Ứng dụng công nghệ di truyền tạo giống chất dinh dưỡng chức năng: Tăng cường FOLATE trong các loại cây TP

Ứng dụng công nghệ di truyền tạo giống chất dinh dưỡng chức năng: Tăng cường FOLATE trong các loại cây TP

Phương pháp bổ sung vitamin trước đây:

Nguyễn Kiều Oanh

 Có sẵn trong các cây lương thực chính

 Dễ tiếp cận với những vùng kém phát triển

 Folate là gì?

tan trong nước.

sung vào các loại thực phẩm (các loại mì, nui, ngũ cốc

ăn sáng…)

• Phân tử folate chứa pteridine, p-carotene (provitamin A) (2000, 2005)ABA và glutamate.

2 TỔNG QUAN

Nguyễn Kiều Oanh 6

 Folate là gì?

 Vai trò của folate đối với CON NGƯỜI:

Ngăn ngừa một số bệnh

Thai nhi:

• Dị tật ống thần kinh: thiếu một phần não

(anencephaly), nứt đốt sống (spina bifida)

• Bệnh thiếu máu (megaloblastic anemia)

Người trưởng thành:

• Rối loạn thoái hóa thần kinh (Alzheimer)

• Nguy cơ bệnh tim mạch

Nguyễn Kiều Oanh 8

 Nhu cầu folate

1μg DFE=1μg folate trong thực phẩmg DFE=1μg DFE=1μg folate trong thực phẩmg folate trong thực phẩm

=0.6μg DFE=1μg folate trong thực phẩmg acid folic từ thuốc hoặc thực phẩm bổ sung

=0.5μg DFE=1μg folate trong thực phẩmg acid folic từ thuốc hoặc thực phẩm bổ sung

uống khi bụng đói

 Những loại cây chứa folate

Loại cây Hàm lượng folate (nmol/

g phần ăn được)

Gạo (trắng, chưa nấu) 0.13-carotene (provitamin A) (2000, 2005)0.18

Lúa mì (cứng, trắng, chưa nấu) 0.84-carotene (provitamin A) (2000, 2005)0.95

Ngô (vàng, hạt, chưa nấu) 0.42

Cà chua (quả) 0.2-carotene (provitamin A) (2000, 2005)0.64

Đậu Hòa Lan (xanh, chưa nấu) 1.45

Rau spinach (lá, chưa nấu) 4.31

Đậu (hồng, hạt trưởng thành,

Nguyễn Kiều Oanh 10

Cà chua chuyển gen giàu folate 1

 Nguy)ên lý tác động

GTP cyclohydrolase I (GCHI) biến mất lúc quả bắt đầu chín,

cắt đứt nguồn cung cấp pteridine.

→ duy trì liên tục hoạt động của GCHI.

Nguyễn Kiều Oanh

12

 Qui trình nghiên cứu

TN 1

Tạo cây sản xuất thừa

pteridine

Bước 1: Thiết kế vector

tái tổ hợp có chứa GCHI

Bước 2: Kỹ thuật biến

đó cho quả tiếp tục chín

 Thí nghiệm 1

Bước 1: Thiết kế vector tái tổ hợp có chứa GCHI

•Vector pMON10086: promoter E8 của cà chua, terminator, gen kháng

kanamycin npt II.

•cDNA GCHI của động vật có vú (mã số GenBank BE136861)

•cDNA này được chèn vào vector pMON10086

Bước 2: Kỹ thuật biến nạp di truy)ền

•Vector pMON10086 được đưa vào chủng Agrobacterium tumefaciens

bằng phương pháp tạo lỗ bằng dòng điện

•Biến nạp Agrobacterium tumefaciens vào cây cà chua.

3.1 CÀ CHUA GIÀU FOLATE 1

Nguyễn Kiều Oanh 14

Trước khi chèn GCHI Sau khi chèn GCHI

Thiết kế vector tái tổ hợp có chứa GCHI

Hàm lượng folate tổng trong quả red-ripe của 12 thể

biến nạp GCHI+ và 10 thể biến nạp đối chứng

Tích lũy pteridine làm tăng hàm lượng folate.

Mức folate cao nhất đạt được (≈4nmol mỗi

g khối lượng tươi)

180μg/ml g mỗi 100g Mức này sẽ cung cấp cho toàn bộ chế độ folate

đề nghị đối với một đứa trẻ và gần một nửa cho người lớn.

