Xây dựng quy trình định lượng nồng độ BKV DNA bằng kỹ thuật real time PCR và phân tích đặc điểm di truyền phân tử của virus BK ở bệnh nhân ghép thận

Trong khi đó, việc xác định, theo dõi, giám sát tải lượng BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR trong máu của bệnh nhân ghép thận đã được công nhận là công cụ rất có giá trị tiên đoán BKVN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH H ỌC

LÊ THỊ BẢO QUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV- DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà N ội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH H ỌC

LÊ THỊ BẢO QUYÊN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG NỒNG ĐỘ BKV- DNA BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA VIRUS BK Ở BỆNH NHÂN GHÉP THẬN

L ỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn đầu tiên tôi xin trân trọng gửi tới TS Hoàng Xuân Sử, người

thầy đã truyền cảm hứng nghiên cứu khoa học cũng như tận tình giúp đỡ, giảng giải

và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn nghiên cứu này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Mai Thị Đàm Linh, người thầy đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đinh Thị Thu Hằng cùng các cán bộ nhân viên trong phòng thí nghiệm “Vi sinh và các Mầm bệnh Sinh học – Viện Nghiên

cứu Y Dược học Quân sự - Học viện Quân y đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình

thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy, các cô trong bộ môn Vi sinh vật cùng các thầy cô giáo khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học

Quốc gia Hà Nội đã hết lòng giảng dạy kiến thức khoa học cho tôi trong quá trình

học tập và nghiên cứu tại trường

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp

đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Hà N ội, 18 tháng 2 năm 2020

Học viên

Lê Thị Bảo Quyên

PCR Polymerase Chain Reaction

RFLP Restriction fragment length polymorphism ROC Receiver operating characteristic

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 2 1 Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 30

Bảng 2 2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 31

Bảng 2 3 Thành phần và điều kiện Nested PCR khuếch đại gen VP1 35

Bảng 2 4 Thí nghiệm đánh giá độ nhạy mẫu bệnh phẩm 42

Bảng 3 1 Thành phần phản ứng real-time PCR 51

Bảng 3 2 Đánh giá độ đặc hiệu 52

Bảng 3 3 Khảo sát độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trên mẫu bệnh phẩm 56

Bảng 3 4 Đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn nồng độ 101-103 IU/µl 58

Bảng 3 5 Tỷ lệ nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận 61

Bảng 3 6 So sánh giữa ba nhóm bệnh nhân dựa vào giá trị ngưỡng 65

Bảng 3 7 Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng ở bệnh nhân ghép thận 66

Bảng 3 8 Sự phân bố các phân nhóm của BKV 69

Bảng 3 9 Vị trí SNP khác nhau giữa kiểu gen BKV-I và BKV-IV 70

Bảng 3 10 Xác định vị trí SNP BKV-I trong vùng gen VP1 (1630-1956) 71

Bảng 3 11 Đa dạng SNP ở kiểu gen BKV-IV 72

Bảng 3 12 Trình tự axit amin ở những vị trí SNP trong phân nhóm IV 73

Bảng 3 13 So sánh trình BKV phân lập theo cặp từ mẫu máu 74

Bảng 3 14 Sự phân bố kiểu gen BKV theo các chỉ số lâm sàng 77

DANH M ỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Cấu trúc virion BKV 7

Hình 1 2 Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của BKV 9

Hình 1 3 Các tế bào decoy trong nước tiểu 17

Hình 2 1 Vector pGEM T easy 29

Hình 3 1 Khuếch đại đoạn chèn cho tách dòng 45

Hình 3 2 Kết quả sàng lọc plasmid tái tổ hợp trên môi trường 46

Hình 3 3 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme và AvaII 47

Hình 3 4 Kết quả so sánh trình tự đoạn chèn với trình tự trên Ngân hàng gen Quốc tế bằng phần mềm Blast 48

Hình 3 5 Kiểm tra lại trình tự mồi và probe cho real-time PCR 49

Hình 3 6 Tối ưu nồng độ probe 50

Hình 3 7 Tối ưu nồng độ mồi 50

Hình 3 8 So sánh sự tương quan giữa bộ mẫu chuẩn WHO và LDA 53

Hình 3 9 Xác định khoảng định lượng của bộ mẫu chuẩn 56

Hình 3 10 Ngưỡng phát hiện BKV-DNA trên mẫu bệnh phẩm 57

Hình 3 11 So sánh sự tương quan giữa hai bộ kit 58

Hình 3 12 Phân tích sự khác biệt giữa hai bộ kit 59

Hình 3 13 Đường cong ROC BKV-DNA trong máu nhằm phát hiện BKVN 63

Hình 3 14 Đường cong ROC BKV-DNA trong nước tiểu nhằm phát hiện BKVN63 Hình 3 15 Cây phát sinh loài trên vùng gen VP1-BKV (1630-1956) 68

M ỤC LỤC

M Ở ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 D ịch tễ học 3

1.2 T ổng quan về BKV 5

1.2.1 L ịch sử phát hiện BKV 5

1.2.2 Đặc điểm sinh học 6

1.3 Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận 11

1.3.1 Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận 11

1.3.2 Độc lực kiểu gen BKV và bệnh lý ghép thận 13

1.4 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV 16

1.4.1 T ế bào học 16

1.4.2 Sinh thiết thận 17

1.4.3 Ch ẩn đoán sinh học phân tử 17

1.5 Tình hình nghiên c ứu BKV 19

1.5.1 Tình hình nghiên c ứu phát triển kit 19

1.5.2 Tình hình nghiên c ứu hiện trạng nhiễm BKV 21

1.6 Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh 22

1.6.1 Định nghĩa 22

1.6.2 Đặc điểm của các phương pháp xây dựng cây chủng loại 23

1.6.3 Ứng dụng cây chủng loại phát sinh trong xác định genotype BKV 25

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Nguyên li ệu 27

2.1.1 M ẫu nghiên cứu 27

2.1.2 Các v ật liệu 27

2.1.3 Hóa ch ất 29

2.2 Thi ết bị chính 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 33

2.3.2 Xây d ựng quy trình định lượng nồng độ BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR 34

2.3.3 Phân tích đặc điểm di truyền BKV ở bệnh nhân ghép thận 43

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Xây d ựng quy trình định lượng BKV-DNA bằng real-time PCR 45

