Tách Dòng Và Giải Trình Tự Gen Mã Hóa Độc Tố Tiêu Chảy Và Độc Tó Gây Nôn Của Chủng Bacillus Cereus

perfrigens vào tới ruột non, chúng sẽ sản sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước [59,60].. Trên đây chỉ là một vài ví dụ điển hình nhưng nh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐINH THỊ NGA

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ

TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS

CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐINH THỊ NGA

TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ

TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS

CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Mã số: 60420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: T.S Phùng Tôn Quyền

.

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn thạc sĩ tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu, nhân dịp này tôi xin được bày

tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những sự giúp đỡ này

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Tôn Quyền là người thầy đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành

bản luận án này.

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Học viên

Đinh Thị Nga

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn

là trung thực

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015

Tác giả

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh mục hình

Danh mục bảng

MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 3

1.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning) 3

1.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 3

1.2 Tổng quan về Bacillus cereus 5

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus 5

1.2.2 Đặc điểm hình thái 7

1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 7

1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng 8

1.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 10

1.2.6 Đặc điểm huyết thanh học 11

1.2.7 Đặc điểm phân loại 12

1.3 Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus 12

1.3.1 Các loại độc tố ruột (enterotoxin) 12

1.3.2 Độc tố gây nôn (cereulide) 16

1.3.3 Những bệnh gây ra bởi Bacillus cereus, không liên quan tới ngộ độc thực phẩm 18

1.4 Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus 19

1.4.1 Nguồn gốc lây nhiễm B cereus 19

1.4.2 Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm của Bacillus cereus 20

1.4.3 Liều lượng gây ngộ độc 21

1.4.4 Triệu chứng 22

1.5 Biện pháp phòng ngừa sự lây nhiễm và phát triển của Bacillus cereus trong thực phẩm 23

1.5.1 Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao 23

1.5.2 Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ thấp 24

1.5.3 Sử dụng chất bảo quản 25

1.5.4 Thực hiện điều kiện vệ sinh tốt GHP (good hygienic practices) và thực hành sản xuất tốt GMP (good manufacturing practices) [45] 25

1.6 Một số phương pháp nghiên cứu để nhận biết Bacillus cereus 26

1.6.1 Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 26

1.6.2 Phương pháp dựa trên đặc điểm huyết thanh học 28

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Vật liệu 31

2.1.1 Sinh phẩm 31

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Phương pháp phân lập 34

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 34

2.2.3 Phương pháp tách DNA tổng số 34

2.2.4 Phương pháp tinh sạch plasmid của E coli 35

2.2.5 Phương pháp PCR khuếch đại gen 36

2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose 36

2.2.7 Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet 36

2.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng 37

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Phân lập Bacillus cereus trên môi trường MYP 39

3.2 Phát hiện gen mã hóa độc tố củ a Bacillus cereus bằng phản ứng PCR 39

3.3 Tách dòng và đọc trình tự gen bceT, nhe và hblA 41

3.3.1 Tách dòng gen bceT, nhe và hblA 41

3.3.2 Đọc trình tự gen má hóa các đô ̣c tố 44

KẾT LUẬN 47

KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

5 DNA Deoxyribonucleotide acid

6 dNTP deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate

9 EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid

10 EtBr Ethidium Bromide

11 kDa Kilo Dalton

12 OD Optical density - mật độ quang học

13 PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi

14 SDS Sodium dodecyl sulphate

15 Sol Solution

17 X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside

Danh mục hình

Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B cereus 7

Hình 1.2: Khuẩn lạc B cereus trên môi trường thạch huyết 8

Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B cereus 11

Hình 1.4 Cấu trúc hoá học của cereulide [24] 17

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc B cereus trên môi trườ ng MYP sau 12 giờ nuôi 39

Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại các gen độc tố của gen bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) và hblA (319 bp) 40

Hình 3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α 41

Hình 3.4 Điê ̣n di sản phẩm cắt DNA plasmid các dòng khuẩn la ̣c trắng trên gel 1% agarose 42

Hình 3.5 Điê ̣n di sản phẩm PCR của các dòng khuẩn la ̣c trắng trên gel 1% agarose 43

Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid của protrein BCET vói trình tự BAA041341 trên ngân hàng gen quốc tế 44

Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid của protrein NHE vói trình tự DQ153257.1 trên ngân hàng gen quốc tế 45

Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid của protrein HBL vói trình tự EEK50059.1 trên ngân hàng gen quốc tế 46

MỞ ĐẦU

dương và sinh bảo tử B cereus thường xuất hiê ̣n trong đất , trong sữa nguyên liê ̣u, trong các sản phẩm từ sữa và trong các loa ̣i ngũ cốc B cereus có khả

năng liên quan đến các bê ̣nh về đường ruô ̣t như gây nôn và tiêu chảy nhờ khả năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tổ hợp hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T

(BCET) và cytotoxin K (Beecher, Wong, 1994) Ngoài ra , B cereus còn có

khả năng sản sinh một loại độc tố chịu nhiệt n on-riposome peptide synthetase (NRPS-cereulide) (Agata et al., 1995)

Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y

tế có khả năng kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình thành có năng lực kiểm nghiệm Tuy nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác Phương pháp này có nhược điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần và độ chính xác không cao.Trong những năm gần đây, các phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa trên nguyên tắc di truyền phân tử và miễn dịch học đã được thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisa cho kết quả rất khả quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồng vài giờ, không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao Những phương pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngành công

nghệ thực phẩm hiện đại

xuất phát từ tính cấp thiết chúng tôi tiến hành đề tài: “Tách dòng và giải

trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus

cereus phân lập tại Việt Nam” Với mục đích tạo nguồn gen cho sản xuất

nguyên liệu chế tạo kit phát hiện các độc tố của vi khuẩn B cereus sau này

*/ Mục tiêu của nhiệm vụ:

- Tách dòng và đọc trình tự gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy nhờ khả năng sản sinh 4 loại enterotoxin trong đó có 2 tổ hợp hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là

enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K từ vi khuẩn B cereus

*/ Nhiệm vu của đề tài:

- Phân lập vi khuẩn B.cereus tư các mẫu phẩm thu thập tại một số quán

an vỉa hè tại hà nội,

- Sàng lọc hệ gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu chảy , trong đó có 2 tổ hợp hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) và 2 enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) và cytotoxin K

- Tách dòng và đọc trình tự các gen HBL, NHE, BCET và cytotoxin K từ

một số chủng vi khuẩn B cereus

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm và nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

1.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning)

