Nghien cuu xay dung quy trinh xac dinh ham luong S-allyl L-cysstein va DADS trong toi den

Trên thế giới có rất nhiều phương pháp xác định SALC và DADS trong tỏi đen, do SALC là hợp chất có khả năng hấp thụ quang cũng như phát xạ quang, vì thế các phương pháp thường được sử dụ

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thu Hoa

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG S – ALLYL – L – CYSTEIN (SALC), DIALLY DISULFIDE (DADS) TRONG TỎI ĐEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

-

NGUYỄN THỊ THU HOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG S– ALLYL–L-CYSTEIN (SALC), DIALLY DISULFIDE (DADS) TRONG

TỎI ĐEN

Hà Nội - 2016

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ THU HOA

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG S–ALLYL–L–CYSTEIN (SALC), DIALLY DISULFIDE (DADS)

TRONG TỎI ĐEN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ THỊ HỒNG HẢO

Hà Nội - 2016

Trang 3

Nguyễn Thị Thu Hoa i Trường ĐHKH Tự nhiên

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Thị Hồng Hảo

đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm

An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu tại Viện

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Cao Công Khánh, ThS Vũ Thị Kim Oanh cùng toàn thể các anh chị trong khoa Nghiên cứu Thực phẩm, các anh chị trong Viện, đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình làm thực tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Thầy Cô giảng dạy tại Khoa Hóa học, đặc biệt các thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong môi trường khoa học, hiện đại

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và anh chị trong Bộ môn Hoá Phân tích đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu này

Hà Nội, tháng 12, năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hoa

Trang 4

Nguyễn Thị Thu Hoa ii Trường ĐHKH Tự nhiên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH/ ĐỒ THỊ vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ TỎI ĐEN 3

1.1.1 Khái quát chung về tỏi trắng 3

1.1.2 Khái quát chung về tỏi đen 4

1.1.3 Quá trình lên men tỏi thành tỏi đen 5

1.2 TỔNG QUAN VỀ S-ALLYL-L-CYSTEIN VÀ DIALLYL-DISULFIDE 6

1.2.1 Tổng quan về S-allyl-L-cystein 6

1.2.1.1 Cấu trúc và tính chất 6

1.2.1.2 Vai trò của SALC đối với sức khỏe con người 7

1.2.2 Tổng quan về diallyl disulfide (DADS) 9

1.2.2.1 Cấu trúc và tính chất 9

1.2.2.2 Tác dụng của DADS đối với sức khỏe con người 10

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH S-ALLYL-L-CYSTEIN VÀ DIALLYL DISULFIDE 11

1.3.1 Các phương pháp xác định SALC 11

1.3.1.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV 11

1.3.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang 13

1.3.1.3 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS 13

1.3.2 Các phương pháp xác định diallyl disulfide DADS 15

1.3.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV 15

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ (LC/MS/MS) 15

1.3.2.3 Sắc ký khí (GC) 16

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

Trang 5

Nguyễn Thị Thu Hoa iii Trường ĐHKH Tự nhiên

2.1 ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Mục tiêu ghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.1.3 Đối tượng 18

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Hóa chất 18

2.2.2 Dụng cụ phân tích 20

2.2.3 Thiết bị phân tích 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 21

2.3.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 22

2.4 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 23

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25

2.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ 25

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SALC TRONG TỎI ĐEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-PDA 27

3.1.1 Khảo sát điều kiện của phương pháp HPLC-PDA để xác định hàm lượng S-allyl-L-cystein 27

3.1.1.1 Lựa chọn điều kiện detector 27

3.1.1.2 Lựa chọn điều kiện phân tích S-allyl-L-cystein bằng phương pháp HPLC-PDA 28

3.1.1.3 Khảo sát điều kiện dẫn xuất hóa 28

3.1.1.4 Khảo sát chương trình rửa giải của pha động 31

3.1.2 Khảo sát điều kiện chiết mẫu 35

3.1.3 Thẩm định phương pháp phân tích 36

3.1.3.1 Độ đặc hiệu 36

3.1.3.2 Khoảng tuyến tính và lập phương trình đường chuẩn 38

Trang 6

Nguyễn Thị Thu Hoa iv Trường ĐHKH Tự nhiên

3.1.3.3 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 39

3.1.3.4 Độ lặp lại 40

3.1.3.5 Độ thu hồi 41

3.1.4 Áp dụng phân tích S-allyl-L-cystein trong một số mẫu thực tế 42

3.2 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG DADS TRONG TỎI ĐEN BẰNG GC - MS 44

3.2.1 Lựa chọn các điều kiện của phương pháp GC-MS để xác định hàm lượng DADS 44

3.2.1.1 Lựa chọn cột tách 44

3.2.1.2 Lựa chọn chương trình nhiệt độ cột tách 44

3.2.2 Khảo sát điều kiện chiết mẫu 45

3.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 46

3.2.3.1 Độ đặc hiệu 46

3.2.3.2 Xây dựng đường chuẩn 47

3.2.3.3 Giới hạn định lượng (LOQ) 48

3.2.3.4 Độ lặp lại 49

3.2.3.5 Độ thu hồi 50

3.2.4 Áp dụng phân tích một số mẫu thực tế 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC I

Trang 7

Nguyễn Thị Thu Hoa v Trường ĐHKH Tự nhiên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Độ hòa tan của 1g SALC trong các dung môi khác nhau và độ pH khác

nhau ở 200C 7

Bảng 3.1 Khảo sát số mM muối borat 29

Bảng 3.2 Khảo sát pH đệm borat 30

Bảng 3.3 Khảo sát thời gian dẫn xuất FMOC 31

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát SALC khi phân tích ở chế độ đẳng dòng 32

Bảng 3.5 Các chương trình dung môi gradient 33

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết methanol : nước 36

Bảng 3.7 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ SALC 38

Bảng 3.8 Độ lệch của từng điểm chuẩn SALC dùng xây dựng đường chuẩn 38

Bảng 3.9 Kết quả đo mẫu tỏi đen hàm lượng thấp 39

Bảng 3.10 Kết quả độ lặp lại khi phân tích hàm lượng SALC trong mẫu tỏi đen 40

Bảng 3.11 Bảng đối chiếu kết quả độ lặp lại của phương pháp HPLC-PDA để phân tích hàm lượng SALC trong tỏi đen theo AOAC 40

Bảng 3.12 Kết quả độ thu hồi khi phân tích hàm lượng SALC trong mẫu tỏi đen ở 3 mức nồng độ khác nhau 41

Bảng 3.13 Bảng đối chiếu kết quả độ thu hồi của phương pháp HPLC-PDA để phân tích hàm lượng SALC trong tỏi đen theo AOAC 41

Bảng 3.14 Kết quả phân tích hàm lượng SALC trong một số mẫu thực tế 43

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát tỉ lệ dung môi chiết ethanol, acetone và methanol 45

Bảng 3.16 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ DADS 47

Bảng 3.17 Độ lệch của từng điểm chuẩn DADS dùng xây dựng đường chuẩn 48

Bảng 3.18 Kết quả độ lặp lại khi phân tích hàm lượng DADS trong mẫu tỏi đen 49

Bảng 3.19 Bảng đối chiếu kết quả độ lặp lại của phương pháp GC-MS để phân tích hàm lượng DADS trong tỏi đen theo AOAC 50

Bảng 3.20 Kết quả độ thu hồi khi phân tích hàm lượng DADS trong mẫu tỏi đen 50 Bảng 3.21 Kết quả phân tích hàm lượng DADS trong một số mẫu thực tế 52

Trang 8

Nguyễn Thị Thu Hoa vi Trường ĐHKH Tự nhiên

DANH MỤC CÁC HÌNH/ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh củ tỏi trắng Lý Sơn 3

Hình 1.2 Hình ảnh sản phẩm tỏi đen sau khi lên men 5

Hình 1.3 Quy trình lên men tỏi đen 5

Hình 1.4 Công thức hóa học của S-allyl-L-cystein 6

Hình 1.5 Quá trình chuyển hóa γ-glutamyl-S-allylcystein thành SALC 7

Hình 1.6 Công thức hóa học của Diallyl disulfide 10

Hình 2.1 Hình ảnh hệ thống phân tích HPLC –PDA hãng Water để xác định hàm lượng SALC trong tỏi đen 21

