báo cáo thực tập chuyên ngành cnsh y dược

ĐẶT VẤN ĐỀ• Kĩ thuật nuôi cấy tế bào là một công cụ cần thiết mở đường cho những nghiên cứu về ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chấ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM KHOA SINH HỌC-CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH

CNSH Y DƯỢC

I Đặt vấn đề

II Tổng quan III Vât liệu – phương pháp

IV Kết quả- giải thích

V Kết luận – Kiến nghị

VI Tài liệu tham khảo

PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

I ĐẶT VẤN ĐỀ

• Kĩ thuật nuôi cấy tế bào là một công cụ cần thiết mở đường cho những nghiên cứu về ung thư, phân loại các khối u ác tính, mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa chất, xác định sự tương hợp mô trong cấy ghép…

• Vì vậy việc nắm vững các thao tác cơ bản của kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật là nền tảng thiết yếu cho tất cả những nghiên cứu trên tế bào

3

II TỔNG QUAN

1 Tủy xương: chứa các loại tế

bào : tế bào gốc trung mô MSC,

tế bào gốc tạo máu HSC, tế bào

máu trưởng thành

2 Tế bào gốc trung mô (MSC)

• Có khả năng bám vào bề mặt

giá thể khi nuôi cấy in vitro và có

hình dạng giống nguyên bào sợi

• Có khả năng biệt hóa thành

nhiều dòng tế bào khác nhau như

xương, mỡ, sụn

Hình 1 Tủy xương

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Môi trường DMEM/F12 FBS 10%

- Môi trường đông lạnh

- Môi trường giải đông

5

• Dụng cụ:

- Erlen - Buồng đếm hồng cầu

- Becher - Bình flask

- Falcon - Cryotube

- Kẹp cong, kẹp thẳng - Kim tiêm

- Kéo thẳng - Đĩa petri

- Ống bóp - Khay rác

NUÔI CẤY SƠ CẤP

7

2 Phương pháp

THAY MÔI TRƯỜNG

Hút bỏ môi

trường cũ Rửa PBS

Bổ sung môi trường mới

CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH

Hút bỏ môi

trường cũ

Thêm môi trường

Ly tâm thu cặn

Rửa PBS Thêm trypsin Thêm môi

Đôn

g lạnh

0,5ml

GIẢI ĐÔNG

Cryotube 37 o C Bổ sung môi

trường giải đông

Ly tâm thu cặn

Bổ sung môi trường nuôi

IV KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH

1 NUÔI CẤY SƠ CẤP

11

Hình 2 Hình chụp tế bào nuôi cấy sơ cấp

Thu được hỗn hợp tế bào: hồng cầu, tế

bào đơn nhân và các loại tế bào khác

Bảng kết quả

Đĩa lõm, không có nhân 7-8um Hồng cầu

Tròn, có nhân Lớn hơn so với hồng

cầu Tế bào đơn nhân

• Nhận xét: Trên cùng 1 con chuột, số lượng tế bào thu

được ở tủy xương của nhóm ít hơn nhóm 8

• Giải thích:

- Trong quá trình thu nhận, dội rửa tủy xương chưa sạch

- Do thao tác chưa tốt, làm gãy một phần khúc xương

- Sau khi thu nhận, huyền phù chưa đều  tế bào tập trung thành cụm

Hình 3 Hình chụp tế bào nuôi cấy sơ cấp

So sánh quá trình qua ngày nuôi sơ cấp

So sánh tế bào trước và sau khi thay môi trường

Trước khi thay môi trường Sau khi thay môi trường

16

2 Thay môi trường

• Nhận xét:

- Sau khi thay môi trường, các tế bào tách ra, các tế bào không bám dính, bám dính yếu bị loại bỏ, quan sát được các tế bào bám dính (tế bào hình thoi, hình sao, hình sợi dài) với số lượng tế bào nhiều hơn

Trước cấy chuyền Sau cấy chuyền

So sánh trước và sau cấy chuyền tế bào MCF7

3 CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH

- Khi tế bào phủ kín 70-80% diện tích bề mặt nhựa nuôi

cấy thì nên cấy chuyền

Hình 6 Hình chụp tế bào sau giải đông

Hiệu suất giải đông tế bào H=

• Nhận xét: Mật độ tế bào sống sau giải đông đạt hiệu suất cao

V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 KẾT LUẬN

- Nuôi cấy sơ cấp thành công tế bào tủy xương chuột

- Cấy chuyền được tế bào MCF7

- Đông lạnh và giải đông tốt

2 KIẾN NGHỊ

• Cần thêm thời gian nuôi sơ cấp để đủ mật độ tế bào để cấy chuyền trên chính tế bào của nhóm.

