Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây bù dẻ trơn (uvaria boniana), bù dẻ hoa vàng (uvaria hamiltonii), lãnh công màu hung (fissistigma cupreonitens) và lãnh công xám (fissistigma glaucesens) tt

Đ i ƣ ng nghiên cứu Đối ng nghiên cứu của lu n án là dịch chiết từ loài bù dẻ ơ Uvaria boniana Fin.. lãnh công màu hung Fissistigma cupreonitens Merr.. & Chun và lãnh công xám Fissis

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

g h ƣ h h h i Việ ƣ Ph m Tự nhiên – T ƣờ g Đ i học Vinh và

Viện Nghiên cứu Tây Nguyên

g i Ở Vi t Nam, h Na (A aceae) có 201 i (29 chi) g ó hiều

i ặc hữu h Alphonsea sonlaensis Ban, Artabotrys hienianus Ban, Artabotrys vietnamensis Ban, Artabotrys vinhensis Ast., Fissistigma

taynghuyenense Ban, Fissistigma tonkinense (Fin & Gagnep.) Merr., Goniothalamus donnaiensis Fin&Gagnep., Goniothalamus vietnamensis Ban., Melodorum kontumense Ban,

Chi Fissistigma Griff., là một chi quan tr ng của h Na (Annonaceae),

với kho ng 80 loài, phân bố rộng rãi ở châu Á Aus a ia ặc bi t ở khu vực

Đô g Na Á h Ma aysia I d esia Th i a T u g Quốc, Campuchia,

Lào và Vi t Nam Một số loài thuộc chi Fissistigma là cây thuốc chữa các b nh

e cơ ắp, gan, gan lách to, thần kinh t a, viêm khớp, kháng viêm và chống

khối u Chi ù dẻ (Uvaria ) ộ chi ớ của h Na (A aceae) hế giới có

kh g 175 i Vi Na có kh g 17 i C c cây huộc chi y chủ yếu dây e hay ụi hiế khi cây gỗ; Mặc dù các cây h Na (Annonaceae)

có giá trị kinh tế r ca cũ g h có ho t tính sinh h c quý c sử dụng rộng rãi trong dân gian, song vi c nghiên cứu về thành phần hóa h c của nó vẫn

ch a c tiến hành nhiều ở Vi t Nam

Vì ý d ó ch g ôi ã ch ề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học

và ho t tính sinh học của cây bù dẻ ơ (Uvaria boniana), bù dẻ hoa vàng (Uvaria hamiltonii), lãnh công màu hung (Fissistigma cupreonitens) và lãnh công xám (Fissistigma glaucesens) từ ó gó hầ x c ịnh thành phần hóa

h c của các h p ch t và tìm ra ngu n nguyên li u ch g h hóa d c

Đ i ƣ ng nghiên cứu

Đối ng nghiên cứu của lu n án là dịch chiết từ loài bù dẻ ơ (Uvaria

boniana Fin & Gagnep.), bù dẻ hoa vàng (Uvaria hamiltonii Hook.f et

Thoms.) lãnh công màu hung (Fissistigma cupreonitens Merr & Chun) và lãnh

công xám (Fissistigma glaucesens (Hance) Merr.) ở Vi t Nam

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Chiết ch n l c với các dung môi thích h ể hu c hỗn h p các h p

ch t từ các loài dịch

- Ph ơ g h ch i h chế các ch t: Chiết nguyên li u; chiết với các

du g ôi có ộ phân cực khác nhau ở nhi ộ phòng h hexane, ethyl ace a e c f u a … Tách và tinh chế các ch t bằng cách kết h p các

5 Nhữ g g g p i của lu n án

Trong nghiên cứu này, ch g ôi ã hu c một số kết qu sau:

1.Từ bù dẻ ơ (Uvaria boniana Fin & Gagnep) ã hâ x c ịnh

c u trúc của 8 h p ch t bao g m: uvaridacol G ; phenylprop-2’-en-1’-yl]cyclohex-2-en-1-one; 3,7- di e h xy que ce i 4’- O-

stigmasterol, 6-methoxyzeylenol; aristolactam AII; stigmasta-4,22-dien-3-on Các chất này lầ ầ iê ƣ c phân l p từ loài này