Hình 2.2 Hình ảnh hệ thống phân tích GC-MS hãng Thermo để xác định hàm lượng DADS trong tỏi đen 22

Hình 3.1 Sắc đồ xác định SALC bằng HPLC – PDA với số mM muối borat là 20mM 29

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic SALC vào pH đệm borat bằng 8 30

Hình 3.3 Sắc đồ xác định SALC bằng HPLC-PDA với pH đệm borat 8 30

Hình 3.4 Sắc đồ xác định SALC khi khảo sát ở chế độ đẳng dòng với tỷ lệ dung môi CH3COONH4:ACN = 40:60, thời gian phân tích 40 phút 32

Hình 3.5 Sắc đồ xác định SALC khi khảo sát ở chế độ đẳng dòng với tỷ lệ dung môi CH3COONH4:ACN = 60:40, thời gian phân tích 40 phút 32

Hình 3.6 Sắc đồ chuẩn SALC 4µg/mL theo chương trình dung môi gradient 1 33

Hình 3.10: Sắc đồ xác định hàm lượng SALC trong mẫu tỏi đen khi phân tích trên hệ thống HPLC-PDA 35

Hình 3.11 Sắc đồ xác định SALC bằng phương pháp phân tích HPLC-PDA tỷ lệ dung môi chiết MeOH:H2O = 50:50 36

Hình 3.12 Sắc đồ của dung dịch chuẩn SALC 37

Trang 9

Nguyễn Thị Thu Hoa vii Trường ĐHKH Tự nhiên

Hình 3.13 Sắc đồ của dung dịch mẫu trắng 37

Hình 3.14 Sắc đồ của dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn SALC 37

Hình 3.15 Đường chuẩn của SALC 38

Hình 3.16 Quy trình tách và xác định hàm lượng SALC trong mẫu tỏi đen 42

Hình 3.17 Sắc đồ của dung dịch mẫu TĐ1 khi phân tích trên hệ thống HPLC-PDA 43

Hình 3.18 Sắc đồ xác định DADS khi chiết bằng dung môi MeOH 45

Hình 3.19 Sắc đồ của dung dịch chuẩn DADS 4,0 µg/mL 46

Hình 3.20 Phổ khối của dung dịch DADS 4,0 µg/mL khi phân tích trên hệ thống GC-MS 46

Hình 3.21 Đường chuẩn của DADS xác định bằng phương pháp GC-MS 47

Hình 3.22 Sắc đồ của DADS tại mức dưới định lượng 49

Hình 3.23 Quy trình tách và xử lý mẫu tỏi đen để phân tích hàm lượng DADS 51

Hình 3.24 Sắc đồ của dung dịch mẫu TD3-2996dvc khi phân tích trên hệ thống GC-MS 53

Trang 10

Nguyễn Thị Thu Hoa viii Trường ĐHKH Tự nhiên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS 2,2-azino-bis-(3-ethylbenozothiazoline-6-sulfonic acid)

Trang 11

Nguyễn Thị Thu Hoa 1 Trường ĐHKH Tự nhiên

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với sự tiến bộ của con người cùng với sự phát triển vượt bậc của ngành khoa học công nghệ đã tạo ra hàng loạt các dược phẩm có nguồn gốc nhân tạo với tính năng chữa bệnh rất công hiệu và mang lại kết quả rất nhanh chóng Nhưng đằng sau đó còn có những hạn chế, tác dụng phụ… gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Do vậy khuynh hướng quay về với thiên nhiên sử dụng những loài thực vật vừa có giá trị dinh dưỡng và dược tính chữa bệnh đang ngày càng được quan tâm Trong đó tỏi đen được xem là những loại thực vật hội đủ các nhu cầu thiết yếu của con người hơn hẳn các loại thực vật khác trong tự nhiên

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của tỏi đen [8, 9, 10, 15, 50] cho thấy: sau khi lên men, các hợp chất hữu cơ lưu huỳnh tan trong nước như S-allyl-L-cystein (SALC), alliin, isoalliin, methiin… và các hợp chất hữu cơ lưu huỳnh không tan trong các dung môi không phân cực như diallyl disulfide, diallyl trisulfide… Điều này làm cải thiện một số hoạt tính sinh học của tỏi đen như khả năng chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, ức chế tế bào ung thư [7, 8, 22, 23,24] Trong số các hợp chất chứa lưu huỳnh, S-allyl-L-cystein và diallyl disulfide là hoạt chất được chú ý nhiều nhất vì có nhiều hoạt tính có lợi cho sức khỏe con người Với mục đích

và ý nghĩa thực tiễn như thế thì việc kiểm soát chất lượng tỏi đen và các sản phẩm

từ tỏi đen sẽ giúp mọi người có được nguồn dinh dưỡng hợp lý, đủ về số lượng và đảm bảo về chất lượng

Trên thế giới có rất nhiều phương pháp xác định SALC và DADS trong tỏi đen, do SALC là hợp chất có khả năng hấp thụ quang cũng như phát xạ quang, vì thế các phương pháp thường được sử dụng để xác định SALC là HPLC-detector PDA,detector huỳnh quang (FLD), detector khối phổ (MS) và detector UV [15, 35,

41, 42, 43]; còn đối với hợp chất DADS, do tính chất dễ bay hơi và hàm lượng chất trong mẫu thấp nên phương pháp phân tích sử dụng phổ biến sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Ở Việt Nam, các nghiên cứu về SALC từ tỏi đen vẫn còn nhiều hạn chế, tại Học viện quân y 103 [1] đã có công trình công bố, tuy nhiên, nghiên cứu này còn

Trang 12

nhiều thiếu sót do còn ảnh hưởng khá nhiều của nền mẫu; còn đối với DADS chưa

có nghiên cứu cụ thể nào để phân tích hàm lượng DADS trong tỏi đen. Do đó, vấn đề đặt ra là tìm quy trình nghiên cứu để xác định hàm lượng SALC và DADS trong tỏi đen

Từ những lý do trên, chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy

trình xác định hàm lượng S-allyl-L-cystein (SALC), Diallyl disulfide (DADS) trong tỏi đen” với hai mục tiêu như sau:

1 Xây dựng quy trình định lượng S-allyl-L-cystein (SALC) trong tỏi đen bằng HPLC-PDA

2 Xây dựng quy trình định lượng Diallyl disulfide (DADS) trong tỏi đen bằng GC-MS

Trang 13

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ TỎI ĐEN

1.1.1 Khái quát chung về tỏi trắng

Tỏi (danh pháp hai phần: Allium sativum) là một loài thực vật thuộc họ

Hành Alliaceae [2], nghĩa là có họ hàng với hành tây, hành ta, hành tím, tỏi tây,

v.v Tỏi không chỉ đóng vai trò là một gia vị trong bữa ăn mà còn có tác dụng như một vị thuốc hữu hiệu với nhiều tác dụng

Hình 1.1 Hình ảnh củ tỏi trắng Lý Sơn

Tỏi được sử dụng rộng rãi như là một gia vị dùng cho thực phẩm và dược liệu quan trọng nhất trong nhiều thế kỉ Nó đã được trồng từ thời cổ đại, được sử dụng làm gia vị và hương liệu do các tiềm năng chữa bệnh Hoạt tính của tỏi phụ thuộc vào các hoạt chất của nó, đặc biệt là các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ – tạo vị cay nồng của tỏi Ngoài các hợp chất đó, hoạt tính của tỏi cũng được đặc trưng bởi các hoạt chất phenolic – tính dược lý và hàm lượng tương đối cao [29] Phần hay được sử dụng nhất của cả cây tỏi là củ tỏi, mà ta vẫn dùng làm gia vị Củ tỏi có nhiều tép Từng tép tỏi cũng như cả củ tỏi đều có lớp vỏ mỏng bảo vệ Tỏi sinh trưởng tốt trong môi trường nóng và ẩm

Tác dụng của tỏi: Hành khí, ôn trung, tiêu tích trệ, sát trùng, giải độc, trù trị, cảm cúm, ho gà, viêm phế quản, ăn uống tích trễ, thượng vị đau tức do đầy hơi, tiêu

chảy, mụn nhót, áp xe viêm tấy, hói trán, trị giun kim [4]

Tại Việt Nam có nhiều vùng đất trồng tỏi nổi tiếng như: Lý Sơn, Phan Rang và gần đây nhất là Bắc Giang