3.1.1 Tách dòng vùng gen VP1 45

3.1.2 Thi ết lập bộ mẫu chuẩn 48

3.1.3 Thi ết kế mồi và probe cho real-time PCR 49

3.1.4 T ối ưu kỹ thuật real-time PCR 49

3.1.5 Đánh giá kỹ thuật real-time PCR 52

3.1.6 Quy trình xác định tải lượng virus BK trong máu và nước tiểu ở bệnh nhân ghép th ận 60

3.2 Xác định vai trò BKV-DNA với bệnh thận do BKV 61

3.2.1 Xác định tỷ lệ lưu hành BKV ở bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR61 3.2.2 Xác định giá trị ngưỡng BKV-DNA dự đoán BKVN 62

3.2.3 Đánh giá vai trò BKV-DNA với các yếu tố lâm sàng 66

3.3 Phân tích đặc điểm di truyền phân tử BKV 67

3.3.1 Xác định kiểu gen BKV lưu hành tại Việt Nam 67

3.3.2 Phân tích các v ị trí SNP-BKV trên vùng gen VP1 ở bệnh nhân ghép thận70 3.3.3 Đánh giá vai trò của kiểu gen BKV với bệnh thận do BKV 77

K ẾT LUẬN 79

KI ẾN NGHỊ 80

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 81

M Ở ĐẦU

Ghép thận là phương pháp điều trị thay thế hiệu quả nhất hiện nay cho những

bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Ở nước ta, ước tính khoảng 80.000 bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối, 90% bệnh nhân suy thận mạn dẫn đến tử vong do không được điều trị và khoảng 4.000 bệnh nhân có nhu cầu ghép thận mỗi năm Cho đến nay nhiều cơ sở y tế trong cả nước đã triển khai thành công kỹ thuật này, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cũng như hiệu quả kinh tế cho những bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối

Với sự ra đời của các loại thuốc ức chế miễn dịch thế hệ mới kèm theo là sự tái hoạt động mạnh của BK virus (BKV) được khẳng định là nguyên nhân quan

trọng hàng đầu dẫn đến rối loạn chức năng thận ghép, thậm chí mất mô ghép ở bệnh nhân sau ghép thận Một số nghiên cứu tiến cứu theo dõi ở những người nhận thận ghép cho thấy sự xuất hiện rất sớm BKV trong máu và nước tiểu, thậm chí trong

những giờ đầu sau ghép, với tỷ lệ mắc cao nhất xảy ra khoảng từ 1-3 tháng sau ghép Tỷ lệ BKVN (BK Virus Nephropathy: bệnh thận do BKV) ước tính khoảng 1-10% trong năm đầu sau ghép thận, trong đó 50% trường hợp BKVN bị thải ghép hoàn toàn [8]

Hiện nay, vấn đề theo dõi và giám sát nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận tại nước ta chưa nhận được sự quan tâm đúng mức trong các cơ sở y tế có khả năng

thực hiện ghép thận Chẩn đoán BKVN ban đầu thường gặp nhiều khó khăn do biểu

hiện lâm sàng không đặc hiệu, nghèo triệu chứng, do đó dễ bỏ sót chẩn đoán hoặc

nhầm với giai đoạn thải ghép cấp Sinh thiết thận được coi là tiêu chuẩn vàng trong xác định BKVN, nhưng đây lại là phương pháp xâm lấn, đòi hỏi trang thiết bị đồng

bộ và đào tạo chuyên sâu Trong khi đó, việc xác định, theo dõi, giám sát tải lượng BKV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR trong máu của bệnh nhân ghép thận đã được công nhận là công cụ rất có giá trị tiên đoán BKVN [8] Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử về BKV được công bố ở Việt Nam Một số

cơ sở y tế đã sử dụng các kit thương mại như Realstar BKV PCR Kit (Altona

1

Diagnostics, Germany), Artus® BK Virus RG PCR Kit (Qiagen, Germany) … xác định tải lượng BKV-DNA, tuy nhiên giá thành các kit này rất cao và đòi hỏi đầu tư trang thiết bị đồng bộ, đồng thời còn chưa đề cập đến khía cạnh các kit này có thể không phù hợp với một số chủng BKV lưu hành ở Việt Nam

Một số nghiên cứu đề nghị rằng tải lượng BKV trong nước tiểu >107 copy/ml hay trong máu >104 copy/ml là giá trị cho phép chẩn đoán sớm BKVN [35] Tuy nhiên con số chính xác về giá trị ngưỡng cho phép phát hiện BKVN phụ thuộc vào

độ nhạy kỹ thuật real-time PCR cũng như sự tương tác giữa virus và người bệnh ở

những khu vực địa lý khác nhau Mặt khác, BKV genotype I-IV cũng như các biến

thể khác của virus đã được tìm thấy ở những bệnh nhân BKVN [7] Giải trình tự vùng gen VP1 từ mẫu sinh thiết thận từ bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép nhấn

mạnh sự tồn tại của các “điểm nóng” đa hình, với trình tự không ổn định theo thời gian ở hầu hết các trường hợp được theo dõi [18] Các nghiên cứu in vitro gần đây

về các phân nhóm biến thể cho thấy sự thay thế axit amin có thể làm thay đổi khả năng tương tác của virus với các tế bào chủ, do đó thay đổi độc lực của virus với người bệnh [18] Như vậy, sự đa dạng về đặc điểm di truyền BKV rất cần thiết để tìm kiếm mối quan hệ tiềm năng giữa kiểu gen của BK virus và bệnh cảnh lâm sàng sau ghép thận

