Khóa luận tốt nghiệp: Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính.. Năm 2010, Magdalena và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa các yếu tố dinh dưỡng như nguồn cac

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

TỐI ƯU HOÁ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

CHỦNG Lactobacillus plantarum NT1.5

BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: ThS DƯƠNG NHẬT LINH SVTH : TRẦN THỊ KIỀU

MSSV : 1053012348 KHOÁ: 2010 – 2014

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014

Cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Văn Minh – giảng viên khoa Công nghệ

Sinh học Trường Đại Học Mở Tp Hồ chí Minh, cô thầy là người đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện, truyền đạt kiến thức để em có thể hoàn thành tốt đề tài

Chân thành cảm ơn các thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại Học Mở

Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến thức cơ bản làm nền tảng để em có thể hoàn thành đề tài

Thầy Đan Duy Pháp, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Phạm Thị Minh Trang, chị

Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Nguyễn Đạt Phi là người đã truyền đạt những kinh

nghiệm, động viên giúp đỡ em vượt qua những khó khăn trong thời gian thực hiện đề tài

Xin cảm ơn đến các anh/ chị, các bạn và các em Phòng thí nghiệm Công nghệ Vi sinh đã giúp đỡ, động viên em trong thời gian qua

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Ba, Mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh ủng hộ tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành tốt việc học tập của mình

Chân thành cảm ơn!

Bình Dương, ngày tháng năm 2014

TRẦN THỊ KIỀU

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 5

1.1.1 Giới thiệu 5

1.1.2 Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic 7

1.1.3 Tổng quan về Lactobacillus plantarum 8

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS 10

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới 10

1.2.2 Các nghiên cứu trong nước 11

1.3 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 12

1.3.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 12

1.3.2 Thí nghiệm sàng lọc 14

1.3.3 Thí nghiệm tối ưu hóa 16

1.4 PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU 24

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.2.2 Môi trường – hóa chất 24

2.2.3 Dụng cụ 24

2.2.4 Trang thiết bị 24

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Hoạt hóa chủng 25

2.3.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng của L plantarum NT 1.5 26

2.3.4 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L plantarum

NT1.5 27

2.3.5 Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng 28

2.3.6 Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman 30

2.3.7 Thí nghiệm khởi đầu 32

2.3.8 Tìm khoảng tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính bằng phương pháp leo dốc 32

2.3.9 Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu xác định giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng chính 33

2.3.10 Xác định thời gian tăng trưởng của chủng L plantarum NT1.5 trên môi trường tối ưu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD 610 35

3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT 1.5 36

3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT1.5 38

3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG 39

3.4.1 Nguồn nitơ 39

3.4.2 Nguồn cacbon 41

3.4.3 Nguồn khoáng 42

3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN 44

3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU 48

3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC 50

3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN 52

3.9 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU 57

4.1 KẾT LUẬN 61

4.2 KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 68

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Streptococcus 6 Hình 1.2 Lactobacillus 6 Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013)

9 Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình 13 Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và Behnken, 1960) 20 Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 22

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các nguồn nitơ khảo sát 28

Bảng 2.2 Các nguồn cacbon khảo sát 29

Bảng 2.3 Các nguồn khoáng khảo sát 30

Bảng 3.1: Giá trị đo OD 610 và mật độ tế bào (Log(N/mL) 35

Bảng 3.2 Giá trị OD 610 theo thời gian 36

Bảng 3.3 Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) tại mỗi giá trị nhiệt độ và độ pH khảo sát 38

Bảng 3.4 Giá trị log (N/ mL) của các nguồn nitơ khảo sát 40

Bảng 3.5 Giá trị log (N/ mL) của các nguồn cacbon khảo sát 41

Bảng 3.6 Giá trị log (N/ mL) của các nguồn muối khoáng khảo sát 43

Bảng 3.7 Mức ảnh hưởng của từng yếu tố 44

Bảng 3.8: Kết quả thí nghiệm Plackett- Burman 45

Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động của các yếu tố ảnh hưởng chính 50

Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm leo dốc 51

Bảng 3.12 Bảng giá trị các biến số thí nghiệm Box-Behnken 53

Bảng 3.13 Bảng biến số các giá trị thí nghiệm Box-Behnken 53

Bảng 3.14 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố 56

Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian 57

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.4 Kết quả khảo sát nguồn nitơ 40

Đồ thị 3.5 Kết quả khảo sát nguồn Cacbon 42

Đồ thị 3.6 Kết quả khảo sát nguồn muối khoáng 43

Đồ thị 3.7 Đồ thị các ảnh hưởng chính (Main Effects Plot) 47

Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau 55

Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào với các cặp biến khác nhau 56

Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng của L plantarum NT 1.5 theo thời gian trên môi trường tối ưu 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cholesterol trong máu tăng làm tăng nguy cơ bệnh tim và đột quỵ, một phần ba bệnh tim thiếu máu cục bộ là do cholesterol cao Nhìn chung, cholesterol tăng ước tính gây ra 2,6 triệu ca tử vong (4,5% của tổng số) và 29,7 triệu người gánh hậu quả Tổng

số cholesterol trong máu cao là nguyên nhân chính gây bệnh tật ở cả các nước phát triển

và đang phát triển như là một yếu tố nguy cơ bệnh tim thiếu máu cục bộ và đột quỵ (WHO, 2013)