Trang 14

Trong những năm gần đây, tỏi đã được nghiên cứu nhiều bởi lợi ích của nó đối với sức khỏe con người: các tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư Do vậy, tỏi đã trở thành một trong những loại thực phẩm ngăn ngừa bệnh phổ biến nhất Mặc dù tỏi có rất nhiều lợi ích sức khỏe do hoạt chất allicin và các hoạt chất trong tỏi, nhưng nó còn hạn chế do đặc trưng mùi và gây đau bụng với những người mẫn cảm Vì vậy, các nghiên cứu gần đây tập trung vào phương pháp chế biến khác nhau như xử lý nhiệt, lão hóa và lên men để loại bỏ và cải thiện mùi hăng khó chịu của tỏi [40]

1.1.2 Khái quát chung về tỏi đen

Tỏi đen (black garlic) là sản phẩm lên men từ tỏi tươi (hay còn gọi là tỏi trắng) bằng cách gia nhiệt tỏi tươi ở nhiệt độ cao dưới sự kiểm soát độ ẩm trong hơn một tháng Hơn nữa, quá trình gia nhiệt thường được sử dụng trong sản xuất thực phẩm

Một trong những mục tiêu quan trọng nhất của quá trình gia nhiệt để nâng cao chất lượng thực phẩm, giúp ngon miệng, thay đổi màu sắc, hương liệu và kết cấu trong thực phẩm Ngoài ra, quá trình làm nóng dẫn đến sự hình thành các hoạt chất sinh học mới do quá trình chuyển hóa của một số hoạt chất [29]

Tỏi đen có ở Việt Nam cách đây khoảng 3 năm, đầu tiên do tiến sĩ Vũ Bình Dương nghiên cứu đề tài về ứng dụng lên men tỏi đen từ tỏi Lý Sơn, Việt Nam Và được sản xuất thử nghiệm thành công Sau đó được các trung tâm nghiên cứu, các doanh nghiệp phát triển sản xuất và bán phổ biến rộng rãi trong cả nước, đặc biệt thị trường ở thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội do được quảng bá rộng về công dụng vượt trội cho sức khỏe nên đã được đón nhận và tiêu thụ khá mạnh [8, 9,10]

Hoạt chất S-allyl cysteine là hoạt chất rất có lợi cho cơ thể chống lại bệnh ung thư [43], ngoài ra diallyl disulfide và diallyl trisulfide tác dụng hạ huyết áp, hạ cholesterol [48] Với các hoạt chất này, sau khi sử dụng cơ thể chuột đã giảm thiểu ảnh hưởng của tia xạ tới các cơ quan như cơ quan miễn dịch, hệ thống võng nội bộ Mật độ tế bào tại hạch, lách, tuyến ức và tủy xương dày đặc hơn, ít bị tổn thương hơn ở nhóm chuột bị chiếu xạ không uống tỏi hoặc uống tỏi thường Đây là minh chứng cho khả năng bảo veeh các tế bào miễn dịch của tỏi đen dưới tác động của tia

xạ [10]

Trang 15

Hình 1.2 Hình ảnh sản phẩm tỏi đen sau khi lên men

1.1.3 Quá trình lên men tỏi thành tỏi đen

Trong quá trình lên men sẽ xảy ra phản ứng chuyển hoá các hợp chất chứa lưu huỳnh như methionin, cystein, methanethiol thành những hợp chất mới chứa lưu huỳnh tan được trong nước như S-allyl-L-cystein alliin, isoalliin, methionin, cycloalliin, các dẫn chất của cysteine, dẫn chất tetrahydro-β-carboline Đây là những hợp chất quan trọng làm tăng tác dụng của sản phẩm tỏi đen thu được Quy trình lên men tự nhiên cũng làm cho hàm lượng carbohydrate tăng từ 28,7% (trong tỏi) lên tới 47,9% (trong tỏi đen), nhờ đó tỏi đen có vị ngọt của trái cây Vì trong thành phần tỏi có chứa đường và acid amin, sau khi trải qua quá trình lên men sẽ tạo

ra melanoidin, một chất có màu sẫm đen Do đó tỏi sau khi lên men tự nhiên (không dùng hóa chất) lại chuyển thành màu đen, vị ngọt, không còn mùi cay, hăng của tỏi thông thường [45] Sơ đồ quy trình lên men tỏi tạo tỏi đen như hình 1.3 [5]

Hình 1.3 Quy trình lên men tỏi đen

Thành phần tỏi có chứa đường và acid amin, sau khi trải qua quá trình lên men sẽ tạo ra melanoidin, một chất có màu sẫm đen làm sản phẩm có màu đen

Tỏi tươi Chọn lọc, phân loại làm sạch Xử lý, Ủ nhiệt, lên men Thu tỏi đen

Kiểm tra, chất lượng tỏi Đóng gói,

bảo quản

Trang 16

1.2 TỔNG QUAN VỀ S-ALLYL-L-CYSTEIN VÀ DIALLYL-DISULFIDE 1.2.1 Tổng quan về S-allyl-L-cystein

S-allyl-L-cystein (SALC) là một acid amin chứa lưu huỳnh được tìm thấy trong dịch chiết tỏi đã lên men [47], hợp chất chiếm hàm lượng nhiều nhất Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các hoạt động chống oxy hóa của tỏi đen và SALC ở thí nghiệm trong ống nghiệm (in vivo) – trong các mô hình thí nghiệm động vật liên quan về mất cân bằng oxi hóa và thí nghiệm trên tế bào (in vitro) – tác giả đã sử dụng một vài phương pháp để loại bỏ một số phản ứng oxi hóa đặc biệt và làm giảm các ảnh hưởng của quá trình oxy hóa Xuất phát từ những thực nghiệm đó, tác dụng bảo vệ của tỏi đen và SALC để ngăn ngừa và cải thiện sự mất cân bằng oxy hóa

[14]

1.2.1.1 Cấu trúc và tính chất

SALC được mô tả với các khái niệm khác nhau như S-allylcystein, deoxyalliin Phần hoạt động mạnh nhất của phân tử SALC là liên kết -C-S- trong phân tử Đây là một liên kết hoạt động nó mang đến cho SALC những hoạt tính sinh học cao

Hình 1.4 Công thức hóa học của S-allyl-L-cystein

Danh pháp IUPAC: (R)-3-(Allylthio)-2-aminopropanoic acid

và cộng sự cho thấy khả năng hòa tan khác nhau của SALC trong các dung môi

Trang 17

phân cực như nước, methanol, acetonitrile… và tại các độ pH khác nhau (Bảng 1.1) [50]

S

COOHHN

O

NH2

NH2COOH

Hình 1.5 Quá trình chuyển hóa γ-glutamyl-S-allylcystein thành SALC

SALC là một hợp chất hữu cơ tương đối bền, không bị thay đổi tính chất, cấu trúc trong dịch chiết tỏi khoảng 2 năm [31] Mặc dù sau một thời gian lưu trữ mẫu

có sự thay đổi nhỏ về màu sắc chuyển từ màu trắng sang màu vàng nhạt, nhưng không xảy ra sự chuyển đổi hoặc phân hủy ra chất khác

Bảng 1.1 Độ hòa tan của 1g SALC trong các dung môi khác nhau và độ pH khác

1.2.1.2 Vai trò của SALC đối với sức khỏe con người

- Giảm lượng đường huyết trong máu

Trong nghiên cứu để đánh giá tác động của SALC trong đường huyết và hệ thống miễn dịch tuyến tụy trên cơ thể chuột bị bệnh tiểu đường chỉ ra rằng hàm

γ-glutamyltransferase

Trang 18

lượng glucose, TBARS và các enzyme chống oxy hóa đã bị biến đổi trong cơ thể chuột mắc bệnh tiểu đường Những thay đổi này đã ở mức độ gần như kiểm soát được sau khi sử dụng SALC Tác dụng chữa bệnh đái tháo đường và chống oxy hóa được so sánh với glyclazide – một loại thuốc hạ đường huyết đặc hiệu [23]

- Ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư CWR22R, điều trị ung thư

tuyến tiền liệt [39]

- Giảm kích thước của mảng xơ vữa động mạch vàng, điều trị nhồi máu cơ

tim [44]

