Thiết kế mồi tổng hợp gen sản sinh α amylase từ chủng bacillus subtillis

Thiết kế mồi tổng hợp gen sản sinh α-amylase từ chủng Bacillus subtillis GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Cách TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC... Phân tích đề bài

Thiết kế mồi tổng hợp gen sản sinh

α-amylase từ chủng Bacillus subtillis

GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Cách

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC

Phân tích đề bài

• Quy trình tách dòng gen: Chủng Bacillus subtilis => Tinh sạch và thu DNA tổng số => PCR đoạn gen sản xuất α-amylase (đoạn gen đích) tạo số lượng đoạn gen đủ lớn => Tạo vector và tách dòng gen.

 Vậy làm sao để tách đặc hiệu đoạn gen đích ? => Cần thiết kế mồi đặc hiệu để PCR cho đoạn gen đích

• Thiết kế mồi ảo => Đặt mua mồi dựa trên cơ sở mồi đã thiết kế.

• Thiết kế mồi ảo dựa trên vùng bảo thủ từ khuôn ảo.

• Khuôn ảo là trình tự Nu của chủng Bacillus subtilis có quan hệ họ hàng gẫn gũi, điều kiện sinh trưởng tương đồng với điều kiện của ta

• Mượn trình tự Nu của các nhà khoa học cũng nghiên cứu về gene tổng hợp enzyme α-amylase từ Bacillus subtilis để tìm vùng bảo thủ giữa các chủng Bacillus subtilis này

• Thiết kế mồi, thực hiện PCR ảo trên khuôn ảo

• So sánh sản phẩm PCR ảo với kho dữ liệu Database trong NCBI

• Dự đoán tính trạng sản phẩm

Tìm kiếm thông tin về các chủng Bacillus subtilis sản xuất α-amylase trên cơ

sở dữ liệu NCBI

Chọn ít nhất 3 bài báo nghiên cứu về

Bacillus Subtilis có sản xuất enzyme

α-amylase

• Các đối tượng dùng tham khảo nghiên cứu đều thuộc cùng loài Bacillus subtilis.

=> Lựa chọn chủng làm khuôn ảo có họ hàng gần và có điều kiện sinh trưởng phát triển tương đồng với điều kiện sinh trưởng của chủng thực của ta.

• Chọn chủng Bacillus subtilis strain AS01a – được nghiên cứu ở Ấn Độ.

Sử dụng phần mềm Clustal Omega để tìm ra vùng cấu trúc bảo thủ từ

3 chủng trên

Đếm số thứ tự Nucleotide thuộc vùng mà ta chọn để thiết kế mồi.

+ Chọn Nu bắt đầu thiết kế mồi xuôi từ Nu 7– 30+ Chọn Nu bắt đầu thiết kế mồi ngược 1977– 1954

Sử dụng phần mềm Primer-Blast của NCBI để thiết kế mồi cho phản ứng PCR ảo

Chạy chương trình, đưa ra kết quả 4 cặp mồi

Tiến hành PCR ảo với khuôn ảo và cặp mồi ảo thứ 1 – sử dụng phần mềm smsPCR

Sản phẩm PCR ảo

Kích thước sản phẩm PCR ảo 1977 bp

Dựa vào phần mềm Blast của NCBI, tiến hành so sánh sản phẩm PCR ảo với

cơ sở dữ liệu

Mục đích: Dựa vào sự tương đồng

trình tự Nu mà phán đoán sự tương đồng tính trạng.

=> Cụ thể: Xem xét sản phẩm PCR

có trình tự tương đồng với các chủng Bacillus subtilis sản xuất amylase không qua đó phán đoán

nó có khả năng sản xuất amylase ?

Tìm đọc thông tin về chủng có sự tương đông lớn với sản phảm PCR ảo

KẾT LUẬN:

 Sản phẩm thu được qua thực hiện chươn g trình PCR có khả năng biểu hiện tính trạng sản xuất enzyme amylase

α- Kết quả thu được chỉ mang tính tham khảo do ban đầu chỉ mượn thêm 2 trình tự để tìm vùng bào thủ, vì vậy

để có kết luận chính xác ta cần tiến hành tìm hiểu để đưa ra khuôn ảo tốt hơn, so sánh với nhiều trình tự và rất nhiều bài báo khác

Phương án tách dòng gen ảo

1. Chọn vector tách dòng

2. Chọn đoạn DNA insert (đoạn gen đích đã được tách riêng và PCR lên số lượng lớn)

3. Lựa chọn enzyme thích hợp cắt nối thích hợp với vị trí trên vector

4. Chèn đoạn DNA inseart vào vector

5. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ giữ gen (E.coli DH5α đã loại bỏ độc tính)

6. Phân lập tế bào có chứa vector tái tổ hợp bằng chỉ thị (kháng sinh, lac Z)

7. Giữ giống bằng glycerol hoặc đông khô

Vector pCR2.1 • Thuộc nhóm vector Plasmid

• Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớn.

• Mạnh và đa năng, phù hợp với nhiều RE khác nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker

• Vùng polylineker gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzymee cắt hạn chế tương

tự như vùng polylineker của pUC19 => cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA

lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng đoạn DNA có hai đầu dính khác nhau

mà không cần chất gắn.

Plasmid: pCR2.1 – 3929 bp

Bài báo cáo của em còn nhiều thiếu sót, mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo từ thầy và các bạn ạ

Em cảm ơn thầy và các bạn đã quan tâm lắng nghe