Cho đến nay, ở nước ta mới chỉ có một vài công bố về ca lâm sàng nhiễm BKV ở bệnh nhân sau ghép thận Nhận thấy tính cấp thiết của tình hình trên, chúng tôi thực hiện đề tài với hai mục tiêu:

1 Xây d ựng quy trình xác định tải lượng BK virus trong máu và nước

ti ểu của bệnh nhân ghép thận bằng kỹ thuật real-time PCR

2 Xác định tỷ lệ lưu hành và kiểu gen BKV, kết hợp phân tích các đặc điểm di truyền phân tử của BKV ở những bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam

2

Sự tái hoạt động của BKV được kích hoạt khi phản ứng miễn dịch trung gian qua tế bào suy giảm, điển hình ở các cá nhân bị suy giảm miễn dịch như AIDS, phụ

nữ có thai, bệnh nhân bị tiểu đường và đặc biệt là những trường hợp ghép tạng Sau khi nhân lên, BKV đi vào các mao mạch, xuất hiện trong nước tiểu và tấn công bộ phận ghép, dẫn đến các tổn thương khác nhau Khi sự nhân lên của BKV bắt đầu

xảy ra ở vùng vỏ thận thì có sự liên quan rõ rệt với sự hoại tử của tế bào biểu mô ống thận và nồng độ creatinine huyết thanh tăng [42] Người ta cho rằng cơ chế dẫn đến rối loạn chức năng mô ghép thận đồng loại là do rò rỉ và sự chảy ngược nước

tiểu từ các ống thận bị tổn thương vào các khoang kẽ và các mao mạch quanh ống

thận Do đó tổn thương và hoại tử ống thận cấp là đặc điểm quan trọng của bệnh

thận do BKV và là một yếu tố xác định BKVN [38] Sự tổn thương thận mạn tính

do BKV dẫn đến xơ hóa mô kẽ của thận không thể hồi phục và teo ống thận Khoảng 1/3 số bệnh nhân xuất hiện BKV trong nước tiểu sẽ phát triển BKV trong máu và nếu không được can thiệp kịp thời sẽ phát triển thành BKVN (tỷ lệ dao động từ 1 đến 10%) [71] Sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận lần đầu tiên được chứng minh qua sự phát tán virus trong nước tiểu, với tỷ lệ từ 20% đến 60% bệnh nhân Dữ liệu từ Mạng lưới chia sẻ nội tạng Hoa Kỳ (The United

3

Network for Organ Sharing) cho thấy tổn thương về thận ghép liên quan đến BKV

là 7,5% (70/938) trong năm 2009 và 5,7% (36/632) vào năm 2010 [68]

Một số yếu tố nguy cơ nhiễm BKV trước ghép bao gồm giới tính nữ, mô ghép từ người cho chết não, những chấn thương gây thiếu máu cục bộ, kháng thể đặc hiệu BKV cao ở người cho thận, sự không phù hợp HLA cũng như người cho là người Mỹ gốc Phi [8] Mức độ ức chế miễn dịch là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất

ở những bệnh nhân ghép thận dẫn tới nhiễm BKV cũng như phát triển BKVN, tuy nhiên chưa có những tiêu chuẩn liều lượng ức chế miễn dịch liên quan chắc chắn đến sự xuất hiện của BK trong nước tiểu Bên cạnh đó, những giả thuyết cho rằng kháng thể trong huyết thanh của người cho có thể là nguyên nhân chính làm tăng nguy cơ nhiễm BKV cũng như BKVN ở bệnh nhân sau ghép thận còn gây nhiều tranh cãi Kết quả nghiên cứu của Shah và cộng sự (2000) [75], cho thấy những trường hợp mà BKV âm tính trong huyết thanh người nhận nhưng dương tính với huyết thanh người cho có nguy cơ phát triển BKVN cao nhất (43%) Trong khi đó, Bohl và cộng sự (2005) [25], lại ghi nhận nhóm có nguy cơ cao nhất phát triển BKVN (50%) là nhóm huyết thanh dương tính với BKV ở cả người cho và người

nhận Mặt khác, trong cả hai nghiên cứu, đều đồng nhất kết quả nhiễm BKV thấp

nhất (10%) khi huyết thanh đồng thời của người cho và người nhận âm tính với BKV Hơn nữa, Bohl và cộng sự cũng chỉ ra sự vắng mặt của HLA-C7 ở người

nhận có liên quan đến tăng nguy cơ nhiễm trùng [25]

Các yếu tố nguy cơ sau ghép dẫn tới BKVN bao gồm tổn thương niệu quản, đái tháo đường, độ trễ chức năng thận ghép, nhiễm cytomegalovirus, điều trị thải ghép cấp tính bằng các loại thuốc ức chế calcineurin hoặc steroid Ngoài ra, những

bệnh nhân có HLA và ABO không tương thích với người cho hoặc tổn thương niệu

quản do đặt stent niệu quản có thể dẫn tới nguy cơ bị BKVN cao hơn [8]

Một số báo cáo cũng cho thấy sự xuất hiện của BKV trong máu hoặc nước tiểu có thể phát hiện ở những bệnh nhân ghép tạng khác [6], [49], như ghép tim, phổi và gan, nhưng nhìn chung sự có mặt của BKV trong máu hoặc nước tiểu không