Việc giảm cholesterol là vấn đề rất quan trọng để ngăn ngừa bệnh tim mạch (Lim

và cs., 2004) Một trong những giải pháp đó là nghiên cứu vi khuẩn lactic vừa có hoạt tính probiotic và vừa có hoạt tính làm giảm cholesterol là vấn đề thiết thực, được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu

Trong những năm gần đây có nhiều nghiên cứu chứng minh enzym thủy phân

muối mật (BSH) từ vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus…)

có tác dụng làm giảm cholesterol (Lim, 2004; Liong, 2005) Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn có khả năng giảm cholesterol bằng cách hấp thu trực tiếp vào màng tế bào (Ziarno, 2007)

Ngày nay việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa vi khuẩn probiotic như

Lactobacilli có tầm quan trọng ngày càng tăng Những vi khuẩn này có tác dụng

kháng khuẩn, làm tăng giá trị cảm quan, dinh dưỡng và mang lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng (Shahravy, 2012)

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 đã được chứng minh có khả năng làm

giảm cholesterol thông qua việc hấp thụ cholesterol qua màng tế bào và khả năng sinh enzym BSH đồng thời có hoạt tính probiotic như: khả năng chịu pH dạ dày, kháng

muối mật, kháng khuẩn,… (Dương Nhật Linh, 2013) Vì vậy Lactobacillus plantarum

NT1.5 có thể được ứng dụng để sản xuất các chế phẩm probiotic có hoạt tính làm giảm cholesterol

Ngày nay, nhu cầu sử dụng thực phẩm lên men kết hợp với chế phẩm sinh học ngày càng tăng Để đáp ứng nhu cầu này, việc sản xuất lượng lớn sinh khối vi sinh vật đang được quan tâm Do đó, nghiên cứu phát triển môi trường nuôi cấy mới để tăng

cường sản xuất sinh khối có thể dẫn đến việc sản xuất probiotic có hiệu quả kinh tế hơn (Shahravy, 2012)

Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng

Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm”

Nội dung thực hiện:

bào tương ứng với từng giá trị OD

gian tăng trưởng tối ưu của vi khuẩn

Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng thiết kế Plackett – Burman (P - B)

bằng phương pháp Box-Behnken

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC

1.1.1 Giới thiệu

Vi khuẩn lactic acid (LAB) là nhóm vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, là một chế phẩm sinh học an toàn cho con người (David, 2013)

Theo khóa phân loại Bergey (2001), vi khuẩn lactic được sắp xếp:

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không sinh bào tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm Những vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu, cho nên chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic, nhiều loại vitamin…, bình thường chúng không có cytochrome Vì vậy, chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, hoặc gọi là vi hiếu khí, có khả năng lên men trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí

LAB có liên kết chặt chẽ với vi khuẩn có lợi trên niêm mạc ruột của người và

động vật LAB bao gồm khoảng 20 chi trong đó chi Lactobacillus, Leuconostoc,

Pedicoccus và Streptococcus là những chi điển hình (Marcel, 2005)

Trong đó tế bào của chúng có dạng hình cầu như Streptococcus, Lactococcus,

Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus

b

a

Hình 1.1 Streptococcus a: Streptococcus dưới kính hiển vi điện tử b: Streptococcus nhuộm Gram

Hình 1.2 Lactobacillus a: Lactobacillus dưới KHV điện tử b:Lactobacillus nhuộm Gram

Bifidobacteria cũng được xem là một chi của lactic acid bacteria do có cùng đặc

điểm tiêu biểu và cách thức lên men đường

1.1.2 Con đường biến dưỡng của vi khuẩn lactic

Sự phân loại giữa các chi của vi khuẩn lactic dựa trên hình thái, cách thức lên men đường, sự phát triển ở những nhiệt độ khác nhau, cấu trúc của sản phẩm acid lactic, khả năng chịu muối, chịu acid hoặc kiềm (Mascel, 2005)

LAB có hai con đường lên men đường chính (Mascel, 2005):

lactic hay còn gọi là con đường lên men lactic đồng hình

men dị hình

Dựa vào khả năng lên men đường người ta chia LAB thành LAB đồng hình và LAB dị hình

1.1.2.1 Lên men đồng hình

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình gần như chuyển hóa hoàn toàn đường chúng

sử dụng thành acid lactic Trong điều kiện thừa glucose và oxy hạn chế lên men đồng hình 1 mol glucose theo con đường chuyển hóa EMB (Embden – Meyerhoff – Parnas) tạo 2 mol pyruvate Sự cân bằng oxi hóa khử trong tế bào được duy trì thông qua các quá trình oxi hóa của NADH, song song đó là sự khử pyruvat thành acid lactic Các phản ứng diễn ra trong phần nền tế bào chất Các enzym đặc trưng trong quá trình này

là aldolase và triozophosphateisomerase Glucose không phải là đường duy nhất có thể được sử dụng Với hệ thống enzym thích hợp, các loại đường khác có thể được chuyển đổi thành glucose hoặc một trong những chất trung gian trong quá trình như glucose-6-phosphate (hoặc trong trường hợp đường pentose, ribulose-5-phosphate) Khả năng

sử dụng các loại đường khác nhau ở vi khuẩn lactic thay đổi theo loài Đại diện cho

kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Streptococcus,Petiococcus và

