Theo phương án tách dòng gen lựa chọn, hãy thiết kế primer và xây dựng phương án thực hiên tách dòng gen

Bài thực hành này em lựa chọn tách dòng gen interleukin-6 của Canis lupus familiaris chó nhà.. Bước 1: Truy cập vào cơ sở dữ liệu trực tuyến NCBI để tìm các loài, chủng bất kì có gen i

Họ và tên: Mai Thị Miên

MSSV: 20174939

Lớp: KTSH-02

GVHD thí nghiệm: GS Nguyễn Văn Cách

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM: TIN SINH HỌC

ĐỀ TÀI: Theo phương án tách dòng gen lựa chọn, hãy thiết kế primer và xây dựng

phương án thực hiên tách dòng gen

Bài thực hành này em lựa chọn tách dòng gen interleukin-6 của Canis lupus familiaris

(chó nhà)

Em muốn tách dòng gen interleukin-6 ở chó nhà mà chưa biết trình từ đoạn gen như thế

nào nên dựa vào cơ sở dữ liệu trực tuyến NCBI, EBI,… để dự đoán

Bước 1: Truy cập vào cơ sở dữ liệu trực tuyến (NCBI) để tìm các loài, chủng bất

kì có gen interleukin-6 mà có đặc điểm tính trạng, thuộc tính, gần gũi với chó nhà

Khi tìm kiếm trên NCBI, hiển thị rất nhiều kết quả với các loài có gen mã hóa interleukin-6 Em chọn lọc các gen interleukin-6 của các loài gần gũi với chó nhà như sau:

+ Canis familiaris interleukin-6 ( IL-6) mRNA, complete cds – MAM

08-DEC-1995 với trình tự gen FASTA:

>U12234.1 Canis familiaris interleukin-6 (IL-6) mRNA, complete cds

GCCCTCGAGCCCACCAGGAACGAAAGAGAGCTCCATCTGCCCTCCAGGACCCCAGCTATGAACTCCCTCT CCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGC AGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTG ATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGTGTGAAG ACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAGATGGATGCTTCCA ATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCGGTCTTGTGGAGTTTCAGCTACACCTG AATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGGAAAATGTCAAGTCTGTGCACATGAGTACCAAGATCC TGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCAGGATGAAGTGACCACTCCTGACCCAACCACAGACGC CAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGTCGCAGGATGAGTGCGTGAAGCACACAACAATTCACCTCATCCTGCGG AGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGTCTGAGGGCTGTTCGGATAATGTAGCCTGGGCATCTAAGATTGC TGTAGTTCATGGGCATTCCTTTCTCCAGTCAGAAACCTGTGCAGTGGGCACAAAACTTATGTTGTTCTCT GTGAGGAACTAAAAGTATGAGCGTTAGGACACTATTTTAATTATTTTTAATTTATTGATATTTAAATATG TGATATGGAGTTAATTTATATAAGTAATAGATATTTATATTTTTTATGAAGTGCCACTTGAAATATTTTA TGTATTCATTTTGAAAAAGTTAACGTAAAATGCTATGCGGCTTGAATATCCTCGATGTTTCGGAGCCAGG TCATTTCTTGGAATGTGTAGGTTTACCTCAAATACATGGCTAACTTATGCATATTTTTAAAAGAAATATT TATACTGTGTTTATATAATGTTTAAATTGTTTTTATACCAATAAACACCTTTTT

+ Canis familiaris interleukin-6 ( IL-6) mRNA, complete cds – MAM

17-JUL-2000 với trình tự gen FASTA:

>AF275796.1 Canis familiaris interleukin-6 (IL-6) mRNA, complete cds

ATGAACTCCCTCTCCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCC CGGGACCCCTGGCAGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAA AGTGGAAGAACTGATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTT AACAAGTGTGAAGACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAG ATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCGGTCTTGTGGAGTT TCAGCTACACCTGAATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGGAAAATGTCAAGTCTGTGCACATG AGTACCAAGATCCTGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCAGGATGAAGTGACCACTCCTGACC CAACCACAGACGCCAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGTCGCAGGATGAGTGGCTGAAGCACACAACAATTCA CCTCATCCTGCGGAGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGTCTGAGGGCTGTTCGGATAATGTAG

+ Canis lupus familiaris interleukin 6 (IL-6), mARN MAM 28-APR-2020 với trình tự gen FASTA:

>NM_001003301.1 Canis lupus familiaris interleukin 6 (IL6), mRNA

GCCCTCGAGCCCACCAGGAACGAAAGAGAGCTCCATCTGCCCTCCAGGACCCCAGCTATGAACTCCCTCT CCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGC AGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTG ATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGTGTGAAG ACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAGATGGATGCTTCCA ATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCGGTCTTGTGGAGTTTCAGCTACACCTG AATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGGAAAATGTCAAGTCTGTGCACATGAGTACCAAGATCC TGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCAGGATGAAGTGACCACTCCTGACCCAACCACAGACGC CAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGTCGCAGGATGAGTGCGTGAAGCACACAACAATTCACCTCATCCTGCGG AGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGTCTGAGGGCTGTTCGGATAATGTAGCCTGGGCATCTAAGATTGC TGTAGTTCATGGGCATTCCTTTCTCCAGTCAGAAACCTGTGCAGTGGGCACAAAACTTATGTTGTTCTCT GTGAGGAACTAAAAGTATGAGCGTTAGGACACTATTTTAATTATTTTTAATTTATTGATATTTAAATATG TGATATGGAGTTAATTTATATAAGTAATAGATATTTATATTTTTTATGAAGTGCCACTTGAAATATTTTA

TGTATTCATTTTGAAAAAGTTAACGTAAAATGCTATGCGGCTTGAATATCCTCGATGTTTCGGAGCCAGG

TCATTTCTTGGAATGTGTAGGTTTACCTCAAATACATGGCTAACTTATGCATATTTTTAAAAGAAATATT

TATACTGTGTTTATATAATGTTTAAATTGTTTTTATACCAATAAACACCTTTTT

+ Vulpes vulpes interleukin 6 mRNA, complete cds, MAM 15-MAY-2007

>EF543193.1 Vulpes vulpes interleukin 6 mRNA, complete cds

ATCTGCCCTCCAGGACCCCAGCTATGAACTCCCTCTCCACAAGCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGT

GATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGCAGGAGATTCCAAGGATGATGCCACTTCAAATAGT

CTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTCATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGA

GAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGTGTGAAGACAGCAAGGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACA

TCTTCCCAAACTGGAGGGAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGA

ATCACTACCGGTCTTACGGAGTTTCAGCTACACCTGAATATCCTCCAGAACAACTATGAGGGTGATAAGG

AAAATGCCAAGTCTGTGCACACGAGTACCAAGATCCTGGTCCAGATGCTAAAGAGCAAGGTAAAGAATCA

GGATGAAGTGACCACTCCGGACCCAACCAGAGACGCCAGCCTGCAGGCTATCTTGCAGCCGCAGAATGAG

TGGCTGAAGCACACAACAATTCACCTCATCCTGCGGAGTCTGGAGGATTTCCTGCAGTTCAGCCTGAGGG

CTGTTCGGATAATGTAGCCTGGGCATCTAAGATTGCTGTAGTTCATGGGC

+ Felis catus interleukin 6 (IL6), mRNA, MAM 10-MAY-2020

>NM_001009211.2 Felis rúcatus interleukin 6 (IL6), mRNA

GACTCCAGCCATGACCTTCCTCTCCACAAGCGCCTTCAGTCCACTCGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTG

GTGGTGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGGAGGAGATGCCACCTCAAATAGACTACCACTCA

CCTCTGCAGACAAAATGGAAGAACTCATTAAGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAAAAAGGAGAT

GTGTGACAACTATAACAAATGTGAGGACAGCAAGGAGGCACTGGCAGAAAACAACCTGAATCTTCCGAAA

CTGGCAGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCCTGACAAGAATCACTACTG

GTCTTCAGGAGTTTCAGATATACCTGAAATTCCTCCAGGACAAGTATGAGGGTGATAAGGAAAATGCCAA

GTCTGTGTACACCAGTACTAACGTCCTGCTCCAGATGCTGAAGCGTAAGGGAAAGAATCAGGATGAGGTA

ACCATCCCTGTCCCAACCGTAGAAGTTGGCCTGCAGGCTAAGCTGCAGTCACAGGAAGAGTGGCTGAGGC

ATACAACAATTCACCTCACCCTTCGAAGGCTGGAGGACTTCCTTCAGTTCAGCCTCAGGGCTGTTCGGAT

AATGTAACCTGGGCATCTAAGATTGCTGTAGTTCACGGGCATTCCTTTCTCTGGTCAGAAACCTGTCCAC

TGGGCATGTAACTGATGTTGTTCTCTGTGAAGAACGAAAAGTATGAGCGTTA

+ Bos taurus interleukin 6 (IL6), mRNA , MAM 19-JUN-2020

>NM_173923.2 Bos taurus interleukin 6 (IL6), mRNA

CCAGGAACGAAAGAGAGCTCCATCTGCCCTCCAGGAACAGCTATGAACTCCCGCTTCACAAGCGCCTTCA

CTCCATTCGCTGTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGATGACTTCTGCTTTCCCTACCCCGGGTCCCCTGGG

AGAAGATTTCAAAAATGACACCACCCCAGGCAGACTACTTCTGACCACTCCAGAGAAAACCGAAGCTCTC

ATTAAGCGCATGGTCGACAAAATCTCTGCAATGAGAAAGGAGATATGTGAGAAGAATGATGAGTGTGAAA

GCAGCAAGGAGACACTGGCAGAAAATAAGCTGAATCTTCCAAAAATGGAGGAAAAGGACGGATGCTTCCA

ATCTGGGTTCAATCAGGCGATTTGCTTGATCAGAACCACTGCTGGTCTTCTGGAGTATCAGATATACCTG

GACTACCTCCAGAACGAGTATGAGGGAAATCAGGAAAATGTCAGGGATTTGAGGAAAAATATCAGAACAC

TGATCCAGATCCTGAAGCAAAAGATCGCAGATCTAATAACCACTCCAGCCACAAACACTGACCTGCTGGA

GAAGATGCAGTCTTCAAACGAGTGGGTAAAGAACGCAAAGATTATCCTCATCCTGAGAAACCTTGAGAAT

TTCCTGCAGTTCAGCCTGAGAGCTATTCGGATGAAGTAGCTGGGGCTCCCATGATTGTGGTAGTTCCTGG

GCATTCCCTCCTCTGGTCAGAAACCTGTCCACTGGGCACACAACTTATGTTGTTCTCTATGAAGAACTAA

AAGTATGAGCGTTAGGACACTATTTTATCTTTAATTTATTGATATTTAAATATGTGATTTTGAGTTAATT

TATATACATGATAAGTATTTATATTTTTATGAAGTGCCACTTGAAATATTTTATGTATTTGGTTTGAAAA

AGTAACGTAAAAATGGCTATGTGGCTTGAATGTCCTTATTGTTTTGGAGACAAATCATTTCTTGAAATGT

GTAGGCTTACCTCAAAAAATTTGCTAACTTATGCATATTTTTAAAGGCATATTTATATTGTATTTATATA

ATGTTTAGGCTGTTTTTATAACAATAAACTTCTTTTTTAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA

Bước 2: Sử dụng chương trình phân tích cấu trúc chuỗi CLUSTAL OMEGA để

tìm kiếm các vùng có cấu trúc đặc biệt, phân tích mức độ tương đồng và phân ly giữa các chuỗi, dự đoán cấu trúc chuỗi và sắp xếp tương quan theo quan hệ tiến hóa Trong đó vùng bảo thủ được sử dụng để thiết kế mồi

Ta copy 5 trình từ gen bên trên vào phần mềm CLUSTAL OMEGA để chạy kết quả và thu được kết quả như sau:

Kết quả cho thấy các chuỗi gen này có nhiều vùng bảo thủ và vùng phân ly (vùng

có dấu * là vùng bảo thủ, còn không có dấu * là vùng sai khác giữa các chuỗi)

Dựa vào thời gian công bố gần đây nhất và đặc điểm tính trạng tương đồng với loài mà em nghiên cứu tách dòng  chọn chuỗi NM_001003301.1 để làm khuôn ảo

Bước 3: Thiết kế mồi

Sử dụng phần mềm PRIMER BLAST để thiết kế mồi Copy trình tự gen FASTA của NM_001003301.1 vào khung, sau đó lựa chọn

