa trên số lượng thể vùi sau khi sản xuất

khoang, nhằm hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn và bảo vệ môi trường đồng ruộng.

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- Virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang: Được thu thập ngoài đồng ruộng vàđược phân lập tại phòng thí nghiệm Sinh học (Viện Bảo vệ thực vật)

- Tế bào sâu khoang: Nguồn thực liệu tế bào sâu khoang sử dụng trongnghiên cứu do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp, là dòng tế bào phát triển từ tế bàogốc của mô phôi sâu khoang và đã được phân lập nuôi nhân, chọn lọc qua 135 chu

kỳ, hiện đang được lưu giữ bảo quản tại Viện Bảo vệ thực vật

- Sâu non sâu khoang: Được nhân nuôi trong các lồng nuôi sâu chuyên dụng với thức ăn bằng lá bắp cải thu hái hàng ngày và xử lý vô trùng bằng cồn 700

4.2 Phạm vi nghiên cứu

- Đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên bắp cải, lạc, đậutương và khoai sọ ngoài đồng ruộng Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng NPV

có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang

- Xác định điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

- Điều kiện lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào sâu khoang

- Kỹ thuật tinh sạch thể vùi, tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

5 Những đóng góp mới của luận án

- Lần đầu tiên cung cấp các dẫn liệu khoa học có hệ thống về khả năng pháttriển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tếbào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tại Việt Nam

- Bổ sung các dẫn liệu khoa học mới về mức độ phổ biến của NPV trên sâukhoang hại bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ Phân lập, tuyển chọn được 3 chủngNPV có tiềm năng (TL.1a; TL.2a; TL.3a), trong số đó TL.1a có hoạt lực gây chếtsâu khoang cao nhất (80%) và số thể vùi hình thành nhiều (2,6 x 108 OB/10 sâu)

- Bước đầu xác định được kỹ thuật tinh sạch thể vùi NPV phục vụ tạo dạng

sử dụng chế phẩm Phát triển được 2 chế phẩm NPV dạng bột thấm nước (NPV-1

WP và NPV-2 WP) có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang hại trên cây bắp cải(80,51- 82,29%) và đậu tương (96,92%)

CHƯƠNG 1

CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu

NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) thuộc giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae là một trong số ít vi rút có thể tồn tại ở dạng thể vùi (Occlusion

Bodies- OB) nên dễ dàng phân lập, lưu giữ và tạo dạng thành chế phẩm sinh học.Trên đồng ruộng, NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôntồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm ngoài tự nhiên và chỉ

bị tiêu diệt khi thể vùi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặc dính bámtrên thân cây, lá cây, tàn dư cây trồng khi phơi nhiễm dưới ánh sáng trực xạ mạnh

hoặc tia cực tím (Kitajima, 1989; Grzywacz et al.,1996; Erayya, 2013) [6, 12, 13].

Sau khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi NPV, gặp pH cao(> 9,0) của ruột giữa làm vỏ protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các thể hoạtđộng (virion) và các thể vi rút hoạt động này sẽ xâm nhiễm vào nhu mô ruột giữa.Sau đó xâm nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể côn trùng Sau 2-3 ngày, sâu

ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Sajap et al., 2000) [14].

Khi sâu non chết, cơ thể căng mọng rất dễ bị vỡ khi có va chạm nhẹ và saukhi vỡ, thân sâu dính bám vào lá hoặc thân cây và treo ngược cơ thể Khi sâu chết,các thể hoạt động của NPV tập hợp lại trong vỏ bọc protein thành thể vùi, thể vùiđược giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại trong đất, trên tàn dư câytrồng Một sâu non chết bệnh NPV có thể chứa tới 24.553 thể vùi được giải phóng

ra môi trường đồng ruộng và có thể tồn tại từ 20-30 năm Trong quá trình canh táccây trồng, làm đất hoặc do mưa gió, các thể vùi này dính bám lên lá cây và tiếp tụcchờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại (Pourmirza, 2000) [15]

Như vậy, việc phun chế phẩm NPV vừa có ý nghĩa như một loại thuốc sinhhọc để phòng trừ sâu hại một cách trực tiếp, vừa có tác dụng bổ sung nguồn virushữu ích, góp phần bảo vệ cân bằng sinh thái trên đồng ruộng

Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các tế bàosống của cơ thể côn trùng ở điều kiện môi trường thích hợp, như vậy việc phát triển

sinh khối NPV phải được thực hiện trên cơ thể sâu còn sống như phương pháp nuôisâu truyền thống hoặc lây nhiễm trên các mô, tế bào được nuôi nhân (Kalmakoff và

Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009; Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007,

Rohrmann và George, 2011) [6, 11, 9, 16]

Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu để có sự hiểu biết đầy đủ về điều kiện pháttriển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân trên cơ sở sửdụng các chủng NPV có hoạt lực cao đã được tuyển chọn để phát triển sinh khốiNPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại

1.2 Tổng quan tài liệu

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

1.2.1.1 Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng

Các nhà khoa học trên thế giới đều xác định sâu khoang (Spodoptera litura

Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là loài sâu đa thực, phá hại trên trên 290 loài câythuộc 90 họ thực vật khác nhau và được coi là đối tượng sâu hại quan trọng trongsản xuất nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Kumari và Singh, 2009; Hong,

2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al.,2000) [1, 2, 20] Theo tổng hợp của Kuldeep

et al (2018) [17], sâu khoang phân bố rộng khắp ở khu vực Đông Nam châu Á, gây

hại trên 63 loại cây thuộc 22 họ, là sâu hại nguy hiểm gây thiệt hại nặng trên cácloại rau màu, đậu tương và bông, đay, v.v Riêng tại Ấn độ, theo Alfred vàSamiayyan (2017) [18] đã thống kê và xác định sâu khoang phá hại trên 140 loàicây thuộc 40 họ thực vật khác nhau, chủ yếu trên các cây trồng nông nghiệp

Sâu khoang có thời gian qua các giai đoạn phát dục khá dài, nhất là giai đoạnsâu non là thời gian sâu phá hại trên cây trồng, nên mức hại do sâu gây ra lớn.Nghiên cứu sự phát triển của sâu khoang trên cà chua, Nagamandla và Shantanu(2018) [19] xác định ở nhiệt độ 200C thời gian sâu non kéo dài tới 41,8 ± 3,56 ngày

và thời gian hoàn thành vòng đời là 60,4 ± 3,13 ngày; ở nhiệt độ 250C, thời giantương ứng là 25,8 ± 0,67 và 41,6 ± 1,08 ngày, nhưng ở nhiệt độ 300C thời gian phátdục của sâu khoang rút ngắn, còn 16,3 ± 0,83 và 30,1 ± 1,29 ngày (tương ứng)

Kết quả nghiên cứu của Jadhav et al (2015) chỉ rõ, khi sinh sống trên cây

nho ở điều kiện nhiệt đới, vòng đời của sâu từ 52- 56 ngày, trong đó thời gian phát

dục của trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành sâu khoang là 5- 7 ngày; 20- 23ngày; 4- 6 ngày và 9- 12 ngày (tương ứng), một trưởng thành cái đẻ trung bình499,2 trứng/con cái Tác giả cũng xác định tỷ lệ trứng nở của sâu khoang và khảnăng sống sót của sâu non tuổi lớn khá cao, vì vậy tác hại do sâu khoang gây ra trên

cây trồng thường rất lớn [20] Theo nghiên cứu của Patil et al., (2014), sâu khoang

có tiềm năng sinh sản rất cao, một trưởng thành cái có thể đẻ từ 500- 1.263 trứng vàkhi trứng nở với thời gian sống của sâu non tới 24,5- 28,2 ngày thì mức gây hại củachúng là rất lớn [21]

Nghiên cứu của Alfred và Samiayyan (2017) chỉ rõ sức ăn của sâu khoangtrên cây đậu triều ở mức cao nhất với chỉ số tiêu thụ thức ăn tới 3,889 trên đậu đỗ,

trong khi với các cây trồng khác ở mức từ 2,825- 3,343 [22] Theo Liu et al (1995)

xác định điều kiện thích hợp cho sâu khoang phát triển số lượng là 28- 300C và độ

ẩm không khí từ 85- 95% [23] Kết quả nghiên cứu của Muniappan và Marutani(1992) xác định số lượng quần thể sâu khoang phát triển mạnh ở nhiệt độ không khí29- 300C và độ ẩm trên 90% Các tác giả chỉ rõ sâu khoang phát triển nhanh với mật

độ cao trên bắp cải (185,7 con/10 cây), cải dưa và cải cuốn (169,0 con/10 cây) [24]

Hình 1.1 Các giai đoạn phát dục của sâu khoang

Kết quả nghiên cứu Jat et al (2017) [25] và Srivastava et al (2018) [26] xác

định NPV là tác nhân vi sinh vật gây chết sâu khoang rất phổ biến, được coi là nhân

tố quan trọng và có hiệu quả cao trong điều hoà số lượng quần thể sâu hại trên đồngruộng Hiện nay, các nhà bảo vệ thực vật rất quan tâm đến việc phát triển, ứng dụngcác chế phẩm NPV trong hệ thống quản lý tổng hợp (IPM) sâu hại nói chung và sâukhoang nói riêng

Tại Quảng Đông (Trung Quốc), Liu et al., (1995) xác định yếu tố hạn chế

đáng kể sự phát triển số lượng quần thể sâu khoang ngoài đồng ruộng là các tácnhân ký sinh trên sâu non, đặc biệt NPV có thể làm sâu chết từ 7,2- 30,5% Mặtkhác, do sâu hoá nhộng trong đất nên khi mưa kéo dài làm đất ngập nước thì nhộng

có thể chết tới 100% [23]