Ngộ độc thực phẩm là thuật ngữ dùng để chỉ một hội chứng cấp tính, xảy ra đột ngột, do ăn phải thức ăn có chất độc, biểu hiện bằng những triệu trứng nôn mửa, tiêu chảy và những triệu chứng khác tuỳ theo đặc điểm của từng loại ngộ độc (tê liệt thần kinh, co giật, rối loạn hô hấp, tuần hoàn, vận

động…) [3]

1.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

Hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới, ngộ độc thực phẩm xảy

ra thường xuyên với nhiều nguyên nhân khác nhau Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm thường được chia thành tác nhân lây nhiễm và tác nhân độc tố Tác nhân lây nhiễm bao gồm các loại vi khuẩn, virut, ký sinh trùng… Còn tác nhân độc tố bao gồm các độc tố có sẵn trong thực phẩm, các loại hoá chất tồn

dư trong thực phẩm như kim loại nặng, thuốc trừ sâu, các chất phụ gia hoá học…[60]

Trong các vụ ngộ độc thực phẩm hiện nay, nguyên nhân do vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn chiếm tỉ lệ cao Có rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực phẩm tuy nhiên khoảng 90% ca ngộ độc thực phẩm hiện nay

là do Staphylococus aureus, Salmonella, Clostridium perfingens, Vibrio

parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Escherichia coli và Bacillus cereus…

[59] Do đó việc tìm hiểu các đặc tính của chúng là vô cùng cần thiết để có thể đưa ra biện pháp kiểm soát hiệu quả Dưới đây là đặc tính của một số

chủng vi khuẩn có nguy cơ ngộ độc cao:

Staphylococus aureus

S aureus thường gặp ở các món ăn như salat cà chua, bánh sandwich

và các sản phẩm đóng hộp Khi S aureus nhiễm vào thực phẩm, chúng sẽ sản

sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng nôn, choáng váng và đau

quặn bụng [59,60]

Salmonellae sp

Salmonellae thường tồn tại trong các thực phẩm có hàm lượng protein

cao như thịt, cá, trứng…Salmonellae có thể sinh trưởng trong thực phẩm,

nhưng không sinh độc tố, khi chúng vào trong ruột hoặc vào máu chúng mới

sinh độc tố Bệnh ngộ độc do Salmonellae có triệu chứng điển hình như buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau đầu [59,60]

Clostridium perfrigens

C perfrigens thường xuất hiện trong đất, nước do đó chúng rất dễ

nhiễm vào thức ăn Khi xâm nhập vào cơ thể người và động vật, chúng thường cư trú trong ruột non Nếu thực phẩm chứa một lượng lớn vi khuẩn

này được tiêu hoá thì khi C perfrigens vào tới ruột non, chúng sẽ sản sinh độc

tố gây ngộ độc thực phẩm với triệu chứng đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước

[59,60]

Vibrio cholerae

V cholerae thường có mặt trong những thực phẩm chưa được nấu chín

kỹ đặc biệt là các loại thuỷ, hải sản sống Ngộ độc do V cholerae có các triệu

chứng điển hình như nôn, tiêu chảy dữ dội và liên tục nhưng không đau bụng Bệnh nhân nếu không điều trị kịp thời sẽ bị mất nước nghiêm trọng, trụy tim

dẫn đến tử vong [59,60]

Escherichia coli

E coli là vi khuẩn sống chủ yếu trong ruột của người và động vật

Nhiễm trực khuẩn đường ruột này với số lượng lớn sẽ bị ngộ độc Triệu chứng bệnh chủ yếu là đau bụng dữ dội, tiêu chảy, có thể nôn mửa [59,60]

Ngoài ra còn rất nhiều loại vi khuẩn khác có khả năng gây ngộ độc đã được nghiên cứu Trên đây chỉ là một vài ví dụ điển hình nhưng nhìn chung vi khuẩn có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở 2 dạng: Ngộ độc do ăn phải thức

ăn có độc tố của vi khuẩn mà không cần có mặt tế bào của chúng

(Staphylococus aureus) và ngộ độc do ăn phải thức ăn nhiễm một số lượng

lớn tế bào hoặc bào tử vi khuẩn để khi vào tới ruột non chúng phát triển sinh

độc tố gây ngộ độc ( Salmonella) Nhưng trong số đó, vi khuẩn Bacillus

cereus lại có khả năng gây ngộ độc thực phẩm ở cả hai dạng trên với hai thể

bệnh điển hình là nôn và tiêu chảy

1.2 Tổng quan về Bacillus cereus

B cereus thuộc nhóm 1 chi Bacillus Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus có

mặt ở khắp mọi nơi trong môi trường sống, chúng mang đặc điểm chung là vi khuẩn Gram dương, tế bào có dạng hình que, hô hấp hiếu khí hay hiếu khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43] Hiện nay, có khoảng trên

100 loài thuộc chi này đã được miêu tả, một số loài có ứng dụng trong công nghiệp (sản xuất emzym) hoặc trong nông nghiệp (sản xuất thuốc trừ sâu sinh học), một số loài lại gây bệnh cho người và động vật Các loài gây bệnh quan

trọng thường nằm trong nhóm Bacillus cereus (nhóm 1 chi Bacillus) gồm

Bacillus cereus, Bacillus myco¿des, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium và mới đây có thêm hai loài là Bacillus weihenstephanensis và Bacillus pseudomyco¿des được phát hiện [38] Các

loài trong nhóm này có độ tương đồng về trình tự 16S, 23S rất cao và chúng

có % (G + C) tương đồng khoảng 31%-41% Đây chính là những đặc điểm

quan trọng để phân loại chúng thuộc nhóm Bacillus cereus [43]

Trong các loài thuộc nhóm B cereus có liên quan tới an toàn thực phẩm và sức khoẻ con người thì B thuringiensis được biết đến như là một loài vi khuẩn có

khả năng hình thành protein tinh thể độc có khả năng sử dụng làm thuốc trừ sâu

sinh học, B anthracis là tác nhân gây bệnh than Ngoài ra, B cereus, B

thuringiensis, B weihenstephanensis thường được tìm thấy trong các sản phẩm

lương thực, thực phẩm bị hỏng [14] Trong số đó, B cereus là nguyên nhân chủ

yếu và quan trọng nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus

B cereus được Frankland phân lập đầu tiên vào năm 1887 từ không khí tại

một chuồng bò [64] Năm 1906 ở Châu Âu, 300 người bệnh được đưa vào

bệnh viện với những triệu chứng của bệnh đường ruột do ăn phải món thịt băm bị nhiễm số lượng lớn một loại vi khuẩn hiếu khí, sinh bào tử, hình que

được gọi tên là Bacillus peptonificans Sau này nó được đổi tên là Bacillus

cereus [61,64]