2 Từ bù dẻ hoa vàng (Uvaria hamiltonii H k.f e Th s.) ã hâ p

x c ịnh c u trúc của 8 h p ch t bao g m: quercetin, luteolin-7-O-glucoside,

luteolin-4’-O-glucoside, rutin, rhoifolin, glutinol, zeylenol, lupeol Các chất này lầ ầ iê ƣ c phân l p từ loài này

3 Từ cây Lãnh công xám (Fissistigma glaucescens (Hance) Merr.) bằng

c c h ơ g h sắc kí ã hâ p 06 h p ch g ó có 04 h p ch t ancaloit aristolactam BII, velutinam, aristolactam BI, pukatein và 02 h p ch t

flavonoid apigenin-8-C-β-D-galactopyranoside và rutin Các chất velutinam, pukatein và apigenin-8-C-β-D-galactopyranoside này lầ ầ iê ƣ c

phân l p từ loài này

4 Từ dịch chiết methanol của lá cây lãnh công màu hung (Fissistigma

cupreonitens Merr & Chun.) bằ g c c h ơ g h sắc kí ã hâ c 6

h p ch t bao g m 04 h p ch t flavonoid: 6-hydroxy-5,7,8-trimetoxy flavanon, 2’ 5’-dihydroxy-3’ 4’ 6’-trimetoxy chalcon, quercetin, rutin và 02 h p ch t

chalcon lầ ầ iê ư c phân l p từ loài này

5 Thử ho t tính sinh h c kháng vi sinh v t và ho t tính chống oxi hóa của

hươ g 1 TỔNG QUAN

i h h ổ g i iệ i g

Tổ g qua ề chi Uvaria

Cây Bù dẻ ơ (U a ia ia a Fi & Gag e )

Cây Bù dẻ hoa vàng (Uvaria hamiltonii Hook.f et Thoms )

Tổ g qua ề chi Lãnh công (Fissistigma)

Cây lãnh công xám (Fissistigma glaucesens (Hance) Merr.),

Cây lãnh màu hung (Fissistigma cupreonitens Merr & Chun)

Với c c ội du g c ề c g :

- Giới hi u ề ặc iể si h h c hâ ố

- Nghiê cứu ê h h hầ hóa h c

Mẫu cây bù dẻ ơ (Uvaria boniana Fin & Gagnep.), bù dẻ hoa vàng (Uvaria hamiltonii Hook.f et Thoms.), lãnh công màu hung (Fissistigma

cupreonitens Merr & Chun) và lãnh công xám (Fissistigma glaucesens (Hance)

Merr.), c thu hái ở n quốc gia Pù Huống, Pu Mát- Ngh An, Vi t Nam

h g 08 2015 Mẫu c ịnh danh bởi PGS.TS Trần Huy Thái,

Vi n Sinh thái và Tài nguyên Sinh v t Tiêu b c u giữ t i khoa Vi n Công ngh Hóa Si h Môi g T g Đ i h c Vinh

1 phươ g ph p xử lý m u và chi t

Mẫu c thu hái vào mùa thích h g Mẫu khi l y về c rửa

thích h p bằng thiết bị chiế siêu â ể hu c dịch chiết

1 phươ g ph p phâ í h, phâ p các h p chất

Để hâ ích hâ ch cũ g h hâ p các h p ch t, sử dụng các

h ơ g h sắc ký h : Sắc ký ớ ỏ g (T C); Sắc ký cộ h g (CC); Sắc

ký cộ ha h (FC); Sắc ký ỏ g hi u g ca hâ ích iều chế (HP C);

1.4 Phươ g ph p h o sát cấu trúc các h p chất

C u trúc của các h p ch c kh o sát nh sự kết h c c h ơ g h phổ:

Phổ ử g i (UV); Phổ h ng ngo i IR; Phổ khối ng phun mù electron

C-NMR; Phổ cộ g h ởng từ h t nhân DEPT, HSQC, HMBC; Phổ cộ g h ởng từ h t nhân COSY, NOESY