- SALC cũng có hoạt tính chống oxy hóa cao về khả năng loại bỏ gốc tự

do, tiền chất oxy hóa, kích thích sự hoạt động của enzyme chống oxy hóa, ức chế enzyme oxy hóa và các hiệu ứng chelating tham gia vào các hoạt động bảo vệ của dịch chiết tỏi và SALC, qua đó nhấn mạnh tiềm năng sử dụng như tác nhân điều trị

[14, 22]

- Đối với những người mắc bệnh tiểu đường thì SALC giúp điều trị và bảo

vệ chống lại do bị thiếu isulin làm cho quá trình vận chuyển glucose không được đưa đi đến các tế bào, kết quả là lượng đường glucose trong máu tăng cao

Theo J Trace Elem Med Biology (2013) cho biết, kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học tại Trung tâm Công nghệ Sinh học, Trường Cao đẳng Nghệ thuật và Khoa học [24] đã chỉ ra rằng SALC có tác dụng bảo vệ chống lại bệnh tiểu đường phát triển do SALC chứa amino acid làm gia tăng một loại protein đặc hiệu vận chuyển sắt để phá hủy tế bào beta sản xuất insulin Ngoài ra, nghiên cứu mới cho thấy rằng những con chuột không có cơ chế vận chuyển sắt này sẽ được bảo vệ chống lại bệnh tiểu đường phát triển

- Giảm hàm lượng choresterol, giảm mỡ máu, giúp chống nguy cơ bị béo phì [18]

- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư gan , điều trị ung thư gan [30]

- Giảm tổn thương não liên quan đến quá trình mất cân bằng oxi hóa sau khi bị tắc động mạch não trung (MCAO) Kết quả cho thấy rằng SALC làm giảm đáng kể tình trạng thiếu máu não (gồm vùng nhồi máu thực sự và vùng nguy cơ

Trang 19

nhồi máu) và chảy máu não, chống lại quá trình oxi hóa và ngăn chặn các tổn hại đến tế bào thần kinh [36]

Ngoài ra, SALC còn được biết đến với các tác dụng điều trị ung thư trực tràng, ung thư biểu mô [21] và bệnh lý Alzheimer [16]

Năm 2010, tác giả Danna Wang và cộng sự [19] đã thực hiện thí nghiệm ảnh hưởng của dịch chiết tỏi đen đến hệ thống miễn dịch của cơ thể trên chuột và thấy rằng việc tăng cường hệ thống miễn dịch trên chuột là do hàm lượng S-allyl-L-cystein – làm giảm đáng kể các tế bào gây ung thư kết trực tràng cũng như số lượng các tế bào ruột già tiền ung thư

1.2.2 Tổng quan về diallyl disulfide (DADS)

Cystein là một tiền chất quan trọng của các hợp chất lưu huỳnh hữu cơ trong tỏi đen, chẳng hạn S-methyl-L-cysteine sulphoxide (methiin) và S-allyl-L-cysteine sulphoxide (alline) – là những hợp chất thơm chứa nhiều gốc cysteine Sau khi tiến hành xử lý mẫu như cắt, nghiền hoặc loại nước, các hợp chất này sẽ bị phân hủy thành các hợp chất dễ bay hơi khác, bao gồm diallyl sulfide, diallyl disulfide, diallyl trisulfide, thorne và ajoene [45]

Tác giả Michael và cộng sự cũng cho thấy rằng, DADS là một hợp chất hữu

cơ chứa lưu huỳnh, dễ bay hơi và rất hoạt động trong tỏi đã chưng cất Ngoài ra, nó còn tạo mùi đặc trưng cho tinh dầu tỏi [34] Hoạt chất DADS là hoạt chất rất có lợi cho cơ thể chống lại bệnh ung thư, giảm lượng cholesterol trong máu, hạ huyết áp [32] Đây là một trong những hợp chất quan trọng nhất tạo nên tác dụng thần kỳ cho tỏi đen và các sản phẩm từ tỏi đen

1.2.2.1 Cấu trúc và tính chất

Về mặt cấu trúc, trong phân tử DADS chứa liên kết lưu huỳnh (-S-S-) (Hình 1.6) nên nó hoạt động hơn so với các hợp chất lưu huỳnh khác như diallyl sulfide (DAS), allyl methyl disulfide (AMDS), allyl methyl trisulfide (AMTS)… trong quá trình cảm ứng của các enzyme giải độc mà không ức chế hoạt động của nó, cho thấy tầm quan trọng của nhóm sulfide với hợp chất chứa lưu huỳnh [38]

Trang 20

S2

Hình 1.6 Công thức hóa học của Diallyl disulfide

Danh pháp IUPAC: 3-[(Prop-2-en-1-yl) disulfanyl]prop-1-ene

Công thức hóa học: C6H10S2 Khối lượng phân tử: 146,28 g/mol

Khối lượng riêng: 1,01 g/cm3

Điểm sôi: 1800C

Diallyl disulfide (DADS) được hình thành từ quá trình chuyển hóa của Allicin [39] DADS là chất lỏng màu vàng nhạt, dễ bay hơi, mùi đặc trưng Là chất

ít phân cực nên dễ tan trong các dung môi ít phân cực như methanol, cồn 960C…

1.2.2.2 Tác dụng của DADS đối với sức khỏe con người

- Ức chế sự tăng trưởng và tồn tại của tế bào ung thư dạ dày AGS, hỗ trợ điều trị bệnh ung thư dạ dày

Theo nghiên cứu về đánh giá tác động của DADS với sự gia tăng của tế bào ung thư dạ dày AGS – được điều trị với các nồng độ khác nhau tại Khoa Ngoại, Bệnh viện Halsol đã cho thấy rằng DADS gây ra ức chế sự tăng trưởng và tồn tại của tế bào ung thư dạ dày phụ thuộc vào liều lượng Nhưng mối quan hệ việc chống tăng sinh và thay đổi cấu trúc tế bào ung thư vẫn chưa tỷ lệ thuận với nồng độ DADS [26]

- DADS và ung thư đại tràng

Như kết quả nghiên cứu của tác giả Yang JS cùng cộng sự của mình về tác động của DADS việc chặn chu kỳ tế bào và apotosis (sự tự hủy diệt tế bào) trong dòng tế bào ung thư đại tràng COLO 205 cho thấy rằng sau khi điều trị 24 tiếng, tế bào bị apotosis bị phá vỡ [25]

- Ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư vú [13]

- DADS cũng được xem như là một hoạt chất kháng tiểu cầu, ức chế sự

hình thành của tiểu cầu thromboxane trong điều trị bệnh động mạch vành [11]

Trang 21

- Chất ức chế men khử 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A Men này xúc tác phản ứng chuyển 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A thành mevalonate trong quá trình tổng hợp cholesterol, làm giảm lượng cholesterol huyết

tương và trong gan [37]

- DADS có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh như Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157:H7, Listeria

monocytogenes, Staphyllococcus aureus và Campylobacter jejuni [33]

1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CYSTEIN VÀ DIALLYL DISULFIDE

S-ALLYL-L-1.3.1 Các phương pháp xác định SALC

Những nghiên cứu tách và xác định S-allyl-L-cystein (SALC) trên thế giới

đã có số lượng lớn các bài báo công bố với các quy trình tách và xác định SALC [14, 15, 16, 22, 35, 41, 42, 43]

Do SALC là một acid amin tương đối bền, không bị thay đổi tính chất, cấu trúc trong thời gian dài và có hàm lượng cao trong dịch chiết tỏi nên thường chỉ có HPLC được sử dụng rộng rãi để phân tích hàm lượng SALC với các detector khác nhau Trong đó có 3 phương pháp chính là HPLC-UV, HPLC-FLD, HPLC-MS

Hiện nay, tỏi đen chỉ được nghiên cứu tại Học viện Quân y quy mô cấp nhà nước Theo chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu định lượng S-allyl-L-cystein trong tỏi đen Lý sơn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, tác giả Chử Văn Mến đã cho biết hàm lượng SALC trong tỏi đen Lý Sơn thay đổi theo thời gian lên men và đạt cao nhất sau 35 ngày [1]