Từ năm 1926 đến năm 1929: Theo thông báo có hai vụ ngộ độc liên quan

tới một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus hiếu khí có trong nước sốt vani và

món thịt đông.Từ năm 1936 đến năm 1943: Trong 367 vụ ngộ độc ở thành

phố Stockholm thì có 117 vụ nguyên nhân là do Bacillus spp Tuy nhiên do chưa có những hiểu biết rõ ràng về B cereus nên chưa thể khẳng định rõ vai

trò của chúng trong các vụ ngộ độc trên [61]

Năm 1950, Steinar Hauge nhà khoa học người Na Uy với những thí

nghiệm đặc biệt đã khẳng định B cereus là nguyên nhân gây ngộ độc thực

phẩm và là tác nhân gây bệnh cho con người Để cung cấp bằng chứng khẳng

định B cereus là nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm, Hauge đã chứng minh bằng cách uống môi trường nuôi cấy B cereus Ông đã nuôi chúng tới

mật độ 4.106

tế bào /g và uống 200ml Sau 13 giờ, ông cảm thấy đau bụng dữ

dội và bị tiêu chảy ra nước Đó là những thí nghiệm đầu tiên về loại B cereus

gây tiêu chảy

Năm 1954, một số cuộc thí nghiệm với những người tình nguyện ở Mỹ đã thất bại trong việc xác nhận lại những thí nghiệm của Hauge Đến năm 1969, những

vụ ngộ độc thực phẩm do B cereus đầu tiên đã được công bố ở Mỹ [64]

Năm 1971, 20 năm sau khi B cereus được công nhận là tác nhân gây ra

thể bệnh tiêu chảy, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một loại ngộ độc khác

gây ra bởi B cereus được gọi là typ gây nôn Loại B cereus gây nôn được

phát hiện sau 6 vụ ngộ độc xảy ra ở Anh với các triệu chứng buồn nôn và nôn mửa sau khi ăn món cơm rang của một nhà hàng Trung Quốc [61,64] Từ đó đến nay rất nhiều viện nghiên cứu của các nước trên thế giới đã và đang tiến

hành nghiên cứu về B cereus cũng như các độc tố của chúng nhằm tìm ra các

phương pháp phát hiện nhanh chính xác vi khuẩn này trong các loại thực phẩm, góp phần giảm thiểu các vụ ngộ độc thực phẩm do nó gây ra

Ở Việt Nam hiện nay, chưa có những nghiên cứu cụ thể, chi tiết về B

cereus mặc dù một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus khác đã được

nghiên cứu kỹ như B thuringiensis, B antharcis…

1.2.2 Đặc điểm hình thái

B cereus thuộc chi Bacillus, là trực khuẩn Gram dương, hô hấp hiếu khí

hoặc kỵ khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử [43]

Về mặt tế bào, ngoài những đặc điểm chung của chi Bacillus thì Bacillus

cereus còn có những đặc điểm riêng sau: Kích thước tế bào B cereus dài 3-5

ỡm, rộng 1-1,2ỡm, tế bào hình que thẳng, hai đầu có thể tròn hoặc vuông

Phần lớn tế bào B cereus thường có khả năng di động nhờ lông roi tuy nhiên cũng có một số chủng không có khả năng di động B cereus có khả năng hình thành nội bào tử Nội bào tử của B cereus nằm ở trung tâm tế bào, kích thước

của bào tử khoảng 1-1,5ỡm, bào tử nang không phồng Bào tử có dạng hình elip một số có dạng hình tròn hay hình khối (Hình 1.1) [61,64]

Hình 1.1: Tế bào (A) và bào tử (B) của B cereus

1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy

B cereus có thể sinh trưởng, phát triển ở dải nhiệt độ, pH rất rộng Chúng

có thể phát triển ở nhiệt độ 4-5ºC trong khi đó một số chủng lại có thể phát

triển ở nhiệt độ 55ºC Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của B cereus là

30-37ºC Độ pH biến thiên từ 4,3-9,3; pH tối ưu là 7-7,2 Độ hoạt động của nước

> 0,92 B cereus có thể phát triển trên môi trường có nồng độ NaCl từ 7,5%, một số chủng còn có thể chịu được nồng độ 10% [23,37,61,64] B

7-cereus phát triển tốt nhất trong điều kiện hiếu khí nhưng vẫn có thể phát triển

trong điều kiện kỵ khí Tuy nhiên, quá trình sản sinh độc tố đặc biệt là độc tố gây nôn sẽ không xảy ra ở nhiệt độ <10ºC và >40ºC cũng như trong điều kiện

kỵ khí [28,33,36]

Khi nuôi cấy B cereus trên môi trường phân lập MYP

(manitol-yolk-polimyxin) trong điều kiện tối thích tº=37ºC, pH= 7-7,2 sau 1 ngày, khuẩn lạc

B cereus có màu hồng eosin (do không có quá trình lên men manitol), xung

quanh khuẩn lạc có vùng kết tủa màu hồng (do có khả năng sinh enzym lecithinase) [22,23,37,63]

Trên môi trường nuôi cấy vi khuẩn cơ bản MPA (meat- pepton-agar),

khuẩn lạc B cereus có đường kính khoảng 0,4-0,5cm, màu sắc khuẩn lạc từ

trắng sữa đến trắng đục, khuẩn lạc tròn có tâm lồi, bề mặt sần sùi, không dính ướt và có vành ở mép [14,43]

Hình 1.2: Khuẩn lạc B cereus trên môi trường thạch huyết

Trên môi trường thạch máu cừu, B cereus có khả năng sinh haemolysin làm tiêu huyết (Hình 1.2) Đây là một đặc điểm được sử dụng để phân biệt B

cereus và B anthracis do B anthracis không có khả năng sinh haemolysin

Haemolysin là một trong những độc tố quan trọng trong quá trình gây bệnh

của B cereus [23,37]

1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng

Đặc điểm quan trọng của chi Bacillus nói chung và B cereus nói riêng

đó là khả năng hình thành bào tử Nhờ có đặc điểm này mà B cereus có thể

tồn tại phổ biến trong môi trường kể cả trong môi trường khắc nghiệt nhất Vì

vậy, khả năng lây nhiễm B cereus vào thực phẩm trở nên dễ dàng và nguy

hiểm hơn

Khi tế bào sinh dưỡng của B cereus gặp phải điều kiện bất lợi như

nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp, pH cực đoan, tia tử ngoại hay môi trường

thiếu chất dinh dưỡng, khô hạn… B cereus sẽ sinh nội bào tử Nội bào tử

nằm trong tế bào mẹ, khi tế bào mẹ phân giải nội bào tử trở thành tự do Bào

tử rất bền vững chúng có thể tồn tại và phát triển độc lập trong khoảng thời gian dài Khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi về chất dinh dưỡng, nhiệt độ,

pH tối ưu …, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào sinh dưỡng Tế bào sinh dưỡng này sẽ tiếp tục sinh trưởng phát triển và tiến hành các hoạt động trao đổi chất Khi dinh dưỡng cạn kiệt, môi trường bất lợi nội bào tử lại được hình thành [2]