Lactobacillus nhóm I (Desantis và cs., 1989)

1.1.2.2 Lên men dị hình

Lên men dị hình sử dụng con đường pentose phosphate, cách gọi khác là con đường phosphoketolase pentose Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6- phosphogloconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử

(GAP) và một phân tử acetyl phosphate GAP sau đó được chuyển hóa thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất trung gian là acetyl – CoA và acetaldehyde Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối cùng (bao gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với sản phẩm từ quá trình dị hóa một phân

tử glucose Hai enzyme đặc trưng trong quá trình này là transketolase xúc tác chuyển hóa nhóm ketol-2C và transaldolase xúc tác chuyển hóa nhóm 3C Quá trình này xảy ra

trong cytosol Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc oenococcus,

Weissella và Lactobacillus nhóm III (Desantis và cs., 1989)

1.1.3 Tổng quan về Lactobacillus plantarum

1.1.3.1 Phân loại

Theo Bergey và cộng sự, (1923) Lactobacillus plntarum được phân loại:

Giới (Kingdom): bacteria

1.1.3.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn Lactobaciillus plantarum

Lactobacillus plantarum là một trong hơn 50 loài Lactobacillus Lactobacillus plantarum là vi khuẩn gram dương, catalase âm (Bujalence, 2006), hình trực không

sinh bào tử được tìm thấy trong hệ tiêu hóa của người và động vật Vi khuẩn này lần đầu tiên được tìm thấy trong nước bọt của con người (Waugh và cs., 2009)

Lactobacillus plantarum là một loại vi khuẩn có khả năng thích nghi cao, nó có

nghi Trong chi Lactobacillus, L Plantarum được xếp vào nhóm vi khuẩn lên men dị

hình, có thể sống trong nhiều môi trường như thịt, cá, sữa, các quá trình lên men thực vật, thực vật và trong nhiều loại pho mát (Kohajdová, 2012)

L plantarum có nhiều điểm khác biệt so với các loài lactobacillus khác ở những

điểm sau:

- Có bộ gen tương đối lớn nên có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau (Kleerebezem và cs., 2003)

- Có thể lên men nhiều loại đường

-Thích nghi cao với điều kiện acid, chịu pH thấp (Daeschel và Nes 1995)

- Có thể chuyển hóa acid phenolic (Barthelmebs và cs., 2000; Barthelmebs và cs., 2001), phân giải muối tanat nhờ hoạt động của enzyme tannase (Vaquero và cs., 2004)

Hình 1.3 Lactobacillus plantarum dưới kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013)

1.1.3.3 Lợi ích của vi khuẩn L plantarum

Lactobacillus plantarum có nhiều trong nước bọt và đường tiêu hóa của con

người Nó thường được sử dụng trong các quá trình lên men thực phẩm và làm

probiotic Các chế phẩm sinh học sử dụng L plantarum ngày càng được công nhận trên

thị trường

L plantarum có thể nâng cao tính toàn vẹn ruột, hoạt động trao đổi chất của các

tế bào đường ruột, kích thích phản ứng miễn dịch (Nissen và cs., 2009)

Giảm thiểu một số triệu chứng rối loạn tiêu hóa khi điều trị bằng kháng sinh (Lonnermark và cs., 2009)

Theo nghiên cứu của nhóm Karlsson và cộng sự (2009) được tiến hành ở Thụy

Điển cho thấy uống trực tiếp L plantarum có thể tăng tính đa dạng của hệ vi sinh vật ở

ruột kết

Bảo vệ tế bào biểu mô khỏi sự gây hại của E coli bằng cách thay đổi hình thái tế

bào chủ, giảm hình thành tổn thương, tăng sức đề kháng và khả năng thẩm thấu đơn lớp phân tử (Qin và cs., 2009)

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ

LACTOBACILLUS

Các nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã và đang được triển khai rộng rãi trên toàn

thế giới, trong đó đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về Lactobacillus Tuy nhiên ở

Việt Nam, số lượng các nghiên cứu về vi khuẩn lactic còn quá khiêm tốn và có rất ít

công trình nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Lactobacillus Phần lớn các nghiên cứu về Lactobacillus ở trong nước chỉ là nghiên cứu cơ bản về nhóm vi khuẩn

này như ở mức phân lập và định danh, tuyển chọn giống có hoạt tính tốt để làm probiotic

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 2012, Hu và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi

cấy Lactobacillus plantarum YSQ khi sử dụng các sản phẩm nông nghiệp có giá thành

thấp như bột đậu nành, bột ngô, lúa mì và nước ép cà chua làm nguồn dinh dưỡng, từ

đó làm giảm giá thành sản phẩm khi lên men theo quy mô lớn

Năm 2010, Magdalena và cộng sự đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa các yếu tố dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, muối khoáng và các yếu tố tăng trưởng (vitamin

B, axit amin) khi dùng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng sinh khối vi khuẩn

