Cơ sở khoa học và ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán trước sinh

Kết quả Triple testHàm lượng AFP cao: Cho biết thai nhi có nguy cơ mắc khuyết tật ống thần kinh hoặc thiếu một phần não Kết quả xét nghiệm Triple test được đánh giá dựa vào hàm lượng c

CHỦ ĐỀ: CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ ỨNG DỤNG

SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

Sơ lược về Chẩn đoán trước sinh

tượng, v v

Các phương pháp tiêu biểu

microarray

Sơ lược về Chẩn đoán trước sinh: 

Nhiệm vụ

Đề ra những giải pháp xử trí kịp thời, tư vấn di truyền cho từng cá

nhân, từng gia đình, hạn chế sự ra đời của nhứng đứa trẻ khuyết tật,

góp phần thực hiện ưu sinh học cho nòi giống.

Mục đíchPhát hiện sớm các bệnh, tật di truyền của thai nhi.

Khái niệmChẩn đoán tình trạng phôi thai trước khi trẻ được sinh ra

Cơ sở: 

Mỗi con người hình thành đều nhận 50% vật chất di truyền 

từ bố và 50% vật chất di truyền từ mẹ. Trong quá trình phát triền  cá  thể,  con  người  luôn  chịu  tác  động  của  các  yếu  tố môi  trường  bao  gồm  yếu  tố  ngoại  cảnh  và  yếu  tố  cơ  thể. Một số yếu tố độc hại có thể gây các đột biết dẫn đến bệnh tật di truyền ở mức độ NST hoặc mức độ gen.  

Sinh thiết gai nhau thai

Các xét nghiệm khác từ tế bào phôi thai

SIÊU ÂM BÀO THAI

Xác định được một số khuyết 

tật  di  truyền  nhất  là  các 

trường hợp khuyết tật về hình 

thái  như:  một  số  tật  của  chi, 

sứt  môi,  hở  hàm,  vô  não, 

thoát  vị  não,  não  úng  thủy, 

tràn  dịch  não,  thoát  vị  rốn, 

thoát  vị  cơ  hoành,  dị 

dạng thận,  dị  tật  tim,  đa  ối, 

thiểu ối, thai chậm lớn

11-13  tuần,  thường  phát  hiện  được  dấu  hiệu  dày 

khoảng  sáng  sau  gáy.  Hygroma  Kystique  (dị  dạng 

bạch  mạch  dạng  nang)  là  triệu  chứng  khá  đặc  hiệu 

đầu  dày,  da  bụng  cũng  có  thể  dày.  Trường  hợp 

Hygroma  Kystique  lớn,  thai  nhi  có  tình  trạng  hết 

nước ối, việc chẩn đoán có thể bị bỏ qua hoặc nhầm 

lẫn

- Nếu người mẹ bỏ qua thăm khám siêu âm thời kỳ 

11-13  tuần,  những  thời  điểm  sau,  có  thể  quan  sát 

thấy  da  dày  ở  thai  nhi,  không  có  sống  mũi,  khoảng 

cách hai mắt xa nhau, dị  tật tim, và  chân  tay (đa dị 

Sàng lọc máu mẹ

Thời điểm

13 tuần 6 ngày tuổi ( tương ứng chiều dài

đầu mông thai nhi từ 45 – 84mm), tốt nhất 

vào tuần thai thứ 12

Mẹ bầu nên thực hiện từ tuần thai thứ 15 đến tuần thai 22, chính xác nhất là vào tuần thứ 16 - 18

Bộ chất xét

xuất từ nhau thai

• β-hCG tự do (FBC): Một thành phần trong cấu trúc của hCG (human chorionic 

gonadotropin)

• AFP (Alpha-fetoprotein): Một loại glycoprotein 

có nguồn gốc từ bào thai

• uE3 (Unconjugated estriol): Xuất hiện vào ngày thứ 8 của thai nhi

• β hCG (Beta human Chorionic Gonadotropin): Một loại steroid do nhau thai sản xuất

Tỷ lệ âm tính/dương tính giả 5%

Kết quả Double test

• Kết quả xét nghiệm Double test kết luận thai nhi có  nguy cơ cao hay thấp với hội chứng dị tật bẩm sinh.

• Xét nghiệm Double test nguy cơ thấp

Một  trong  hai  kết  quả  sau  khi  xét  nghiệm  được  dự  đoán  đó  là  thai  nhi  có  nguy  cơ  thấp  (ít  có  nguy  cơ  mắc hội chứng Down) dựa trên kết quả đo độ mờ da  gáy  <  3mm,  tỷ  lệ  bất  thường  ở  khoảng  21,1%.  Nếu  nguy cơ đã được hiệu chỉnh ≤ 1: 100 thì thai nhi được  xem như có nguy cơ thấp (âm tính).