Bào tử của B cereus có khả năng chịu nhiệt hơn hẳn tế bào sinh dưỡng của chúng [62,64] Ở thể sinh dưỡng B cereus, dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ

cao thì bào tử của nó lại có khả năng kháng lại nhiệt độ cao Trong sữa, bào tử

B cereus có thể chịu đựng được nhiệt độ 100ºC trong 2-3 phút trong khi đó

các quá trình thanh trùng sữa thường chỉ xảy ra tại nhiệt độ 70-80ºC trong vài

phút; trong thực phẩm có nồng độ axít thấp (pH>4,5) B cereus có thể chịu

được khoảng 5 phút [61] Đặc biệt, trong thực phẩm có hàm lượng lipit cao

như trong dầu đậu nành thì bào tử B cereus có thể chịu được nhiệt độ 121ºC

trong 30 phút [62] Vì vậy, trong quá trình chế biến thực phẩm khó có thể loại

bỏ hết bào tử B cereus Ngoài ra, bào tử B cereus còn chịu được tia bức xạ

cao hơn tế bào sinh dưỡng Nếu ta có thể tiêu diệt được 90% tế bào sinh

dưỡng B cereus ở 0,17- 0,65 kGy thì để tiêu diệt được 90% bào tử B cereus thì cường độ bức xạ phải là 1,25- 4 kGy Đặc biệt, bào tử B cereus kỵ nước hơn bào tử của các loài Bacillus spp Do vậy, chúng có thể bám chặt vào bề

mặt của những dụng cụ, máy móc dùng cho quá trình chế biến thực phẩm

[12] Điều này chứng tỏ bào tử B cereus không chỉ nhiễm từ thực phẩm mà

còn từ những dụng cụ chế biến hay đựng thực phẩm và bất cứ lúc nào chúng

cũng có thể gây nguy hiểm cho an toàn sức khoẻ con người

1.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá

B cereus có rất nhiều đặc điểm sinh lý, sinh hoá giống với một số loài

thuộc nhóm Bacillus cereus Bảng 1 sau đây tóm tắt một số đặc điểm chính để phân biệt một số loài thuộc nhóm 1 chi Bacillus này:

Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt các loài trong nhóm 1 chi Bacillus

Bảng 1 cho thấy 4 loài B cereus, B thuringiensis, B myco¿des, B

anthracis có những đặc điểm sinh lý, sinh hoá rất giống nhau chỉ có B megaterium là có nhiều đặc điểm khác hơn cả Tuy nhiên, trong 4 loài đó thì

mỗi loài vẫn có những đặc điểm riêng: B myco¿des có khả năng hình thành khuẩn lạc hình rễ cây trên môi trường dinh dưỡng cơ bản, trong khi đó B

anthracis lại không có khả năng chuyển động và không sinh haemolysin Trên

môi trường thạch huyết B anthracis vẫn có khả năng hình thành khuẩn lạc có kích thước 0,3-0,5cm nhưng không phân giải huyết, B thuringiensis có khả năng sinh protein tinh thể độc Trong khi đó, B cereus lại có khả năng chuyển

động và phân giải huyết rất mạnh, không hình thành khuẩn lạc dạng rễ cây và

không có khả năng sinh protein tinh thể độc [37]

1.2.6 Đặc điểm huyết thanh học

Hiện nay theo một số nghiên cứu, B cereus có 13 kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên O) và giống như B thuringiensis, B cereus cũng có kháng

nguyên tiêm mao (kháng nguyên H) và 42 loại kháng nguyên H đã được sử

dụng cho phân loại B cereus 23 trong 42 typ huyết thanh H có liên quan tới các thể bệnh gây ra bởi B cereus Các nghiên cứu đã cho thấy các typ huyết

thanh 1,2,6,8,10,12 và 19 thường liên quan tới các vụ ngộ độc thể bệnh tiêu

chảy còn các nhóm huyết thanh 1,5,8,12,19 của B cereus lại liên quan tới

những vụ ngộ độc thể nôn Trong đó, typ huyết thanh H1 thường chiếm ưu thế và gây ra cả hai loại thể bệnh [23,61]

Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao của B cereus

1.2.7 Đặc điểm phân loại

Do B cereus là loại vi khuẩn có dải nhiệt độ phát triển khá rộng nên dựa vào nhiệt độ có thể phân chia các chủng B cereus như sau:

• Các chủng ưa nhiệt (Mesophilic) là những chủng B cereus có khả

năng sinh trưởng ở dải nhiệt độ 10ºC- 42ºC một số có thể phát triển ở 50ºC- 55ºC, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30ºC- 37ºC

• Các chủng ưa lạnh (Psychrophilic hay Psychorotrophic) là những

chủng B cereus có khả năng sinh trưởng ở dưới 10ºC một số chủng có thể

phát triển ở 4ºC, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 30ºC- 37ºC Các chủng này không sinh trưởng ở nhiệt độ >42ºC [38]

1.3 Các nhân tố gây độc của Bacillus cereus

B cereus được biết đến là tác nhân gây ra những bệnh về đường tiêu

hoá cũng như một số bệnh không liên quan đến đường tiêu hoá Chúng có khả năng gây ngộ độc thực phẩm với hai thể bệnh điển hình là tiêu chảy và nôn

Có rất nhiều loại độc tố tham gia vào quá trình gây ra hai thể bệnh này Thể bệnh nôn gây ra bởi một loại độc tố có khả năng kháng nhiệt cao được gọi là cereulide hay emetic toxin có mặt trong thực phẩm trước khi con người tiêu hoá Trong khi đó, thể bệnh tiêu chảy lại là kết quả của rất nhiều loại độc tố ruột (enterotoxin) khác nhau gây nên Chúng là các sản phẩm trao đổi chất

của tế bào B cereus sinh ra ở ruột non trong quá trình phát triển [23,38] 1.3.1 Các loại độc tố ruột (enterotoxin)

1.3.1.1 Đặc điểm cấu trúc và cơ chế hoạt động

a Đặc điểm cấu trúc

Ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy là một loại thể bệnh phổ biến Hiện nay, có bốn loại độc tố ruột được biết đến là enterotoxin-T, cytotoxin K, haemolysin BL (HBL) và non-haemolytic enterotoxin (NHE) [7,39] Trong

