xây dựng phương án tách dòng gen mã hoá interferon alpha 2b từ gà gallus gallus

TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA 2bXÁC ĐỊNH GEN ĐÍCH XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN VÀ BIỂU HIỆN... TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA• Khái quát chung:  Interferon là một nhóm các protein t

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

TIN SINH HỌC

XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN

TÁCH DÒNG GEN MÃ HOÁ INTERFERON ALPHA 2b TỪ

GÀ GALLUS GALLUS

TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA 2b

XÁC ĐỊNH GEN ĐÍCH

XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN VÀ BIỂU HIỆN

TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA

Cấu trúc không gian của interferon alpha

TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA

• Khái quát chung:

 Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất bởi các

tế bào của hệ miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virus, vi khuẩn vàTB ung thư Interferon đóng vai trò quan trọng trong cửa ngõ miễn dịch, nó là hàng rào bảo vệ đầu tiên của cơ thể chống lại virus và sự phát triển bất

thường của tế bào.

 Kích thước 165 aa, với trọng lượng khoảng 19,2 kDa Là 1 gen

không có intron với chiều dài 1 gen là 498 bp

TỔNG QUAN VỀ INTERFERON ALPHA

• Chức năng:

 Kích thích các tế bào chưa bị nhiễm virus đề kháng với virus thông qua cơ chế hoạt hóa các gene làm hạn chế tổng hợp các mRNA và hạn chế tổng hợp các protein của virus.

 Các cytokin này kích thích hầu hết các tế bào của cơ thể tăng biểu hiện phức hợp hòa hợp tổ chức chính lớp I (MHC I) nhờ đó các tế bào này đề kháng với tác dụng của tế bào NK Mặt khác, IFN-α và α và IFN-α và β cũng kích thích các tế bào mới nhiễm virus tăng biểu hiện (MHC I) và dễ bị tiêu diệt bởi các tế bào CD8 độc tế bào.

 Những phân tử này có khả năng hoạt hóa các tế bào NK, nhờ sự hoạt hóa đó mà các tế bào giết tự nhiên (không phân biệt đối

tượng) sẽ hoạt động có chọn lọc hơn, nghĩa là chỉ tiêu diệt các tế bào nhiễm virus.

Tạo vecto tách dòng tái

tổ hợp

Biến nạp vào

TB chủ

Lựa chọn chủng tái tổ hợp

TẠO GEN ĐÍCH

• Truy cập vào trang NCBI để xác định gen đích cần tách: từ loài gà có tên Gallus gallus (lấy từ một loài giồng nhau

nhưng khác nhau về thời gian lấy mẫu)

• Truy cập trang Clustal Omega so sánh sự tương đồng của loài gà tại 4 thời điểm khác nhau để tìm ra vùng bảo thủ

• Tạo mồi ảo

• Chạy PCR test

• Chạy Blast tìm ra các tính trạng tương đồng

•Truy cập NCBI, đánh tìm kiếm trong mục Nucleotide tìm

interferon alpha Gallus Gallus

•Hiện ra hàng loạt kết quả, lấy chủng Gallus Gallus với các thời gian lấy mẫu khác nhau

•Truy cập Clustal Omega tìm vùng bảo thủ từ nu 1-α và 582

•Thiết kế mồi cho loài mã AB021153.1

Thiết kế mồi ảo trong chương trình Primer Blast

Chạy được mồi xuôi và mồi ngược, sản phẩm PCR dự kiến có

501bp với mồi Primer pair 4 Lý do chọn mồi số 4 là do mồi 4 có

tỷ lệ GC cao và kích thước sản phẩm PCR tạo thành phù hợp với việc tạo ra interferon alpha 2b

Chạy PCR Test

Sản phẩm PCR ảo, có kích thước 501 bp phù hợp → phù hợp

với kết quả dự đoán khi chạy Primer

Kết quả chạy Blast:

Total score = max score: chỉ có 1 vùng bảo thủ duy nhất

E value: rất nhỏ nên sự khác biệt không lớn

Per Ident: 100%, nghĩa là sự tương đồng là 100% về tính trạng

Chạy Blast

Sự tương đồng các loài: Khi ấn vào các dòng thì sẽ hiện ra sự bắt cặp mồi giữa các loài tương ứng là tương đồng bao nhiêu cặp nu, dựa vào quy định màu sắc.

Dự đoán tính chất của

Sự bắt cặp mồi: Mồi xuôi tạo sản phẩm kích thước 501 bp, bắt cặp 100%

→ phù hợp Mồi ảo tương thích 100%

PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN

 Sản phẩm PCR thu được đoạn gen 501 bp và được kiểm tra trên gel agarose và tinh sạch.

TIẾN HÀNH TÁCH DÒNG GEN

• B2: Gắn vào vecto tách dòng

 Sử dụng vecto tách dòng plasmid PJET1.2

 Sản phẩm PCR nhân gen và vector tách dòng pBluescript được cắt đồng thời bằng hai enzyme đặc hiệu là: NotI

và EcoRI (10U/μL)μL)L)

 -α và Sản phẩm cắt sau đó được tinh sạch và ghép nối bằng enzyme T4 ligase

 Sản phẩm ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào

ckhả biến theo phương pháp điện biến nạp ở 2,5 kV

trong 5ms

 Nuôi trên MT thạch YPD có G418 được cấy chuyền vào

MT thạch MM, ủ trong 16 giờ ở 28oC

 Trình tự gen sau đó được kiểm tra bằng cách so sánh

với trình tự gen gốc trên ngân hàng gen NCBI bằng

công cụ BLAST

BIỂU HIỆN GEN

• Vector biểu hiện pPIC9K được sử dụng để chuyển gen vào động vật (gà)

• Vector pPIC9K được cắt đồng thời bằng enzyme đặc hiệu sau đó ghép nối bởi enzyme T4 DNA ligase

• Sản phẩm ghép nối được chuyển vào tế bào pPIC9K và nuôi cấy trên môi trường thạch YPD

• Để chuyển vào động vật, plasmid tái tổ hợp được

chuyển vào tế bào vi khuẩn, sau đó nuôi động vật với các điều kiện thích hợp để biểu hiện tính trạng ra ngoài

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Giáo trình Tin sinh học, Nguyễn Văn Cách

2 Luận văn Tạo dòng và biểu hiện gen mã hoá

Interferon alpha 2b của người trên hệ thống pichia pastoris