• Xét nghiệm Double test nguy cơ cao

Nếu dựa vào kết quả đo độ mờ da gáy của thai nhi ở  khoảng  3,5  –  4,4mm,  tỷ  lệ  bất  thường  ở  khoảng  64,5%  trở  lên  thì  thai  nhi  được  xếp  vào  nhóm  nguy 

cơ  cao  với  hội  chứng  dị  tật  bẩm  sinh.  Nếu  nguy  cơ  được hiệu chỉnh ở khoảng ≥1: 100 thì thai được xem  như có nguy cơ cao (dương tính).

Kết quả Triple test

Hàm lượng AFP cao: Cho biết thai nhi

có nguy cơ mắc khuyết tật ống thần

kinh hoặc thiếu một phần não

Kết quả xét nghiệm Triple test được đánh giá dựa vào hàm lượng cao hoặc thấp của AFP, hCG, Estriol:

Hàm lượng AFP thấp: Cho biết những bất thường về lượng

hCG và estriol cho biết khả năng bào thai có thể mắc phải hội chứng Down (3 nhiễm sắc thể thứ 21) hoặc hội chứng Edward (3 nhiễm sắc thể thứ 18) và các bất thường về di truyền khác.

Những lưu ý khi thực hiện xét nghiệm Triple test

• Sau khi có kết quả xét nghiệm kết luận Triple test có nguy cơ cao, mẹ bầu thường được bác sĩ tư vấn

thực hiện chọc ối để có kết quả chính xác nhất về các hội chứng dị tật bẩm sinh được sàng lọc cho bé.

• Nếu kết quả của Triple test khác hoàn toàn với kết quả của Double test, mẹ bầu nên hỏi ý kiến bác sĩ để

có được những tư vấn kỹ lưỡng nhất về trường hợp này

• Kết quả của xét nghiệm Triple test chỉ mang tính tương đối, tỷ lệ âm tính giả và dương tính giả cao Rất

nhiều trường hợp kết quả Triple test dương tính nhưng trẻ sinh ra lại hoàn toàn bình thường Bên cạnh

đó, nhiều đơn vị thực hiện xét nghiệm lại có khả năng đưa ra những kết quả xét nghiệm khác nhau.

• Độ chính xác của Double test và Triple test chỉ ở khoảng hơn 80%, bởi vậy mẹ bầu nên lựa chọn cơ sở y

tế uy tín để thực hiện xét nghiệm cho kết được giảm thiểu sai số tối đa.

• Trong trường hợp thai đôi các chỉ số AFP (alpha fetoprotein), β-hCG (beta-human chorionic hCG (beta-hCG (beta-human chorionic human chorionic

gonadotropin) và estriol không liên hợp uE3 (unconjugated estriol) còn gọi là Estriol tự do (Free Estriol)

có thể tăng bất thường khiến cho việc chẩn đoán không chính xác Chính vì vậy, trong trường hợp mẹ bầu mang thai đôi thì tỷ lệ cho kết quả chính xác sẽ thấp hơn rất nhiều so với thai đơn.

• Người mẹ mang thai cần nhớ chính xác tuần tuổi thai, thực hiện Triple test đúng thời điểm để có được

kết quả chính xác nhất.

Xét nghiệm di truyền không xâm lấn

(NIPT - Non Invasive Prenatal Testing)

• NIPT (Non-Invasive Prenatal Test) là

phương pháp xét nghiệm trước sinh tiên tiến nhất trên thế giới, phân tích các ADN tự do của thai nhi tan trong máu mẹ bằng công nghệ giải trình tự Gen, từ đó phát hiện các bất thường NST ở thời điểm rất sớm với độ chính xác rất cao Bởi vì chỉ lấy máu mẹ, không cần chọc ối nên NIPT tuyệt đối an toàn cho mẹ và thai nhi

Quy trình xét

nghiệm

• Lấy 10 ml máu thai phụ

• Tách chiết DNA tự do trong máu thai phụ

• DNA tự do được giải trình tự

• Phân tích kết quả bằng thuật toán tin sinh, tính toán nguy cơ dị bội nhiễm sắc thể

• Kết quả NIPT : nguy cơ thấp thì tiếp tục theo dõi thai kì, nếu nguy cơ cao, phát hiện dị bội: làm NST đồ từ tế bào dịch ối

Chọc dò dịch ối

•Chọc ối là một xét nghiệm trước sinh giúp bác sĩ thu

thập những thông tin sức khỏe cần thiết của thai nhi từ một mẫu nước ối của người mẹ Mục đích của thủ thuật chọc ối là để xác định xem thai nhi của mẹ có nguy cơ mắc phải những rối loạn di truyền nhất định hoặc bất thường nhiễm sắc thể hay không.