đó, ba loại được chứng minh là có liên quan tới các vụ ngộ độc gây thể bệnh tiêu chảy là HBL, NHE và cytotoxin K còn enterotoxin-T được coi như là một

enterotoxin vì nó có cấu trúc gần giống với enterotoxin của vi khuẩn [7]

Bảng 1.2 Đặc điểm một số độc tố ruột của Bacillus cereus [17,34, 39]

phân tử

Khả năng gây ngộ độc thực phẩm

Haemolysin BL

(HBL)

Protein

3 thành phần

B 37,5 kDa

Có

L1 38,5 kDa

L2 43 kDa Non-haemolytic

enterotoxin

(NHE)

Protein

3 thành phần

Có

Trong 3 loại độc tố nêu ở trên thì HBL và NHE là hai độc tố ruột quan

trọng có mặt trong hầu hết các vụ ngộ độc gây tiêu chảy do B cereus Hiện

nay, đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào hai loại độc tố này [57]

HBL là một loại độc tố dung huyết có bản chất là một protein 3 thành phần B, L1, L2 Trong đó, B là nhân tố liên kết (Binding) còn L1 và L2 là 2 nhân tố phân giải (Lytic) [19] Độc tố HBL này đã được tinh chế và xác định

đặc điểm Bằng các thí nghiệm in vitro, các nhà khoa học đã chỉ ra độc tố này

có hoạt tính hoại tử, tăng tính thấm thành mạch máu cũng như khả năng gây tích tụ dịch trong ruột già [39] Trong protein nhiều thành phần này, mỗi protein thành phần đều được mã hoá bởi một gen Tiểu phần B được mã hoá

bởi gen hblA còn gen hblC và hblD lần lượt mã hoá cho tiểu phần L1, L2 Các gen này cùng nằm trên một operon Hoạt tính của độc tố này mạnh nhất khi

có đầy đủ cả 3 protein thành phần [57] Tuy nhiên, thành phần protein HBL

của B cereus không phải lúc nào cũng có đầy đủ cả 3 protein thành phần

Trong 3 protein thành phần trên thì thành phần L2 có vai trò làm tăng hoạt

tính cho B và L1 nên không phải tất cả HBL của các chủng B cereus đều sản

xuất L2 [61]

NHE cũng là một protein 3 thành phần: A, B, C Trong đó NHEC là protein liên kết còn NHEA, NHEB là protein phân giải Giống như HBL, hoạt

tính của NHE mạnh nhất khi có đầy đủ cả 3 protein này Các gen nheA, nheB,

nheC lần lượt mã hoá cho 3 protein NHEA, NHEB, NHEC, 3 gen này cũng

cùng nằm trên một operon [39,57] Ngoài sự tương đồng về đặc điểm cấu tạo,

2 loại độc tố HBL và NHE còn có một đặc điểm chung là sự dịch mã operon

tổng hợp HBL, NHE đều được gen plcR điều hoà dương Gen plcR là gen điều hoà sự tổng hợp phospholipase C Nếu chủng B cereus có gen plcR điều hòa âm thì chủng đó không có khả năng sản xuất HBL hay NHE còn nếu plcR

điều hoà dương thì chúng có khả năng sinh HBL và NHE Lúc đó chúng có khả năng gây ngộ độc thực phẩm dạng tiêu chảy [6]

Enterotoxin- T được biết đến từ năm 1995 Độc tố này đã được nhân

dòng và tiến hành một loạt các thí nghiệm invitro Nó là một protein đơn

mang một số tính chất của một enterotoxin như khả năng gây độc tế bào, khả năng tăng tính thấm thành mạch máu, khả năng gây tích tụ dịch, gây chết chuột nhưng nó không có khả năng phân giải huyết Nhưng hiện nay vẫn chưa tìm thấy sự có mặt của loại độc tố này trong các vụ ngộ độc thực phẩm liên

quan tới B cereus Protein độc tố này được mã hoá bởi gen bce-T [8]

Cytotoxin K là loại enterotoxin được biết đến muộn nhất nhưng nó lại

có khả năng gây tử vong cao Năm 2000, các nhà nghiên cứu đã phát hiện sự

có mặt của độc tố này sau một vụ ngộ độc xảy ra tại một gia đình người Pháp, tổng cộng có 44 người bị ngộ độc trong đó 6 người bị tiêu chảy ra máu dẫn tới tử vong Cytotoxin K là một protein đơn có hoạt tính dung huyết và gây hoại tử Nó bộc lộ tính độc rất cao trên tế bào biểu mô của người Gen mã hoá

cho độc tố này là cytK [57]

Ngoài B cereus thì B thuringiensis và B weihenstephanensis đều có khả năng tạo ra ít nhất một trong các độc tố gây tiêu chảy ở trên đặc biệt là B

thuringiensis Một số chủng B thuringiensis được thông báo có liên quan tới

một số vụ ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy [29,32,34]

b Cơ chế hoạt động của độc tố ruột gây tiêu chảy

Hiện nay, cơ chế hoạt động của các độc tố ruột trên chưa được biết rõ nhưng HBL và NHE đều là sản phẩm trao đổi chất trong quá trình phát triển

của tế bào B cereus, được sinh ra ở pha phát triển luỹ thừa (pha log) và đạt được lượng lớn nhất ở cuối pha này [17] Qua các nghiên cứu invitro trên tế

bào CaCo-2 (tế bào biểu mô ruột non người), các nhà khoa học đã phỏng đoán có 2 cơ chế hoạt động của HBL [12] Thứ nhất, tiểu phần B liên kết vào màng tế bào trước sau đó tiểu phần L đi vào bên trong làm thay đổi các chức năng trao đổi chất của tế bào Thứ hai, tiểu phần B liên kết vào màng tế bào

và gây ra vết thương trên bề mặt màng tế bào khi có sự liên kết của cả hai thành phần B và L Cơ chế hoạt động của NHE cũng tương tự như vậy [17,39]

Enterotoxin- T đã được tách dòng và biểu hiện trong E coli Nhưng

độc tố này chưa được tìm thấy trong bất cứ một vụ ngộ độc nào Vì vậy, nếu

nó có khả năng gây độc thì hiện nay chưa có thông tin liên quan tới cơ chế hoạt động của enterotoxin này [8]

Do cytotoxin K chỉ mới được phát hiện vào năm 2000 nên những nghiên cứu về cơ chế gây độc của nó còn rất hạn chế Trong nghiên cứu

invitro, các tác giả đã chỉ ra độc tố này có khả năng hình thành lỗ rò trong

tầng kép photpholipid Điều đó chứng tỏ cơ chế hoạt động của cytotoxin K là khả năng hình thành lỗ rò trên tế bào biểu mô ruột người gây ra quá trình thoát dịch và phá huỷ tế bào biểu mô ruột dẫn đến hoại tử [57]