2.2 Hoá chất, dụng cụ và thi t bị

2.2.1 Hoá chất

Các dung môi ngâm chiết mẫu thực v t là dung môi công nghi p hexan,

e ha u a e hy ace a e ace e ớc c t Các dung môi sử dụng cho các lo i sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột thuộc lo i tinh khiết phân tích (PA) Các

du g ôi c sử dụng là:

2.2.2 Dụng cụ và thi t bị

Nhi ộ nóng ch y ê y Ya ac MP-S3;

-

- Độ quay cực c ê y hâ cực kế Jasco DIP -370;

- Phổ tử ngo i UV c ghi trên máy quang phổ Hitachi UV-3210,

- Phổ khối ng (ESI-MS, HR-ESI-MS) c ê y B uke Dai ics APEX II 30eV s ec e he T ng Đ i h c Y Trung Quốc (Đ i Loan) và máy micrOTOF-QII 10187 T g Đ i h c Khoa h c Tự hiê Đ i

h c Quốc gia H Chí Minh;

- Phổ cộ g h ởng từ h t nhân 1H-NMR c ê y B uke 500MHz

Bruker 125 MHz (Vi n Hóa h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c Công ngh Vi t Nam) và máy Brucker AVANCE III-700 (khoa Hoá h c Đ i h c Quốc gia Che g Ku g Đ i a ) ới ch t chuẩn là TMS;

- Sắc ký cột sử dụng silicagen cỡ h t 60,70-230 Kieselgel và 230-240 (Merck)

- B n mỏ g c tráng kieselgel 60 và các ch t hiển thị bằng dung dịch

2.3 Nghiên cứu các h p chất từ bù dẻ ơ (Uvaria boniana Fin &

Gagnep)

2.3.1 Chi t xuất và phân l p các h p chất

Lá khô của loài bù dẻ ơ (Uvaria boniana) (6 0 kg) c chiết với dung

môi methanol ở nhi ộ h g sau ó c t thu h i dung môi bằng c t quay châ khô g c cặn chiết (254 g) Cặn chiế hòa a g ớc và chiết lần

t với c c du g ôi e hy ace a u a hu c cao chiế hâ n ethyl acetate (172 g) u a (33 g) ca ớc (40 g)

Ca hâ n ethyl acetat tiến hành sắc ký cột silica gel với dung môi rửa

gi i hexan: aceton (100:0 - 1:1 / ) hu c nhiều hâ n nhỏ Những

hâ n nhỏ y c phân tích bằng TLC và gộp l i h h 10 hâ n (U1-U10).Phâ n U1 (6,5 g), sắc ký cột với silica gel, hỗn h p dung môi rửa gi i hexa e : ace e (15:1) hu c 7 hâ n nhỏ U1.1-U1.7 Phân

n U1.1 (2,6 g) sắc ký cột silica gel rửa gi i bằng hỗn h p dung môi hexane :

ace e (15:1) hu c h p ch t UBM4 (38 g) Phâ n U1.4 (2,5g) sắc

ký cột silica gel với hỗn h p rửa gi i hexa e : ace e (9:1) hu c h p ch t

UBM1 (12 mg) và UBM2 (27 g) Phâ n U2 (5,6 g), sắc ký cột với silica

gel, dung môi rửa gi i chloroform: methanol (C:M) (50:1-10:1 / ) hu c 5

hâ n nhỏ U21-U25 Phâ n U22 (1,2 g) sắc ký cột silica gel, dung môi

rửa gi i C:M=20:1 ( / ) hu c UBM7 (19 g) Phâ n nhỏ U24 (0,84 g), sắc ký silical gel, dung môi rửa gi i C:M=15:1 hu c ch t UBM8 (14

g) Phâ n U3 (4,8 g), sắc ký cột silica gel với dung môi rửa gi i C:M (30:1-6:1 / ) hu c 5 hâ n nhỏ Phâ n U34 (0,96 g), sắc ký cột

silica gel, dung môi rửa gi i C:M (10:1) hu c ch t UBM6 (15 mg) Phân

n U7 (1,9 g), sắc ký cộ si ica ge c rửa gi i bằng hỗn h p chloroform

10

2.4 Nghiên cứu các h p chất từ bù dẻ hoa vàng (Uvaria hamiltonii)

2.4.1 Chi t xuất và phân l p các h p chất

Lá khô của bù dẻ h a g (U ha i ii) (1 5 kg) c chiết với methanol

C, c t thu h i du g ôi hu c dịch chiết methanol (207 g), phân bố dịch chiế e ha g ớc c chiết lầ t với hexane, chloroform (CHC 3) e hy ace a e hu c cao chiế ơ g ứng: n-hexane (UHH) (39,2