Chọc dò ối thường được tiến hành vào tuần thứ 15 - 18

vì các lý do:

Trước tuần 15 dịch ối còn ít, ít tế bào bong vào nước ối,

có thể gây sẩy thai Sau tuần 15 tử cung đã

to, lượng dịch ối khoảng 100 - 180 ml nên việc lấy dịch ối

dễ dàng hơn, số tế bào sống bong ra từ bào thai

và màng ối lúc này cũng nhiều hơn, đủ để làm các xét nghiệm và nuôi cấy tế bào thành công Sau tuần 15 tần

số sẩy thai tự nhiên bắt đầu giảm, cũng thuận lợi hơn cho việc làm các thủ thuật như chọc dò dịch ối.

Tỷ lệ sẩy thai do chọc dò ối là 0,5 -hCG (beta-human chorionic 1%.

Quy trình chọc dò dịch ối

Đầu tiên, thai phụ nằm xuống với tư thế được chỉ

định và bác sĩ sẽ thực hiện siêu âm để xác định tư

thế của thai và tình trạng nhau thai

•Thông qua hình ảnh siêu âm, bác sĩ xác định được vị

trí chọc ối an toàn cho cả mẹ và bé Sau đó, bác sĩ sẽ

vệ sinh phần bụng của người mẹ với chất khử trùng

rồi bắt đầu tiêm thuốc tê tại chỗ qua da

•Tiếp theo, bác sĩ sẽ sử dụng một đầu tiêm dài và

mỏng để chọc vào vị trí đã khử trùng trước đó, rút

khoảng 15 - 20ml Quá trình rút nước ối mất khoảng

30 giây Mẫu nước ối này sau đó sẽ được kiểm tra

bằng các xét nghiệm chẩn đoán cần thiết

•Sau khi lấy nước ối, bác sĩ sẽ kiểm tra lại xem em bé

trong bụng mẹ vẫn khỏe mạnh hay không và có bị

ảnh hưởng gì sau khi chọc ối không

Sinh thiết tua nhau thai

•Xét nghiệm sinh thiết gai nhau hay sinh thiết gai nhau (CVS - Chorionic Villus Sampling) là thao tác kỹ thuật áp dụng trong sản khoa: lấy một mẫu tế bào là phần màng đệm bao bọc quanh phôi thai, còn gọi là gai nhau để tiến hành phân tích và tìm ra những bất thường nhiễm sắc thể

Nguy cơ sảy thai khoảng 1/500

QF – PCR  (QUANTITATIVE  FLUOR

ESCENT - POLYMERASE

CHAIN REACTION)

- QF PCR – PCR định lượng huỳnh quang là

một kĩ thuật PCR dùng để khuếch đại các

đoạn DNA ngắn đặc hiệu (STR), đánh dấu

bằng tín hiệu huỳnh quang và định lượng

bằng điện di mao quản

Quy trình thực hiện kỹ thuật QF-PCR

STR (Short Tandem

- STR được lựa chọn làm marker phải có mức độ dị hợp tử cao, kích thước trong khoảng 100 – 400 bp để phản ứng PCR được thực hiện hiệu quả

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phương pháp PCR cho phép khuếch

đại, tạo một số lượng rất lớn bản

sao của gen (hay một đoạn DNA)

trong một thời gian ngắn dựa trên

cơ sở tính chất biến tính, hồi tính

của DNA và nguyên lý tổng hợp

DNA.

DNA khuôn Nucleotide tự do Mồi: bao gồm mồi xuôi F và mồi ngược R

Enzyme DNA polymerase

Dung dịch đệm (buffer)

Thiết bị phản ứng PCR

=> Yếu tố cần thiết

Nguyên lý

chung: 

- PCR là một chuỗi phản ứng liên tục

gồm nhiều chu kì, sản phẩm tạo ra ở

chu kì trước lại được làm khuôn ở

chu kỳ kế tiếp nên số lượng bản sao

tạo thành tăng theo cấp số nhân

Nguyên tắc điện di: DNA là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, do đó trong môi trường có điện trường, các phân tử DNA có kích thước khác nhau di chuyển

từ cực âm sang cực dương với tốc độ khác nhau

=> Điện di mao quản là

• Hiển thị 3 đỉnh với tỉ lệ 1:1:1 (trisomy 3 alen)