1.2.1.2 Nghiên cứu về NPV trên sâu hại

Theo Evans (1986), Summer và Smith (1987), Rohman và George (2011) chỉ

rõ vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae, lớp

Virus, bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus- NPV) và

vi rút hạt (Granulosis Virus – GV) [27, 28] NPV là tác nhân gây chết cao đối vớicác loài côn trùng thuộc các Bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Neuroptera,

Coleoptera, Trichoptera và nhện Theo Arayya et al (2013) NPV phát sinh và tồn

tại phổ biến trong tự nhiên, rất chuyên tính với ký chủ, không lây nhiễm trên độngvật máu nóng, an toàn với thiên địch và môi trường [29]

Hình 1.2 Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D)

(Nguồn: Rohrmann và George, 2011)

Theo Arayya et al (2013), NPV có dạng hình gậy, có kích thước 40- 70 x

250 - 400nm bao gồm lớp vỏ lipoprotein bao quanh nhân (capsid) chứa thể protein (core) và được gọi là nucleo- capsid NPV tồn tại dưới dạng các hạt tinh thểsáng, góc cạnh gọi là thể vùi (OB) hay còn gọi là polyhedra hoặc thể nhân đa diện(PIB) Khi quan sát dưới kính hiển vi phản pha, thể vùi có kích thước 1-7µm Tinhthể này có nhiều cạnh và tạo thành 1 protein có khối lượng phân tử khoảng 25- 30kDa Các hạt virus có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsit (virion) và NPV cómột đặc tính hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào vật chủ với kíchthước 0,5 - 15 nm [13]

DNA-Theo Hong et al (2002), Rohrmann và George (2011) [2, 5], cấu tạo của

NPV gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ capsid và lõi axit nucleic

- Vỏ ngoài: là một lớp màng lipoprotein ngoài cùng còn gọi là protein ngoài.

Protein ngoài mang tính kháng nguyên và có tác dụng kích thích vào hệ thống miễndịch của cơ thể vật chủ

- Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn

cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp dịch Protein tạo nên vỏ capsid được gọi làprotein trong Protein trong mang tính kháng nguyên, có tác dụng làm tăng khả nănggây bệnh của virus

- Genom: Genom của NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch xoắn kép Khi

nhiễm vào tế bào vật chủ virus đưa lõi ADN vào tế bào vật chủ, ADN của virus sửdụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nênprotein và quá trình nhân lên của ADN Mặt khác, khi tế bào bị nhiễm virus, ADNcủa virus sinh ra men Azenaza ức chế ADN của tế bào vật chủ và phân giải tạothành các nucleotit tự do Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, ADN thìNPV tạo thành thể virus mới

Theo Lynn (2002), vỏ của polyhedrin (thể vùi) được bao bọc là protein.Polyhedrin dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm Do đó trong dịch ruột giữa củasâu khoang với pH là 9-10 các thể đa diện bị phá vỡ, giải phóng các hạt virus tự do(virion) Các hạt virus xâm nhập vào tế bào máu đến tế bào da, tế bào biểu mô khíquản và tế bào mỡ để gây bệnh [30]

Quá trình nhân lên của NPV và sự hình thành thể đa diện được tiến hànhtrong nhân tế bào, vỏ của thể đa diện được tổng hợp ở ngoài nhân sau đó vậnchuyển vào trong nhân để hình thành các thể đa diện Số lượng virus và thể đa diệnngày một tăng, kết quả phá vỡ tế bào vật chủ, giải phóng virus tự do và thể đa diện.Virus tự do lại tiếp tục xâm nhập vào tế bào lân cận, bắt đầu chu trình phá vỡ tế bàotiếp theo Khi các tế bào vật chủ bị phá vỡ, quá trình phát bệnh của sâu hại sẽ biểuhiện ra bên ngoài.

Phân tích trên kính hiển vi điện tử thấy các thể vùi đa diện nhân là nhữngtinh thể lớn, nhiều cạnh, có dạng như hình thoi, hình vuông, kích thước từ 1- 7 m.Các thể vùi này có cấu tạo vỏ bọc bởi các thể protein Các lát cắt cực mỏng phóngđại trên 60.000 lần cho thấy các khối đa diện chứa nhiều virion hình que (Rohrmann

và George, 2011; Khosaka et al., 1971) [5].

Theo Harrap (1972), các virion của NPV có một nucleocapsid trong một lớp

vỏ bao và nucleopsid này cũng có dạng hình que, chiều dài trung bình của cácvirion là 200µm và đường kính 30 µm [31] Rohrmann và George (2011) [5] cònchỉ rõ các virion có 2 loại, gồm thể vùi (OB) và thể chồi (BV)

Theo Rohrmann và George (2011), thể vùi (Occlusion Bodies – OB) hay còngọi là thể vùi đa diện (Polyhedrosis Inclusion Bodies – PIB) có tính bền vững cao

và chống chịu tốt với điều kiện môi trường bình thường, chúng chứa thể đa diệntrong lớp vỏ protein gọi là polyhedrin Các khối đa diện có đặc điểm dễ bị kiềm hoá,dùng NaOH 0,1N có thể phá vỡ các vỏ đa diện giải phóng các virion Vì vậy trongruột côn trùng, dịch ruột mang tính kiềm nên các polyhedra dễ bị phân huỷ để lâynhiễm tiếp vào các nhân của các tế bào khác Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một sợi đôiADN dạng vòng Khối lượng phân tử 75 - 10 x 106 Da

Thể chồi (BV) được hình thành trong quá trình xâm nhiễm vào tế bào nhu

mô ruột giữa của vật chủ, sau đó các polyhedra của thể chồi xâm nhiễm vào các tếbào của các cơ quan vật chủ Đến cuối quá trình xâm nhiễm, các virion tập hợp lại

và hình thành lớp vỏ bọc protein trở thành thể vùi (OB) trong tế bào vật chủ và sau

đó giải phóng ra môi trường theo xác chết bị phân rã của cơ thể vật chủ [5]

Theo Farrar et al (1999) thì NPV là nhóm virus lớn và có hiệu quả gây chết

cao đối với các loài côn trùng, mỗi loài virus thường rất chuyên tính Đặc biệt, cácloài NPV hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có xương sống Vì thế,chúng là những tác nhân sinh học rất hữu ích trong phòng trừ sâu hại cây trồng [32]

Kết quả thí nghiệm đồng ruộng trên cải bắp của Jat et al (2017) xác định hiệu lực trừ sâu khoang (Spodoptera litura) đạt từ 58,15- 72,13% khi phun với liều lượng 1,5

x1012 OB/ha [33] Kết quả của Grzywacz et al (2008) cho thấy hiệu quả trừ sâu Spodoptera exempta trên đậu đỗ đạt tới 96% khi phun SpexNPV với liều lượng 5 x

1011 OB/ha [34] Kết quả thí nghiệm của Bedjo (2017) trên đậu tương tại vùngĐông Java (Indonesia) với các chủng khác nhau ở nồng độ từ 1 x 106 đến 1 x 1012PIB/ml thì chủng có tỷ lệ sâu non sâu khoang tuổi 3 cao nhất đạt từ 51,11- 77,78%

sau 168 giờ xử lý [35] Tại Malaysia, Sajap et al (2000) đánh giá mức độ chuyên tính của NPV sâu khoang (Spodoptera litura) đã xác định khi phun NPV sâu

khoang với liều lượng 6 x 107 PIB và 6 x 108 PIB/sâu non sâu khoang cho hiệu quảgây chết tương ứng là 80,81 và 95,95%, nhưng hoàn toàn không gây chết sâu non

Spodoptera retorta Clerk (Noctuidae) và Preroma pendulla Joanis (Psychidae) [14] Kết quả nghiên cứu của Jat et al.(2017) khi so sánh hiệu lực của các thuốc bảo vệ

thực vật dùng phòng trừ sâu khoang trên bắp cải, xác định hiệu lực của NPV đạt76,11%, trong khi thuốc Spinosat đạt 85,99% và chế phẩm Bt đạt 52,93% sau 7ngày phun [33]

Từ kết quả đánh giá hiệu quả của NPV trong phòng từ sâu khoang khi sửdụng riêng rẽ hoặc phối hợp với thuốc hoá học trên bắp cải tại Pakistan, nhóm tác

giả Maqsood et al (2017) và Sumaira et al (2017), đã khẳng định NPV là tác nhân

vi sinh vật có hiệu quả cao trong quản lý sâu khoang, chúng không chỉ gây chết sâu

non mà cả nhộng và trưởng thành mới vũ hoá [36, 37] Arayya et al (2013) cho

rằng NPV với nhiều đặc tính quí được coi là thuốc trừ sâu sinh học có tiềm năng

cần được khai thác sử dụng để phòng trừ sâu hại [13] Theo tổng hợp của Devi et al.

(2016), hiện nay đã có 15 loại chế phẩm NPV đã được thương mại hoá, các sảnphẩm đóng vai trò quan trọng trong công tác bảo vệ cây trồng và thân thiện môitrường Tuy nhiên, theo tác giả, do NPV thuộc tác nhân ký sinh bắt buộc, chỉ có thể

phát triển sinh khối trên sâu, mô hoặc tế bào sống, điều này được xác định là khókhăn lớn nhất cho việc phát triển sinh khối NPV để phòng chống sâu hại [38] Mặtkhác, NPV phát sinh rất phổ biến trên đồng ruộng nhưng hoạt lực diệt sâu hại củachúng cũng rất khác nhau, nên khi phát triển thành chế phẩm có hiệu quả cần thiếtphải qua quá trình tuyển chọn (Escribano,1999) [39] Kết quả nghiên cứu của Bedjo(2017) xác định chỉ có 1 trong 6 chủng phân lập NPV sâu khoang hại đậu tương làSlNPV-JTM 97c có hiệu lực gây chết sâu đạt 77,9% [35].