• Tiến hành thêm các thử nghiệm: sử dụng các marker bề mặt,

biệt hóa in vitro để khẳng định được tế bào gốc trung mô

A MỤC ĐÍCH

Nắm được các thao tác trên giao tử đực và cái

Tìm hiểu được về phương pháp thụ tinh trong ống

nghiệm

Tìm hiểu quá trình hình thành và phát triển của phôi

25

B NGUYÊN TẮC

• KÉO PIPETTE PASTEUR

- Kéo được pipette với đầu hút có kích thước phù hợp, hút được từng tế bào trứng chuột riêng lẽ

- Kéo pipttle góc 30o -40o với thao tác nhanh dứt khoát trên ngọn lửa đèn cồn

• CHÍCH CHUỘT:

- Gây siêu bài noãn: Chuột cái được tiêm PMSG và hCG vào ổ bụng

- Tiêm 10IU cho mỗi loại hormone

- Gây mê: Khi tiêm cần nắm chặt vùng da sau cổ để chuột nằm yên

- Tiêm vào phần cơ đùi

LỌC DẦU KHOÁNG

27

• Nguyên tắc: Dầu khoáng được lọc qua màng lọc

parafilm 0.22um để loại bỏ các tạp chất và các phần tử

vi sinh vật  đảm bảo điều kiện vô trùng

• Công dụng của dầu khoáng

- Lớp dầu khoáng phủ lên các vi giọt giữ cho các vi giọt không nhiễm khuẩn trong điều kiện tủ nuôi cấy

- Giữ cho vi giọt có dạng hình cầu , không lan ra trên mặt đĩa

- Giữ vi giọt không bị bay hơi

EmbryoCul vào chân đế tạo phần thân vi giọt

Ủ vi giọt: 370C, 5%CO2 trong 3h

 Đánh giá: vi giọt tròn đều, đúng thể tích, không nhiễm

C QUY TRÌNH IVF

II Thu giao tử đực

III Thụ tinh trong ống nghiệm

29

I THU GIAO TỬ CÁI

ĐÁNH GIÁ TRỨNG

Hình 5: Trứng sau thu nhận từ buồng trứng

Trứng mờ, nhạt màu, có lớp cumulus bao phủ dày đặc bao quanh  trứng trưởng thành (trứng số 2) Một số bất thường về hình dạng ( trứng số 1 và 3)

II THU GIAO TỬ ĐỰC

2 KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH

Kết quả: Thu được tinh dịch, không lẫn mỡ, máu, mảnh mô Không đánh giá được chất lượng tinh trùng

Giải thích: Do thao tác sai trong quá trình vệ sinh buồng

đếm và nạp mẫu : cồn chưa khô  trypane blue kết tủa cồn trong buồng đếm  tinh trùng co cụm lại không quan sát được mẫu

Hướng giải quyết: xin mẫu của nhóm 11

Hình 4b: Đếm tinh trùng Hình 4a Tinh trùng dưới kính hiển vi (Nhóm 11)

Mật độ tinh trùng trong mẫu:

N= (tinh trùng/ml)

Đánh giá: chất lượng tinh trùng tốt (tinh trùng khỏe, bơi tốt, mật độ cao)

Số tinh trùng trong buồng đếm

( 25 ô của ô trung tâm)

• Lượng tinh trùng có trong 430µl:

0,43= 2,9 x 106 tinh trùng

• Mật độ tinh trùng để thụ tinh  2,5.106 tinh trùng/ml

 Thể tích môi trường cần hút để đạt mật độ 2,5.106 tinh trùng/ml: = 1.17 ml

•

NHUỘM PHÔI

Nhận xét: Phôi bắt màu thuốc nhuộm Hoechst (màu xanh) và PI (màu đỏ)

Giải thích:

Hoechst liên kết DNA  huỳnh quang màu xanh

Phôi chết  màng tế bào không hoạt động  PI liên kết với DNA huỳnh quang màu đỏ

Hình : Phôi được nhuộm với Hoecst và PI

Phôi được nhuộm với Hoechst và PI trong 10 phút, rửa sạch, sau đó quan sát dưới kính hiển vi

Phôi bắt màu Hoechst Phôi bắt màu PI

D KẾT LUẬN

• Thực hiện các thao tác cơ bản trong việc thu nhận xác định và đánh gía trên giao tử đực và cái ở chuột

• Tạo được vi giọt thụ tinh và nuôi phôi

• Vi giọt không bị nhiễm

• Chưa xác định được hình thái các giai đoạn

phát triển của phôi.

E KIẾN NGHỊ

• Có thể được luyện tập thêm các thao tác hút chuyển

trứng

• GVHD thực hiện toàn bộ kĩ thuật trước 1 lần để sinh

viên có thể có xem và rút kinh nghiệm trước khi thực

hiện

• Thụ tinh trong những hệ thống thụ tinh khác

41

VI TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Giáo trình thực tập chuyên ngành CNSH Y Dược

• Công nghệ sinh học trên người và động vật, Phan Kim Ngọc- Phạm Văn Phúc

• Công nghệ tế bào gốc, Phan Kim Ngọc- Phạm Văn Phúc

• Công nghệ hỗ trợ sinh sản, Phạm Văn Phúc