1.3.1.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV

Chử Văn Mến và các cộng sự đã ứng dụng và phát triển phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao gắn với detector UV để xác định hàm lượng S-allyl-L-cystein trong tỏi đen Lý Sơn Mẫu thử được chuẩn bị bằng cách cân chính xác 30g mẫu tỏi, nghiền nhỏ, cho vào bình nón định mức 100mL, thêm 100mL nước cất hai lần, chiết siêu âm trong 90 phút ở 400C, lọc qua màng lọc 0,45µm, dịch lọc được dùng để tiêm mẫu Điều kiện phân tích sắc ký được tối ưu hóa bằng cột C18, pha động gồm hai kênh dung dịch acid phosphoric 0,1% trong nước và acetonitrile với chương

Trang 22

trình gradient, bước sóng hấp thu đo ở 210nm, thể tích tiêm mẫu là 10μl Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác, độ đúng cao, giới hạn phát hiện thấp và giới hạn định lượng của SALC là 28,21 ng/mL

0 phút – 95%A, 15 phút - 95%A, 18 phút -100% B, 20 phút – 95% A Thời gian đo trong 20 phút Đường tuyến tính tốt (R2 = 0,9994 > 0,999) Hàm lượng SALC:

522,51±1,19 µg/mL Phương pháp này có độ thu hồi tương đối cao >99%

Tác giả Arnault và cộng sự [15] đã phát triển phương pháp HPLC với

detetector UV để xác định S-allyl-L-cystein (SALC) trong tỏi đen Mẫu được chiết lặp 2 lần bằng nước tại nhiệt độ 700C, thời gian chiết 3-5h/1 lần chiết, loại cặn bằng giấy lọc có kích thước lỗ 0,5mm Dịch lọc được bơm vào hệ thống HPLC-UV: cột Hypurity Elite C18 (150×3mm; 3µm), pha động bao gồm kênh A: 20 mmol/L sodium dihydrogenphosphate và 10 mmol/L hepta-nesulfonic acid trong nước, pH 2,1 (điều chỉnh bằng orthophosphoric acid 850 mL/L); kênh B chứa dung dịch rửa giải kênh A trộn với acetonitrile với tỷ lệ 1:1 (v/v) theo chương trình gradient Detector UV tại bước sóng phát hiện là 208nm, thời gian phân tích mẫu khoảng 50 phút Giới hạn phát hiện của phương pháp là 29,67 µg/mL cao hơn so với thí nghiệm của tác giả Mun-su Kim, nhưng thời gian phân tích tương đối dài

Nhìn chung, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV đều sử dụng cột C18 để tiến hành tách chất, dung môi – hóa chất thông dụng nên tiết kiệm chi phí sử dụng Tuy nhiên, bước sóng phát hiện không đặc hiệu thường bị nhiễu bởi pic các tạp chất khác nên khó phát hiện SALC Bên cạnh đó, giới hạn phát hiện của phương pháp không cao và thời gian phân tích tương đối lâu

Trang 23

1.3.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang

Năm 2012, Sang Eun Bae và các cộng sự [43] đã phát triển và thẩm định phương pháp xác định SALC trong tỏi đen Mẫu tỏi được dẫn xuất với AQC khi phân tích bằng HPLC được chuẩn bị như sau lấy khoảng 20mL dịch chiết tỏi thêm vào 100mL thuốc thử AccQ-Flour (khoảng 10mM AccQ-Flour trong acetonitrile) rồi tiến hành lắc Votex trong vài giây Tiến hành gia nhiệt ở máy ổn nhiệt tại 550

C, lắc 15 phút rồi tiêm 20µL vào hệ thống HPLC Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng với cột C18 AccQ-Tag (150mm x 3,9mm x 0,4µm), nhiệt độ cột 370C, tốc độ dòng 1mL/phút Detector huỳnh quang được thiết lập bước sóng kích thích là 250nm và bước sóng phát xạ là 395nm Chương trình gradient tuyến tính với pha động A: 100 mL/L AccQ-Tag (sodium acetate (CH3COONa) 140 mmol/L, triethylamine 17 mmol/L, calcium disodium EDTA 1 mmol/L, pH 5,05) và pha động B: hỗn hợp acetonitrile và nước (theo tỷ lệ 3:2 về thể tích); A: 95-5, 70-30, 0-100, 95-5, 95-5 được sử dụng tương ứng ở các khoảng 0-20 phút, 20-25 phút, 25-27 phút, 27-32 phút Hệ thống cho phép tách chất chiết thô trong khoảng 32 phút Hệ số biến thiên (CV%) 7,08 – 7,90%, giới hạn phát hiện là 6,28 µg/mL

Trong phân tích SALC, so với phương pháp HPLC-UVD khi sử dụng phương pháp HPLC-FLD có LOD, LOQ lớn hơn xấp xỉ bốn lần so với phương pháp HPLC-UV Những kết quả này liên quan đến độ nhạy của phương pháp hay nói cách khác, HPLC-UV có độ nhạy và độ phân giải thấp hơn so với HPLC-FLD

Độ chụm và độ chính xác của phương pháp phân tích tác giả pha các mẫu tự tạo đã biết trước hàm lượng và làm thí nghiệm để tìm giá trị trung bình Hệ số biến thiên (%CV) của SAC xấp xỉ 6,70 – 9,37 % (HPLC-UV), trong khi đó với phương pháp HPLC-FLD hệ số biến thiên 1,22- 1,67% Theo Thông tư ICH Q2 (R1) (1995, 1997), độ chụm chuẩn có CV%<2%, do đó việc %CV thấp phản ánh độ chính xác của phương pháp phân tích [43]

1.3.1.3 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS

Tác giả Sanghee Lee và cộng sự [42] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ (LC-MS/MS) để xác định S-allyl-L-cystein từ tỏi Mẫu được đồng nhất, chiết lỏng lỏng bằng methanol S-allyl-L-

Trang 24

cystein được tách và xác định bằng LC-MS/MS, chế độ bắt đa mảnh phổ (Multiple Reaction Monitoring: MRM): thế declustering: 122V, thế entrance 10V và năng lượng va chạm 53V, thế mao quản 5500V, GS1 và GS2: 50 psi, nhiệt độ 500C Điều kiện sắc ký lỏng: cột C18 Zorbax Eclipse XDB (50 mm x2,1 mm, 1,8 mm), tốc độ dòng chảy 0,2 mL/phút Pha động bao gồm kênh A (dung dịch 0,1% formic acid trong 20mM ammoniuom acetate (pH 3,5)) và kênh B (0,1% formic acid trong ACN); phân tích theo chương trình giải gradient: 40% B (0 phút), 100% B(6 phút), 100% B (8 phút), 40% B (8,5 phút) Kết quả thu được khối lượng phân tử ion (m/z)

là 395 (M + H)+, ion (m/z) 170, ion chính (m/z) 157 là dẫn xuất của SALC Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,02 µg/mL

Tác giả Sanghee Lee và cộng sự [41] đã phát triển phương pháp MS/MS sử dụng cột trao đổi ion SALC được tách và xác định bằng hệ thống sắc ký lỏng LC kết hợp thiết bị khối phổ QTRAP với nguồn ion hóa TurbolonSpray: GS1: 50psi, GS2: 30 psi, nhiệt độ probe: 5500C, thế mao quản 5000V Điều kiện sắc ký lỏng: cột CAPCELL PAK CR 1:4 (100 x 2,0 mm, 3 µm) Pha động: kênh A (2mM đệm ammonium acetate (pH =3,5)) và kênh B (0,1% formic acid trong ACN), tốc

LC-ESI-độ dòng 0,15 mL/phút Kết quả phát hiện được mảnh m/z 162,0 – 145,0 của SALC Đường cong chuẩn của SALC (r2

=0,999) từ 5 đến 2500 ng/mL Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5,0 ng/mL Khi tiến hành phân tách SALC, tác giả đã sử dụng cột trao đổi ion thay vì cột C18 như các nghiên cứu phía trên Đây là kỹ thuật mới, đòi hỏi người thực hiện phải có những hiểu biết nhất định và tốn kém

Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS sử dụng thiết bị hiện đại, tương đối đắt tiền nên không được trang bị nhiều trong các phòng thí nghiệm Mặt khác, vận hành thiết bị đòi hỏi kỹ thuật viên phải có kỹ thuật nhất định, hiệu quả không cao

Sau khi nghiên cứu các tài liệu thế giới, chúng tôi nhận thấy rằng hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng dịch chiết là nước do S-allyl-L-cystein tan trong nước và đây là dung môi không độc, giảm chi phí thí nghiệm Ngoài ra, cột C18 cũng được