Hơn nữa, kết quả nghiên cứu của Salama et al (2017) chỉ ra rằng virus còn

chịu tác động của tia UV (Ultra violet), nhất là khi sử dụng chế phẩm trong mùa hè,

do tia UV sẽ làm giảm số lượng thể vùi của chế phẩm từ 25,2- 34,5% khi phơinhiễm UV từ 2- 4 giờ, dẫn tới làm giảm hiệu quả trừ sâu của thuốc còn 67,3% vàkéo dài thời gian trước khi chết của sâu ngoài đồng ruộng từ 2- 3 ngày Vì vậy, việcchọn thời điểm sử dụng chế phẩm NPV cũng là vấn đề cần thiết [40]

1.2.1.3 Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng

Cũng như tế bào động vật nói chung, các dòng tế bào của các loài côn trùngcũng thuộc nhóm Eukaryote, là tế bào của sinh vật có nhân chuẩn, có màng nhânngăn cách nhân với tế bào chất và trong nhân tế bào phân tử DNA kết hợp với cácprotein tạo thành các sợi nhiễm sắc thể (Sills, 2005) [41]

Theo tổng kết của Granados et al (2007), Elanchezyan (2009), Lynn (2002)

và Sudeep et al (2005) thì trong những năm đầu của thế kỷ 20 khoa học nghiên cứu

về côn trùng trong một số lĩnh vực đã có những ý tưởng đầu tiên về việc sử dụng tế

bào côn trùng trong nuôi cấy in vitro như là một công cụ thí nghiệm cho các nghiên

cứu cơ bản về sinh học tế bào, bệnh lý côn trùng, v.v [9, 11, 30, 42]

Dẫn theo tài liệu tổng hợp của Granados et al (2007) [9], thí nghiệm nhân nuôi tế bào côn trùng in vitro đầu tiên do Goldsmidt tiến hành vào năm 1915, ông

đã nuôi cấy các phần mô tách ra từ loài tằm Hyalophora cecropia Sau đó, vào cuối

những năm 1930, Trager thực hiện một bước đột phá lớn bởi đã phát triển được mộtmôi trường nuôi cấy dựa trên những hiểu biết về tính chất vật lý và hóa học của tếbào máu côn trùng Đến năm 1956, Wyatt đã phát triển một môi trường dựa trênphân tích sinh hóa chi tiết của tế bào máu tằm và chứng minh môi trường này gây ra

sự tăng trưởng của tế bào từ mô buồng trứng của loài tằm Bombyx mori, đóng góp

vào sự tăng trưởng và duy trì sự sống sót của tế bào trong phòng thí nghiệm trongthời gian dài đến ba tuần

Gần 50 năm sau kết quả nghiên cứu đầu tiên của Goldschmidt (1915), Grace(1962) đã nghiên cứu ra môi trường nuôi cấy cùng với việc phân lập, nhân nuôithành công dòng tế bào đầu tiên từ bộ Lepidoptera, kể từ đó có tới hơn 500 dòng tếbào khác nhau đã được phát triển, chủ yếu là ở các bộ Diptera, Lepidoptera,

Hemiptera và Orthoptera (Dẫn theo Granados et al 2007 và Lynn, 1998) [9, 43].

Khi bắt đầu nuôi cấy tế bào côn trùng, một phương pháp chung giống nhưphương pháp duy trì nuôi cấy tế bào động vật đã được áp dụng cho nuôi cấy tế bàocôn trùng Tuy nhiên, điều kiện cụ thể cần phải được thay đổi và có tiêu chuẩn riêngđối với từng loài tùy thuộc vào mô chọn để nuôi cấy ban đầu, môi trường nuôi cấy,chất dinh dưỡng bổ sung, pH, nhiệt độ nuôi, v.v (Freshney, 1987) [44]

Theo Grace (1982) và Granados et al (2007), trong phát triển sinh khối tế

bào từ các tế bào gốc thì tế bào sẽ phân chia liên tục trong thời gian dài ở môitrường thích hợp Nếu mô tế bào phân lập không chứa tế bào gốc thì tế bào sẽ pháttriển chậm hoặc phát triển với tốc độ giảm dần và cuối cùng chúng không phân chiatiếp mà sẽ tự chết dần [45, 9]

Theo Elanchezyan (2009), việc nhân nuôi phát triển sinh khối tế bào côntrùng có ý nghĩa to lớn để phục vụ cho nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứngdụng và thương mại Chúng được sử dụng để sản xuất chế phẩm vi rút cho từng loàithuộc bộ Lepidoptera, tạo ra thuốc trừ sâu sinh học hoặc sử dụng cho protein tái tổhợp Vì vậy, việc nghiên cứu và sử dụng tế bào côn trùng ngày càng được quan tâmtại nhiều nước trên thế giới Sản phẩm tế bào nhân nuôi còn phục vụ việc sản xuấtprotein tái tổ hợp, nghiên cứu sinh học và hoá sinh học tế bào; hiển thị các gen lạtrong công nghệ tái tổ hợp gen; phát hiện tác nhân gây bệnh và tương tác giữa tếbào và vi rút; sản xuất qui mô thương mại các vacxin chữa bệnh [11]

Theo đánh giá của Guy and Goodman (2008), hiện nay các nghiên cứu tậptrung nhiều vào việc phát triển các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật sử dụng vi rútcôn trùng, coi đó như một công cụ mới trong quản lý sâu hại cây trồng nông lâm

nghiệp [46] Còn Granados et al (2007) và Weiss et al (1981) cho rằng định hướng

thời gian tới sẽ là thời kỳ nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng với qui

mô lớn và thúc đẩy sản xuất cũng như thương mại sản phẩm từ nhân nuôi tế bào

trên thị trường, nhất là các thuốc trừ sâu sinh học virus [9, 47] Sudeep et al (2005)

chỉ rõ có tới 15 dòng tế bào của bộ Lepidoptera đã được xác định tại Ấn Độ đang và

sẽ sử dụng để nhân sinh khối virus với qui mô lớn phục vụ sản xuất thuốc trừ sâusinh học [42]

Qua 25 năm nghiên cứu, Lynn (2002) [30] đã tổng kết thành qui trình chungcho việc nhân sinh khối tế bào côn trùng qua 11 công đoạn với các yêu cầu cụ thểkhác nhau cho từng công đoạn nhân nuôi Đồng thời, chỉ rõ các loại vật liệu và thiết

bị cần có để nuôi nhân tế bào, đồng thời mô tả chi tiết các bước thực hiện củaphương pháp có hiệu quả để nhân nuôi đối với các dòng tế bào côn trùng khác nhau,

cụ thể như:

- Bốn bước thực hiện chung cho các dòng tế bào côn trùng;

- Bốn bước thực hiện đối với tế bào không bám dính hoặc bám dính lỏng lẻo,

như các dòng tế bào của loài Spodoptera litura và Mamestra brassica v.v

- Sáu bước thực hiện với các dòng tế bào bám dính chặt, như các dòng tế bào

của loài Spodoptera frugipera, Anticarsa gemmatalis và Plutella xylostella, v.v.

- Đối với các dòng tế bào bám dính rất chặt như loài Heliothis armigera và Diabrotica undecimpuncta phải thực hiện 7 bước bằng phương pháp Tripsin hoá.

Lynn (2002) cũng chỉ rõ vấn đề cần lưu ý trong nuôi cấy tế bào động vật nóichung cũng như nuôi cấy tế bào côn trùng nói riêng đó là việc kiểm soát lây nhiễm

trong quá trình nhân nuôi in vitro tạo vật liệu tế bào [30].

Theo Hurton et al (2005), có 5 yếu tố liên quan đến việc không nhận biết và

khắc phục được tế bào nuôi cấy bị lây nhiễm, bao gồm: Một là: do kỹ thuật thao táckhông đúng và nhiễm từ nguồn thực liệu ban đầu; Hai là: nhận biết nhiễm qua kiểmtra cảm quan (độ đục, màu sắc của môi trường nuôi cấy chuyển sang màu vàng,v.v.); Ba là: có khoảng 6% các mẻ nuôi cấy tế bào bị nhiễm mà không thể nhận biếtngay nên không kịp khắc phục; Bốn là: không nhận biết được do có chất kháng sinhtrong môi trường nuôi cấy đã ức chế tạm thời vi khuẩn; Năm là: không có cách khắc

phục dẫn đến tế bào bị phá hủy Theo đó nguồn nhiễm có thể là từ mô ban đầu chưasạch, nhiễm chéo trong quá trình nuôi cấy, do các dụng cụ phòng thí nghiệm, môitrường, thuốc thử chưa vô trùng và do thao tác của các kỹ thuật viên [48].

