Ứng dụng tin sinh học trong tách dòng gene mã hóa enzyme natokinase trên đối tượng giả định là vi khuẩn bacillus

Thông tin về nattokinase• Nattokinase là một enzyme thuộc họ serine protease • Được tìm thấy trong Bacillus subtilis trong canh trường đậu tương lên men của Nhật Bản • Có chức năng sinh

Ứng dụng tin sinh học trong tách dòng gene mã hóa enzyme natokinase trên đối tượng giả định là vi khuẩn bacillus

TÌM KIẾM THÔNG TIN VỀ NATTOKINASE

TÌM THÔNG TIN VỀ GENE CẦN TÁCH DÒNG TRÊN CSDL TRỰC TUYẾN

• Đối tượng : gene mã hóa

• Tìm hiểu thông tin về

protein nattokinase, gene

mã hóa,

Ảnh: ví dụ về một kết quả tìm kiếm Nguồn ảnh b: He Ni Peng-Cheng et.al, 2016

Thông tin về nattokinase

• Nattokinase là một enzyme thuộc họ serine protease

• Được tìm thấy trong Bacillus subtilis trong canh trường đậu tương lên men của Nhật Bản

• Có chức năng sinh học trong việc ngăn chặn cục máu đông và được sử dụng như một

loại thuốc trong điều trị bệnh về tim mạch do có khả năng hòa tan sợi thrombi

• Gene coding cho nattokinase là gene aprN gồm một khung đọc mở ORF gồm 1146 nu,

mã hóa cho chuỗi preprotein( chuỗi aa tín hiệu, chuỗi aa pro peptide, 275 aa protein

trưởng thành, nặng 27.7 kDa, pI là 6.6)

• Chuỗi tín hiệu có chức năng dẫn đường cho enzyme ra ngoại bào

• Chuỗi pro-sequence có tác dụng như một chaperone nội bào, có chức năng hỗ trợ sự

cuộn gấp chính xác của enzyme trưởng thành

• Được biểu hiện trên B subtilis hoặc E.coli

• Một số chủng Bacillus được sử dụng là B amyloliquefaciens, B licheniformis, B subtilis, and B amylosacchariticus Bộ gene của các chủng này được thiết kế sao cho các protease

bị mất chức năng hoặc thiếu hệ thống protease (extracellular-protease-deficient B

subtilis system )

XÁC ĐỊNH VÙNG BẢO THỦ

Tìm kiếm các genome mang bộ gene

mã hóa protein nattokinase

Công cụ : CSDL NCBI

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleoti

de

So sánh để tìm ra vùng bảo thủCông cụ:

Clustal Omega

https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

•Bước 1: truy cập

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide, tìm kiếm với từ khóa nattokinase

•Kích vào đường dẫn để xem thông tin: ngày công

bố, nơi thực hiện, nguồn gốc chủng, canh trường nuôi cấy để bước đầu xác định quan hệ gần gũi giữa chủng vi khuẩn mình có và chủng lấy làm khuôn thiết kế mồi

•Kích vào FASTA để xem trình tự nu

•Lựa chọn nhiều nhất có thể, ít nhất là 3 trình tự, sao chép vào file word ở định dạng fasta

XÁC ĐỊNH VÙNG BẢO THỦ-1

Chú ý:

ưu tiên lựa chọn complete cds

Các đoạn gene lựa chọn

>KY576911.1 Bacillus subtilis strain MX6 nattokinase

(aprN) gene, complete cds

>KJ174339.1 Bacillus subtilis strain MTCC 1427

nattokinase (aprN) gene, complete cds

>KF734090.1 Bacillus subtilis subsp natto strain jap10 nattokinase gene, complete cds

>FJ376817.1 Bacillus subtilis subsp natto strain Tangshan nattokinase gene, complete cds

>FJ374767.1 Bacillus subtilis subsp natto strain MBS 04-6 nattokinase (aprN) gene, complete cds

>JN392072.1 Bacillus subtilis strain LSSE-22 nattokinase (aprN) gene, complete cds

….

để vào phần mềm Clustal Omega

• Đưa các trình tự lựa chọn vào, set

các thông số mong muốn theo

hướng dẫn

• Cho chương trình chạy để xem kết

quả

Kết quả xác định vùng bảo thủ

Vùng bảo thủ là vùng có nhiều dấu sao bên dưới, dùng làm

vùng thiết kế mồi

Vùng phân li.

Vùng bảo thủ.