Lactobacillus rhamnosus PEN

Năm 2006, Altaf và cộng sự đã tối ưu hóa môi trường thu acid lactic cho chủng

Lactobacillus amylophilus GV6 bằng cách sử dụng các nguồn cacbon, nitơ rẻ tiền như:

bột bắp, bột đậu lăng đỏ thay thế cho pepton, glucose trong môi trường MRS bằng phương pháp Plackett-Burman và đáp ứng bề mặt (RSM) Kết quả cho thấy

Lactobacillus amylophilus GV6 đạt được hiệu suất 78,4% và năng suất 96% (g acid

lactic/ g tinh bột được sử dụng)

Farooq và cộng sự (2012) đã sử dụng mật rỉ đường (phụ phẩm của quá trình sản xuất đường mía) làm nguồn cacbon trong môi trường tối ưu thu sinh khối của vi khuẩn

Lactobacillus delbrueckii

Năm 1995, Oh và cộng sự đã công bố nghiên cứu về các giá trị tối ưu của trypton,

cao nấm men, glucose, nhiệt độ nuôi cấy cho sự tăng trưởng của Lactobacillus casei YIT 9018 Kết quả giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của L.casei

YIT 9018 như sau: trypton, 3,04%; cao nấm men, 0,892%; glucose, 1,58%; nhiệt độ

Năm 2006, Zhong đã công bố nghiên cứu về tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

Lactobacillus casei LC2W bằng phương pháp bề mặt đáp ứng để tăng cường sản xuất

exopolysaccharid Kết quả tối ưu các điều kiện nuôi cấy để sản xuất exopolysaccharid: nhiệt độ nuôi cấy là 32,5°C và thời gian nuôi là 26 giờ

1.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Năm 1996, Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự đã công bố nghiên cứu về môi trường nuôi vi khuẩn lactic tốt nhất Môi trường đó là sữa gầy hoàn nguyên với thời gian lên men tốt nhất là 18-20 giờ, bổ sung giống 2-3%

Trong công bố nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự năm 2003 đã sử

dụng hai chủng Bifidobacteria bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic Tìm ra được ba môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn Bifidobacteria

bifidum là môi trường thyoglycolat, môi trường nước chiết gan, môi trường nước chiết

thịt bò ở điều kiện nuôi cấy kỵ khí Môi trường thích hợp cho L acidophilus là môi

trường MRS, môi trường nước chiết cà chua, môi trường nước chiết giá, môi trường nước thải của Công ty sữa Vinamilk

1.3 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

Quy hoạch thực nghiệm là dạng nghiên cứu về mối quan hệ nguyên nhân – kết quả Trước hết, nhà nghiên cứu cần xác định các thông số (hay các biến) cần và có thể quan tâm rồi đưa ra các chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra

mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)

1.3.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Quy hoạch thực nghiệm là cơ sở phương pháp luận của nghiên cứu thực nghiệm hiện đại Đó là phương pháp nghiên cứu mới, trong đó công cụ toán học giữ vai trò tích cực Cơ sở toán học nền tảng của lý thuyết qui hoạch thực nghiệm là toán học xác suất thống kê với hai lĩnh vực quan trọng là phân tích phương sai và phân tích hồi qui (Giang Thị Kim Liên, 2009)

1.3.1.1 Khái niệm

Quy hoạch thực nghiệm là tập hợp các tác động nhằm đưa ra chiến thuật làm thực nghiệm từ giai đoạn đầu đến giai đoạn kết thúc của quá trình nghiên cứu đối tượng (từ nhận thông tin mô phỏng đến việc tạo ra mô hình toán, xác định các điều kiện tối ưu), trong điều kiện đã hoặc chưa hiểu biết đầy đủ về cơ chế của đối tượng (Giang Thị Kim Liên, 2009)

Hình 1.6 Hộp đen trong hệ thống điều khiển một quá trình

Các tín hiệu đầu vào được chia thành ba nhóm: (Giang Thị Kim Liên, 2009)

điều chỉnh theo dự định, biểu diễn bằng vectơ:

E = [E1, E2, , Ef]

Các tín hiệu đầu ra dùng để đánh giá đối tượng là vectơ Y = (y1, y2, , yq) Chúng thường được gọi là các hàm mục tiêu Biểu diễn hình học của hàm mục tiêu được gọi là mặt đáp ứng (bề mặt biểu diễn) Phương pháp toán học trong xử lý số liệu

từ kế hoạch thực nghiệm là phương pháp thống kê Vì vậy các mô hình biểu diễn hàm mục tiêu chính là các mô hình thống kê thực nghiệm Các mô hình này nhận được khi

có công tính nhiễu ngẫu nhiên

1.3.1.3 Ưu điểm về quy hoạch thực nghiệm

Quy hoạch thực nghiệm đóng vai trò quan trọng trong khoa học kỹ thuật Các mô hình lý thuyết, giải thuật, quá trình mới luôn được kiểm nghiệm thực trước khi đem ra

ứng dụng Hơn nữa, quy hoạch thực nghiệm còn có ý nghĩa bổ sung, hoàn chỉnh các kết quả nghiên cứu sáng tạo lý thuyết đã được phát triển (Giang Thị Kim Liên, 2009)

Có thể nói, lý thuyết quy hoạch thực nghiệm từ khi ra đời đã thu hút sự quan tâm

và nhận được nhiều đóng góp hoàn thiện của các nhà khoa học Những ưu điểm rõ rệt của phương pháp này so với các thực nghiệm cổ điển là: (Giang Thị Kim Liên, 2009)