Theo Lynn (1996) cách đơn giản để tránh nhiễm khuẩn là không sử dụngkháng sinh trong nuôi cấy duy trì dòng tế bào Trong khi điều này nghe có vẻ mâuthuẫn thì lí do thật đơn giản Nếu không có kháng sinh trong môi trường, nếu nuôicấy bị nhiễm khuẩn thì sự nhiễm vi khuẩn đó sẽ nhận biết ngay trong môi trườngnuôi cấy giàu dinh dưỡng chỉ trong ít ngày nuôi cấy Điều này giúp kĩ thuật viênphát hiện sớm nhất có thể và nuôi cấy trở lại để phục hồi tế bào bị nhiễm [49]

Ngược lại, nếu nuôi cấy duy trì tế bào có kháng sinh có thể cấy chuyền tế bàotrong nhiều tuần hoặc nhiều tháng với mật độ nhiễm thấp mà không phát hiện được.Điều đó có thể giải thích là do chất kháng sinh được sử dụng liên tục sẽ làm chậm

sự phát triển của vi khuẩn trong tế bào bị nhiễm mà mắt thường không nhận biếtđược nhưng thực tế nuôi cấy đó đã bị nhiễm khuẩn Bằng cách đó, tất cả các tế bàonuôi cấy sẽ bị nhiễm khuẩn lan rộng và khi đó cũng sẽ có ít hy vọng phục hồi

Vì lý do nêu trên, Lynn (1996) cho rằng chỉ nên sử dụng kháng sinh trongnhững thí nghiệm trong thời gian ngắn hoặc nuôi cấy sơ cấp Trong trường hợp nuôicấy sơ cấp, sau mỗi lần nhân sinh khối tế bào môi trường nuôi cấy cũ được thay thếbằng môi trường mới phải bổ sung chất kháng sinh (thường sau cấy chuyển lần thứ5) Như thế tránh được hầu hết mọi sự nhiễm khuẩn [49]

Theo tác giả này, mối lo ngại chính khi nuôi cấy tế bào côn trùng lại là việc

tế bào bị nhiễm vi rút và mycoplasma Để tránh nhiễm vi rút và mycoplasma thì giảipháp tốt nhất đó là không bao giờ được sử dụng pipet hút bằng miệng và môitrường, huyết thanh không chính hãng Bên cạnh đó, tác giả cũng khẳng định mộtlợi thế khi nuôi nhân tế bào côn trùng, trong khi rất nhiều các tác nhận và chất gâynhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật có xương sống phải đối mặt thì lại không phải làmột vấn đề với các tế bào côn trùng

Để loại bỏ tất cả các nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy tế bào côn trùng cầnphải kiểm tra vô trùng ở tất cả các giai đoạn nuôi cấy, cần tiến hành định kỳ hàngtháng cho nuôi cấy các dòng tế bào liên tục, định kỳ hàng tuần trong trường hợp

phòng thí nghiệm bị nhiễm, trước mỗi lần bảo quản và trong trường hợp gặp cùngmột vấn đề với những kết quả bị lặp đi lặp lại Khi phát hiện nhiễm cần loại bỏ ngay

tế bào đang nuôi cấy và kiểm tra tế bào đang bảo quản Đồng thời, cô lập tất cả cácmẫu bảo quản liên quan đến mẫu nhiễm, khử trùng phòng thí nghiệm theo qui trìnhtiêu chuẩn và loại bỏ ngay lập tức những tế bào không thể phục hồi thay thế

Các nhà khoa học của Invitrogen Life Technologies (2002a) đã nêu khá chitiết về qui trình nuôi nhân, môi trường nhân sinh khối cần phải sử dụng và cácphương pháp nhận biết, xử lý khi sinh khối tế bào nuôi nhân bị nhiễm tạp Qui trìnhcũng chỉ rõ từ khâu chuẩn bị các trang thiết bị cần thiết, chuẩn bị môi trường nhânnuôi, hệ thống điều khiển điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, pH và không khí,v.v.) và kỹ thuật bảo quản tế bào trong thời gian chờ sử dụng, v.v Các tác giả nàycũng nêu rõ 2 chỉ tiêu đánh giá chất lượng nuôi nhân dựa trên kết quả tính tổng số tếbào có trong dịch thể, hình thái của tế bào và mức độ biến động số lượng tế bào dựatrên xác định tổng số tế bào sống có được [50]

Như vậy, khi phát triển sinh khối đối với mỗi dòng tế bào của 1 loài côntrùng cần thiết phải có sự nghiên cứu chi tiết để xác định rõ các yếu tố thích hợp cho

sự phát triển của tế bào, gồm: chủng loại môi trường, huyết thanh bổ sung, nhiệt độ

và pH môi trường nhân nuôi, v.v

Theo Murhammer (2007) [51], quá trình nuôi nhân tế bào của loài côn trùngnào đó cũng đều phải trải qua 3 công đoạn khác nhau, gồm: nhân sơ cấp, nhân thứcấp và nhân sản xuất Các bước thực hiện cũng tương tự như nuôi nhân một tácnhân vi sinh vật hữu ích để phát triển chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật, bao gồm:

- Nhân giống thực liệu từ giống gốc hay còn gọi là nhân sơ cấp hoặc nhân sơkhởi (Initiation culture): nguồn thực liệu tế bào hay còn gọi là giống gốc thườngđược bảo quản trong điều kiện lạnh sâu, như tủ lạnh sâu (-1980C) hoặc trong bình ni

tơ lỏng Khi đưa vào nhân nuôi phải thực hiện giai đoạn nhân phục hồi, loại bỏ hoạtchất duy trì, thay bằng môi trường nuôi nhân nhằm giúp tế bào phục hồi trở lại cáchoạt động sống của mình

- Nhân nguồn thực liệu hay còn gọi là nhân thứ cấp (Subculture): Đây là giaiđoạn cần thiết để tạo ra sinh khối tế bào với khối lượng đủ lớn làm cơ sở cho nhângiống tế bào, phục vụ cho các nghiên cứu chuyên sâu và sản xuất chế phẩm.

- Nhân sản xuất sinh khối tế bào (Cell culture): Tuỳ theo mục đích sử dụng,như: để nghiên cứu, để phát triển khối lượng nguồn tế bào phục vụ lây nhiễm vi rúttạo chế phẩm Để sản xuất chế phẩm sinh học, tuỳ theo điều kiện trang thiết bị, nhucầu về khối lượng chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật, cần sản xuất mà việc nhânsinh khối có thể tiến hành với qui mô nhỏ hoặc lớn

Trong quá trình nuôi nhân, thời gian đầu trong môi trường đầy đủ nên hàmlượng tế bào tăng dần và đạt đỉnh cao sau 4- 8 ngày tuỳ theo dòng tế bào, sau đógiảm nhanh do dinh dưỡng trong môi trường hết dần Murhammer (2007) chia diễnbiến tăng trưởng mật độ tế bào trong quá trình phát triển số lượng tế bào thành 4giai đoạn: 1) Pha chậm hay còn gọi là pha khởi động; 2) Pha tăng trưởng mật độtheo hàm số số mũ; 3) Pha ổn định và 4) Pha suy giảm, tế bào chết dần do thiếudinh dưỡng và điều kiện môi trường (như: dinh dưỡng, pH, v.v.) không còn thíchhợp cho tế bào hấp thu để phân chia tăng trưởng mật độ, đòi hỏi phải loại bỏ dịchmôi trường cũ và thay bằng môi trường mới để tiếp tục phát triển Trong pha chậm,các tế bào đưa vào nuôi cấy dần thích ứng với môi trường nuôi cấy mới, còn ở pha

ổn định thì mật độ tế bào không tăng và cần thu hoạch tế bào vào thời điểm này Vìvậy, thời gian tính từ khi bắt đầu nhân nuôi đến khi kết thúc pha phát triển ổn địnhđược xác định là một chu kỳ nuôi cấy [51]

Theo Murhammer (2007) [51] đề xuất việc tính khả năng tăng trưởng mật độ

tế bào trong một chu kỳ nhân nuôi của một loài côn trùng nào đó có thể tính theocông thức sau:

N = N0exp(µt)

Trong đó: N : là mật độ tế bào (tế bào/ml) ở thời điểm t;

N0 : là mật độ tế bào (tế bào/ml) ở thời điểm t =0; µ là tốc độ tăng trưởng đặc trưng (h-1) và

t : là thời gian nhân nuôi (giờ)

Đồng thời, tác giả cũng đã tổng hợp và chỉ rõ các bước thưc hiện của kỹthuật nhân sinh khối tế bào côn trùng ở giai đoạn nhân sơ khởi, sản xuất ở qui mônhỏ dưới 10 lít và với qui mô lớn đến 100 hoặc tới 5.000 lít.

Theo Elanchezhyan (2009) hoàn toàn có thể nuôi nhân tế bào côn trùng vớimôi trường nhân tạo có chứa đầy đủ các hợp chất hữu cơ, vitamin, axit hữu cơ,muối vô cơ và huyết thanh động vật trên bình nuôi cấy kích thước nhỏ và bình códung tích lớn [11], song cần phải nghiên cứu nhu cầu của từng dòng tế bào cụ thể

1.2.1.4 Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng

• Môi trường nuôi nhân

Theo Elanchezhyan (2009), các loại tế bào côn trùng được nuôi nhân trongmôi trường nhân tạo có đầy đủ các thành phần, gồm: carbohydrate, các vitamin, axíthữu cơ, muối vô cơ v.v Ngoài ra, các môi trường phải được bổ sung với các hợpchất hóa học xác định khác để góp phần thúc đẩy phát triển và phân chia của tế bào,chẳng hạn như huyết thanh bào thai bê, thành phần hữu cơ chiết xuất từ vi khuẩnhoặc protein thủy phân [11]

Đến nay, các nhà khoa học đã phát triển khá nhiều loại môi trường có tínhnăng khác nhau phục vụ nuôi nhân tế bào côn trùng, đã được giới thiệu thương mạihoá trên thị trường và nhà sản xuất sinh khối tế bào chỉ việc lựa chọn sao cho cóhiệu quả kinh tế Thành phần môi trường nuôi nhân cơ bản gồm có muối vô cơ,carbonhydrate, axit amin, vitamin, axít béo và các loại lipid, protein, peptide, huyếtthanh và các chất đệm điều chỉnh pH môi trường nuôi cấy (Lynn,1996) [49]

Granados et al (2007) đã tổng hợp lại lịch sử việc nghiên cứu môi trường

nuôi nhân tế bào chỉ rõ, từ năm 1935 Trager đã thiết lập môi trường để nuôi nhân tếbào tằm dâu với 6 thành phần và bổ sung 10% huyết tương của tằm nhưng nhậnthấy số lượng tế bào tăng không nhiều Đến năm 1956, Wyatt đã thành công nuôicấy tế bào tằm dâu khi sử dụng môi trường với 34 thành phần, gồm 5 loại muối vô

cơ, 3 loại đường, 4 axít vô cơ, 22 loại axit amin và được bổ sung 10% huyết tươngcủa tằm dâu [9]