• Hiển thị 2 đỉnh với tỉ lệ 2:1 (trisomy 2 alen)

* Nếu chỉ hiển thị duy nhất 1 đỉnh thì chưa kết luận được vì không xác định được số lượng alen

ANEUFAST KIT

- Bao gồm 6 set chỉ thị phân tử : S1, S2, M21, M13, M18, MXY

- Chuẩn bị cho phản ứng PCR

Kết quả của

thai nhi mắc

hội chứng DOWN

Đánh giá:

Ưu điểm

- Độ chính xác 100% trong phát

hiện các trường hợp lệch bội NST

hay gặp: Down, Edward, Patau

- Không đòi hỏi thời gian nuôi cấy

nên thời gian trả kết quả nhanh

- Chỉ cần 1 lượng ít tế bào ối

Nhược điểm

- Không phát hiện được bất thường về cấu trúc: đảo đoạn, chuyển đoạn; thể khảm

- Không phát hiện được mất đoạn NST có kích thước nhỏ hơn 2 Mb

MLPA PCR (Multiplex Ligation Probe Amplification)

Kỹ thuật khuếch đại các đoạn đầu dò phụ thuộc vào phản ứng nối

- Nguyên lý: sau khi mẫu DNA được biến tính, một

hỗn hợp các đoạn đầu dò (probe) của MLPA được

thêm vào mẫu Mỗi probe MLPA bao gồm hai

oligonucleotide gắn trực tiếp trên trình tự mục

tiêu Mỗi một probe trong probemix MLPA có chiều

dài khuếch đại duy nhất, thường dao động từ 130-500

nt Trong phản ứng PCR, tất cả các probe đã được

lai được khuếch đại đồng thời sử dụng cùng một cặp

mồi PCR Mồi PCR được đánh dấu huỳnh quang, cho

phép các sản phẩm khuyếch đại được phát hiện trong

phân tích đoạn bằng thiết bị điện di mao quản Chiều

cao tương đối của mỗi probe khi so sánh với chiều cao

tương đối của probe trong các mẫu DNA tham

chiếu khác nhau sẽ phản ánh số lượng bản sao tương

đối của các trình tự mục tiêu trong mẫu.

MLPA KIT – Hãng MRC (Hà Lan)

Giai đoạn Thành phần cần chuẩn bị Quy trình thực hiện

- Đưa các ống mẫu vào máy chu trình nhiệt (thermocycler)

- Biến tính DNA mẫu ở 98°C trong 5 phút, sau đó hạ nhiệt xuống 25°C

Phản ứng lai

(Hybridization reaction) - 1,5µl MLPA probe mix- 1,5µl MLPA buffer - Tiếp tục biến tính DNA mẫu ở 95°C trong 1 phút- Lai qua đêm (16-20 giờ) ở 60°C

Phản ứng nối

(Ligation reaction) -25µl nước siêu tinh khiết (ultrapurewater)

- 3µl SALSA ligase buffer A

- 3µl SALSA ligase buffer B

- 1µl SALSA ligase 65 enzyme

- Thực hiện phản ứng nối ở 54°C trong 15 phút

- Bất hoạt enzyme ligase ở 98°C trong 5 phút

+ Tổng hợp mạch mới ở 70°C trong 60 giây

- Sau phản ứng PCR, hạ nhiệt xuống 72°C trong 20 phút, rồi hạ tiếp xuống 15°C, phản ứng MLPA kết thúc

- Sản phẩm sau phản ứng được bảo quản ở 4°C tối đa trong 1 tuần

- Kết quả được thể hiện qua các đỉnh huỳnh quang,

mỗi đỉnh thể hiện sản phẩm khuếch đại của 1 đoạn

dò đặc hiệu

- Kết quả mẫu thí nghiệm được đem so sánh với

mẫu kiểm chứng, từ đó đưa ra kết luận

Mẫu kiểm chứng

Mẫu thí nghiệm

Hội chứng siêu nữ (XXX)

Đột biến dị hợp tử mất đoạn ASPA exon 1-6 Đột biến đồng hợp tử mất đoạn ASPA exon 1-6

- Phát hiện bất thường số lượng NST 13,18,21,X,Y

- Phát hiện đột biến mất đoạn, lặp đoạn : hội chứng DiGeorge, hội chứng Williams, teo cơ tủy (SMA)