3.98 nmol

Nguyễn Kiều Oanh

16

 Thí nghiệm 2

Bổ sung 2μg/ml mol PABA qua cuống ở giai đoạn breaker

Kết quả: PABA ngoại sinh làm tăng hàm lượng folate

(2.5 đến 9 lần)

Ảnh hưởng của PABA ngoại sinh đến hàm lượng folate

Nguyễn Kiều Oanh

cung cấp đủ nhu cầu folate hằng ngày của một người trưởng thành.

Phân tích Northern blot.

và sau khi

 Qui trình nghiên cứu

Nguyễn Kiều Oanh 20

 Thiết kế vector tái tổ hợp

3.3 LÚA GIÀU FOLATE

 Kết quả

 Mức tối đa của folate là 38,3 nmol / g tương đương với 1.723 μg/ml g /100 g

khối lượng tươi.

 Nó vượt quá ngưỡng folate đề nghị hàng ngày cho người lớn gấp 4 lần

(400 μg/ml g) và cũng trên 2,5 lần lượng folate cho phụ nữ mang thai (600 μg/ml g).

Nguyễn Kiều Oanh 22

 Kết quả

 Sau 30 phút đun sôi thì 45%

folate thất thoát

 Giả sử rằng mức khả dụng sinh học trung bình của folate tự nhiên khoảng 50%, 100g gạo tăng cường folate có khả năng đáp ứng yêu cầu folate hàng ngày cho một người trưởng thành

 Tồn tại:

Hàm lượng pteridine và PABA tích lũy) quá nhiều:

• Cà chua 2: folates / PABA / pterins = 1/2.5/0.75

• Lúa: folates / PABA / pterins = 1/0.5/0.013

Trong đó:

• p-ABA : không gây hại tới sức khỏe

• pteridines: vẫn chưa được làm rõ và cần được khảo sát

 tetrahydrobiopterin (H4B): tham gia vào quá trình tổng hợp các chất

dẫn truyền thần kinh

 dihydroneopterin và neopterin: kích thích hệ miễn dịch, tham gia vào

phản ứng stress

Do đó tình trạng xáo trộn của pteridine có thể có ảnh hưởng đến sức

khỏe con người

Cần nghiên cứu thêm nhiều năm mới có thể đưa ra thị trường

Nguyễn Kiều Oanh 24

 Hướng phát triển

1 Tăng cường folate trên các cây) lương thực khác

2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pteridine lên sức khỏe con

người

3 Kết hợp với giống địa phương và tính trạng năng suất

cao để phát triển rộng rãi

4 KẾT LUẬN

1 Cây trồng biến đổi gen tăng

năng suất, từ đó giảm sử

dụng thuốc trừ sâu, giảm thiểu

ô nhiễm môi trường

2 Chất dinh dưỡng và mùi vị

được cải thiện, có hiệu quả

cho sức khỏe người tiêu thụ

3 Thực phẩm biến đổi gen có

chức năng vaccine sẽ làm

tăng cường khả năng miễn

dịch của con người đối với

bệnh tật nan y như viêm gan

siêu vi B

1.Ảnh hưởng đến môi trường

và sức khỏe con người

2 Sự tổng hợp ra các loại protein gây dị ứng có hại đến sức khỏe lâu dài của con người

Nguyễn Kiều Oanh 26

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô

Phụ lục 1: Con đường tổng hợp folate ở thực vật

Nguyễn Kiều Oanh 28

 Vai trò của folate

Cofactor tham gia vào chu trình chuyển hóa

1 nguyên tử carbon:

• Sinh tổng hợp nucleotide

• Sinh tổng hợp amino acid: methionine

• Chu trình methyl hóa

• Điều hòa nồng độ formaldehyde và formate trong tế

bào

Phụ lục 2: Vai trò của folate

Phụ lục 3 : C1 metabolism

Nguyễn Kiều Oanh 30

Phụ lục 4 : Plasmid pMON10086

Trước khi chèn GCHI Sau khi chèn GCHI

Phụ lục 5: Các GĐ chín của cà chua

Nguyễn Kiều Oanh 32

Phụ lục 6: Chuyển gen bằng Agrobacterium tumfaciens

Phụ lục 7: Xác định cây chuyển gen

 Mồi PCR

(5’-CTTTCTTGTTCCCATTTCTC-3’)

(5’-ATGCACATGTGTGTCGCTTC-3’)

 Cây dương tính với cấu trúc GCHI được chuyển qua đất

và phát triển đến trưởng thành trong buồng tăng trưởng (16-h ngày; 23°C; mật độ dòng quang hợp: 200 μg/ml mol photon/m2.s mỗi 8h đêm; 20°C) và tưới với dung dịch dinh dưỡng.