đề cập và tiến hành trong các thí nghiệm Trong các phương pháp đã nghiên cứu, hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC được sử dụng tương đối nhiều Hệ thống

Trang 25

HPLC-FLD cho độ nhạy và hiệu suất cao nhưng tính áp dụng thực tiễn không cao

do số lượng hệ thống HPLC ghép nối FLD được trang bị ít hơn so với detector PDA nên sắc ký lỏng ghép nối detector PDA là tiền đề để nghiên cứu sau này

1.3.2 Các phương pháp xác định diallyl disulfide DADS

1.3.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV

Năm 2010, Tác giả Mun-su Kim và các cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV để phân tích hàm lượng diallyl disulfide (DADS) từ tỏi đen [35], thủy phân mẫu phân tích tại nhiệt độ phòng và chiết bằng methanol Sử dụng hệ thống sắc ký lỏng pha thuận C18 (3,9mm×150mm, 4µm), tốc

độ dòng: 1mL/phút Detector UV được thiết lập bước sóng phát hiện là 210nm Một gradient rửa giải gồm nước (kênh A), methanol (kênh B) đã được sử dụng để tách DADS Hàm lượng DADS là: 8,710 ± 0,45 µg/mL

Trong phương pháp phân tích này, tác giả đã tiến hành thủy phân mẫu bằng cách đơn giản, hóa chất thông dụng, dễ mua, chi phí giá thành thấp tuy nhiên dung môi chiết MeOH hòa tan nhiều tạp chất khác gây ảnh hưởng lớn đến dung môi phân tích Mặt khác giới hạn phát hiện của phương pháp chưa cao nên tính áp dụng thực tiễn thấp

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ (LC/MS/MS)

Jiben Roy và các cộng sự [27] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng khối phổ chuỗi để xác định hàm lượng diallyl disulfide trong tỏi đen Nghiên cứu này cũng có giai đoạn thủy phân mẫu trong hỗn hợp nước và methanol (tỷ lệ 1:1 về thể tích), tốc độ ly tâm 2000 vòng/phút và lọc qua giấy lọc có kích thước lỗ lọc 0,2 μm Sau đó, mẫu được bơm vào hệ thống sắc ký lỏng khối phổ chuỗi, detector MS-MS Trong nghiên cứu, tác giả đã sử dụng Cột Econosphere C-18 (10m, 250 mm x 10mm) và hệ dung môi pha động H2O:MeOH (1:1), tốc độ dòng 3 mL/phút Thu được các mảng m/z: 41, 39, 81, 146(M+H)+, 105, 113 Các tác giả vẫn sử dụng cột C-18 để tách chất, dung môi phân tích pha động dễ kiếm Tuy nhiên, phương pháp này sử dụng thiết bị hiện đại, chi phí tương đối cao và hệ thống còn tương đối ít trong các phòng thí nghiệm nên tính khả năng triển khai thực tế khó khăn

Trang 26

1.3.2.3 Sắc ký khí (GC)

Năm 2013, Cathy J Watson và cộng sự đã phân tích DADS trong tỏi bằng phương pháp sắc ký khí với detector khối phổ (GC-MS) Sử dụng cột 30m, kích thước cột mao quản: đường kính 250 µm, bề dày lớp film của pha pha tĩnh 0,25 µm Các thông số nhiệt độ được cài đặt: chương trình lò ở 200C giữ trong 2 phút, rồi tăng lên đến 2000C cứ tăng 100C/phút , tiếp tục tăng 350C/phút đến 3000C giữ nhiệt

độ này trong 1 phút Tổng thời gian phân tích 27,85 phút Khoảng quét từ 30-300 amu, tốc độ quét: 15,26 scan/giây Nguồn ion hóa là 70eV Khoảng tuyến tính DADS là 0,5 – 50 µg/mL [17]

Năm 2014, Sung-Jin Lim và cộng sự đã sử dụng sắc khí khí với detector ion hóa ngọn lửa để xác định ba hợp chất lưu huỳnh hữu cơ là dimethyl disulfide, diallyl disulfide và diallyl trisulfide trong thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học từ dịch chiết tỏi Sau khi tách từ thuốc bảo vệ thực vật bằng cách chiết lỏng lỏng với cột chiết pha rắn HLB và cột chiết pha rắn ENVI-Carb, tất cả các chất phân tích được tách ra trên cột RTX-5 (30mx 250mm x250mm, RESTEK, Pennsylvania, Mỹ); dòng Heli (99,999%, 3 mL/phút); nhiệt độ cột ban đầu ở 400C giữ trong 8 phút, 50C phút-1, 600C, 150C phút-1, 2300C (giữ trong 1 phút); nhiệt độ detector,

3000C; và thể tích tiêm 1 µL Giới hạn định lượng của DADS là 0,063 mg/L Độ thu hồi DADS đạt 84,8±1,9% [46]

Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy và độ chính xác cao phù hợp với chất dễ bay hơi và phân hủy như DADS Bên cạnh đó, DADS là chất dễ bị phân hủy, hàm lượng trong mẫu thấp nên khi sử dụng hệ thống GC ghép nối với detector khối phổ cho kết quả chính xác hơn, tính đặc hiệu và hiệu suất cao hơn so với các loại detector khác Vì vậy, phương pháp này được đề xuất để xác định hàm lượng DADS trong tỏi đen

Hiện nay tại Việt Nam chưa có phương pháp tiêu chuẩn, trong khi việc sử dụng tỏi đen lại phát triển nhanh chóng, không có biện pháp kiểm tra chất lượng hữu hiệu, do đó nhu cầu xây dựng phát triển và phương pháp là cần thiết Việc xây dựng phương pháp xác định S-allyl-L-cystein bằng HPLC-PDA và diallyl disulfide bằng GC-MS với các bước thực hiện nhanh gọn, kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản, dễ thực hiện sẽ tạo thuận lợi cho việc áp dụng tại các phòng thí nghiệm trong cả nước,

Trang 27

Nguyễn Thị Thu Hoa 17 Trường ĐHKH Tự nhiên đặc biệt là các trung tâm kiểm nghiệm tuyến địa phương phục vụ tốt công tác kiểm nghiệm thực phẩm nói chung

Trang 28

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Mục tiêu ghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là:

1 Xây dựng quy trình định lượng S-allyl-L-cystein (SALC) trong tỏi đen bằng HPLC-PDA

2 Xây dựng quy trình định lượng Diallyl disulfide (DADS) trong tỏi đen bằng GC-MS

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm :

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định hàm lượng SALC trong tỏi đen bằng HPLC

- Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu để xác định hàm lượng DADS trong tỏi đen bằng GC-MS

- Đánh giá phương pháp phân tích: độ đặc hiệu phương pháp, khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ thu hồi, độ lặp lại

- Áp dụng để phân tích hàm lượng SALC và DADS trong mẫu tỏi đen và các sản phẩm từ tỏi đen

2.1.3 Đối tượng

- Đối tượng mẫu: Tỏi đen và các sản phẩm làm từ tỏi đen được lấy ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội

- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

- Địa điểm: trên địa bàn nội thành Hà Nội

- Khối lượng mẫu lấy: hai đơn vị mẫu (hộp, gói, lọ)/ mẫu

- Bảo quản và lưu trữ mẫu: điều kiện thường

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Hóa chất

Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được pha bằng nước cất 2 lần

Trang 29

 Chất chuẩn

- Chuẩn S-Allyl-L-Cystein (Sigma Aldrich, hàm lượng ≥98%)

- Chuẩn Allyl disulfide (Sigma Aldrich, hàm lượng 80%)

 Hóa chất dung môi

- Acetonitrile (Merck, Đức)

- Methanol (Merck, Đức)

- Amoni Acetate (Merk, Đức)

- Acetone (Merck, Đức)

- Nước cất hai lần lọc qua màng 0,45µm sau đó rung siêu âm

 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

 Phân tích hàm lượng S-allyl-L-cystein bằng HPLC-PDA

- Dung dịch chuẩn SALC: Cân khoảng 0,0100g SALC (M = 161g/mol) cho vào bình định mức 50,0mL Pha loãng đến vạch bằng MeOH và lắc đều được dung dịch chuẩn 200µg/mL Dung dịch chuẩn bảo quản ở ngăn mát tủ lạnh