4

liên quan đến chức năng thận suy giảm ở những bệnh nhân này [60], [71] Ở những

bệnh nhân ghép tế bào gốc, sự tái hoạt động của BKV gắn liền với tình trạng viêm bàng quang xuất huyết với các triệu chứng như khó tiểu, tiểu ra máu Tỷ lệ nhiễm BKV trong nước tiểu dao động từ 50%-100% ở người nhận ghép tủy xương và ghép

tế bào gốc tạo máu trong vòng 2 tháng sau cấy ghép [18]

BKV cũng được báo cáo là nguyên nhân gây ra hẹp niệu quản, hội chứng

thận hư, viêm bàng quang, viêm phổi, hội chứng tan máu và bệnh đa hồng cầu liên quan đến polyomavirus BKV cũng có thể liên quan đến bệnh lupus ban đỏ hệ thống

bằng cách tạo ra các kháng thể chống lại DNA và histones cũng như liên quan đến các khối u và ung thư [38] Hẹp niệu quản liên quan đến BKV đã được báo cáo ở

những người nhận ghép thận cũng như những người ghép tế bào gốc tạo máu Barasa.N và cộng sự (2010) [63], đã ghi nhận trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu

xuất hiện một loạt các biến chứng sau ghép bao gồm hẹp niệu quản, viêm bàng quang xuất huyết và hội chứng thận ứ nước Bệnh nhân này được chỉ định xét nghiệm máu với sự xuất hiện của herpes simplex virus (HSV) sau 21 ngày ghép, và BKV sau 28 ngày Mặt khác, sự lan rộng nhiễm trùng nội mô do BKV được ghi

nhận là có liên quan đến những tổn thương tế bào nội mô, dẫn đến tổn thương mao

mạch, phù nề và tăng sinh khối u trên cả hai bên thận Báo cáo của Bratt G và cộng

sự (1999) [26], về một trường hợp bệnh nhân bị viêm võng mạc đang trong giai đoạn AIDS tiến triển, ghi nhận BKV liên quan chặt chẽ tới viêm phổi Hai trường

hợp tử vong do viêm phổi khác đã được báo cáo, trong đó 1 bệnh nhân sau ghép tế bào gốc tạo máu và một bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu lympho mãn tính trong giai đoạn hóa trị liệu [4], [89]

1.2 T ổng quan về BKV

1.2.1 L ịch sử phát hiện BKV

BKV được phát hiện lần đầu vào năm 1971, tại phòng thí nghiệm nghiên cứu virus thuộc Lodon, Anh Trong một nghiên cứu dịch tễ học về nhiễm cytomegalovirus ở những người nhận ghép thận, Sylvia Gardner đã quan sát thấy

5

những mụn cóc sinh dục chứa hạt virus tương tự như papillomavirus ở một bệnh nhân nam người Sudan Những báo cáo tương tự về tình trạng mụn cóc xuất hiện nhiều ở những bệnh nhân ghép thận cũng đã được công bố trước đó, tuy nhiên, yếu

tố quan trọng trong lâm sàng của bệnh nhân này là hiện tượng hẹp niệu quản, dẫn

tới phải can thiệp phẫu thuật Sau khi tiêm nước tiểu của bệnh nhân vào tế bào thận

khỉ rhesus và các tế bào thận trong phôi thai người, xuất hiện bệnh học tế bào nhưng không phải do papillomavirus Do đó, virus này được xác định là virus mới, đặt tên

là BK theo tên viết tắt của bệnh nhân được phân lập lần đầu tiên [70]

1.2.2 Đặc điểm sinh học

1.2.2.1 Phân lo ại

BKV thuộc họ Polyomaviridae, chi Polyomavirus BKV cùng họ với JC virus (JCV) cũng như virus Simian 40 (SV40) BKV, JCV và SV40 là ba virus thuộc họ polyomavirus, có tính tương đồng cao ở trình tự DNA và promassimotein

Sự tương đồng trong trình tự gen giữa BKV – JCV và BKV - SV40 lần lượt là 72%

và 69% Cả ba virus đều mã hóa cho 6 loại protein Sự tương đồng axit amin trong vùng sớm là 88% giữa BKV - JCV, 81% giữa BKV - SV40 và 79% giữa JCV - SV40 Ở khu vực mã hóa muộn (các protein cấu trúc), sự tương đồng là 86% giữa BKV- JCV, 85% giữa BKV - SV40 và 82% giữa JCV - SV40 [9]

1.2.2.2 C ấu trúc virion

BKV không có vỏ bao ngoài nhưng có vỏ capsid hình khối đa diện với 20

mặt tam giác đều, đường kính dao động từ 40-44 nm Capsid gồm các protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3, bao quanh phân tử DNA kép mạch vòng được gắn kết cùng

với protein histone Protein capsid được sắp xếp trong một cấu trúc đa diện 7 mặt có

chứa 360 phân tử VP1, sắp xếp thành 72 patamers Mỗi patamer liên kết với bên trong bằng một phân tử protein capsid VP2 hoặc VP3 Do đó, VP1 là protein duy

nhất bộc lộ bên ngoài virion, chịu trách nhiệm gắn kết virus với thụ thể tế bào chủ cũng như thúc đẩy quá trình xâm nhập [3] Trong những nghiên cứu gần đây, khi quan sát BKV dưới kính hiển vi điện tử, các nhà khoa học thấy những điểm tương

6

tác giữa protein VP2, VP3 với protein histone và hệ gen Nhiều giả thuyết đặt ra, VP2 và VP3 là cầu nối giữa VP1 và cấu trúc chromatin [43]

