tách dòng gen defensin thực vật và thiết kế vector chuyển gen để tạo dòng ngô chuyển gen kháng mọt

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌCĐỀ TÀI: TÁCH DÒNG GEN DEFENSIN THỰC VẬT VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG NGÔ CHUYỂN GEN KHÁNG MỌT... 2.Thiết kế mồi: - Align các trình tự mã hóa

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC

ĐỀ TÀI: TÁCH DÒNG GEN DEFENSIN THỰC VẬT VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG NGÔ

CHUYỂN GEN KHÁNG MỌT 

• Là ngũ cốc giầu tình bột, hạt ngô là một trong đối tượng

dễ bị mọt xâm hại Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch) là loại đa thực, có thể ăn được hầu hết các loại ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu và nhiều sản phẩm thực vật khác Thức ăn thích hợp nhất với mọt là hạt ngô và gạo

• Các mẫu ngô lai được trồng ở Việt Nam hiện nay cho năng suất cao nhưng sản lượng, giá thành, chất lượng bị giảm đáng kể do hạt của các mẫu ngô này rất dễ bị mọt xâm hại

 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ tạo giống ngô kháng mọt đang được nhiều nhà khoa học quan tâm

n thực vật

• Là protein đa chức năng nhỏ bao gồm 45-54 amino acid, giàu cysteine,  ức chế sự sinh trưởng của nấm, chống vi khuẩn, làm thay đổi kênh màng, ức chế hoạt động của trypsin, α-amylase

• Defensin của thực vật có 18 nhóm, trong đó nhóm 1 bao gồm các defensin có khả năng ức chế enzyme α-amylase hoặc trypsin

• Trong ruột mọt ăn ngô, defensin liên kết với trung tâm hoạt động của α-amylase trong ruột mọt, dẫn đến ức chế quá trình tiêu hóa tinh bột của mọt

Thiết kế vector chuyển gen mang gen defensin1 phục vụ việc phát triển mẫu ngô chuyển gen có khả năng kháng mọt cao

Các bước

tiến hành

1 Xác định gene cần tách:

- Xác định tính trạng quan tâm

- Xác định gen quy định tính trạng đó trong các báo cáo khoa học

- Tìm kiếm 1 số gen mã hóa protein quan tâm trên ngân hàng dữ liệu

2.Thiết kế mồi:

- Align các trình tự mã hóa 1 protein bằng Clustal Omega

- Xác định vùng bảo thủ (mồi được thiết kế sẽ nằm trong vùng bảo thủnày)

- Thiết kế mồi: sử dụng các chương trình như: Primer Blast, Primer3Plus,Primer3

3.Kiểm tra mồi: Sử dụng PCR ảo SMSXem xét đoạn kết quả sau khi chạy SMS xem có tương đương (kíchthước, ) với đoạn mà định nhân lên không, rồi cho vào Blast của NCBI

để xem nó có là gen mã hóa tính trạng cần nghiên cứu không

4.Phân tích cấu trúc 3D, dự đoán sản phẩm tách dòng và biểu hiện protein.5.Xây dựng phương án tách dòng gen

gen cần tách

Truy cập phần mềm Clustal Omega theo link: 

https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ để so sánh độ tương đồng giữa các gen đã chọn và tìm ra vùng bảo thủ

để thiết kế mồi

Giao diện của Clustal Omega:

gen cần tách

Đưa các trình tự nu vừa thu được từ NCBI vào ô bên dưới, thiết lập các thông số mong muốn và nhấn vào ô "Submit" để ra kết quả

=> sử dụng làm vùng thiết kế mồi.

*Từ kết quả, nhận thấy gen  HG792392.1 chứa nhiều

trình tự bảo thủ, độ dài hợp lí, là một gen ngô ở Sơn La, nên có

khả năng tương đồng cao với gen ngô lai ở Việt Nam cần nghiên cứu

• 5 nu cuối cùng đầu 3’ cần có ít nhất 2G hoặc 2C

• Hạn chế khả năng tự bắt cặp của mồi và bắt cặp mồi với nhau: hạn chế các đoạn lặp hoặc những đoạn từ 4 nu trùng nhau trở lên.