 Trong thí nghiệm bổ sung PABA vào, trái cây giai đoạn breaker đã được cắt tại gốc của cuống, bổ sung PABA (2μg/ml mol PABA trong 100μg/ml l nước) hoặc nước trong 1 ngày (đối với mẫu đối chứng), sau đó bỏ cuống và cho chín thêm trong 6 ngày ở 23°C.

Nguyễn Kiều Oanh 34

 Protein được chiết xuất từ mô vỏ quả bằng

cách nghiền trong Tris HCl 0.1M (pH 8,0) có

chứa ascorbate 15 mM, DTT 2 mM, và

Polyvinylpolypyrrolidone 3% (wt/vol).

 Sau khi được làm sạch bằng cách ly tâm, các

mẫu (80 μg DFE=1μg folate trong thực phẩmg protein) được tách trên gel SDS-carotene (provitamin A) (2000, 2005)

polyacrylamide, sau đó được chuyển qua

màng nitrocellulose, và khảo sát với kháng

thể pha loãng 1:2,000.

Phụ lục 8: Phân tích Western blot với kháng thể

Phụ lục 9: Phân tích pteridine và PABA

 Nghiền 0,70g quả trong N 2 lỏng và đồng nhất với 7 ml methanol (dd A)

 Phân tích pteridine:

• Trộn 600μl dd A với 250μl CHCll dd A với 250μl dd A với 250μl CHCll CHCl 3 , 50μl dd A với 250μl CHCll nước, lắc trong 40 phút Sau đó thêm 225μl dd A với 250μl CHCll CHCl 3 và 340μl dd A với 250μl CHCll nước, lắc trong 20 phút.

• Ly tâm , hòa tan phần cặn vào 200μl dd A với 250μl CHCll nước.

• Mẫu được oxi hóa bằng cách thêm 0,1 thể tích của một dung dịch gồm I 2 1% và KI 2% (wt/vol) trong HCl 1 M và ủ trong bóng tối trong 1h, I 2 dư được loại ra bằng cách thêm 10μl dd A với 250μl CHCll Na-ascorbate 5% (wt/vol) (dd B).

• Phân tích pteridine tổng trong dd B bằng phương pháp HPLC với cột

Ultremex C18 IP (Phenomenex, Belmont, CA) 5 - μl dd A với 250μl CHClm, 250 x 4,6-mm,

hoặc cột Synergi Fusion-RP 80 (Phenomenex) 4 - μl dd A với 250μl CHClm, 4,6 x 250-mm Phase động là Na-phosphate 10 mM (pH 6,0) 1,5 ml/min Các peak được phát hiện bằng detector huỳnh quang Waters 2.475 (350 nm - 450 nm).

• Để kiểm tra các trạng thái ôxi hóa pteridine , 2-mercaptoethanol 10 mM

và Na-ascorbate 2% (wt /vol) được thêm vào dd A, và bước oxi hóa

được bỏ qua Đỉnh pteridine liên hợp đã được thu hồi từ phase động nhờ phương pháp trao đổi ion (2 đơn vị trong 40 μl dd A với 250μl CHCll dung dịch Na-phosphate 10mM, pH 6,0, 37°C, 5-120 phút) và được xử lý bằng HCl (1M, 100°C, 1 h) hoặc với α-glucosidase hoặc β-glucosidase.

 Phân tích PABA: trong 5-ml dd A bằng phương pháp HPLC.

Nguyễn Kiều Oanh 36

Phụ lục 10: Phân tích folate

(N-cyclohexylamino) ethanesulfonic acid 50 mM điều chỉnh đến pH 7,9 với

10 mM.

glutamyl hóa folate.

ái lực folate.

có chứa NaCl 1M.

detector điện hóa, sử dụng một cột Prodigy ODS2 (Phenomenex) 5 –μl dd A với 250μl CHClm, 150

x 3,2 mm với điện thế đặt ở 0, 300, 500, và 600 mV Phase động là một hỗn

Phụ lục 11: Sơ đồ hệ thống HPLC

Nguyễn Kiều Oanh 38