− Giảm đáng kể số lượng thí nghiệm cần thiết

− Hàm lượng thông tin nhiều hơn rõ rệt, nhờ đánh giá được vai trò qua lại giữa các yếu tố và ảnh hưởng của chúng đến hàm mục tiêu Nhận được mô hình toán học thống kê thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê, đánh giá được sai số của quá trình thực nghiệm theo các tiêu chuẩn thống kê cho phép xét ảnh hưởng của các yếu tố với mức độ tin cậy cần thiết

− Cho phép xác định được điều kiện tối ưu đa yếu tố của đối tượng nghiên cứu một cách khá chính xác bằng các công cụ toán học, thay cho cách giải gần đúng, tìm tối ưu cục bộ như các thực nghiệm thụ động

1.3.2 Thí nghiệm sàng lọc

Thí nghiệm sàng lọc là thí nghiệm được tiến hành nhằm các mục đích sau:

Xác định đâu là yếu tố ảnh hưởng chính đến đối tượng hay quá trình cần khảo sát Đáng giá mức độ ảnh hưởng của các yếu tố

Đánh giá mức độ ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố

Thí nghiệm sàng lọc thường khai thác các dạng thí nghiệm toàn phần 2 mức khi

số yếu tố thí nghiệm không lớn hoặc thiết kế thí nghiệm riêng phần hay thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman (P-B)

1.3.2.1 Sơ lược về thết kế thí nghiệm tìm các yếu tố ảnh hưởng của Plackett- Burman

Xác định các “yếu tố quan trọng” ảnh hưởng đến quá trình mục tiêu

Bắt nguồn từ ma trận đầy đủ (full - factorial matrices), sử dụng giả định rằng tất

cả các tương tác không có dấu hiệu liên quan đáng kể so với các yếu tố chính, thiết kế Plackett – Burman dựa trên ma trận hai cấp cho mỗi yếu tố và sửa đổi nó để giảm thất bại (Plackett và Burman, 1946)

Yếu tố tác động chính trong thiết kế Plackett - Burman thay thế tất cả các tương tác của một ma trận đầy đủ Tuy nhiên, điều này không có nghĩa là thông tin về sự tương tác không thể được xác định từ thiết kế Plackett-Burman (Plackett và Burman, 1946)

Với một thiết kế Plackett - Burman gồm n thí nghiệm (với n là bội số của 4, n ≤

100, ngoại trừ n = 92 là chưa thể xác định) với số yếu tố k ≤ (n - 1)

Như vậy thiết kế Plackett – Burman là thiết kế tiết kiệm thời gian và số thí nghiệm nhất với số yếu tố cần khảo sát là cao nhất Thiết kế Plackett – Burman là một thiết kế không thể thiếu khi đối tượng đang nghiên cứu chưa có nhiều thông tin về các yếu tố có khả năng ảnh hưởng chính đã được khảo sát (Plackett và Burman, 1946) Việc chọn các ma trận mà sẽ phụ thuộc vào số yếu tố thí nghiệm trên cộng với các phương pháp lựa chọn để xác định sai số thí nghiệm

Có nhiều cách để xác định sai số thí nghiệm như (Plackett và Burman, 1946):

- Chọn điểm trung tâm và cho một số thí nghiệm tại điểm đó

- Lặp lại toàn bộ ma trận thí nghiệm

- Thực hiện nhiều phép đo độc lập trong tổ hợp

 Phân tích kết quả thí nghiệm

Sau khi thử nghiệm được tiến hành, dữ liệu từ thí nghiệm được sử dụng để tính toán các hiệu ứng và để xác định ý nghĩa thống kê của những hiệu ứng (Plackett và Burman, 1946)

Để tính toán các hiệu ứng, nhập các giá trị trung bình vào ma trận Sau đó, so sánh sự khác biệt giữa các đáp ứng trung bình ở mức cao và đáp ứng trung bình ở mức thấp Các ảnh hưởng của yếu tố luôn luôn thay đổi trong các phản ứng khi đi từ cấp độ thấp đến cấp độ cao (Plackett và Burman, 1946)

Xác định được mức độ để thiết lập các yếu tố phụ thuộc vào mục tiêu thử nghiệm (Plackett và Burman, 1946):

Nếu mục đích là để tối đa hóa một phản ứng, tất cả các yếu tố có tác động tích cực sẽ được thiết lập để hoạt động ở mức độ cao và tất cả các yếu tố có tác động tiêu cực sẽ được thiết lập để hoạt động ở mức thấp

Nếu mục tiêu là để giảm thiểu các phản ứng, tất cả các yếu tố có tác động tích cực

sẽ được thiết lập ở mức thấp và tất cả đều có một tác động tiêu cực sẽ được thiết lập ở mức cao

Nếu như ảnh hưởng của các yếu tố được kiểm tra có ý nghĩa thống kê thì yếu tố

đó là 1 yếu tố quan trọng…

1.3.3 Thí nghiệm tối ưu hóa

Một trong những mục đích chính của nghiên cứu thực nghiệm trong kĩ thuật là tìm giá trị cực trị hay tìm vùng tối ưu cho một quá trình hay các điều kiện tối ưu để vận hàng một hệ thống Lớp các bài toán nghiên cứu thực nghiệm về vấn đề tối ưu thường được biết đến với tên gọi “phương pháp bề mặt chỉ tiêu” (Response Surface Method – RSM) nhằm mục đích (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011):