Tác giả này cũng chỉ rõ hiện nay có nhiều loại môi trường nhân nuôi tế bàokhác nhau được thương mại hoá trên thị trường và thường bao gồm 30 thành phần

khác nhau Tuy nhiên, theo tác giả này thì không hẳn tất cả các thành phần đó đềucần thiết cho sinh trưởng của tế bào Vì tác giả này lý giải dựa trên kết quả nghiên

cứu của Gaw et al (1958) thì chỉ cần môi trường có 6 thành phần được bổ sung

thêm huyết tương loại không có hoạt tính là đủ và cho rằng có thể trong huyết tương

có chứa yếu tố sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và tạo tế bào,

vì vậy việc bổ sung huyết tương có tác dụng thúc đẩy phát triển của tế bào

Theo Agathos (2007), sự sinh trưởng của tế bào côn trùng cũng như tế bàocủa các động vật khác đều yêu cầu môi trường thích hợp để phân chia tế bào Môitrường nuôi cấy là một hỗn hợp của các vitamin, aminoaxit, carbonhydrate và mộtlượng nhỏ huyết tương hoặc huyết thanh Việc nuôi nhân tế bào truyền thống đềudựa trên môi trường cơ bản, như môi trường Grace, TNM-FH hoặc TC-100 có bổsung 5 hoặc 10% huyết thanh (FBS) Đồng thời, một số công ty hoá sinh về nuôinhân tế bào côn trùng còn đưa ra các loại môi trường cho phép giúp việc nhân tếbào với mật độ cao, như: SF 900 II, Express FiveTM của hãng Invitrogen; Ex- Cell

400, Ex- Cell 401, Ex- Cell 405, Ex- Cell 420 của hãng JRH Biociences, v.v [16]

Từ các kết quả nghiên cứu của mình, Agathos (2010) khẳng định môi trường nuôinhân thích hợp là yếu tố quyết định sự thành công của việc nuôi nhân tế bào ở cáccấp độ từ qui mô nhỏ trên bình có dung tích 25cm2 đến qui mô lớn 2000 lít [52]

Lynn (1996) cũng khẳng định vấn đề quan trọng nhất cần xem xét để pháttriển sinh khối của một dòng tế bào mới là môi trường nhân nuôi Tác giả cho rằngnhiều môi trường được sản xuất đặc biệt dành cho nuôi cấy tế bào các loài thuộc bộLepidoptera Các môi trường này được cải tiến từ môi trường Grace như ExCell

401, SF-900 và Insect-Xpress hoặc môi trường cải biến từ môi trường BML/TC-10,

đó là môi trường TC-100 có bổ sung thêm các peptit (như 1,25% phytone peptone,1,25% peptone #P0521, 0,075% peptone P7750 và 5- 10% Fetal Bovine Serum(Sigma)) Ngoài ra, những điểm chính cần cân nhắc trong việc lựa chọn một môitrường cho phát triển sinh khối một loài côn trùng là pH, độ thẩm thấu, số lượng và

tỷ lệ các chất muối vô cơ có trong môi trường nhân nuôi [49]

Theo Lynn (2002) [30], hiện nay các công ty hóa sinh đã giới thiệu ra thịtrường nhiều loại môi trường tiêu chuẩn và các thành phần bổ trợ khác nhau cho

việc nuôi nhân tế bào côn trùng Các sản phẩm đó được tạo ra có đầy đủ các thànhphần dinh dưỡng nên vừa có hiệu quả cao trong việc nhân nuôi tế bào côn trùng,vừa có tính ổn định và tiện sử dụng Song vẫn phải đánh giá lựa chọn chủng loạimôi trường và xác định tỷ lệ chất bổ trợ phù hợp với từng loại tế bào và từng loàicôn trùng cụ thể [30].

Mishuhashi (1976) tiến hành nuôi nhân sơ cấp dòng tế bào sinh trưởng liên

tục được phân lập từ phôi của nhộng sâu khoang (S litura) bằng môi trường

MGM-450 được bổ sung 10% FBS hoặc bằng môi trường MM có 3% FBS thì mật độ tế

bào tăng gấp 2 lần sau 48 giờ [53] Bhutia et al (2012) đã tiến hành thí nghiệm so

sánh mật độ tế bào tạo ra khi nuôi nhân với dòng tế bào SF9 trên 2 loại môi trường

là IPL-41và EMICG, kết quả mật độ tế bào khi nuôi trên IPL-41 tăng 14,81 lần vàtrên EMICG tăng 13,76 lần so với mật độ ban đầu trước khi nuôi nhân [54]

Segura và Felio (2012) đã tiến hành nhân nuôi dòng tế bào mô phôi loài

muỗi vằn Culex quinquefasciatus (Diptera) Khi nuôi cấy trong các môi trường khác

nhau, như: L-15, Grace’s, Grace’s/L-15, MM/VP12, Schneider’s và DMEM để tìm

ra môi trường nhân nuôi thích hợp, với pH 6,7 - 6,9 và ủ ở 280C Kết quả là môitrường Grace’s/L-15 là thích hợp nhất cho việc nuôi nhân tế bào bám dính và tăngsinh khối tế bào [55]

Như vậy, để nuôi nhân sinh khối tế bào côn trùng đạt hiệu quả cao thì việcnghiên cứu xác định lựa chọn chủng loại môi trường nuôi nhân cho phù hợp vớitừng cấp độ nhân và với dòng tế bào của từng loài côn trùng cụ thể là vấn đề cầnthiết, là yêu cầu đầu tiên của việc nhân sinh khối tế bào

• Nhiệt độ khi nuôi nhân

Nhiệt độ cũng là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng thành công

của nhân nuôi in vitro tế bào côn trùng Theo Lynn et al (2005), hầu hết các dòng tế

bào côn trùng nhân nuôi ở nhiệt độ từ 250C – 290C, nhưng khi nuôi nhân sơ cấp thìtiến hành ở nhiệt độ từ 260C – 280C Tác giả cho rằng đây khoảng nhiệt độ phù hợpnhất và tốt nhất cho hầu hết các tế bào côn trùng phân chia, có thể đó là khoảngnhiệt độ thích hợp đối với hầu hết các loài côn trùng sinh sống trong tự nhiên [56].Tuy nhiên, theo khuyến cáo của Invitrogen Life Technologies (2002) thì cần duy trì

ổn định ở nhiệt độ 270C là thích hợp nhất khi nuôi nhân các dòng tế bào SF9 vàSF21 [52] Còn Murhammer (2007) lại nuôi nhân thành công các dòng tế bào này ởnhiệt độ 27- 280C [51].

Theo Elanchezhyan (2009) thì nhiệt độ thích hợp nhất để nuôi nhân hầu hếtcác dòng tế bào côn trùng là 27,0- 27,50C [11] Toprak và Gurkan (2004) chỉ rõnhiệt độ không khí là 27 ± 0,50C và độ ẩm không khí trong buồng nuôi nhân là 75%

là thích hợp nhất khi nuôi nhân tế bào Spodoptera litoralis [57] Knudson và Tisley

(1974) sử dụng mức nhiệt 270C khi nuôi nhân tế bào sâu hại này để đánh giá khả

năng lây nhiễm vi rút NPV [58], trong khi đó Lynn et al., (2005) lại tiến hành nuôi

nhân 12 dòng tế bào ở nhiệt độ 260C [56] và Petchprakob et al (2007) nuôi nhân tế bào sâu xanh Heliothis zea ở nhiệt độ 270C [59] cũng như McAteer và Davis (1994)

khi nuôi nhân dòng tế bào SF9 và SF21 của sâu khoang Spodoptera frugiperda, của

tằm dâu Bm5 và của sâu đo xanh BT1-Tn-5B-4 cũng đều ở nhiệt độ 270C [60] Guy

và Goodman (2008) nuôi nhân 2 dòng tế bào tạo được từ sâu xanh Heliothis virescens ở nhiệt độ 280C cho mật độ tế bào từ 0,5 x 107 tế bào/ml lên tới 1,35 x 107

tế bào/ml tăng 2,7 lần) trong bình nuôi T-75 cm2 [46] Trong khi đó, Mishuhashi

(1995) nhận thấy nuôi nhân dòng tế bào sâu khoang Spodoptera litura ở nhiệt độ

250C cho mật độ tế bào tăng gấp 2 lần sau 43 giờ [61] Agathos (2007) khuyến cáonên duy trì ở nhiệt độ 27 ± 0,50C khi nuôi nhân tế bào theo phương pháp lắc [16].Còn Knudson và Tinsley (1974) khuyến cáo nên duy trì nhiệt độ 270C khi nhân sinhkhối tế bào với khối lượng lớn [58]

Khuyến cáo của Invitrogen Life Technologies (2002) đã chỉ ra rằng phạm vinhiệt độ từ 27 đến 30°C là thuận lợi cho sự tăng trưởng tế bào côn trùng và phạm vitối ưu cho phát triển sinh khối là 27- 28°C, ở nhiệt độ trên ≥30°C thì tế bào chết dần

và mật độ tế bào trong bình nuôi nhân bị giảm đi rõ rệt Sau đó, khi trở lại nhiệt độ

27 hoặc 28°C thì sinh khối tế bào sẽ không thể phục hồi trở lại được nữa [50]

Hầu hết các nghiên cứu hiện tại của nuôi cấy tế bào côn trùng sử dụng mộtmức nhiệt độ ổn định trong quá trình nuôi cấy Lynn (1996) đã nghiên cứu ảnhhưởng của nhiệt độ dao động đến sự phát triển tế bào côn trùng Các tế bào đượcnuôi cấy ở nhiệt độ 280C trong 2 ngày và sau đó chuyển sang điều kiện các mức

nhiệt độ khác nhau Giới hạn nhiệt độ trên được giữ ở 280C và giới hạn dưới là 20,

