Dựa trên cơ sở dữ liệu trực tuyến, lựa chọn gen và tách dòng gen mong muốn

Ta có kết quả như dưới ảnh sau: Lựa chọn thêm một số gen khác có sự tương đồng để có thể tìm được đoạn tương đồng.. Sau khi đã tìm được các gen, ta đi tìm đoạn tương đồng, để có thể tìm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC- CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

BỘ MÔN: TIN SINH HỌC

Họ và tên: Nguyễn Thị Thanh Diệp MSSV: 20174525

Lớp: KTSH01 GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Cách

Hà Nội, 2020

Đề tài thí nghiệm : Dựa trên cơ sở dữ liệu trực tuyến, lựa chọn gen và tách dòng gen mong muốn

I Lựa chọn đề tài thí nghiệm

- Lựa chọn tách dòng gen ALS87231.1 của virus Coxsackie A16 - virus gây bệnh tay chân miệng ở người

II Thông tin về gen

1 Tìm hiểu về bệnh tay chân miệng (HFMD)

- Bệnh tay chân miệng do các loại virus thuộc họ Enterovirus gây ra Người bệnh được xác định là nhiễm tay chân miệng khi xét

nghiệm dương tính với virus Coxsackievirus A từ 2 đến 8, 10, 12, 14, 16; Coxsackievirus B 1, 2, 3, 5; Enterovirus 71- Tay chân miệng EV71

- Khi nhiễm virus tay chân miệng người bệnh sẽ có những biểu hiện chính là tổn thương da, niêm mạc dưới dạng phỏng nước ở các vị trí đặc biệt như niêm mạc miệng, lòng bàn tay, lòng bàn chân, mông, gối Các trường hợp biến chứng nặng của bệnh tay chân miệng thường do EV71 gây ra nếu không được phát hiện sớm và điều trị kịp thời có thể gây nhiều biến chứng nguy hiểm dẫn đến tử vong như viêm não - màng não, viêm cơ tim, phù phổi cấp

- Một số thông tin tìm được trên trang web www.ncbi.nlm.nih.gov

+ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4185891/

+ https://link.springer.com/article/10.1007/s00430-016-0465-y

2 Thông tin về virus CV-A16

- CA16 được phân lập lần đầu tiên ở Nam Phi vào năm 1951 Nó là một

loại virus thuộc loài Enterovirus A (HEV-A) thuộc vào

chi Enterovirus, Picornaviridae CA16 là một hạt nhỏ (đường kính ~

30nm), không bao bọc, chứa một bộ gen RNA virus polyadenylated chuỗi đơn, khoảng 7,4 kb Bộ gen chứa một khung đọc mã hóa một tiền chất polyprotein lớn, sau đó được xử lý thành protein cấu trúc P1

và protein phi cấu trúc P2 và P3 P1 có thể được xử lý bởi một

proteinase được mã hóa bằng virus, dẫn đến các protein tiểu đơn vị capsid của virus VP0, VP1 và VP3 VP0 có thể được tách ra để tạo ra VP2 và VP4 VP1, VP2 và VP3 nằm ở phần bên ngoài của capsid trong khi VP4 nằm ở phần bên trong Các epitopes trung hòa chủ yếu nằm trên VP1 Vùng mã hóa được đặt cạnh các vùng không mã hóa 5′

và 3′ Vùng không mã hóa 5′ bao gồm ~ 740 nucleotide và chứa các trình tự kiểm soát sự sao chép và dịch mã bộ gen, chẳng hạn như vị trí nhập liệu ribosome bên trong (IRES) Vùng không mã hóa 3′ chứa đuôi polyA rất cần thiết cho sự lây nhiễm vi-rút

- Thông tin tìm kiếm trên trang web

+ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4185891/

+ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28659474/

3 Dòng gen lựa chọn

- Lựa chọn tách dòng gen ALS87231.1 của virus Coxsackie A16

III Thiết kế mồi primer và xây dựng phương án thực hành tách dòng gen

1 Thiết kế mồi primer

- Các bước được tiến hành

Dưa trên Graphic của bài viết, t tìm được gen cần tách dòng

Sau đó vào FASTA để tìm được trình tự nucleotide Ta có kết quả như

dưới ảnh sau:

Lựa chọn thêm một số gen khác có sự tương đồng để có thể tìm được

đoạn tương đồng Ở đây, các gen lựa chọn được thể hiện bằng các hình

ảnh sau đây

Sau khi đã tìm được các gen, ta đi tìm đoạn tương đồng, để có thể tìm

được mồi phù hợp

+ Giao diện trang web https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

+ Ở STEP 1, ở phần Enter or paste a set of , ta lựa chọn RNA

+ Tiếp đó, ta copy các đoạn gen đã tìm được vào trong ô

Chúng ra được kết quả như trong ảnh

Lựa chọn các vùng bảo thủ là các đoạn có nhiều sự tương đồng ( lựa chọn

khoảng từ 30-50 nucleotide)

Ảnh minh họa cho sự tương đồng

Ở đây ta lựa chọn vùng bảo thủ từ 61 đến 120 và từ 301 đến 360

Sau khi tìm được đoạn tương đồng, ta có thể đi thiết kế đoạn mồi phù hợp

Vào trang

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome, ta có giao diện như ảnh

Điền các thông số như ảnh dưới đây:

Giao diện kết quả hiện ra:

Ta lựa chọn mồi 1 vì theo trình tự trên web đã sắp xếp, mồi đầu tiên có tỉ

lệ phù hợp cao hơn so với các mồi dưới

Hình ảnh mồi 1 như ảnh dưới

Ngoài mồi đầu tiên, web cũng đưa ra các mồi khác có tỉ lệ phù hợp thấp

hơn

2 Chạy PCR

- Vào trang web

https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html để pcr

- Ta có giao diện như dưới ảnh

- Ta điền các thông số như ảnh dưới đây

- Ta được kết quả như ảnh dưới đây

3 Thông tin về protein

a Khối lượng phân tử, điểm đẳng nhiệt

- Sau đó vào trang web blast X

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAGE_T

YPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome

- Giao diện như ảnh sau

- Tiếp theo ta có được kết quả như giao diện dưới đây

Ta lựa chọn trình tự protein đầu tiên Khi đó ta có kết quả như ảnh

dưới, tiếp đó lựa chọn vào FASTA để xem trình tự protein

Ta có kết quả như ảnh dưới đây

Sau khi đã có trình tự protein, vào trang web https://www.expasy.org/

Lựa chọn Proteomics, ta có giao diện như ảnh dưới đây

Lựa chọn vào trang web https://web.expasy.org/compute_pi/ ta có kết

quả như ảnh dưới đây

Sau đó ta điền copy đoạn protein trên vào phần trắng như ảnh dưới

đây

Ta có kết quả sau

Ta có :

Điểm đẳng nhiệt : 5.11

Khối lượng phân tử : 22928.69

b Vị trí của protein trong tế bào

Ta vào lại Blast X, ta vào tương tự để ra được kết quả

Ta thấy có khá nhiều loài tương đồng 100% với ALS87231.1, ta lựa

chọn ALB74861.1, click chọn FASTA , ta có trình tự protein như đã

nói phía trên

Vào http://phobius.sbc.su.se/, copy trình protein ở trên vào và chạy

chương trình, ta được kết quả:

Nhận xét: Ta có thể thấy vị trí của protein là ngoài tế bào chất ( với tỉ lệ gần như

là tuyệt đối)

4 Dự đoán chức năng

- Vào https://www.expasy.org/, chọn proteomics, chọn protein

modifications, chọn UniProtKB/Swiss-Prot, vào BLAST, copy trình tự

protein và chạy chương trình, ta có kết quả như dưới đây

- Ta chọn protein có tỉ lệ cao nhất là 98%, và thu được phần dự đoán

chức năng