=>Chọn trình tự mồi trên khuôn gen  HG792392.1 (giống ngô Sơn La)

• Forward primer: 32-53

• Reverse primer: 152-173

mồi

Truy cập phần mềm Primer Blast theo link:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ để thiết kế mồi cho phản ứng PCR

Giới hạn độ

dài

Nhiệt độ 

mồi

Sau khi set up các thông số, nhấn vào ô "Get Primer để chạy chương trình

2.Thiết

kế mồi

Sau khi chạy chương trình, thu được 4 cặp mồi:

Dựa vào các tiêu chí chọn mồi, chọn cặp mồi số 1 

-Forward primer: TCCTCGTCCTCATGCTCCTC-Reverse primer:  CGGTCTGGCACACGTTGG

3.Kiểm tra

mồi

Truy cập phần mềm PCR Test theo link:

https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.htmlfbclid=IwAR3EKOp97MhS3l0DisH_XyQNg8GZWJp-UIDT6efgShXRd83wTwT7p3zjJ0k

  để thực hiện PCR đối với đoạn gen của HG792392.1 với cặp mồi số

3.Kiểm tra

mồi

Kết quả sau khi chạy PCR ảoNhận xét: đoạn kết quả trên có kích thước gần tương đương với đoạn gen định nhân lên

=>Đoạn bảo thủ chọn tương đối phù hợp

3.Kiểm tra

mồi

mồi

Thu được kết quả:

*Lựa chọn protein tương đồng cao nhất với mục tiêu: CEJ09690.1 FASTA: > CEJ09690.1 D efensin protein [Zea m ays]

M APSRRM AAPVLVLM LLPVATELG TTKVAEARH CLSQ SH RFKG LCM SSN N C

AN VCQ TEN FG G ECKAEG ATRKCFCKKIC\

*Chọn vào mục Accession để xem một số thông tin protein

Truy cập link: https://www.uniprot.org/uniref/ để dự đoán chức năng của protein

=>Vào mục Blast, nhập vào trình tự PCR ảo

Chọn protein có độ tương đồng cao rồi vào mục Funtion:

Truy cập link: http://phobius.sbc.su.se/index.html để tìm vị trí 

=> Nhập vào trình tự protein thu được kết quả:

phương án 

tách dòng g

en

   Phương pháp nghiên cứu

• Tách chiết RNA tổng số; tổng hợp cDNA.

• Gen defensin1 phân lập từ ngô (ZmDEF1) được khuếch đại bằng

kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF-F/ZmDEF-R (ZmDEF-F: 5’- ACGCG TCGACATGGCGCCGTCTCGACGCA0 -3’ và ZmDEF-R: 5’CCCAAGCTTGCAGATCTTCTTGCAGA AGCAC -3’) và ở chu kỳ nhiệt 94oC/4 phút, 30 chu kỳ của 94o C/45 giây – 58o C/30 giây – 72o C/60 giây) và 72o C/10 phút.

•  Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, tinh sạch theo GeneJET PCR Purification KIT, gắn vào vector tách dòng pBT

• Vector tách dòng được biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α bằng sốc nhiệt (42o C trong 1 phút 30 giây) E coli DH5α mang vector tách dòng được chọn lọc trên môi trường LB đặc bổ sung X- gal, IPTG, kháng sinh carbenicilin Xác định khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp bằng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu Plasmid tái tổ hợp được thu nhận bằng cách tách chiết theo phương pháp tách dòng phân tử của Sambrook và Russell (2001)

phương án 

tách dòng g

en

 Phương pháp nghiên cứu

Vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1 được thiết kế bằng cách gắn gen ZmDEF1 vào khung vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso theo cơ chế trao đổi chéo đặc hiệu vị trí của phage λ như mô tả của Karimi và đồng tác giả (2002)

Thank for watching