Kích thước bộ gen BKV khoảng 5,3 kb, chứa các gen mã hóa cho protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3), các protein giúp cho quá trình nhân lên của virus (LTA: Large T antigen, STA: Small T antigen, agnoprotein) và vùng không mã hóa (NCCR: Non coding control region) NCCR là một vùng biến thể cao, có chứa các

vị trí liên kết khác nhau với các nhân tố điều hòa của tế bào chủ, do đó được xem là vùng điều hòa biến thể (HVRR: Hypervariable Regulatory Region) [23] Khung đọc

mở nằm ở trung tâm của bộ gen, thúc đẩy việc sao chép diễn ra theo hai chiều Trong quá trình nhân lên, LTA tạo thành một phức hợp đa phân liên kết với vị trí

khởi đầu sao chép (Ori) và hoạt động như một helicase để tạo điều kiện cho việc sao chép vùng mã hóa muộn [86] LTA cũng là một yếu tố điều hòa quan trọng, thúc đẩy tế bào chủ đến pha S của chu trình tế bào bằng cách liên kết với các protein ức

chế khối u Rb, p107, p130 và p53 [39] Bên cạnh đó, STA liên quan đến khả năng nhân lên của virus, sự vận hành chu trình tế bào và biến nạp Các protein capsid VP1, VP2, VP3 được tạo ra trong tế bào chất, vận chuyển vào nhân thông qua các tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins Một khi các protein capsid xâm nhập vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra [57]

Hình 1 1 C ấu trúc virion BKV [3]

1.2.2.3 Con đường lây nhiễm

Con đường lây nhiễm BKV vẫn chưa được xác định rõ ràng [51] Nhiều

bằng chứng cho thấy đường hô hấp và tiêu hóa là hai con đường lây truyền chính

7

Các con đường lây nhiễm khác như truyền máu, đường sinh dục, ghép tạng (đặc

biệt là ghép thận đồng loại) và từ mẹ sang con cũng đã được báo cáo [3] Nhiễm trùng tiên phát thường hiếm khi xuất hiện các triệu chứng bệnh hoặc chỉ xuất hiện triệu chứng viêm đường hô hấp nhẹ Điều này cho thấy BKV thâm nhập đường máu thông qua nhiễm trùng ở amidan Sau khi thâm nhập vào các tế bào máu ngoại vi, virus sẽ lan truyền sang các mô khác nhau, điển hình là thận [70] Trong lần nhiễm trùng tiên phát, BKV tồn tại dai dẳng trong các tế bào ống thận và sự tái hoạt động không triệu chứng xảy ra khi virus được bài tiết trong nước tiểu Trong khi đó, ở

những người khỏe mạnh hay bệnh nhân có khả năng miễn dịch, hiện tượng tái hoạt động của BKV và sự xuất hiện của BKV trong nước tiểu rất hiếm khi xảy ra BKV cũng được tìm thấy trong tế bào bạch cầu, não, hạch bạch huyết với các bằng chứng

về sự xuất hiện BKV-DNA Sự phát tán BKV trong nước tiểu phổ biến hơn ở những

bệnh nhân ghép thận so với người khỏe mạnh Tuy nhiên, cơ chế về sự tồn tại dai

dẳng của BKV và những điều kiện dẫn tới sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch vẫn chưa được nghiên cứu rõ ràng [51]

1.2.2.4 Chu trình nhân lên

Quá trình nhân lên của BKV được bắt đầu bằng sự kiện kháng nguyên VP1

gắn với acid sialic hoặc GD1b/GT1b trên màng tế bào chủ [27] Sau khi phức hợp

gắn kết, BKV thâm nhập tế bào bằng con đường nhập bào (endocytosis) và được

vận chuyển tới lưới nội chất nhờ các microtubule [29] Thông qua VP2, VP3 và con đường importin, BKV tiếp cận nhân và giải phóng DNA vào tế bào vật chủ Tuy nhiên, genome của BKV xâm nhập vào trong nhân của tế bào vật chủ nhưng không tích hợp vào hệ gen người Mặt khác, nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng tích

hợp genome BKV vào hệ gen ở động vật gặm nhấm dẫn đến sự hình thành và phát triển các khối u [3] Hơn nữa, những hiểu biết về cơ chế tương tác giữa BKV-DNA

với hệ gen động vật gặm nhấm để hình thành khối u còn nhiều hạn chế Sau khi giải phóng DNA vào nhân, nhờ phức hệ enzyme của tế bào chủ, quá trình phiên mã sớm

diễn ra nhằm tạo ra các protein hỗ trợ quá trình sao chép của virus (STA, LTA)

Tiếp theo, các protein cấu trúc (VP1, VP2, VP3) được hình thành từ tế bào chất và

8

vận chuyển vào nhân thông qua các tín hiệu định hướng nhân liên kết với proteins

Một khi các proteins capsid xâm nhập vào nhân, sự lan truyền của virus sẽ diễn ra

Hình 1 2 Quá trình xâm nhi ễm và nhân lên của BKV [3]

1.2.2.5 Đáp ứng miễn dịch

• Đáp ứng miễn dịch tự nhiên

Phần lớn các nghiên cứu về mối tương tác giữa BKV với hệ thống miễn dịch

tự nhiên tập trung vào thiết lập sự tái hoạt động của BKV và BKVN ở những bệnh nhân ghép thận (KTRs: Kidney transplant recipients) Womer và cộng sự đã chỉ ra

rằng có sự giảm số lượng tế bào tua (DC: Dendritic cells) trong máu ngoại vi ở bệnh nhân BKVN Các nghiên cứu sâu hơn đã xác định các bệnh nhân có số lượng DC

thấp hơn trước khi ghép có nguy cơ bị BKVN cao hơn [88] DC cũng thực hiện một

9

vai trò quan trọng trong việc kích hoạt đáp ứng miễn dịch thích ứng, đặc biệt là biệt hóa thành các tế bào T đặc hiệu BKV [31]