22, 24, hoặc 260C Kết quả cho thấy rằng nhiệt độ dao động có thể kéo dài giai đoạntăng trưởng tế bào của các dòng tế bào Dao động tối ưu từ 24 đến 280C giúp choviệc thúc đẩy một giai đoạn tăng trưởng tế bào dài mà không làm giảm mật độ tếbào tối đa Ở nhiệt độ dưới 220C, tế bào phát triển quá chậm và không đạt được mộtmật độ tế bào cao như đã đạt được khi nuôi cấy ở 280C [49]

Theo Mitsuhashi và Goodwin (1976) việc nuôi cấy tế bào côn trùng in vitro

ở nhiều nhiệt độ khác nhau, từ 25 đến 300C Nhiệt độ tối ưu cho hầu hết các dòng

tế bào bộ Cánh phấn (Lepidoptera) là 280C Tế bào nuôi trong môi trường không cóhuyết thanh ít chịu ảnh hưởng do thay đổi của nhiệt độ hơn các tế bào phát triểntrong môi trường có bổ sung huyết thanh [62]

Agathos (1994) chỉ rõ nếu nhân nuôi tế bào côn trùng theo phương pháp lớpmỏng tốt nhất phải tuân thủ qua 7 bước và trong quá trình nhân tế bào phải duy trìđiều kiện nhiệt độ 27 ± 0,50C trong thời gian 4 - 6 ngày Còn nhân nuôi tế bào theophương pháp lắc thì cần nhiệt độ là 270C - 290C [63] Kết quả nghiên cứu của

Demir et al (2009) chỉ ra rằng nhiệt độ 280C là thích hợp để nhân thứ cấp 7 dòng tếbào với khối lượng nhỏ [64]

Felio et al (1995) đã phân lập và nuôi nhân, phát triển thành công dòng tế bào từ trứng của phôi loài muỗi rừng Psorophora confinnis khi nuôi nhân ở 280C

[65] Theo Yeh et al (2007), nuôi nhân nuôi tế bào sâu đục quả đậu đỗ Maruca vitrata ở nhiệt độ 280C sẽ có hiệu quả cao nhất [66].

Lynn (1998) đã sử dụng môi trường TC-100 ở nhiệt độ 260C để nhân nuôi

phát triển dòng tế bào sâu xanh Heliothis virescens để đảm bảo duy trì tế bào nhân

nuôi Tác giả cũng cho biết để không bị nhiễm khuẩn thì trong các công đoạn nhânnuôi đều cần bổ sung kháng sinh với lượng 100 đơn vị Penicilin và 0,1mg

Streptomycin cho 1 ml môi trường nhân nuôi tế bào [67]

Mitsuhashi (1976) nhân nuôi sơ cấp tế bào sâu xanh hại bắp cải Mamestra brassicae L (Lepidoptera: Noctuidae) phân lập từ phôi lại sử dụng môi trường

MGM-401 có chứa 1 số kháng sinh (gồm 10 mg Dihydro-streptomycin sulfate, 100

đơn vị Penicilin G potassium, 10 mg Karamycin Sulfate và 1 mg Novobiocin cho

100 ml môi trường), ở nhiệt độ nhân nuôi là 250C [53]

McAteer và Davis (1994) cũng đã nuôi cấy tế bào từ sợi râu của loài

Mamestra brassicae trong môi trường Grace có bổ sung Lactalbumine hydrolysate

và Yeastolate ở 260C Trong nhân nuôi sơ cấp có bổ sung hỗn hợp kháng sinhPenicilin theo tỷ lệ 100 IU/ml hoặc Streptomicin tỷ lệ 100 µg /ml [60]

Theo Trang et al (2003), ngay việc nuôi nhân sâu non sâu khoang để phát

triển sinh khối vi rút cần duy trì ở mức nhiệt độ phù hợp Theo tác giả, nhiệt độthích hợp nhất để nuôi sâu ở nhiệt độ 27 ± 20C và độ ẩm không khí là 60 ± 10%.Điều này cho thấy có mối quan hệ chặt chẽ giữa nhiệt độ trong nuôi nhân tế bào côntrùng và nhiệt độ thích hợp cho sâu non phát triển trong tự nhiên [68]

Qua các tài liệu khoa học đã công bố, có thể nhận thấy nhiệt độ duy trì trongquá trình nuôi nhân tế bào côn trùng cũng là một trong những yếu tố quan trọngquyết định sự thành công hay thất bại của nuôi nhân tế bào Các tài liệu đều chỉ rõhầu hết các dòng tế bào từ các loài côn trùng đều phát triển sinh khối thích hợp vớinhiệt độ từ 26- 280C Điều đó có thể xuất phát từ nhu cầu về nhiệt độ đã được hìnhthành trong quá trình phát triển lịch sử của loài với điều kiện môi trường sống và đãđược mã hoá trong hệ thống di truyền của chúng [69]

• Điều kiện pH môi trường

Điều kiện nuôi nhân tế bào chịu ảnh hưởng lớn của các yếu tố, như: môitrường, nhiệt độ, pH, huyết thanh, v.v Tuy nhiên, không có nhiều nghiên cứu sâu vềảnh hưởng của pH môi trường đến hiệu quả nuôi nhân tế bào côn trùng

Theo Lynn và Shapiro (1998) thì hầu hết các loại tế bào yêu cầu điều kiện

pH tối ưu cho phân chia và phát triển sinh khối trong khoảng từ 7,0- 7,4, nhưng hiệnnay không phải quan tâm nhiều vì các loại môi trường cung ứng trên thị trường cóchứa sẵn thành phần chất đệm đảm bảo pH môi trường ở mức tối ưu cho việc nuôinhân các dòng tế bào và có thể đảm bảo ổn định cho cả chu kỳ nhân nuôi [67]

Kết quả nghiên cứu của Rey et al (2000) cho thấy khi nhân nuôi tế bào với dòng tế bào loài sâu Lutzomya longipalpis (Diptera: Psychodidae) trên môi

trường MM/VP12 có pha thêm 20% huyết thanh ở nhiệt độ 280C thì cần duy trì pH

từ 6,7- 6,9 là thích hợp nhất [70]

Theo Petcharawan et al (2006) nhân nuôi dòng tế bào sâu tơ KMITL-PX-E1

ở giai đoạn nhân thứ cấp từ chu kỳ 17- 18 trở đi vẫn có thể dùng môi trường

TNM-FH và duy trì pH là 6,8 [71] Theo tài liệu của Invitrogen Life Technologies (2002)thì các dòng tế bào phát triển từ phôi sẽ phát triển tốt ở điều kiện pH = 7,4, còn cácdòng tế bào khác yêu cầu pH từ 7,0- 7,4 Riêng đối với dòng tế bào SF9 và SF21 lạiyêu cầu điều kiện pH tối ưu là 6,2 [50]

Jakubowska et al (2009) cho rằng pH của hemolymph ở đa số các loài côn

trùng ngoài tự nhiên nằm trong khoảng 6,4- 7,5, nhưng một số môi trường trên thịtrường có pH= 6 nên có ảnh hưởng lớn đến khả năng phát triển sinh khối của tế bào

và sự lây nhiễm của NPV trên tế bào Vì vậy, cần xác định pH phù hợp với dòng tếbào sẽ nuôi nhân khối lượng lớn [69]

• Huyết thanh bổ sung

Huyết thanh là một hỗn hợp các albumin, các thành phần thúc đẩy tế bàosinh trưởng và thường được bổ sung vào môi trường nuôi nhân tế bào Hiện nay,huyết thanh sử dụng phổ biến gồm huyết thanh bê và huyết thanh ngựa Chất lượng,chủng loại và nồng độ của huyết thanh rất quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình sinhtrưởng của tế bào Theo Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc (2010), huyết thanh lànhân tố cung cấp các chất dinh dưỡng tăng trưởng cần thiết cho chức năng tế bào,huyết thanh còn hoạt động như một chất đệm pH, làm bất hoạt các chất độc gópphần làm tăng khả năng ổn định của sinh trưởng tế bào trong quá trình nhân sinhkhối tế bào Huyết thanh còn cung cấp hormon và chứa các protein bám giúp vậnchuyển các hormone, chất dinh dưỡng và tế bào chống tác hại của các chất thảitrong quá trình nhân nuôi Ngoài ra, huyết thanh còn chứa các nhân tố biệt hoá vàchất ức chế men Protease phân huỷ tế bào [72]

Sudeep et al (2005) cho rằng FBS là chất bổ sung hiệu quả trong nuôi nhân

tế bào côn trùng nhưng thành phần lại khá khác so với huyết thanh nuôi nhân tế bào

ở động vật có xương sống Tác giả cũng chỉ rõ có rất ít dòng tế bào duy trì tăng trưởng tế bào trong điều kiện không bổ sung FBS [42]

Để nhân tế bào dòng HV-AM1 từ sâu xanh Heliothis virescens, Javier et al.

(2008) đã sử dụng MM có bổ sung 3% FBS, nhưng để nhân các dòng tế bào AM1, Hz-AM1, Sf9, BMN4 và Ld652Y tác giả đã sử dụng môi trường TC-100 có

He-bổ sung 10% huyết thanh FBS [95] Maeda et al (1990) nuôi nhân dòng tế bào

CLS-79 trên môi trường IPL-41 và dòng tế bào BmN trên môi trường TC-100, dòng

tế bào Sf-21 và TN-368 trên môi trường TNM-FH nhưng tất cả các môi trường nàyđều được bổ sung 10% huyết thanh FCS Trong khi đó, khi nuôi nhân tế bào các

dòng TN-CL1 của sâu Trichoplusia, HZ-FB33 của sâu Helicoverpa zea, HV-OV của sâu Heliothis virescens, dòng SF-TS của sâu Spodoptera frugiperda và dòng tế bào SE-E4 của sâu Spodoptera exigua [73] Mclntosh et al (2003) đều sử dụng môi

trường ExcellTM401 có bổ sung 10% FBS đã được bất hoạt ở nhiệt độ 560C trong

30 phút [74] Cũng như Popham et al (2010) đã sử dụng môi trường Ex-Cell 420 có

bổ sung 10% FBS đã được bất hoạt bằng nhiệt khi nuôi nhân dòng tế bào Hz-AM1

từ sâu Heliothis zea và BCIRL-Hv-AM1 từ sâu Heliothis virescens [75].