Các độc tố ruột có đặc điểm chung là chúng dễ dàng bị phá huỷ ở nhiệt

độ cao, pH cực đoan và bị phân huỷ bởi các enzym tiêu hoá như trypsin,

pepsin… [64] Vì vậy, nếu chúng được B cereus sinh ra trong thực phẩm

trước khi được con người tiêu hoá thì khi vào tới dạ dày chúng sẽ bị phá huỷ,

mất khả năng gây độc Chúng chỉ thực sự gây nguy hiểm khi được hình thành

ở ruột non của người trong quá trình trao đổi chất của B cereus [57]

1.3.1.2 Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố ruột

Hiện nay, theo cơ chế gây bệnh thì thể bệnh tiêu chảy có thể được chia

ra làm 3 loại: kích thích bài tiết (sencreoty), loại xâm lấn vào màng nhầy của đường ruột nhưng không gây hoại tử (invasive) và loại xâm nhập, gây hoại tử (penetrating) Trong đó, loại tiêu chảy kích thích bài tiết là loại tiêu chảy ra dịch lỏng do quá trình mất cân bằng nước và chất điện giải giữa 2 bên biểu

mô của tế bào ruột non Nguyên nhân thường là do các enterotoxin gây ra

Giống như V cholerae, bệnh tiêu chảy do B cereus thuộc loại tiêu chảy này Sau khi con người ăn phải thực phẩm có chứa bào tử B cereus, bào tử B

cereus vào tới ruột non gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ nảy mầm phát triển

thành tế bào sinh dưỡng Do tế bào B cereus có những sợi tiên mao nhỏ nên chúng có khả năng bám chắc vào tế bào biểu mô ruột [12] Tế bào B cereus

tăng nhanh về số lượng, tại pha sinh trưởng trong quá trình trao đổi chất chúng sản sinh ra các độc tố ruột Các độc tố này được tạo ra trong tế bào vi khuẩn và được tiết vào ruột non người Độc tố này liên kết với thụ thể đặc hiệu trên màng, truyền tín hiệu giữa màng và kích thích các thông tin nội bào, cuối cùng chúng gây ra mất cân bằng sự chuyển dịch nước và các chất điện giải Cụ thể, khi enterotoxin được giải phóng chúng kích hoạt enzym adenylate cyclase (chuyển ATP → cAMP) làm tăng cAMP nội bào Quá trình sản xuất quá mức cAMP kéo theo sự vận chuyển tích cực ion Cl-

vào khoang ruột non và ngăn cản quá trình hấp thụ ion Na+ gây ra mất cân bằng thẩm thấu làm cho một lượng lớn nước của cơ thể bị rút ra chuyển vào ruột non gây ra

bệnh nôn Tất cả các chủng B cereus gây nôn đều có sự đồng nhất về tính

chất kiểu hình vì vậy chúng là đại diện của một dòng riêng biệt Người ta gọi

các chủng này là các chủng B cereus gây nôn (emetic Bacillus cereus ) [24] Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng hầu hết các chủng B cereus

gây nôn thường không có khả năng thuỷ phân tinh bột Vì vậy, chúng thường có mặt trong các thực phẩm có hàm lượng tinh bột cao như gạo, khoai tây…[38, 45, 51]

Các chủng B cereus gây nôn có khả năng sản sinh ra một loại độc tố

dạng vòng nhỏ có khối lượng phân tử là 1,2 kDa được đặt tên là cereulide [9] Độc tố này có khả năng kháng lại nhiệt độ cao, nó có thể tồn tại ở 126ºC trong

90 phút, pH=2, không bị thuỷ phân bởi các enzym tiêu hoá trypsin, pepsin…và có khả năng gây độc ở liều lượng thấp [61] Cereulide là một peptit dạng vòng dodecadepsipeptid gồm 36 vòng liên kết với nhau theo liên kết este và peptit (Hình 1.4) [9,10,24]

[ L-o- Val-L- Val-D-o- Leu-D- Ala]3

Hình 1.4 Cấu trúc hoá học của cereulide [24]

Dựa vào cấu trúc hóa học của cereulide có thể phỏng đoán rằng nó được tổng hợp nhờ một enzym tổng hợp peptit không cần riboxom (a nonribosomal pepdide symthetase NRPS) Cấu trúc dạng vòng và sự có mặt của các D-axit amin trong chuỗi peptit thường là sản phẩm của cơ chế tổng hợp sinh học không cần riboxom [ 10,41,55] Cấu trúc hoá học của cereulide

gần giống với cấu trúc của valinomycin do Streptomyces griseus sinh ra

[9,52,53] Vì vậy cũng giống như valinomycin, cereulide cũng có vai trò như

là một thể vận chuyển ion K+

(potassium ionphore) [9,42,48] Trong một nghiên cứu trên tế bào tinh trùng lợn, người ta thấy độc tố nôn làm cho tinh trùng lợn di chuyển rất chậm Nguyên nhân của hiện tượng này là do cereulide mang ion K+ gây độc đối với ty thể và ngăn cản quá trình phosphoryl hoá tổng hợp năng lượng ở đây [11] Ngoài ra, cereulide có khả năng ức chế tế bào giết tự nhiên (NK) của người, vì vậy nó có thể ảnh hưởng

tới khả năng miễn dịch của con người [46,52,53]

1.3.2.2 Cơ chế gây nôn của độc tố nôn

Độc tố nôn (cereulide) được sinh ra từ cuối pha phát triển luỹ thừa cho tới pha phát triển cân bằng (có thể kéo dài đến khi hình thành bào tử) của tế

bào B cereus Nhiệt độ thích hợp để B cereus sinh cereulide là 25-30ºC còn nhiệt độ <10ºC hay >40ºC B cereus đều không tạo ra độc tố nôn [23] Ngộ độc thực phẩm do B cereus gây nôn là loại ngộ độc do ăn phải thực phẩm có

nhiễm một lượng lớn độc tố cereulide Khi ăn phải thực phẩm này, do độc tố

có khả năng kháng lại pH axít và sự thuỷ phân của enzym tiêu hoá trong dạ dày nên chúng không bị phá huỷ Trong dạ dạy, chúng sẽ kết hợp với thụ thể 5-HT3 tác động đến hệ thần kinh phế vị gây kích thích cổ họng dẫn đến hiện

tượng nôn [9,45,61]