Chỉ ra tập giá trị các biến đầu vào (điều kiện vận hành, thực thi) sao cho tạo ra ứng xử của đối tượng nghiên cứu là tốt nhất

Tìm kiếm các giá trị biến đầu vào nhằm đạt được các yêu cầu cụ thể về ứng xử của đối tượng nghiên cứu

Xác định các điều kiện vận hành mới nhằm đảm bảo cải thiện chất lượng hoạt động của đối tượng so với tình trạng cũ

Mô hình hóa quan hệ giữa đối tượng đầu vào và ứng xử của đối tượng nghiên cứu, dùng làm cơ sở dự đoán hay điều khiển quá trình hay hệ thống

Tiến trình tối ưu hóa RSM thường gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn : Thí nghiệm khởi đầu

Giai đoạn 2: Leo dố tìm vùng cực trị

Giai đoạn 3: Thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu

1.3.3.1 Thí nghiệm khởi đầu

Sau khi tiến hành các thí nghiệm sàng lọc, ta cần loại bỏ bớt các biến có ảnh hưởng không đáng kể đến hàm mục tiêu Tiếp tục tiến hành một số thí nghiệm với các biến còn lại, đồng thời bổ sung thêm một số điểm thí nghiệm trung tâm nhằm đánh giá mức độ phù hợp (Lack-of-fit) của mô hình hồi quy bậc nhất đã xây dựng cho hàm mục tiêu Việc đánh giá như vậy được gọi là “kiểm định mức độ không phù hợp của mô hình” Giả thuyết thống kê được phát biểu như sau:

Giả thuyết đảo: Mô hình khớp với dữ liệu

Giả thuyết chính: Mô hình không khớp với dữ liệu

Để kiểm định về mức dộ phù hợp của mô hình mỗi biến trong một kế hoạch cần nhận 3 mức giá trị

Cũng như các phép kiểm định thống kê khác thông số quan trọng để chấp nhận hay loại bỏ giả thuyết đảo là giá trị p (p-value) Lý thuyết tính toán thống kê chỉ ra như sau:

Nếu giá trị p nhỏ hơn mức ý nghĩa α, ta loại bỏ giả thuyết đảo Nghĩa là mô hình xây dựng không khớp với dữ liệu

Nếu giá trị p lớn hơn mức ý nghĩa α, mô hình đã dựng là phù hợp để mô tả dữ liệu

1.3.3.2 Leo dốc tìm vùng cực trị

Nếu kết quả thí nghiệm khởi đầu cho thấy có thể mô tả hàm mục tiêu bằng một hàm hồi quy bậc nhất, điều đó chứng tỏ vùng thí nghiệm của ta còn ở xa vùng chứa cực trị (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)

Để tìm được vùng chứa cực trị, ta cần thay đổi giá trị các biến thí nghiệm và thực hiện một chuỗi các thí nghiệm liên tiếp ứng với các giá trị mới của biến thí nghiệm để theo dõi sự thay đổi của hàm mục tiêu Các thí nghiệm này gọi là các thí nghiệm leo dốc/ xuống dốc

Để tiến nhanh đến vùng chứa cực trị của hàm mục tiêu, ta cần xác định đúng hướng điều chỉnh giá trị các bước thí nghiệm

Các bước xác định các thông số leo dốc:

thường ta chọn biến dễ điều khiển nhất hoặc biến ứng với hệ số hồi quy có giá trị tuyệt đối lớn nhất

Bước 2: Xác định gia số các biến còn lại theo công thức:

Bước 3: Tiến hành thí nghiệm

Có thể tiến hành các thí nghiệm đơn hoặc lặp để giảm sai số, theo dõi kết quả thay đổi của hàm mục tiêu Giá trị hàm mục tiêu sẽ thể hiện sự cải thiện (tăng khi leo dốc, giảm khi xuống dốc) Tiến hành các thí nghiệm cho đến khi hàm mục tiêu đổi chiều

1.3.3.3 Thí nghiệm bề mặt đáp ứng

Khi cần mô tả chính xác quan hệ giữa hàm mục tiêu và các biến thí nghiệm, ta tiến hành kế hoạch thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu Mục đích của kế hoạch này là bổ sung các điểm thí nghiệm nhằm có thể xây dựng mô hình bậc 2 mô tả hàm mục tiêu (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)

Mô hình bậc hai có dạng:

Với:

Y: Hàm mục tiêu

βi: Hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của yếu tố Xi đối với Y

với Y

 Các bước tiến hành:

- Xây dựng kế hoạch thí nghiệm

- Tiến hành các thí nghiệm và thu thập kết quả

- Phân tích số liệu thí nghiệm; xây dựng mô hình hồi quy

- Xác định điều kiện tối ưu hóa

- Thực hiện các thí nghiệm kiểm định

Có hai dạng kế hoạch thí nghiệm bề mặt chỉ tiêu: thiết kế dạng hỗn hợp tâm xoay (CCD – Central Composite Design) và thiết kế Box – Behnken (Box – Behnken Design)