Petchprakob et al (2007) nuôi nhân dòng tế bào của sâu xanh Heliothis zea

trên môi trường SF-900II có bổ sung 10% huyết thanh FBS không bất hoạt [59],

còn tác giả Woo et al (2007) sử dụng môi trường TC-100 bổ sung thêm 10% FBS

cũng không xử lý bất hoạt để nuôi nhân tế bào các dòng Sf9, Sf21 từ sâu

Spodoptera frugiperda và dòng tế bào Bm5 từ tằm dâu (Bombyx mori) và dòng BT1-Tn-5B-4 từ sâu đo xanh (Trichoplusia ni) [76].

Lery et al (1995) sử dụng môi trường Grace cải tiến và có chứa 20% FBS

trong giai đoạn nhân nuôi sơ cấp để phát triển dòng tế bào thu nhận từ phôi của sâu

đục củ khoai tây Phthorimaea operculelia (Zeller), còn ở giai đoạn nhân thứ cấp cũng tiến hành như ở giai đoạn sơ cấp nhưng chỉ bổ sung 10% FBS [77] Felio et al.

(1995) cũng áp dụng kỹ thuật tương tự đã phát triển và nuôi nhân thành công sinh

khối dòng tế bào phát triển từ mô phôi của muỗi Aedes taeniorhynchus (Diptera:

và Streptomycin) và kháng nấm (Anphoterycin B) Tuy nhiên, ở giai đoạn nhânnuôi thứ cấp, tế bào lại thể hiện khả năng bám dính trong môi trường Grace có bổsung 10% FBS [65].

Petcharawan et al (2006) đã sử dụng môi trường TNM-FH có chứa 20%

FBS trong giai đoạn nhân nuôi sơ cấp để phát triển dòng tế bào sâu tơ E1 từ trứng 2 - 3 ngày tuổi Trong giai đoạn nhân thứ cấp từ chu kỳ 17 - 18 trở đi

KMITL-PX-vẫn dùng môi trường TNM-FH nhưng chỉ bổ sung 10% FBS; Sudeep et al (2009)

đã nuôi cấy ấu trùng muỗi hổ châu Á Aedes aegypti với 20% FBS, trong nhân nuôi

thứ cấp FBS giảm xuống 10% từ chu kỳ cấy chuyền thứ 19 [71]

Mitshuhashi (1995) đã nuôi cấy dòng tế bào phân lập từ buồng trứng nhộngsâu khoang, nuôi cấy sơ cấp trong môi trường MGM-450 có bổ sung 5% FBS và

3% hemolymph Antheraea pernyi (APH) Tuy nhiên dòng tế bào này cũng sinh

trưởng được trong môi trường MGM-450 với 10% FBS hoặc môi trường MM được

bổ sung 3% FBS [61]

Bên cạnh việc sử dụng FBS (huyết thanh bò) là chất bổ trợ cho sinh trưởng tếbào, một số nghiên cứu còn sử dụng huyết thanh của các loài động vật khác với tỷ lệ

khác nhau để nhân nuôi tế bào côn trùng Theo nghiên cứu đã công bố, Vaughn et

al (1977) đã nuôi nhân 2 dòng tế bào là IPLB-Sf 21 và IPL-SF 1254 từ loài sâu xanh da láng Spodoptera frugiperda được nuôi cấy với môi trường IPL-40 và IPL-

45, có bổ sung 4,2% huyết thanh gà tây và 4,2% huyết thanh gà tây thường và hỗnhợp kháng sinh (100IU Penicilin/ml và 100µg Streptomicin/ml) [78] Theo khuyếncáo của Invitrogen Life Technologies (2002a), khi nhân sinh khối tế bào với dòng tếbào SF9, SF21 nếu dùng 60% môi trường Grace, 30% FBS và 10% DMSO đạt mật

độ tới 1x 107 tế bào/ml, với dòng tế bào High FiveTM sử dụng 85% môi trườngExpress Five®SFM, 5% FBS và 10% DMSO thì chỉ đạt 3x106 tế bào/ml [50]

Như vậy, qua các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy việc bổ sung huyếtthanh vào môi trường nuôi cấy tế bào là rất cần thiết Tuỳ theo từng cấp độ nhânsinh khối của từng dòng tế bào các loài côn trùng mà tỷ lệ huyết thanh cần bổ sung

có khác nhau, có thể tới 20%, thậm chí tới 40%

• Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng khối lượng lớn

Theo Elanchezhyan (2009), sự thành công của việc sản xuất thương mại cácchế phẩm dựa trên nhân sinh khối tế bào côn trùng phụ thuộc vào một số vấn đề,như: đặc điểm và sự phát triển của tế bào thích ứng với sản xuất khối lượng lớn, giáđầu tư và mức độ thuận tiện trong cung ứng của các chủng loại môi trường Đặc biệt

là với môi trường hoá chất không huyết thanh và protein, phù hợp với bình nhânsinh khối lớn và tối ưu với hệ thống nhân sinh khối có công suất lớn [11]

Freshney (1987) chỉ rõ kỹ thuật nuôi nhân tế bào phải được điều chỉnh chophù hợp tùy theo dòng tế bào của từng loài côn trùng, môi trường nuôi cấy, môitrường bổ trợ, pH, nhiệt độ nuôi nhân và cơ chế phát triển của tế bào theo phươngthức bám dính bề mặt hay huyền phù [44]

Theo Agathos (1994), tùy theo nguồn thực liệu tế bào của các côn trùng màthu được hiệu quả nhân tế bào khác nhau Tác giả này cũng như một số tài liệu khácđều cho rằng hoàn toàn có thể nuôi nhân tế bào qui mô lớn bằng hệ thống nuôi cấyliên hoàn theo 2 phương pháp: nhân lớp mỏng trên bình dung tích 250- 1.500 ml và

nhân lắc trên bình dung tích từ 2- 15 lít [63] Còn Kanokwan et al (2003) đã tiến

hành thành công việc nuôi nhân tế bào và lây nhiễm vi rút để sản xuất chế phẩmNPV-Ha trên bình nuôi cấy tự động 50 lít [79]

Từ năm 1988, Maiorella et al đã phát triển nhân sinh khối tế bào S frugiperda qui mô lớn bằng các bình nuôi cấy dung tích 21 lít, đạt mật độ 5 x 106 tế

bào/ml Tuy nhiên, các thử nghiệm nhân sinh khối tế bào với dung tích cực lớn tại

Mỹ, từ 500 đến 2.000 lít thì đều không cho kết quả như mong muốn, hàm lượng tếbào chỉ đạt 50% so với nuôi nhân bằng bình 100 lít Các thử nghiệm với dung tích5.000 lít thì hoàn toàn thất bại [80]

Còn Miranda et al (1997) đã tiến hành nuôi nhân tế bào trên hàng loạt bình

có dung tích từ 1,0- 6,0 lít theo 3 bước: bước 1 nhân trên bình 0,5 lít trong 72 giờ;bước 2 chuyển sang bình 3 lít trong 48 giờ và bước 3 nhân trong bình 6 lít trong 72giờ Cả 3 bước đều để ở chế độ lắc 1.000 vòng/phút Kết quả vẫn có thể đạt mật độ3,0 x 109 tế bào/ml [81]

Theo Elanchezhyan (2009) [11], có thể nhân tế bào qui mô nhỏ có thể dễ

dàng thực hiện dần dần qua các bước như Miranda et al (1997) đã làm, từ mức

250ml lên 1000ml và sau đó tới khối lượng lớn hơn Tiến hành như vậy thì việcquản lý nhiễm tạp trong quá trình nuôi nhân sẽ dễ dàng và có hiệu quả hơn [81]

Cynthia et al (2007) và Agathos (2010) đều cho rằng việc sử dụng huyết

thanh FBS chỉ nên áp dụng để nhân nguồn thực liệu tế bào, còn khi nhân tế bào khốilượng lớn thì sử dụng môi trường không huyết thanh như: Ex-cell 405; Ex-Cell 420,SFM, v.v hoặc các môi trường cơ bản như: IPL-41, Grace, TC - 100 BML-TC/10,TNM-FH, v.v Cách làm như vậy nhằm để hạ giá thành sản xuất sinh khối tế bào vìgiá mua huyết thanh trên thị trường thường rất đắt [82, 52]

1.2.1.5 Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi

Theo tổng kết của Elanchezhyan (2009), các dòng tế bào hiện nay được thiếtlập từ 8 bộ côn trùng, trong đó chủ yếu từ bộ Cánh phấn (Lepidoptera) vì bộ côntrùng này là bộ lớn thứ 2 với hơn 200.000 loài của 130 họ Các dòng tế bào chủ yếu

từ các loài côn trùng thuộc bộ Cánh phấn gây hại cây trồng nông nghiệp để nghiêncứu phát triển chế phẩm vi rút [11]

Virus ký sinh côn trùng với tổng số 29 loài thuộc họ Baculoviridae, bao gồm

2 giống là Granulovirus (còn gọi là virus hạt) và Nucleo polyhedrosis virus (virusnhân đa diện) Riêng nhóm Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) có tới 19 loài đã được

xác định và có khả năng hình thành thể vùi (Rohrmann và George, 2011; Devi et al., 2016) [5, 38] Tuy nhiên, NPV có đặc điểm rất chuyên tính và chỉ lây nhiễm

trên ký chủ của nó nên độ an toàn sinh học rất cao, đồng thời có hoạt lực cao tronggây chết sâu hại và có khả năng hình thành thể vùi có thể tồn tại bền vững trong môitrường Chính vì vậy, nhiều năm qua các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhiềuđến việc nghiên cứu phát triển chế phẩm vi rút NPV trên cơ sở nhân sinh khối tếbào côn trùng phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp

Trên đồng ruộng, NPV có thể tồn tại trong đất dưới dạng thể vùi (OB) trongthời gian dài 20- 30 năm Trong quá trình canh tác, làm đất trồng trọt cây trồng cácthể vùi dính bám trên cây, khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùiNPV, gặp pH cao (> 9,0) của ruột giữa thì màng protein của thể vùi bị phá vỡ, giải

phóng các thể hoạt động (virion), các thể vi rút hoạt động này sẽ xâm nhiễm vàonhu mô ruột, sau đó xâm nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể côn trùng Sau 2-3

ngày, sâu ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Sajap et al., 2000) [14].

Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các mô, tếbào sống của cơ thể côn trùng ở điều kiện môi trường thích hợp, đòi hỏi việc pháttriển sinh khối NPV để phòng trừ sâu hại phải được thực hiện trên cơ thể sâu cònsống như phương pháp truyền thống bằng cách nuôi sâu để nhiễm tạo sinh khối

(Grzywacz et al., 1996) [12], hoặc lây nhiễm trên tế bào của loài sâu hại đã được nhân nuôi (Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007; Elanchezhyan, 2009, Sudeep

et al 2005) [9, 16, 11, 42]

Mặt khác, tế bào côn trùng chỉ tồn tại và phát triển sinh khối trong điều kiện

pH ≤ 7,0 (Lynn, 1998; Rey et al., 2000; Petcharawan et al., 2006) [43, 70, 71] Vì

vậy, không thể thực hiện bằng cách sử dụng thể vùi của NPV một cách trực tiếp đểlây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân, do pH của môi trường dịch tế bào khi lâynhiễm không phù hợp để có thể phá vỡ màng bọc protein của thể vùi để giải phóngcác thể hoạt động như diễn ra trong ruột giữa của côn trùng

Vì vậy, để lây nhiễm NPV thành công trên tế bào nuôi nhân, các nhà khoahọc phải tiến hành phá vỡ thể vùi trong điều kiện pH cao trước khi lây nhiễm vào

dịch tế bào Tipvadee et al., (1988) sử dụng Na2CO3 0,1M có pH= 11,2 trong thờigian 20 phút, những thể vùi chưa bị phá vỡ được tách khỏi dịch vi rút bằng cách lytâm ở tốc độ 2.500 vòng/phút trong thời gian 10 phút Nếu muốn phá vỡ triệt để cácthể vùi thì sử dụng Na2CO3 0,1M có pH= 11,2 để trong thời gian 15 phút, sau đó lắcvới tốc độ 50 vòng/phút trong 3 phút rồi để tiếp trong thời gian 12 phút [83]

Cách xử lý của Knudson và Tinsley (1974) có phần phức tạp hơn, bằng cách

sử dụng dung dịch nồng độ từ 0,005M đến 0,05M có chứa 0,05M NaCl trong 1- 3giờ ở nhiệt độ 50C [58] Còn Escribano et al (1999) phá vỡ thể vùi giải phóng thể

hoạt động (virion) trước khi nhiễm bằng cách ủ trong dung dịch đệm DAS (Na2CO3

0,3M, NaCl 0,5M, EDTS 0,03M ở pH= 10,5) ở nhiệt độ bình thường trong 5 phút.Các virion được bảo quản ở 40C trong khi chờ sử dụng Thể vùi còn lại được ly tâmthu hồi ở tốc độ 1480 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 40C [39]

Theo Sudeep et al (2005), trong hơn 2 thập kỷ qua hầu hết các công trình

nghiên cứu tiến hành ở Ấn Độ tập trung vào các dòng tế bào bộ Cánh phấn(Lepidoptera) do tiềm năng phát triển chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Các chếphẩm vi rút tạo ra có độc tính cao và có hiệu quả cao trong phòng trừ các sâu hại, lạirất an toàn đối với người và động vật máu nóng [42]

Kết quả nghiên cứu của Mclntosh et al (2003) xác định khi nhiễm vi rút

NPV trên 5 dòng tế bào trên môi trường Ex-CellTM 401 có bổ sung thêm 10% FBSbất hoạt, số lượng thể vùi hình thành ở dòng tế bào TN-CL1 đạt ít nhất (0,57 ± 3,83

x 106 OB/ml), dòng tế bào SF-TS đạt cao nhất tới 1,165 ± 12,06 x 106 OB/ml [74]

Các nhà khoa học cho rằng việc lây nhiễm vi rút trên tế bào cần dựa theo chỉ

số lây nhiễm (Multiplicity of Infection – MOI), là tỷ lệ giữa số lượng thể vùi và mật

độ tế bào trong 1 đơn vị thể tích khi lây nhiễm Zitzmann et al (2017) chỉ rõ quá

trình lây nhiễm virus phải kéo dài trong một thời gian nhất định, nếu sử dụng chỉ sốMOI thấp (<0,1) thì quá trình lây nhiễm diễn ra 2 giai đoạn, giai đoạn ban đầu tếbào tiếp tục phân chia và bắt đầu quá trình lây nhiễm virus, nhưng với tỷ lệ tế bào bịnhiễm không nhiều, giai đoạn 2 quá trình lây nhiễm tái tổ hợp virus chiếm ưu thế vàhầu hết tế bào bị nhiễm virus Nếu sử dụng chỉ số MOI > 1 thì hầu hết (tới 95%) tếbào bị nhiễm virus ngay sau khi nhiễm [84]

Theo Lynn (2003), mức độ tối ưu của việc lây nhiễm vi rút NPV trên tế bàotuỳ thuộc vào 2 yếu tố là chỉ số MOI và thời gian ủ lây nhiễm, theo tác giả, cầnkiểm tra mật độ tế bào và thể vùi của NPV trước khi lây nhiễm để tính chỉ số MOI,hầu hết các nguồn tế bào nên lây nhiễm virus với chỉ số MOI từ 0,1- 0,5 và ủ lâynhiễm thực hiện trong thời gian 3- 4 ngày [85]

Để đánh giá mức độ lây nhiễm vi rút của tế bào, Demir et al (2009) đã tiến

hành lây nhiễm virus ManeNPV trên sinh khối của 6 loại tế bào trên môi trườngnuôi nhân theo trị số MOI là 10 ở nhiệt độ 280C và ủ lây nhiễm trong thời gian 3ngày Kết quả đã cho thấy có sự khác nhau rõ rệt khả năng lây nhiễm giữa các dòng

tế bào khác nhau [64]

Còn Knudson et al (1974) đã tiến hành nhiễm vi rút trên tế bào nhân nuôi của sâu xanh (Spodoptera frugiperda) Kết quả xác định thời gian tối ưu khi nhiễm

vi rút NPV ở mật độ tế bào là 2,5 x 104 tế bào/ml với chỉ số MOI là 0,1 trong 3 ngày

ở nhiệt độ 270C và đạt 100% số tế bào bị nhiễm vi rút, còn ở nhiệt độ 17 và 370C thì

số lượng tế bào giảm nhanh và tỷ lệ tế bào nhiễm vi rút rất thấp [58]

Nhằm cải tiến việc sản xuất NPV trên tế bào sâu xanh Th-HaNPV bằng thiết

bị bình lên men (Bioreactor) với môi trường SF 900II bổ sung 10% FBS ở nhiệt độ

270C, Petchprakob et al (2007) đã tiến hành sử dụng Na2SO4 và Na2SO3 với nồng

độ 0,2 và 0,4 mg/l (tương ứng) để phá vỡ màng bọc của thể vùi và nhiễm vi rút vớichỉ số MOI là 0,5 trên sinh khối tế bào có mật độ 5x105 tế bào/ml cho thấy chúng đãlàm tăng số lượng thể vùi từ 500- 900 OB/ml [59]

Theo kết quả của Mclntosh et al (2003) khi đánh giá khả năng tái tổ hợp

của NPV với 5 dòng tế bào nhân trên môi trường Ex-CellTM 401, kết quả khi nhiễmNPV tương ứng của sâu hại với chỉ số MOI là 1 thì số lượng thể vùi đạt từ 0,57-11,65 x 106 OB/ml tuỳ loại tế bào côn trùng [74]

Tuy nhiên, theo kết quả nghiên cứu của Jakubowska et al (2009), khi nhiễm

NPV trên tế bào dòng SE301 và sử dụng môi trường Grace bổ sung 10% FBS ở cácmức pH khác nhau Kết quả sau 8 ngày lây nhiễm, số lượng thể vùi thu hoạch lớnnhất ở điều kiện pH là 6,5 đạt tới 3,5 x 106 OB/ml Còn ở mức pH là 6 và 7, sốlượng thể vùi thu được thấp hơn so với số thể vùi ở mức pH= 6,5 là 51,0 và 51,5%(tương ứng) Kết quả lây nhiễm trên tế bào của các dòng Sf21 và HzGUT cũng chokết quả tương tự như với dòng tế bào SE301 [69] Kết quả nghiên cứu về pH có ýnghĩa lớn đối với việc nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào côn trùng để đạt hiệuquả cao trong việc nhân sinh khối NPV

Barbara et al (2007) Bryony và Nusawadany (2007) đã tổng hợp và phân

tích khá chi tiết về đặc điểm cấu trúc tế bào của Baculovirus nói chung và NPV nóiriêng, cũng như về sự phát triển và vòng đời của NPV tái tổ hợp và sử dụng NPVtrong phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp [86, 87]

King et al (2007) cho rằng việc nhân sinh khối tế bào và lây nhiễm NPV

trên các bình 1 hoặc 2 lít sẽ cho hiệu quả nhất đối với qui mô nhỏ và phòng thínghiệm, như bình Erlenmeyer, Spinner hoặc Shake, v.v Tác giả đã xây dựng và đềxuất qui trình lây nhiễm và nhân sinh khối NPV, bao gồm: 8 bước chuẩn bị; 14