1.3.3 Những bệnh gây ra bởi Bacillus cereus, không liên quan tới ngộ độc thực phẩm

Bên cạnh khả năng gây ngộ độc thực phẩm, B cereus còn được biết

đến như một tác nhân lây nhiễm cơ hội gây ra một số bệnh không liên quan

tới thực phẩm Sự lây nhiễm này là do B cereus phát triển bên ngoài đường

ruột [23]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, ngoài độc tố gây nôn và độc

tố ruột gây tiêu chảy, B cereus còn sản sinh nhiều loại enzym như

photpholipase, gelatinase, haemolysin…Vì vậy khi chúng lây nhiễm vào các vết thương như vết bỏng, vết trầy xước… chúng sẽ sản xuất độc tố làm cho

bệnh nặng thêm [23] B cereus còn có thể lây nhiễm vào mắt thông qua các

vật lạ, bụi gây ra các bệnh như viêm nội nhãn, viêm giác mạc [18,23,56,61]

Nguy hiểm hơn là khi B cereus thông qua thuốc tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch

hay qua dụng cụ y tế, băng gạc chúng đi vào máu và gây ra một số bệnh nguy hiểm cho con người như nhiễm trùng máu, viêm màng trong tim, viêm phổi, hoại thư và có thể ảnh hưởng tới cả hệ thần kinh trung ương Đặc biệt, đối với trẻ sơ sinh, người bị suy giảm hệ thống miễn dịch và những người dùng thuốc gây ức chế miễn dịch như những người bị bệnh AIDS, ung thư hay những người phải thay ghép nhân tạo, chỉnh hình, cấy ghép tuỷ sống… thì nguy cơ

nhiễm B cereus là rất lớn [16,23]

1.4 Ngộ độc thực phẩm do Bacillus cereus

1.4.1 Nguồn gốc lây nhiễm B cereus

Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên và khả năng hình thành bào tử

mà B cereus có thể lây nhiễm vào thực phẩm bằng nhiều cách [45] Chúng có

thể tồn tại trong thực phẩm lâu dài cho dù thực phẩm đó đã trải qua các quá

trình như xử lý nhiệt, sấy, thanh trùng…

B cereus có mặt ở khắp mọi nơi, có thể dễ dàng phân lập được chúng

từ đất, nước, bụi, không khí… đặc biệt là trong đất Đất có thể chứa từ 103

-105 bào tử B cereus/g [31] Vì vậy, đất chính là nguồn lây nhiễm chủ yếu bào

tử B cereus vào thực phẩm B cereus trong đất dễ nhiễm vào các loại cây

như lúa, rau màu, cây gia vị… [20,31] Các nghiên cứu cho thấy 100% các

loại gạo đều chứa bào tử B cereus Trong gạo và các thực phẩm giàu tinh bột như khoai tây, các loại ngũ cốc khác… phát hiện được chủ yếu là B cereus gây nôn Trong khi đó, các chủng B cereus gây tiêu chảy lại có thể phát triển

ở phổ thực phẩm rộng hơn Nó có thể tồn tại từ các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật như các loại rau cho tới những thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt, sữa, cá…[45]

Ngoài khả năng lây nhiễm trực tiếp vào thực phẩm từ đất, nước, không

khí… B cereus còn có thể lây nhiễm vào thực phẩm bằng nhiều con đường khác như sự lây nhiễm của bào tử B cereus trong các loại gia vị dùng để ướp, chế biến các món ăn…[45] Đặc biệt, do bào tử B cereus có tính chất kỵ nước

nên nó có khả năng bám rất chắc vào bề mặt của các dụng cụ chế biến thực phẩm như xoong, nồi, chảo…hay cả các dây truyền máy móc trong chế biến thực phẩm công nghiệp [12,13,54] Vì vậy, nếu dụng cụ chế biến không được

vệ sinh sạch sẽ thì bào tử B cereus rất dễ nhiễm vào thức ăn gây ngộ độc cho người sử dụng Bào tử B cereus còn được tìm thấy trong nhà máy sản xuất

giấy hay bao bì gói thực phẩm Do vậy, thực phẩm sau chế biến có thể loại

được B cereus nhưng đến tay người sử dụng vẫn có thể bị nhiễm do bao bì

của chúng [54] Như vậy, tuy chỉ có khả năng gây ngộ độc thực phẩm khi

trong thực phẩm có chứa một lượng nhất định tế bào nhưng B cereus vẫn là

loại vi khuẩn có nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm cao [45]

1.4.2 Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm của Bacillus cereus

Khi con người ăn phải thực phẩm bị nhiễm B cereus thì nguy cơ bị

ngộ độc là rất lớn Hầu hết các loại thực phẩm đều có khả năng lây nhiễm bào

tử của B cereus Nếu môi trường thực phẩm đó không thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử thì B cereus sẽ được tiêu hoá ở dạng bào tử Ngược lại, nếu điều kiện thực phẩm cho phép bào tử nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng thì B

cereus sẽ được tiêu hoá ở dạng tế bào [44] Đặc biệt nếu trong thực phẩm xuất

hiện chủng B cereus có mang gen mã hoá sản sinh độc tố cereulide thì khi con

người ăn phải thực phẩm có độc tố đó sẽ bị ngộ độc với thể bệnh nôn [21, 45]

Sau khi thực phẩm có nhiễm B cereus được tiêu hoá chúng sẽ được

đưa tới dạ dày Dạ dày là nơi có pH thấp và có sự hoạt động của các enzym tiêu hoá như pepsin, tripsin… Vì vậy, nếu trong thực phẩm chỉ chứa bào tử thì

do tính kháng axít và các enzym tiêu hoá nên chúng nhanh chóng được chuyển tới ruột non Còn nếu thực phẩm chứa cả hai loại bào tử, tế bào sinh

dưỡng thì phụ thuộc vào pH của dạ dày mà chỉ có bào tử hay cả bào tử và tế

bào B cereus được chuyển qua ruột non Nếu pH của dạ dày quá thấp thì chỉ

có bào tử được chuyển qua còn nếu pH thuận lợi hơn sẽ tạo cơ hội cho cả tế bào sinh dưỡng được đi qua Do pH của dạ dày còn phụ thuộc vào loại thực

phẩm và cơ thể của từng người Khi vào tới ruột non, bào tử B cereus sẽ nảy

mầm, phát triển và sản sinh độc tố Nếu lượng độc tố tích luỹ đủ thì sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm với thể bệnh tiêu chảy [45]

Trường hợp trong thực phẩm có chứa sẵn độc tố, nếu là độc tố cereulide thì khi vào tới dạ dày chúng sẽ liên kết vào thụ thể 5-HT3 trong dạ dày và gây ra ngộ độc thể bệnh nôn [9] Còn nếu là độc tố gây tiêu chảy enterotoxins thì khi vào tới dạ dày chúng sẽ bị các enzym tiêu hoá phá huỷ Như vậy, ngộ độc thực phẩm thể bệnh tiêu chảy chỉ xảy ra do quá trình tạo

tích luỹ độc tố ruột trong ruột non người [57]