Thiết kế Box-Behnken được hai tác giả Box và Behnken đề xuất năm 1960 với mục đích thiết kế các thí nghiệm 3 mức nhằm xây dựng bề mặt chỉ tiêu Thiết kế này

có tính chất tâm xoay hoặc gần như có tâm xoay (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)

Số thí nghiệm được tính theo công thức: (Giang Thị Kim Liên., 2009)

Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box và

Behnken, 1960)

Thiết kế Box-Behnken có những ưu điểm:

- Số lần thí nghiệm cho mỗi lần lặp ít

- Không có điểm thí nghiệm nào vượt ra ngoài khoảng giữa 2 mức đã thiết lập cho mỗi biến

1.4 PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0

Các kết quả nghiên cứu cần được phân tích và xử lí để thông qua đó, chỉ ra các ý nghĩa của bảng kết quả Với sự trợ giúp của máy tính và các phần mềm chuyên dụng, thiết kế thí nghiệm và xử lí số liệu thực nghiệm đã trở nên nhẹ nhàng và đơn giản hơn rất nhiều (Nguyễn Văn Dự và cs., 2011)

Minitab là một phần mềm máy tính giúp ta hiểu biết thêm về thống kê và tiết kiệm thời gian tính toán

Phần mềm này ban đầu được thiết kế để phục vụ giảng dạy môn thống kê, sau đó

đã được phát triển thành công cụ phân tích và trình bày dữ liệu rất hiệu quả

Giao diện của Minitab ở dạng đồ họa, với các menu và hộp thoại rất đơn giản và

dễ dùng, vận hành như một hộp đen, nhận dữ liệu đầu vào và phân tích, xử lý theo yêu cầu của người sử dụng sau đó hiển thị kết quả thông qua các các cửa sổ (Nguyễn Văn

Dự và cs., 2011)

− Dữ liệu nhập vào có thể được nhận thông qua nhập liệu trực tiếp vào các cửa sổ bảng tính hoặc lấy file dữ liệu của Minitab hoặc từ các ứng dụng bảng tính khác như Excel hay Lotus thông qua chức năng sao chép – dán Ngoài ra Minitab cũng nhận nhấp liệu từ Session Window thông qua các ngôn ngữ nhập lệnh của Minitab

− Kết quả sẽ là các kết quả bằng số, chữ và hình ảnh đồ thị thông qua các cửa sổ Minitab

− Các đồ thị mô tả thống kê của Minitab có hình thức trình bày rất rõ ràng, có thể

dễ dàng hiệu chỉnh theo ý muốn Các đồ thị này cũng có thể kết xuất ra nhiều dạng ảnh hiệu chỉnh được…

Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0

CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU

- Thời gian: Từ tháng 11/2013 đến tháng 5/2014

- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công Nghệ Vi Sinh-Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum NT1.5 được cung cấp từ Phòng thí

nghiệm Công nghệ Vi sinh–Trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh đã được chứng minh

có khả năng làm giảm cholesterol và khả năng làm probiotic (Dương Nhật Linh và cs., 2013)

2.2.2 Môi trường – hóa chất

- Tủ sấy

- Lò viba

- Máy đo pH

- Máy đo mật độ quang

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Hoạt hóa chủng

plantarum NT1.5 trên 5mL môi trường MRS (DeMan Rogosa and Sharpe) ủ ở 37oC / 24-48 giờ

Từ ống môi trường lỏng đã hoạt hóa 24-48 giờ chúng tôi tiến hành cấy ria trên

Sau 48 giờ chọn những khuẩn lạc riêng lẻ, điển hình cấy trên môi trường thạch đứng MRSA giữ chủng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.3.2 Xây dựng biểu đồ tương quan giữa giá trị OD và nồng độ tế bào

2.3.2.1 Định lượng tế bào bằng phương pháp đo OD

Nguyên tắc

Khi một pha lỏng có nhiều phân tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù

và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào Trong một giới hạn của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do đó, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng cách so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm (Trần Linh Thước và cs., 2001)

Thực hiện

ở các nồng độ đếm được

 Xây dựng đường tương quan giữa OD610 và mật độ tế bào tương ứng với các huyền phù bằng phần mềm Excel của Microsoft

2.3.2.2 Định lượng tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Phương pháp định lượng tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc được tiến hành với các bước sau: (Trần Linh Thước và cs., 2001)

-5,…

pha loãng trải 3 đĩa

Lactobacillus plantarum NT 1.5 tại mỗi độ pha loãng: chọn độ pha loãng có số khuẩn

lạc phân bố hợp lý nhất và trong khoảng 25 – 250 khuẩn lạc/ đĩa, đếm số khuẩn lạc trên

cả 3 đĩa lặp lại trên cùng độ pha loãng

Trong đó:

A: Mật độ tế bào (CFU/ mL)

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được

V: Số mL dịch mẫu cấy vào mỗi đĩa

2.3.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng của L plantarum NT 1.5

2.3.3.1 Nguyên tắc

Sự tăng trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể và tốc độ tăng trưởng là sự tăng trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời

gian Một quần thể vi sinh vật thường có những đặc trưng tăng trưởng riêng khi được nuôi cấy trong một môi trường và điều kiện nhất định