(49,3g)

Cao ethyl acetate (UHE) (35,7 g), sắc ký cột silica gel với dung môi rửa

gi i là hỗn h p CHCl3 và MeOH (tỉ l 100:0 ế 0:100) hu c 6 hâ n (UHE1-UHE6) Phâ UHE6 (8 0 g) c phân tích bằng sắc ký sephadex LH-20 với dung môi rửa gi i MeOH và H2O (1:1-1:0) hu c 4 hâ n (UHE6.1-UHE6.4) Phâ n UHE6.3 (229 mg), sắc ký cột silica gel bằng hỗn

h p rửa gi i CHC 3 MeOH (5:1 3:1 1:1) hu c 4 hâ n nhỏ (UHE63.1- UHE63.4) Phâ UHE63.1 (65 g) c tinh chế bằng cột RP-

18 rửa gi i bằ g MeOH H2O (1:1) hu c h p ch t UHM1 (15 mg)

Ca ớc c sắc ký cột diaion HP-20 rửa gi i ớc bằ g ớc sau ó ửa gi i

(UHW1-UHW5) Phâ n UHW3 (11,3 g) sắc ký cột silica gel rửa gi i bằng CHCl3-MeOH (6:1 4:1 2:1 1:1) hu c 5 hâ n (UHW3.1-UHW3.5) Phâ n UHW3.5 (1,5 g), sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi rửa gi i là MeOH v H2O (1:1 1:0) hu c 4 hâ n (UHW35.1-UHW35.4) Phân UHW35.4 (284 g) c tinh chế bằng cột RP-18 rửa gi i bằng MeOH và H2O (1:1) hu c h p ch UHM4 (23 g) Phâ n UHW3.4 (702 mg), sắc

ký cột sephadex LH-20 rửa gi i bằng MeOH và H2O (1:4-1:0) c 5 hâ n (UHW34.1-UHW34.5) Phâ UHW34.4 (54 g) c tinh chế bằng cột RP-18 rửa gi i bằng MeOH và H2O (1:4-1:1) hu c 6 hâ n (UHW344.1-UHW344.6) Phâ n UHW344.3 (36 mg), sắc ký cột silica gel rửa gi i bằng dichlorometha e ace e (2:1) hu c h p ch t UHM2 (8 mg) và UHM5 (12 g) Phâ n UHW3.2 (938 mg), sắc ký cột sephadex LH-20 rửa gi i bằng MeOH và H2O (1:4-1:0) c 5 hâ n (UHW32.1-UHW32.5) Phâ n

(1:1) hu c h p ch t UHM3 (11 mg)

Cao chloroform (41,0 g) (UHC), sắc ký cột silica gel với dung môi rửa gi i

là hỗn h p CHCl3 và MeOH (tỉ l 100:0 ế 0:100) hu c 5 hâ n (UHC1-UHC5) Phâ C3 (10 83 g) c phân tích bằng sắc ký sephadex LH-20 với dung môi rửa gi i MeOH và H2O (1:1-1:0) hu c 4 hâ n

11

(UHC3.1-UHC3.4) Phâ UHC3.2 (0 11 g) c tinh chế bằng cột RP-18 rửa gi i bằ g MeOH H2O (1:1) hu c h p ch t UHM8 (15mg)

Cao hexan, sắc ký cột silica gel với dung môi rửa gi i là hỗn h p hexane/EtOAc

hu c 9 hâ n (UHH1-UHH9) Phâ UHH1 (0 728 g) c sắc ký cột silica gel với dung môi rửa gi i là hỗn h CHC 3:MeOH hu c 5 phân

n (UHH1.1-UHH1.5) Phâ n UHH1.4 (0,194 g), sắc ký cột silica gel bằng hỗn h p rửa gi i hexa e/dich e ha e hu c hu c h p ch t UHM6 (17

mg) và UHM7 (10mg)

12

2.5 Nghiên cứu các h p chất từ loài lãnh công màu hung (Fissistigma

cupreonitens Merr & Chun.)