- Phát hiện các đột biến điểm nhờ sự đặc hiệu của đầu dò

Phạm vi ứng dụng

Đánh giá:

Ưu điểm

- Phát hiện số lượng bản sao bất

thường lên đến 50 trình tự DNA

- Có khả năng phân biệt các trình tự

khác nhau chỉ trong 1 nucleotide

- Chỉ cần 1 lượng ít DNA mẫu

- Có thể phân tích đồng thời nhiều

mẫu, trả kết quả trong 24 giờ

- Trang thiết bị đơn giản (thiết bị PCR

và máy điện di)

FISH (FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION)

- Lai tại chỗ (in situ hybridization) là kỹ thuật lai DNA nhưng không cần tách chiết DNA

ra khỏi nhiễm sắc thể hoặc tế bào.

Kỹ thuật lai tại chỗ đánh dấu huỳnh quang

- Quy trình thực hiện: 

•Thu thập và xử lý mẫu

•Biến tính, lai DNA dò với DNA đích ngay trên tiêu bản

•Rửa mẫu để loại các đầu dò không được lai

•Phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang

• Sử dụng 1 trình tự ngắn đặc hiệu của chuỗi DNA sợi đơn (probe) đánh dấu huỳnh quang

để lai với NST kì giữa ( metaphase FISH) hoặc ở nhân tế bào ở gian kỳ (interphase FISH)

• Interphase FISH thường được dùng để phát hiện bất thường số lượng NST một cách

nhanh chóng

• Metaphase FISH thường dùng để xác định bất thường về cấu trúc NST.

mBAND FISH mFISH

- mFISH ( multicolor FISH)

Là phương pháp FISH mà mỗi NST được đánh dấu bằng 1 màu riêng biệt (nam – 24 màu; nữ - 23 màu)

- mBand FISH (multicolor banding FISH)

Là phương pháp FISH trong đó sử dụng nhiều băng màu cho phép xác định bất kỳ 1 thay đổi nào trên

vị trí băng của NST (đảo đoạn gần tâm, đảo đoạn quanh tâm)

Phân loại phương pháp FISH

+ DNA dò toàn bộ 1 NST: tập hợp những DNA dò nhỏ hơn, mỗi DNA dò nhỏ đó lai với

1 trình tự khác nhau dọc theo chiều dài của cùng 1 NST, dùng để phân biệt NST dựa vào màu sắc của chúng

Ly tâm dịch ối thu cặn tế bào

Ủ trypsin EDTA ở 37 độ C (10-20 phút)

Ly tâm thu cặn tế bào

Ly tâm thu cặn tế bào

Ủ KCl 0,56% ở 37 độ C (10-20 phút)

Cố định tế bào bằng carnoy

Nhỏ cặn để tạo tiêu bản, kiểm tra dưới kính hiển vi soi ngược

Nhỏ probe lên vùng lai (5µl)

Đánh giá:

- Phát hiện được đột biến mất

đoạn nhỏ

- Không đòi hỏi thời gian nuôi cấy

nên thời gian trả kết quả nhanh

-Đầu dò huỳnh quang thiết kế phức tạp

- Yêu cầu nhân công có trình

độ cao

Kỹ thuật karyotype

Khái niệm:

• Đây là kỹ thuật di truyền dựa trên NST

• Được phát hiện rất sớm khoảng đầu thế kỉ XX, xuất phát từ việc quan sát NST của tế bào thực vật

• Được sử dụng trong hầu hết các phòng di truyền tế bào học và được coi là một trong những phương pháp phân tích di truyền tế bào học truyền thống

• Là kỹ thuật phổ biến trong chẩn đoán di truyền trước sinh, trong quá trình lập karyotype có thể xác định luôn được giới tính thai nhi

Nguyên tắc

• Sử dụng tế bào trong dịch nước ối hoặc gai nhau thai làm tiêu bản quan sát bộ NST người ở kì giữa hoặc tiền kì giữa , chụp ảnh của một cụm NST để lập bộ nhiễm sắc thể ( sử dụng hệ thống vi tính kết nối với kính hiển vi) từ đó so sánh với karyotype chứng để phát hiện các bất thường của NST

Phạm vi

• Phát hiện các bất thường về cấu trúc : đảo đoạn ,mất đoạn,lặp đoạn, chuyển đoạn; số lượng NST: lệch bội, đa bội, từ đó phát hiện ra các bệnh : hội chứng Down, trisomy 18, tríomy 13, và các bệnh liên quan đến NST X, Y

• Phát hiện các dạng khảm có trong mẫu phân tích