• Lựa chọn genome gần gũi nhất

với đối tượng cần tách dòng là vi

LỰA CHỌN ĐOẠN GENE GẦN GŨI ĐỂ LÀM ĐOẠN KHUÔN

• Trong trường hợp của vi khuẩn, ngoài việc xác định dựa trên đặc điểm canh trường nuôi cấy, thời gian và địa điểm, để xác định quan hệ gần gũi cần xác định thêm sự tiến hóa của

vi khuẩn nhờ vào giải trình tự 16S RNA, sau đó phân tích quan hệ gần gũi

• Công cụ : Clustal W hoặc phần mềm MEGA 5

SỬ DỤNG PHẦN MỀM PRIMER BLAST ĐỂ THIẾT KẾ MỒI

• Truy cập

https://www.ncbi.nlm.nih.gov

/tools/primer-blast/

• Lựa chọn vùng có dấu sao liên

tiếp ở hai đầu để thiết kế mồi

xuôi và mồi ngược

Giao diện primer blast

Tại ô range: nhập vào vị trí của

vùng muốn thiết kế mồi

Tại ô product size: nhập vào độ

dài chuỗi sản phẩm lấy dư lên

Tại ô primer melting

temperature: đặt nhiệt độ như cài đặt hoặc đặt nhiệt độ 52C-58 C

Các thông số khác có thể để là mặc định

Reverse primer

TTTGTCCAAGTCGGGTGCTT

• Thực hiện phản ứng PCR với bộ mồi trên cơ sở dữ liệu

• Công cụ: SMS PCR hoặc insilico PCR

• https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.ht

ml

• http://insilico.ehu.es/PCR/

THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR ẢO

CHẠY THỬ BỘ MỒI BẰNG SMS PCR

nhập trình tự

nhập mồi xuôi và mồi ngược

Kết quả: Cho ra một trình tự nên mồi là đặc hiệu

Kết quả chạy PCR ảo (sử dụng cho dự đoán protein)

CHẠY THỬ MỒI BẰNG INSILICO

• Truy cập: http://insilico.ehu.es/PCR/

• Lựa chọn loài vi khuẩn, nhập trình tự mồi, cho phép sai lệch

Bước 1: chọn loài vi khuẩn Bước 2: nhập trình tự mồi và chọn

chi vi khuẩn

Giao diện kết quả

Kết quả trình bày dưới dạng như một bản điện di

kết quả chuỗi được khuếch đại

• Công cụ: CSDL NCBI hoặc ExPASy

DỰ ĐOÁN TÍNH CHẤT PROTEIN BẰNG CSDL NCBI

Kết quả

• Lựa chọn trình tự khớp 100 %, dựa vào cấu trúc của protein đó để dự đoán cấu trúc protein quan tâm

• Chọn vào phần gạch chân ở mục Accession để xem một số thông tin protein

Thông tin về protein

Chọn GRAPHIC CDD search result để

xem rõ hơn thông tin chức năng từng vùng trên gene

Kết quả cho thấy: Protein sẽ có cấu trúc tương

tự nhưu một ezyme nattokinase, có hai vùng:

- Vùng inhibitor I9: hoạt động như chaperone

để cuộn gấp đúng protein

Vùng peptidase_S8_subtilisin_subset: mang

chức năng của enzyme, chứa trung tâm hoạt động

Như vậy bị thiếu mất chuỗi tín hiệu

Trình tự chuỗi protein dự đoán:

XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG

Dựa vào thông tin protein và

chuỗi nucleotide được khuấy

đại, xây dựng phương án tách

dòng gene

Công cụ có thể sử dụng:Phần mềm pDRAW32https://www.acaclone com/

Biến nạp vào trong tế bào

Sàng lọc các dòng tế bào mang vecto biến nạp

Nuôi cấy tế bào tái

tổ hợp để thu sản phẩm

Sử dụng phần mềm pDRAW32 để thiết kế vecto tách dòng

Giao diện của phần mềm

pDRAW32

Thiết kế thêm trình tự cắt nối vào mồi

• Tế bào chủ để biến nạp tách dòng là

Bacillus subtilis strain WB800

• Để thuận tiện cho việc cắt nối bổ

sung trình tự cắt nối: Eco RI và Xho I

vào đầu 5’ của mồi xuôi và mồi

ngược

• Vecto tách dòng sử dụng là pTZ57R/T

Forward primer(5’-3’) GAATTCTGCCGGAAAAAGCAGTACAGA

Reverse primer(5’-3’) CTCGAGTTTGTCCAAGTCGGGTGCTT

• Để quan sát chi tiết cấu trúc vecto tách

dòng, truy cập đường dẫn:

https://www.snapgene.com/resources/pl

asmidfiles/?set=ta_and_gc_cloning_vecto

rs&plasmid=pTZ57R_T

Tài liệu tham khảo:

1.Cloning and enhancing production of a detergent- and organic-solvent-resistant

nattokinase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 by using an

eight-protease-gene-deficient Bacillus subtilis WB800 , Thao Thi Nguyen , Thi Dinh Quyen and Hoang Thanh Le

2. http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html

3.Giáo trình tin sinh học, GS.TS Nguyễn Văn Cách, nhà xuất bản Khoa Học và Kĩ Thuật, 2003