Thiết kế tách dòng gen alpha hemoglobin mã hóa protein hemoglobin ở chuột

Hemoglobin cũng đóng vai trò trong việc giúp các tế bào hồng cầu có được hình dạng như chiếc đĩa, giúp chúng di chuyển dễ dàng qua các mạch máu  Hb là đại phân tử có 4 dưới đơn vị tetra

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC

Thiết kế tách dòng gen alpha hemoglobin mã hóa

protein hemoglobin ở chuột

Tổng quan về Hemoglobin

 Huyết sắc tố, còn gọi là Hemoglobin là một protein phức có chứa Fe++, làm nhiệm

vụ vận chuyển oxy từ phổi đến tổ chức và vận chuyển CO2, từ tổ chức về phổi; Hb ở trong hồng cầu và chiếm 33% trọng lượng hồng cầu

 Mỗi protein Hemoglobin (Hb) có thể mang 4 phân tử oxy, thông qua đường máu mà cung cấp oxy cho các tế bào và mô trong cơ thể Hemoglobin cũng đóng vai trò trong việc giúp các tế bào hồng cầu có được hình dạng như chiếc đĩa, giúp chúng di

chuyển dễ dàng qua các mạch máu

 Hb là đại phân tử có 4 dưới đơn vị (tetramère) mà mỗi dưới đơn vị (monomère) có hai phần là hem và globin

 Hem: Là một sắc tố chứa sắt hoá trị (+2), chiếm 4% trọng lượng của huyết sắc tố; có cấu trúc là một vòng porphyrin có 4 nhân pyrol liên kết với ion Fe++

 Globin: Là một chuỗi polypeptid (một chuỗi nhiều acid amin liên kết với nhau giữa các nhóm COOH và NH2), đó là một protein, được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu gen globin Có nhiều loại globin thuộc hai họ (họ α và họ không α) Mỗi loại có số lượng và trình tự acid amin đặc trưng, các chuỗi thuộc họ α là: α và zeta, mỗi chuỗi

có 141 acid amin, có cấu trúc gần giống nhau

 Các chuỗi thuộc họ không α là: β, γ, δ, ε, mỗi chuỗi có 146 acid amin Các chuỗi α

và không α này không phải có hình dạng bất kỳ mà cấu tạo đặc trưng để tạo nên hình khối, trong đó chứa hem và có 4 bậc cấu trúc

Tại sao lại chọn đối tượng thiết kế tách dòng gen là chuột?

 Thiếu máu hồng cầu hình liềm là bệnh do di truyền của hemoglobin trong hồng cầu Các hồng cầu của bệnh nhân có hình lưỡi liềm và hemoglobin bất thường có xu

hướng đóng cục gây tắc nghẽn mạch máu Bệnh nhân dễ bị nhiễm khuẩn và các cục máu đông gây bít tắc những mạch máu làm tổn thương nhiều cơ quan

 Bệnh nhân có số lượng hồng cầu thấp hơn bình thường do các tế bào hình liềm

không thể sống lâu được, trong khi tủy xương không thể tạo ra hồng cầu mới đủ

nhanh để thay thế những tế bào chết đi Đây là một bệnh di truyền, kéo dài suốt đời, bệnh xuất hiện ngay từ khi bệnh nhân mới được sinh ra

 Các phương pháp điều trị trước đây như dùng thuốc giảm đau, truyền dịch chống mất nước nhằm giảm đau, ngăn ngừa nhiễm khuẩn, tổn thương mắt, đột quỵ, kiểm soát các biến chứng Các phương pháp này đều không điều trị dứt điểm được bệnh

mà chỉ làm giảm triệu chứng và điều trị những biến chứng Ghép tủy xương có thể trị dứt hẳn trong một số ít trường hợp Các nhà nghiên cứu đang tiếp tục tìm kiếm

những cách điều trị mới cho bệnh này bao gồm liệu pháp gen, ghép tủy xương, dùng

tế bào gốc, trong đó phương pháp dùng tế bào gốc đã mang đến thành công đáng kể

 Bệnh thiếu máu hình liềm là một căn bệnh ở người, nhưng các nhà nghiên cứu đã làm cho bệnh được biểu hiện ở chuột và được chữa lành bởi những tế bào gốc được sản xuất không phải từ phôi thai

 Các nhà nghiên cứu đã nhân tính hóa các chú chuột, có những tế bào biểu hiện hemoglobin người đột biến của bệnh hồng cầu hình liềm Người ta lấy các tế bào da trên đuôi của những chú chuột này nuôi cấy cho tiếp nhận những biến đổi di truyền (4 gen) làm tái lập chương trình tế bào Các tế bào này trẻ lại giống hệt với các tế bào gốc phôi thai Có 24 dòng tế bào gốc đã được xác lập, rồi được biến đổi nhờ những yếu tố hormon khác thành các tế bào gốc sinh huyết, là nguồn gốc của các hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu trong tủy xương Một trong các dòng này đã nhận gen của hemoglobin bình thường thay thế cho gen bệnh của nó Đó là một kỹ thuật được xem là phương pháp đặc biệt, đặc trị Chỉ một vài tế bào trong các tế bào được tái lập chương trình như thế là đã sinh ra các tế bào gốc sinh huyết bình thường Một khi