Động thái tăng trưởng của vi sinh vật bắt đầu từ một pha tiềm tàng (lag phase) Sau đó, sự tăng trưởng bắt đầu và số lượng tế bào tăng lũy tiến, giai đoạn này gọi là pha log (log phase) Theo thời gian, nguồn dinh dưỡng trong môi trường trở nên cạn kiệt cùng với sự tích lũy của độc chất Sự tăng trưởng dừng lại và đi vào pha ổn định (stationary phase) Nếu tiếp tục nuôi cấy, các tế bào bắt đầu chết và đi vào pha suy tàn (death phase) Mỗi loại vi khuẩn lại có đường cong tăng trưởng riêng, do đó cần phải khảo sát đường cong tăng trưởng của chủng vi khuẩn đang quan tâm để xác định được thời gian thu nhận sản phẩm thích hợp (Nguyễn Thành Đạt, 2011)

2.3.3.2 Thực hiện

bào/mL, sau đó hút 2 mL dịch khuẩn cho vào erlen chứa 18 mL môi trường MRS Nuôi

giờ, 15 giờ, 18 giờ, 21 giờ, 24 giờ, 27 giờ, 30 giờ, 33 giờ, 36 giờ, 39 giờ, 42 giờ, 48 giờ

trưởng của vi sinh vật bằng phần mềm Excel của Microsoft

2.3.4 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho sự tăng trưởng của L plantarum

Hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật là kết quả của các phản ứng hóa học Các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt độ, do đó yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Vùng sinh trưởng của vi sinh vật

là vùng giới hạn giữa nhiệt độ cực đại và nhiệt độ cực tiểu mà vùng này khác nhau giữa các loài

trong môi trường pH ảnh

và các enzyme chứa trong thành tế bào và màng tế bào chất Mỗi loài vi sinh vật chỉ thích hợp sống trong khoảng pH nhất định (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000)

tế bào/mL, sau

đó hút 1 mL dịch khuẩn vào 9 mL môi trường MRS được điều chỉnh ở các giá trị pH

lần lượt như sau: 4, 5, 6, 7, 8 (Bevilacqua và cs., 2008)

Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần

để xác định mật độ tế bào

 Kết quả

Excel của Microsoft

2.3.5 Sàng lọc các yếu tố dinh dưỡng

2.3.5.1 Nguồn nitơ

urê với nồng độ khảo sát được thể hiện trong bảng 2.1 (Han và cs., 2011; Altaf và cs., 2006)

Bảng 2.1 Các nguồn nitơ khảo sát

Môi trường chọn lọc nguồn Nitơ tối ưu gồm có nguồn nitơ cần khảo sát, glucose

2.3.5.2 Nguồn cacbon

Các nguồn cacbon được khảo sát là: succrose, maltose, lactose, glucose, mật rỉ đường, bột bắp với khối lượng khảo sát được trình bày trong bảng 2.2 (Altaf và cs., 2006; Farooq và cs., 2012; Han và cs., 2011; Magdalena và cs., 2010)

Bảng 2.2 Các nguồn cacbon khảo sát

Môi trường chọn lọc nguồn cacbon tối ưu gồm có nguồn nitơ tối ưu, nguồn

2.3.5.3 Nguồn khoáng

Khảo sát các nguồn khoáng: CaCl2, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, K2HPO4,

Môi trường chọn lọc nguồn khoáng tối ưu bao gồm nguồn nitơ tối ưu (10 g/L),

tế bào/ mL sau đó bổ sung 1mL dịch khuẩn vào 20

mL môi trường khảo (pH, nhiệt độ theo kết quả mục 2.3.4.) trong khoảng thời gian

Sau thời gian nuôi cấy đo mật độ tế bào L plantarum NT 1.5 bằng phương pháp

đo độ đục ở bước sóng 610 nm

Các thử nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được xử lý thống kê ANOVA một yếu

tố bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0 và phần mềm Excel Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số

2.3.6 Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman

Mục đích

Xác định các yếu tố quan trọng ảnh hưởng chính đến quá trình lên men thu

sinh khối của chủng vi khuẩn L plantarum NT 1.5

Thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman

Thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman với các yếu tố gồm có: nguồn nitơ, cacbon và các nguồn khoáng đã được chọn ở mục 2.4

Mỗi yếu tố được khảo sát ở 2 mức độ: mức độ cao (+1) và mức độ thấp (-1) Thiết kế được bố trí dựa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm bằng phần mềm thống kê Minitab 16.2.0 của Minitab Inc., USA để ước tính các giá trị t-value, p-value và mức độ tin cậy

giờ

Bổ sung 1 mL dịch khuẩn vào 20 mL môi trường khảo sát

 Số liệu kết quả thí nghiệm được thống kê bằng phần mềm Minitab 16.2.0

 Ảnh hưởng của các yếu tố đến sinh khối chủng vi khuẩn được mô tả qua phương trình hồi quy bậc nhất:





 Dựa vào phân tích hồi quy, nếu mức ý nghĩa đạt trên 95% (p < 0,05), thì yếu tố

đó được cho là có ảnh hưởng chính đến sự tăng sinh khối tế bào và với kết quả thu tiếp tục thực hiện các thí nghiệm tiếp theo để xác định giá trị tối ưu cho sự gia tăng sinh khối