Các tế bào giết tự nhiên (NKs: Natural Killer Cells) cũng có vai trò trong

việc kiểm soát lây nhiễm BKV ở bệnh nhân ghép thận Các thụ thể giống với kháng

thể của tế bào NK (KIR) có vai trò trong đề kháng miễn dịch đối với BKV Các nghiên cứu mới đây đã chỉ ra rằng chiến lược giám sát miễn dịch của BKV có thể thông qua việc ức chế quá trình nhận diện của các tế bào NK Các yếu tố trung gian khác của hệ miễn dịch tự nhiên cũng đóng góp vào việc kiểm soát BKV, như defensins thể hiện hoạt tính chống nhiễm trùng với đa số các virus, nấm và vi khuẩn Nghiên cứu của Dugna và cộng sự đã chỉ ra Defensins 5 của người (HD5) ức

chế sự bám của BKV vào tế bào chủ bằng cách kết tụ virus [28] HD5 thường được tìm thấy trong đường niệu sinh dục, cũng chính là vị trí khu trú của BKV và HD5

có thể bất hoạt BKV theo kiểu phụ thuộc huyết thanh, thực hiện một vai trò quan

trọng trong việc điều tiết sự tái hoạt động không triệu chứng nhiễm virus trong đường tiết niệu sinh dục

Yếu tố trung gian trong hệ miễn dịch tự nhiên cũng có khả năng tác động lên

việc làm mất mô ghép ở bệnh nhân ghép thận do nhiễm BKV Hơn nữa, người ta cũng chỉ ra rằng nhiễm BKV thúc đẩy sự xơ hóa mô ghép ở bệnh nhân BKVN với

bằng chứng là sự tăng biểu hiện collagens nền, các yếu tố tăng trưởng khối u beta (TGF-β), MMP2 và -9, cũng như là tín hiệu của quá trình chuyển đổi biểu mô (EMT) trong mẫu sinh thiết thận [3]

• Đáp ứng miễn dịch thích ứng

Đáp ứng dịch thể

Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống BKV thường diễn ra không lâu sau khi

tiếp xúc với kháng nguyên của virus BKV thường lây nhiễm từ thời thơ ấu, dẫn đến các đáp ứng kháng thể trung hòa đặc hiệu BKV Nghiên cứu của Egli và cộng sự (2009) [30] trên nhóm người khỏe mạnh chỉ ra rằng kháng thể IgG đặc hiệu BKV

xuất hiện ở 87% những người trẻ tuổi (20-29) và 71% ở nhóm người tuổi trung niên (50-59) Tương tự, Randhawa và cộng sự (2002) [70], đã phát hiện 80% người cho

10

thận có kháng thể IgG và 22% có kháng thể IgA đặc hiệu BKV Các báo cáo cũng

chứng minh sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu BKV không đủ để bảo vệ cơ thể trước sự tái hoạt động mạnh mẽ của BKV và các bệnh liên quan Mặt khác, các đột

biến kháng nguyên của virus có thể giúp virus trốn thoát khỏi sự trung hòa qua trung gian kháng thể

Đáp ứng miễn dịch tế bào

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh vai trò quan trọng của tế bào T trong

việc kiểm soát sự lây nhiễm BKV Các phân tích tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu

với BKV ở trong máu ngoại vi và các tập hợp tế bào từ mẫu sinh thiết thận của bệnh nhân BKVN cho thấy đáp ứng của tế bào T diễn ra rất mạnh và liên quan chặt chẽ

tới tải lượng cao của BKV T-CD4 có thể kiểm soát sự tái kích hoạt BKV kể cả trong hệ miễn dịch thiếu hụt tế bào T-CD8 Các thuốc ức chế miễn dịch ngăn cản

thải ghép ở bệnh nhân ghép thận có thể gây giảm biểu hiện các cytokine, như IFN-γ

và TNF Một trong những trở ngại chính trong nghiên cứu tế bào T đặc hiệu BKV là

tỉ lệ thấp các tế bào tiền thân trong máu ngoại vi ở cả người cho và người ghép thận Các nghiên cứu chỉ ra rằng sự tái lập tế bào T đặc hiệu (T-CD4 và T-CD8 ) với BKV liên quan tới khả năng kiểm soát tải lượng BKV trong máu và trong nước tiểu

tốt hơn Do đó việc theo dõi tỷ lệ tế bào T đặc hiệu với BKV sau ghép có thể đưa gia chiến lược giúp tiên lượng nguy cơ sự tái hoạt động của BKV và BKVN [3]

1.3 Mối quan hệ giữa BKV và bệnh lý ghép thận

1.3.1 Mối tương quan giữa nồng độ BKV-DNA và bệnh lý ghép thận

Trước thời kỳ sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép là cyclosporine, hẹp niệu quản là biến chứng thường gặp hơn là BKVN sau ghép thận Nhiều nghiên cứu đã phát hiện việc sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép làm gia tăng nhiễm BKV ở người ghép thận Một số nghiên cứu tiến cứu đã

chỉ ra rằng BKV dương tính cả trong huyết thanh và nước tiểu thậm chí ngay sau

giờ đầu tiên, và tỷ lệ cao nhất từ 1 đến 3 tháng sau ghép thận Điều này cho thấy giả thuyết về nguồn gốc của BKV có thể xuất hiện từ người cho thận chứ không chỉ đơn thuần là sự tái hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận BKV được công

11

nhận như là một dấu ấn liên quan đến sử dụng thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép với liều quá cao [35]