1.4.3 Liều lượng gây ngộ độc

Hầu hết tất cả các loại thực phẩm đều có thể bị nhiễm bào tử B cereus

nhưng khả năng gây ngộ độc còn phụ thuộc vào liều lượng lây nhiễm Ngộ độc thực phẩm chỉ có thể xảy ra khi thực phẩm đó bị nhiễm một lượng bào tử,

tế bào B cereus nhất định [45] Năm 2000, trong một nghiên cứu về vụ ngộ độc xảy ra ở Hà Lan do ăn phải món cơm chay nhiễm độc tố của B cereus

Sau khoảng 2 giờ, 100 trong 120 người ăn đã có triệu chứng nôn và đau bụng

dữ dội Trong mẫu thực phẩm đó người ta xác định được nồng độ của độc tố

nôn là khoảng 0,03-13,3ỡg/g thực phẩm Bằng các thí nghiệm invitro, đã xác

định trong thực phẩm có khoảng 105

-108 tế bào B cereus có khả năng sinh

độc tố nôn là có thể gây ra ngộ độc [45] Do tính kháng nhiệt cao của độc tố

nôn cereulide nên dù tế bào B cereus có thể bị tiêu diệt bởi nhiệt độ trước khi

được tiêu hoá nhưng độc tố nôn thì vẫn còn tồn tại Điều đó giải thích vì sao

có nhiều vụ ngộ độc xảy ra đã được thông báo là chỉ có nhiễm khoảng 103 tế

bào/g Do vậy, số lượng tế bào B cereus trong thực phẩm không phản ánh

đúng sự nguy hiểm của ngộ độc thể nôn [23, 30, 38]

Đối với ngộ độc thể bệnh tiêu chảy, do cơ chế gây bệnh của nó rất phức tạp nên dựa vào những số liệu về dịch tễ học cũng như những thí nghiệm

trong phòng thí nghiệm các nhà khoa học đã xác định được mật độ tế bào B

cereus có thể gây ngộ độc thể tiêu chảy [45] Sau vụ ngộ độc gây tiêu chảy

đầu tiên do B cereus xảy ra ở Oslo, Hauge đã xác định được mật độ tế bào

khoảng 8.108

tế bào là có thể gây ngộ độc thể tiêu chảy [35] Nhiều nghiên

cứu sau đó về các vụ ngộ độc thực phẩm có liên quan tới B cereus, đã xác định được số lượng B cereus có khả năng gây ngộ độc dao động từ 104

-1011

tế bào/g thực phẩm Lượng enterotoxin sinh ra trong ruột non còn thay đổi

phụ thuộc vào loại chủng B cereus khác nhau và nó còn phụ thuộc vào sức

khoẻ của mỗi người Đối với những người trẻ (< 19 tuổi) đặc biệt là trẻ em và những người già (>60 tuổi) thì triệu chứng xảy ra có thể trầm trọng hơn lứa

tuổi khác dù cùng bị lây nhiễm một lượng B cereus nhất định thậm chí còn ít

hơn [45]

Nhìn chung, lượng tế bào hay bào tử B cereus biến đổi từ khoảng

105-108 tế bào/g thực phẩm có thể gây ra ngộ độc Liều lượng này rất quan trọng cho các nhà cung cấp thực phẩm cũng như các cơ quan có thể kiểm soát được về mức độ an toàn cho thực phẩm khi cung cấp cho người tiêu dùng [30,

45, 61, 64]

1.4.4 Triệu chứng

B cereus gây ngộ độc thực phẩm với hai loại thể bệnh chính là nôn và

tiêu chảy Đối với thể bệnh tiêu chảy khi con người ăn phải thực phẩm nhiễm khoảng 105

-108 tế bào/g thực phẩm, sau khoảng 8-16 giờ (thường là 10-12 giờ) ủ bệnh (là khoảng thời gian tính từ lúc thực phẩm được tiêu hoá, tế bào

hay bào tử B cereus được đi qua dạ dày chuyển đến ruột non, bào tử nảy

mầm phát triển và sinh độc tố ruột enterotoxin) thì xuất hiện những biểu hiện đầu tiên của thể bệnh [39,61,62,64] Người bệnh cảm thấy đau bụng dữ dội, tiêu chảy ra nước, một số trường hợp có thể xuất hiện nôn Những triệu chứng

lâm sàng này rất giống triệu chứng ngộ độc do Clostridium perfringens một

loại trực khuẩn Gram dương có khả năng tạo bào tử nhưng không có khả năng chuyển động [4, 23,61,62,64]

Đối với thể bệnh gây nôn thì sau khoảng 0,5- 6 giờ ăn phải thực phẩm

có chứa độc tố nôn cereulide, người bệnh sẽ cảm thấy buồn nôn, nôn mửa thỉnh thoảng có thể bị tiêu chảy [38] Những triệu chứng lâm sàng này tương

tự triệu chứng ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus một loại cầu

khuẩn không chuyển động, không tạo bào tử, sinh sắc tố vàng trên môi trường nuôi cấy [4, 23,61,62,64]

Phần lớn các triệu chứng ngộ độc do B cereus thường nhẹ và sẽ kết thúc

sau khoảng 24 giờ [23,61,62,64] Tuy nhiên chỉ có một vài trường hợp tiêu chảy

ra máu sẽ gây nguy hiểm tới tính mạng cũng đã được thông báo [40] Nhìn chung,

tất cả mọi người đều dễ dàng ăn phải thực phẩm bị nhiễm B cereus nhưng triệu

chứng lâm sàng hay mức độ gây ngộ độc đối với mỗi người lại khác nhau, phụ thuộc vào sức khoẻ và sức đề kháng của mỗi người [45]

1.5 Biện pháp phòng ngừa sự lây nhiễm và phát triển của Bacillus cereus

trong thực phẩm

B cereus phân bố khắp nơi trong đất, nước, không khí… nên việc ngăn

ngừa chúng đặc biệt là bào tử B cereus vào thực phẩm là không dễ dàng [64]

Vì vậy, biện pháp hữu hiệu nhất để phòng ngừa ngộ độc thực phẩm gây ra bởi

B cereus là tìm mọi cách hạn chế tối đa sự nảy mầm của bào tử, ngăn ngừa sự

nhân nhanh của các tế bào sinh dưỡng trong thực phẩm để duy trì mật độ B

1.5.1 Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao

Phương pháp xử lý bằng nhiệt độ cao là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay để tiêu diệt bào tử, tế bào vi khuẩn trong thực phẩm [4]

Tuy nhiên do bào tử của B cereus có khả năng kháng nhiệt cao nên các quá

trình xử lý nhiệt bình thường như quá trình nấu với nhiệt độ nhẹ nhàng hay