đã thu được những tế bào gốc "thuốc" này rồi, các nhà nghiên cứu đã tiêm vào các chú chuột

bị bệnh hồng cầu hình liềm của người

 Kết quả là không những sửa chữa được khuyết tật của hemoglobin bằng cách thay thế 65% hemoglobin bị bệnh bằng các hemoglobin lành mạnh mà còn nghiên cứu về các hồng cầu mới, được sản xuất từ các tế bào gốc bị biến đổi này Sau khi tiêm "thuốc", các chú chuột thể hiện triệu chứng thiếu máu ít hơn, tủy xương sản sinh các hồng cầu mới có kích thước, hình dáng gần với bình thường hơn Trước khi tiêm, ở các chú chuột bị bệnh có sự sản xuất rất nhiều các

tế bào hồng cầu trẻ không trưởng thành để bù lại sự chết sớm của các tế bào hồng cầu trưởng thành Sau khi tiêm, số các tế bào này giảm đi ở các chú chuột được điều trị.

 Vào NCBI, gõ alpha

hemoglobin

Click vào tên 4 loài chuột khác nhau ở bên cột Top organisms

Ta được các bài báo, click vào bài ta chọn, được các kết quả sau

Copy toàn bộ trình tự Fasta của 4 loại chuột trên vào ô nhập trình tự của Clustal Omega

Submit và ta được kết quả thể hiện các vùng tương đồng, từ đó tìm được vùng bảo thủ

Chọn khuôn ảo là chuột Mus Musculus NM_008218.2, là vì dựa theo thông tin trên Genbank thì ngày phát hiện là gần nhất trong số 4 loại, ngày 26/5/2020 và theo các bài báo trên Pubmed của các tác giả thì gen này được các nhà khoa học khai thác từ loài chuột nhà ở Nhật Bản

Copy toàn bộ trình tự gen Fasta của mus musculus vào ô nhập trình tự của PrimerBlast, nhập các thông số mồi xuôi, mồi ngược, chiều dài gen, nhiệt độ mồi, rồi ấn get Primers

Ta được kết quả có các mồi, ta chọn mồi thích hợp dựa vào các điều kiện tỉ lệ

GC nằm trong khoảng 50-55%, tỉ lệ bắt cặp nhỏ hơn 6, nhiệt độ mồi Tm trong khoảng 52 – 62 ℃ , số Nu nằm trong khoảng 18-24

Ta được kết quả là mồi primer 5 với các thông số như sau

Chạy PCR ảo với mồi vừa tìm được bằng cách copy trình tự gen fasta của Mus musculus, nhập đoạn mồi xuôi và mồi ngược

Submit và ta được kết quả sản phẩm chạy PCR ảo

Copy trình tự gen của sản phẩm chạy PCR ảo vừa rồi vào ô nhập trình tự của Blast, submit và ta được kết quả

 Trong mục Description có các đoạn gen có trình tự tương đồng theo tỉ lệ phần trăm ở cột Per Indent, tỉ lệ càng cao thì khả năng tương đồng của gen của mình với gen có trong ngân hàng dữ liệu càng lớn Do đó tính trạng mà gen đó mã hóa sẽ càng giống với tính trạng của gen có trong ngân hàng dữ liệu

Click vào Mus musculus Glnc1 gene for globin c1 accession LT548154, ta

có các thông tin của gen đó về chiều dài Nu, loại, nguồn gốc và trình tự gen Click vào Interpro, ta có các thông tin của Hemoglobin, alpha type như sau:

 Thiết kế phương án tách dòng gen theo các bước như sau:

 Chuẩn bị gen cần tách dòng, bằng phương pháp tổng hợp nhân tạo, chính là các bước như trên, chạy PCR ảo

 Tạo vector tái tổ hợp: chọn vector tách dòng có promoter mạnh, enzyme cắt giới hạn phù hợp để nối giữa gen cần với vector , tạo ra vector tái tổ hợp

 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ

 Sàng lọc các dòng tế bào mang vector tái tổ hợp

 Nuôi cấy tế bào tái tổ hợp để thu sản phẩm

Ta lựa chọn vector tách dòng pET 22b

Chọn 2 enzyme cắt giới hạn là NdeI có trình tự CATATG và XhoI CTCGAG,

bổ sung vị trí cắt cặp mồi vào đầu 5’ của đoạn mồi xuôi và ngược tương ứng