Năm 2002, một nghiên cứu tiến cứu theo dõi sự hoạt động của BKV ở bệnh nhân ghép thận một cách có hệ thống được thực hiện bởi Hirsch và cộng sự trên 78

bệnh nhân ghép thận Kết quả nghiên cứu đã xác định BKV trong máu trung bình ở

tuần thứ 23 sau ghép và có 5 bệnh nhân phát triển BKVN trung bình ở tuần thứ 28

Tải lượng BKV-DNA ở bệnh nhân BKVN cao hơn ở bệnh nhân không BKVN [36] Nghiên cứu khác của Thakur và cộng sự đã theo dõi sự tái hoạt động của BKV ở 32

bệnh nhân ghép thận trong thời gian 3 năm cho thấy tỷ lệ cao nhất của BKV trong nước tiểu và trong máu khoảng 1 tháng sau ghép [69] Almeras và cộng sự theo dõi

119 bệnh nhân trong 12 tháng, 10,9% bệnh nhân dương tính với BKV và thời gian trung bình phát hiện được là 90 ngày (23-214 ngày), trong đó 77% bệnh nhân xuất hiện virus trong máu trước tháng thứ 4 Tất cả các bệnh nhân có BKV trong máu đều có sinh thiết mô ghép và chỉ một người được chẩn đoán BKVN, trong đó tất cả bệnh nhân có tải lượng virus ban đầu <4 log copy/ml (từ 2,69-3,45 log) [20] Tương

tự, nghiên cứu của Mitterhofer và cộng sự trên 36 bệnh nhân ghép thận chỉ ra tỷ lệ cao nhiễm BKV có thể phát hiện được cả trong máu và nước tiểu trong 12 giờ sau ghép và không thay đổi cho đến tháng thứ 6 [6] Nghiên cứu gần đây nhất khảo sát

214 cặp bệnh nhân ghép thận từ người cho sống xác định 85 bệnh nhân nhận thận ghép có BKV trong nước tiểu, trong đó 61 bệnh nhân có BKV trong máu và 22

bệnh nhân có BKVN Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng sự xuất hiện BKV trong nước tiểu ở người cho và người nhận trước ghép là yếu tố nguy cơ cho sự xuất hiện BKV trong nước tiểu và trong máu ở bệnh nhân sau ghép cũng như sự xuất hiện của BKVN sau ghép [74]

Theo Hướng dẫn Thực hành bệnh truyền nhiễm Hội ghép tạng Hoa Kỳ - AST (AST Infectious Disease Community of Practice) đã được công bố gần đây và các hướng dẫn của Hội đồng cải thiện toàn cầu về bệnh thận (The Kidney Disease Improving Global Outcomes, KDIGO) khuyến cao bắt đầu kiểm tra xét nghiệm BKV từ tháng nhất sau khi ghép và sàng lọc thường xuyên hơn (sàng lọc huyết

12

tương hàng tháng trong 6 tháng đầu, sau đó 3 tháng một lần cho đến 2 năm sau) có thể thích hợp hơn trong các trung tâm ghép tạng chuyên khoa Xét nghiệm sàng lọc BKV kết hợp với giảm liều thuốc ức chế miễn dịch là một biện pháp hiệu quả để ngăn ngừa tổn thương mô ghép đồng loại do BKVN Tỷ lệ thải ghép cấp tính được báo cáo sau khi giảm liều thuốc ức chế miễn dịch dao động từ 8 đến 12% và hầu hết đều đáp ứng với điều trị bằng steroid [63] Những bệnh nhân nhiễm BKV khi giảm liều thuốc ức chế miễn dịch nên được theo dõi cẩn thận kết hợp với creatinine huyết thanh được kiểm tra 1-2 tuần/lần và tải lượng BKV-DNA lặp lại trong khoảng thời gian từ 2-4 tuần [71]

Nhiều nghiên cứu đã xác định rằng, tải lượng BKV-DNA trong nước tiểu >

107 copy/ml hay trong máu > 104 copy/ml là giá trị cho phép chẩn đoán sớm BKVN Sau khi BKV tái hoạt động, virus này có thể phát tán ra trong nước tiểu và xuất hiện virus trong máu sau vài tuần Đã có báo cáo về những trường hợp bệnh nhân phát triển virus trong máu mà không có virus nước tiểu, nhưng hiếm gặp BKV trong máu có giá trị chẩn đoán dương (PPV, positive predictive value) cao đối với BKVN so với BKV nước tiểu; do đó việc sàng lọc cho BKV máu là chiến lược sàng lọc lý tưởng của nhiều tổ chức chuyên ngành thận uy tín trên thế giới Bệnh nhân ghép thận nghi ngờ có BKVN trên lâm sàng nên được chỉ định làm xét nghiệm real-time PCR để xác định tải lượng BKV-DNA trong máu và trong nước tiểu [35] Khi các chỉ số xét nghiệm BKV cao hơn giá trị ngưỡng cho phép chẩn đoán BKVN, bệnh nhân cần được chỉ định sinh thiết thận để khẳng định chẩn đoán Nếu bệnh nhân không được điều trị thì nguy cơ không hồi phục chức năng thận ghép hoặc mất thận ghép rất cao Vì vậy, việc theo dõi và giám sát BKV hoạt động đóng vai trò rất quan trọng trong chẩn đoán sớm BKVN và theo dõi điều trị thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép [66]

1.3.2 Độc lực kiểu gen BKV và bệnh lý ghép thận

BKV được phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau trên thế giới và được chia thành bốn kiểu gen (BKV-I, II, III, IV) theo phương pháp huyết thanh học và