2.5.1 Chi t xuất, phân l p, x ịnh cấu trúc các h p chất phân l p ƣ c

c chiết với methanol ở nhi ộ phòng trong th i gian 1 tuần Dịch chiế c

c t thu h i du g ôi hu c 1024 g ca Sau ó cao chiế c phân bố trong

ớc và chiết lầ t với hexan, ethylacetate và butanol C t lo i dung môi cho 122g, 271g, 145 g các cặn dịch chiế ơ g ứng

Ca e hy ace a e (FCE) (271g) c phân tách trên cột silica gel, dung môi

gi i h p là hexan: axeton (100:0; 50:1; 39:1; 30:1; 20:1; 15:1; 9:1; 4:1; 2:1; 1:1 ),

ch 10 hâ n chính từ FCE1-FCE10 Phâ n FCE1 tiếp tục c phân tách l i bằng sắc ký cột nhỏ với dung môi rửa gi i hexa : axe (15:1; 9:1) hu

c 7 hâ chí h ừ FEC1.1-FCE1.7 Phâ n FCE1.1 sắc ký cột silica

Phâ n FCE1.3 sắc ký cột silica gel với h dung môi hexan: axeton (9:1; 4:1)

hu c FCM2 (6-hydroxy-5,7,8- i e xy f a a : 15 g) FCM3 (2’ dihydroxy-3’ 4’ 6’- i e xy cha c : 19 g) Phâ n FCE1.4 sắc ký l i trên cột silica gel với h dung môi rửa gi i CH¬Cl3:CH3OH (20:1) hu c FCM4 (quercetin: 13 mg)

5’-Ca u a (FCB) (145g) c phân tách trên cột silicagel với h dung môi rửa gi i h CHC 3:CH3OH (30:1; 20:1; 10:1; 5:1) hu c 10 hâ n

từ FCB1-FCB10 Phâ n FCB5 sắc ký l i trên cột silica gel với h dung môi rửa gi i CHC 3: CH3OH (10:1; 6:1) hu c FCM5 ( u i : 14 g) Phâ n

-sitosterol-3-O- -D-glucopyranosit: 112 mg)

15

2.6 Nghiên cứu các h p chất từ lá cây lãnh công xám (Fissistigma

glaucescens (Hance) Merr.)

2.6.1 Chi t xuất và phân l p các h p chất

cây ã h cô g x (10 0 kg) c hơi khô xay hỏ và ngâm chiết với methanol ở nhi ộ phòng (7 ngày) Dịch chiế c c t lo i dung môi, cho 1.212 g cao methanol Phân bố ca e ha g ớc sau ó chiết lầ t với hexan, chlororform và butanol C t lo i du g ôi hu c 142, 291, 155 g các cặn dịch chiế ơ g ứng

Cặn chiế ch f 291 g c phân tách trên cột silica gel, dung môi

gi i h p là chloroform-methanol (100:0, 98:1: 95:5; 90:10; 80:2), cho 12 phân

n chính từ FGC1-FGC12 Phâ n FGC2 tiếp tục c tách l i bằng sắc ký cột nhỏ với dung môi rửa gi i hexan: axeton (15:1) cho ch t FGM5 (20 mg) Phâ n FGC3 tinh chế l i bằng sắc ký cột cho h p ch t FGM4 (26 mg) và h p

ch FGM1 (18 g) Phâ FGC4 c tách tiếp bằng sắc ký cột trên silica gel, dung môi rửa gi i là chloroform: methanol 95:5, cho các ch t FGM3 (16 mg)

và ch t FGM2 (18 mg)

Cặn chiế u a (FGB) c phân tách trên cột silicagel với h dung môi rửa gi i h CHC 3:CH3OH (30:1; 20:1; 10:1; 5:1) hu c 10 hâ n từ FGB1-FGB10 Phâ n FGB5 tiến hành sắc ký l i trên cột silica gel với h dung môi rửa gi i CHC 3: CH3OH (10:1; 6:1) hu c h p ch t FGM6 (24 mg)