- Chuẩn bị mẫu tỏi đen để phân tích hàm lượng SALC: Cân khoảng 1,00 – 2,00 g mẫu tỏi đen đã được đồng nhất (bóc vỏ, nghiền nát) Tiến hành chiết lặp 2 lần bằng dung môi MeOH:H2O, tiến hành chiết lặp 2 lần bằng dung môi methanol

và nước, rung siêu âm ở 700C và 60 phút, thu được dịch lọc định mức vào bình 50,0mL, lọc lấy dịch lọc và phân tích bằng hệ thống HPLC-PDA

- Dẫn xuất FMOC-Cl 500µg/mL: Cân 0,0500g FMOC-Cl chuyển vào bình định mức 50,0mL, định mức bằng ACN đến vạch và lắc đều, sau đó chuyển vào bình thủy tinh tối màu

- Pha động HPLC: Cân khoảng 0,770g amoni acetate vào bình định mức 500mL, định mức bằng nước cất đến vạch và lắc đều, lọc qua bộ lọc và rung siêu

âm để khử bọt khí trước khi phân tích sắc ký

- Đệm borat: Cân khoảng 0,720g di-Natriumtetraborat-Decahydrat (Na2B4O7.10H2O, M = 361g/mol) vào bình định mức 100mL, định mức bằng nước cất đến vạch và lắc đều được đệm borat có nồng độ 20,0mM Điều chỉnh đến pH = 8,00 bằng NaOH 0,100N và HCl 8,00N

 Phân tích hàm lượng diallyl disulfide bằng GC-MS

Trang 30

- Dung dịch chuẩn DADS:

 Dung dịch chuẩn gốc 8000 µg/mL: Cân chính xác 501,3 mg chất chuẩn DADS trên cân phân tích vào bình định mức 50,00mL, hòa tan

và chuyển vào bình định mức 50,00mL bằng MeOH, định mức bằng dung môi hòa tan ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ, bảo quản ở ngăn tủ lạnh 2-

80C sử dụng đƣợc trong 6 tháng

 Dung dịch chuẩn trung gian 80 µg/mL: Hút khoảng 1,00 mL dung dịch chuẩn gốc DADS 800 µg/mL vào bình định mức 100 mL đã chứa một ít dung môi MeOH, định mức tới vạch bằng MeOH

 Dung dịch chuẩn làm việc: Pha dãy dung dịch chuẩn DADS chạy sắc

ký (3,20 – 80,0 µg/mL) từ dung dịch chuẩn trung gian Định mức bằng MeOH ở nhiệt độ phòng và lắc kỹ hỗn hợp

- Chuẩn bị mẫu tỏi đen để phân tích hàm lƣợng DADS: Cân khoảng 2,00 –

3,00 g mẫu tỏi đen Tiến hành chiết lặp 2 lần bằng dung môi MeOH, lắc ngang tốc độ 270 vòng/ phút trong 60 phút Thu dịch lọc vào bình định mức 10mL, định mức đến vạch bằng MeOH và phân tích trên hệ thống GC-MS

- Bộ lọc chân không, Hãng Pall (Mỹ)

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, hãng Water, model: e2695, với các

bộ phận: bộ bơm trộn dung môi, bộ loại khí, buồng điều nhiệt, detector PDA 2998

- Hệ thống sắc ký khí khối phổ, hãng Thermo, model: Trace GC Ultra

- Máy rung siêu âm có gia nhiệt hãng Elmasonic

- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (150mm x 4,6mm; 5µm)

Trang 31

- Cột mao quản SPB-5MS Agilent (30m x 0,32mm; 0,25µm)

- Tiền cột C18 Symmetry Waters (20mm x 3,9mm; 5µm)

- Bể rung siêu âm cách thủy

- Cân phân tích hãng Metler Toledo độ chính xác 0,0001g

- Máy ly tâm lạnh của hãng Hettich, Gemany

- Máy Vortex của hãng Genius 3

- Tủ lạnh dùng để bảo quản mẫu

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

S-allyl-L-cystein là hợp chất trong phân tử có khung cacbon cồng kềnh, phân cực do đó nếu sử dụng phương pháp sắc ký khí thường khó bay hơi, chất phân tích cần phải được dẫn xuất hóa chuyển về dạng hợp chất dễ bay hơi và bền nhiệt Nếu sử dụng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp detector khối phổ thì trang thiết bị đắt tiền, chi phí khấu hao lớn, yêu cầu kỹ thuật phân tích cao Mặt khác trong tỏi đen hàm lượng S-allyl-L-cystein có hàm lượng cao do đó phù hợp với tách bằng sắc ký lỏng Chính vì vậy, xác định hàm lượng S-allyl-L-cystein trong tỏi đen sử dụng hệ thống phân tích sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) gắn với detector PDA của hãng Water (hình 2.1) Đây

là phương pháp hiện đại, có độ tin cậy cao, có tính ứng dụng rộng rãi

Hình 2.1 Hình ảnh hệ thống phân tích HPLC –PDA hãng Water để xác định hàm

lượng SALC trong tỏi đen

Trang 32

Trên cơ sở tham khảo tài liệu [1, 15], các bước cần xử lý để phân tích hàm lượng SALC bằng phương pháp HPLC-PDA như sau:

- Cân mẫu vào ống ly tâm, thêm dung môi để chiết chất phân tích

- Lắc votex để mẫu và dung môi được đảo trộn đều

- Rung siêu âm để tăng hiệu suất hòa tan chất phân tích vào dung môi chiết

- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và phần cặn

- Loại bỏ phần cặn, dịch thu được lọc qua giấy lọc để làm sạch chất phân tích

- Bơm vào hệ thống HPLC để phân tích hàm lượng chất S-allyl-L-Cystein

có trong mẫu

2.3.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS)

Diallyl disulfide là hợp chất dễ bay hơi, không phân cực và hàm lượng chất trong mẫu thấp nên phương pháp sắc ký khí khối phổ được sử dụng phổ biến Do vậy, tiến hành xác định hàm lượng DADS bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (sử dụng hệ thống phân tích sắc ký khí khối phổ như hình 2.4) Đây là phương pháp hiện đại, cho độ nhạy cao và độ chính xác cao

Hình 2.2 Hình ảnh hệ thống phân tích GC-MS hãng Thermo để xác định hàm

lượng DADS trong tỏi đen

Trang 33

Trên cơ sở tham khảo tài liệu [31, 35, 46], các bước cần xử lý để phân tích hàm lượng DADS bằng phương pháp GC-MS như sau:

- Đồng nhất mẫu

- Cân mẫu vào ống ly tâm, thêm dung môi methanol để chiết chất phân tích

- Lắc votex để mẫu và dung môi được đảo trộn đều

- Lắc ngang trong khoảng thời gian 60 phút để tăng hiệu suất hòa tan chất phân tích vào dung môi chiết

- Ly tâm với tốc độ cao, phân tách phần dung dịch và phần cặn

- Loại bỏ phần cặn, dịch thu được lọc qua giấy lọc để làm sạch chất phân tích

- Bơm vào hệ thống GC để phân tích hàm lượng chất diallyl disulfide có trong mẫu

2.4 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

a) Tính đặc hiệu (Selectivity)

Lần lượt phân tích các dung dịch: mẫu chuẩn SALC, DADS; mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn SALC, DADS trên hệ thống HPLC (đối với SALC) và hệ thống GC-MS (đối với DADS), tiến hành so sánh thời gian lưu của mẫu chuẩn, mẫu thực và mẫu thực thêm chuẩn

b) Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic sắc ký vào nồng

độ SALC, DADS:

- Từ dung dịch chuẩn gốc SALC 200 µg/mL, tiến hành pha loãng thành

dung dịch chuẩn trung gian và dãy chuẩn làm việc nổng độ khác nhau từ 1,60 µg/mL đến 40,0 µg/mL

- Pha loãng dung dịch chuẩn gốc DADS 8000µg/mL thành các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 3,2; 4,0; 5,3; 8,0; 16; 32; 48; 80 µg/mL

Từ các kết quả thực nghiệm thu được, thiết lập được đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ chất với diện tích pic tương ứng [7] Đường chuẩn được chấp nhận khi hệ số hồi quy tuyến tính R2≥0,99

Trang 34

Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức:

Trong đó:

: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

c) Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Xác định LOD của phương pháp HPLC-PDA để xác định hàm lượng SALC bằng cách lựa chọn mẫu tỏi đen có hàm lượng SALC thấp và phân tích 10 lần song song Sau đó xác định LOD thông qua giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, đánh giá LOD đã tính được thông qua giá trị R LOD đáng tin cậy khi 4<R<10 [7]

Do DADS có hàm lượng ít trong mẫu nên xác định LOQ của phương pháp GC-MS dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu khi phân tích dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn DADS ở nồng độ dưới 3,2µg/mL Từ đó xác định được giới hạn định lượng của phương pháp

d) Độ lặp lại của phương pháp

Xác định độ lặp lại của phương pháp phân tích SALC bằng phương pháp HPLC và phân tích DADS bằng phương pháp GC-MS, xử lý đồng thời 6 mẫu tỏi đen có hàm lượng SALC và DADS, tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC, GC-

MS ở các điều kiện đã chọn Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua

độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối [7]

e) Độ thu hồi của phương pháp

Để đánh giá độ thu hồi của phương pháp phân tích hàm lượng SALC, DADS trong tỏi đen, thực hiện phân tích các mẫu tỏi đen có cho thêm chuẩn tại ba mức nồng độ khác nhau là mức thấp, trung bình và cao, mỗi nồng độ phân tích lặp lại 3 lần Từ đó thu được kết quả và xác định độ thu hồi, tiến hành tham chiếu “Quy định

độ thu hồi của hội đồng châu Âu” [7]

Trang 35

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu đều được xử lí

bằng phần mềm Empower - thiết bị HPLC của Hãng Water; phần mềm

Xcalibur - thiết bị GC-MS của Hãng Thermo

- Ứng dụng phần mềm tin học Microsoft Office Excel

- Sử dụng các công thức xử lí thống kê trong phân tích

 Tính kết quả trung bình (mean) của n lần:

n x

 Giới hạn phát hiện: LOD = 3 × SD

 Giá trị R để đánh giá LOD: R =

 Giới hạn định lượng: LOQ = 3,3× LOD

m

m C

C R

Trong đó: x là giá trị trung bình của mẫu

xi là giá trị lần thử nghiệm i của mẫu

n là số lượng mẫu đem phân tích

Cm: nồng độ SALC, DADS có trong mẫu (mg/100g)

Cm+c: nồng độ SALC, DADS có thêm chuẩn (mg/100g)

m : khối lượng cân mẫu (g)

mc : khối lượng chất chuẩn thêm vào (g)

2.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ

Hàm lượng SALC, DADS trong mẫu tỏi đen được tính theo công thức:

G = C×V×k/m/1000 Trong đó:

Trang 36

G: Hàm lượng SALC, DADS có trong mẫu (mg/g; mg/mL)

C: Nồng độ SALC, DADS tính được từ đường chuẩn (µg/mL)

V: Thể tích dịch chiết cuối cùng phân tích máy (mL)

K: Hệ số pha loãng

m: Khối lượng mẫu (g; mL)

Trang 37

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Do rất khó khăn trong việc tìm được mẫu trắng phù hợp với những mẫu tỏi đen mà không có hàm lượng hai chất S-allyl-L-cystein (SALC) và Diallyl disulfide (DADS), vì vậy tiến hành khảo sát các điều kiện trên cơ sở các mẫu khảo sát được chuẩn bị như sau:

1 Thành phần nền để khảo sát các điều kiện, độ đặc hiệu, độ lặp lại, độ thu hồi để phân tích hàm lượng SALC được chuẩn bị như sau:

0,4mL H2O + 0,2 mL đệm borat (số mM muối borat 20mM, pH=8) + 0,2 mL dẫn

xuất FMOC 500µg/mL

2 Thành phần nền để khảo sát các điều kiện, độ đặc hiệu, độ lặp lại và

độ thu hồi để phân tích hàm lượng DADS được chuẩn bị như sau:

1mL MeOH/ vial Sau đây, trong luận văn này chúng tôi thống nhất gọi mẫu khảo sát là mẫu trắng

3.1 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SALC TRONG TỎI ĐEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC-PDA

3.1.1 Khảo sát điều kiện của phương pháp HPLC-PDA để xác định hàm

lượng S-allyl-L-cystein

3.1.1.1 Lựa chọn điều kiện detector

S-allyl-L-cystein sau khi được dẫn xuất với 9-fluorenylmethyl-chloroformate (FMOC) có thể phân tích trên detector huỳnh quang, UV-Vis, PDA hoặc detector khối phổ Theo kết quả nghiên cứu của tác giả A Fabiani [12], detector PDA đã được sử dụng để phân tích SALC với dẫn xuất FMOC, nó cho độ nhạy, độ chọn lọc cao hơn so với detector UV-Vis Mặt khác, detector PDA là một detector phổ biến, được trang bị rộng rãi trong các phòng thí nghiệm ở nước ta Do đó, lựa chọn detector PDA để phát hiện và định lượng SALC với bước sóng phát hiện là 265 [12], khoảng quét phổ từ 200-400nm

Trang 38

3.1.1.2 Lựa chọn điều kiện phân tích S-allyl-L-cystein bằng phương pháp HPLC-PDA

Nhóm hợp chất acid amin có khả năng hấp thụ bước sóng trong khoảng

220-280nm, tham khảo một số tài liệu (trích dẫn tài liệu vào đây) và điều kiện của phòng

thí nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn các điều kiện phân tích như sau:

- Cột sắc ký pha đảo C18 của hãng Water (15cm x 4,6mm x 5µm), sử dụng

thêm tiền cột

- Pha động: kênh A: dung dịch amoni acetate 20mM, kênh B: acetonitrile

- Detector PDA tại bước sóng 265 nm

- Tốc độ dòng: 1mL/phút

- Thể tích tiêm mẫu: 10µL

Các thông số này sẽ được giữ cố định trong suốt quá trình nghiên cứu

3.1.1.3 Khảo sát điều kiện dẫn xuất hóa

S-allyl-L-cystein ít hấp thụ bước sóng trong vùng tử ngoại (UV) và vùng khả kiến (VIS) Chính vì vậy, lựa chọn dẫn xuất hóa để tăng khả năng tách của S-allyl-L-cystein bằng hệ thống HPLC-PDA Mặt khác, dẫn xuất FMOC là một trong những dẫn xuất phổ biến nhất để phân tích các acid amin trong đó có SALC FMOC

có rất nhiều ưu điểm như: có thể hình thành dẫn xuất nhanh (5 phút), và các dẫn xuất này ổn định lên đến 100 phút Các phản ứng tiếp theo của FMOC-Cl với SALC cho phép giảm sự ảnh hưởng của FMOC-OH hình thành trong môi trường kiềm khi tiến hành phân tích sắc ký [12] Với những ưu điểm của dẫn xuất FMOC và dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm, lựa chọn dẫn xuất FMOC để phân tích hàm lượng SALC trong tỏi đen bằng hệ thống HPLC-PDA

a) Khảo sát số mM muối borat

Tham khảo tài liệu [12] cho thấy số mM muối borat tối ưu để phản ứng giữa FMOC và nhóm amin diễn ra là từ 10 – 100mM Do vậy, khảo sát tại bốn mức số

mM muối borat khác nhau 10 mM; 20mM; 50mM và 100mM Kết quả được chỉ ra trong bảng 3.1 và hình 3.1

Trang 39

Bảng 3.1 Khảo sát số mM muối borat

Số mM muối borat

Diện tích pic (µV*s)

Thời gian lưu (phút)

b) Khảo sát pH đệm borat

Tham khảo tài liệu [12] nhận thấy pH tối ưu để phản ứng giữa FMOC và nhóm amin diễn ra từ 8-10 Để tối ưu hóa quá trình phản ứng giữa SALC và FMOC, tiến hành khảo sát pH đệm borat sử dụng làm môi trường trong khoảng 8-

10 Kết quả được chỉ ra trên bảng 3.2, hình 3.2 và hình 3.3

Trang 40

Thể tích tiêm mẫu: 10µL; Detector PDA tại bước sóng 265 nm

Hình 3.3 Sắc đồ xác định SALC bằng HPLC-PDA với pH đệm borat 8

Định dạng
Số trang	96
Dung lượng	1,88 MB
File đính kèm	271216_Nguyễn Thị Thu Hoa_K25_HPT_ Luận văn.rar (2 MB)