+ vùng bảo thủ đầu từ nucleotit 85- đến nucleotit 143

+ vùng bảo thủ cuối từ nucleotit 350 đến nucleotit 408

Điều chỉnh các thông số trong PRIMER BLAST ( kích thước sản phẩm PCR, nhiệt

độ, ) cho phù hợp như hình dưới đây:

Kết quả chạy PRIMER BLAST tạo ra được 10 đoạn mồi khác nhau như hình sau:

Yêu cầu về đoạn mồi:

+ Độ dài từ 18-24bp

+ Nhiệt độ bắt mồi của hai mồi không chênh lệch quá 5 độ C

+ Tỉ lệ GC: 40-60%, tối ưu là 50-55%

Thông thường cặp mồi đầu tiên là tối ưu nhất, để kiểm tra xem cặp mồi 1 có phù hợp không ta thực hiện quá trình PCR ảo

Bước 4: PCR ảo bằng phần mềm SMS PCR

Ta copy trình tự gen FASTA của NM_001003301.1 vào khung và lần lượt cho các đoạn mồi xuôi và mồi ngược như sau:

Sử dụng cặp mồi là:

T7: 5’ TGCTCCTGGTGATGGCTACT 3’

T3: 5’ CCACAAGACCGGTAGTGATTCT 3’

Sản phẩm PCR thu được có kích thước là 309bp và trình tự gen như sau:

PCR Products results

>309 bp product from linear template NM_001003301.1 Canis lupus familiaris interleukin 6 (IL6), mRNA, base 95 to base 403 (T7 - T3)

TGCTCCTGGTGATGGCTACTGCTTTCCCTACCCCGGGACCCCTGGCAGGAGATTCCAAGG

ATGATGCCACTTCAAATAGTCTACCACTCACCTCTGCAAACAAAGTGGAAGAACTGATTA

AGTACATCCTCGGCAAAATCTCTGCACTGAGAAAGGAGATGTGTGACAAGTTTAACAAGT

GTGAAGACAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAATAACCTACATCTTCCCAAACTGGAGGGAA

AAGATGGATGCTTCCAATCTGGGTTCAATCAGGAGACCTGCTTGACAAGAATCACTACCG

GTCTTGTGG

Bước 5: So sánh sản phẩm PCR trong phần mềm BLAST để dự đoán đặc tính

của sản phẩm dựa vào mối tương quan giữa cấu trúc và tính trạng Cấu trúc gen giống nhau có thể các tính trạng giống nhau nếu không xảy ra đột biến

Sản phẩm PCR có cấu trúc tương đồng với Canis familiaris interleukin-6 Mrna,

AF275796.1 Như vậy có thể dựa vào AF275796.1 để dự đoán tính chất của loài mà mình đang nghiên cứu

Bước 6: Thực hiện tách dòng gen đích

Ta lựa chọn vecto tách dòng là pUC57 và sứ dụng enzym giới hạn là Ndel và EcoRV

Vị trí để cắt mở vòng vecto tách dòng này bằng enzym giới hạn là lacZ, đồng thời lacZ cũng là gen chỉ thị để nhân biết gen đích đã được gắn vào thành công không

Tạo phản ứng nối gen đích + vecto tách dòng + DNA ligase  tạo vecto tách dòng tái tổ hợp

Bước 6: Biến nạp vào tế bào chủ

Tế bào chủ được chọn để biến nạp là E.coli DH5𝛼 và đem đi nuôi cấy ở điều kiện thích

hợp

Bước 7: Lựa chọn chủng tái tổ hợp: chọn khuẩn lạc, nuôi trong môi trường LB

lỏng, thu nhận tế bào mang vecto tái tổ hợp

NHẬN XÉT:

- Bài thực hành tin sinh cho sinh viên hiểu biết thêm và thao tác về cơ sở dữ liệu trực tuyến (NCBI, EBI, ) và biết sử dụng vào mục đích gì để phục vụ cho công việc nghiên cứu cũng như học tập trên lớp

- Bài thực hành lựa chọn phương án tách dòng gen có thể ra kết quả tốt hoặc vẫn còn sai sót trong các bước làm, nhưng em đã hiểu hơn về các bước cần làm khi tách dòng từ gen ban đầu chưa biết cấu trúc

- Bước quan trọng nhất của phương án tách dòng gen này là tìm được trình tự gen

để làm khuôn ảo phù hợp và các loài, chủng phải gần gũi, có tính trạng tương đồng với loài mà mình nghiên cứu