13

sinh học phân tử [80] Kiểu gen I phổ biến nhất trong quần thể người khỏe mạnh trên toàn thế giới (80%), tiếp đến là kiểu gen IV (15%), trong khi kiểu gen II và III hiếm khi được phát hiện (2%) Xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa trên so sánh trình tự toàn bộ gen hoặc trình tự vùng gen đặc trưng VP1, BKV-I tiếp tục được chia thành 4 phân nhóm I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c; trong khi đó BKV-IV đa dạng hơn với 6 phân nhóm IV/a-1, IV/a-2, IV/b-1, IV/b-2, IV/c-1, IV/c-2 [64] Sự phân bố đa dạng của các kiểu gen BKV cũng như phân nhóm BKV ở quần thể người đã được nghiên cứu ở nhiều nước [80], trong đó phân nhóm I/a phổ biến ở châu Phi, phân nhóm I/b-1 phổ biến ở Đông Nam Á, phân nhóm I/b-2 phổ biến ở châu Âu và phân nhóm I/c phổ biến ở Đông Bắc Á [54] Cũng như phân nhóm I, mỗi phân nhóm BKV-IV tương ứng với một vị trí địa lý nhất định [64]

Trong nghiên cứu huyết thanh học, các kiểu gen BKV (I-IV) là các kiểu huyết thanh hoàn toàn khác biệt [67] Ở những người khỏe mạnh, hầu hết có kháng thể trung hòa kiểu gen I, trong khi đó không hình thành kháng thể trung hòa kiểu gen III hoặc IV Hơn nữa, các phân nhóm I/b-1, I/b-2 có thể hoạt động như các kiểu huyết thanh riêng biệt Phân tích huyết thanh học trên chuột được tiêm vắc-xin BKV dựa trên hạt giống virus (VLP) cho thấy sự khác biệt này được chi phối chặt chẽ bởi vị trí gắn kết thụ thể glycan của tế bào trên bề mặt virion Trong khi đó, tất

cả các phân nhóm trong kiểu gen IV có cùng một kiểu huyết thanh duy nhất Mỗi kiểu huyết thanh trung hòa liên kết với một phổ riêng biệt của các thụ thể bề mặt tế bào, cho thấy các kiểu gen BKV khác nhau có mức độ nhân lên và khả năng gây bệnh khác nhau Do đó, các cá thể đã nhiễm một kiểu huyết thanh BKV vẫn có

nguy cơ bị tổn thương khi nhiễm các kiểu huyết thanh BKV khác sau khi điều trị bằng thuốc ức chế miễn dịch tế bào T [67] Điều này rất quan trọng vì nhiễm BKV sau ghép thận chủ yếu xuất phát từ người cho thận [8] Hơn nữa, người nhận ghép thiếu kháng thể trung hòa (NAb) chống lại BKV dẫn đến nguy cơ có nồng độ BKV-DNA trong máu cao hơn sau ghép thận [68] Các nghiên cứu chỉ ra rằng 83 đến 98% dân số có phản ứng kháng thể trong huyết thanh với protein capsid chính (VP1) của kiểu gen BKV-I khi họ 21 tuổi [79]

14

Các kiểu gen BKV I-IV cũng như các biến thể khác của BKV đã được tìm

thấy ở những bệnh nhân BKVN [7] Giải trình tự vùng gen VP1 từ mẫu sinh thiết

thận từ bệnh nhân viêm thận kẽ sau ghép đã nhấn mạnh sự tồn tại của các “điểm nóng” đa hình, với trình tự không ổn định theo thời gian ở hầu hết các trường hợp được theo dõi Các đột biến tập trung tại vòng lặp BC (thuộc vùng VP1) là nơi liên

kết với các thụ thể, liên quan trực tiếp đến khả năng lây nhiễm kém hơn so với

chủng hoang dại trên một số dòng tế bào nhưng những “điểm nóng” về đột biến có

thể mang lại lợi thế cho virus trong việc trốn thoát khỏi sự kiểm soát đối với hệ

miễn dịch của vật chủ [70] Trong một số trường hợp, sự thay đổi chuỗi axit amin là

mối nguy cơ tiềm ẩn ảnh hưởng trực tiếp đến cấu trúc bậc hai và bậc ba của protein

Sự thay đổi axit amin trong khu vực VP1 đã được phát hiện trong các mẫu nước

tiểu thu thập từ cả nhóm bệnh nhân ghép thận không phát triển BKVN và nhóm

bệnh nhân BKVN Các phân tích di truyền trên chuỗi VP1 cho thấy khu vực này

chứa vùng biến đổi cao bộ gen BKV từ nucleotide 1744 đến 1812 (axit amin 61 đến 83), trong đó một số sự thay thế axit amin luôn bảo tồn ở kiểu gen I-IV nhưng cũng

có một số thay thế chỉ mang tính tạm thời Nghiên cứu của Tremolada S và công sự (2010) cho thấy sự thay đổi axit amin K69R và E73Q chỉ gặp ở những bệnh nhân BKVN [84]

Các nghiên cứu in vitro gần đây về các phân nhóm biến thể cho thấy sự thay

thế axit amin có thể làm thay đổi khả năng tương tác của virus với các tế bào chủ,

do đó có thể làm thay đổi độc lực của virus với người bệnh [27] Nghiên cứu của Johannes Korth và cộng sự (2018) [52] tại Đức trên 56 bệnh nhân dương tính với BKV trong máu cho thấy những bệnh nhân nhiễm BKV-II hoặc BKV-IV có nguy

cơ bị BKVN cao hơn so với nhiễm những kiểu gen khác Trong khi đó, một số nghiên cứu khác chỉ ra kiểu gen BKV-I/b-2 và BKV-IV thường dẫn đến nguy cơ phát triển của BKVN cao hơn [73],[74] hoặc không có mối tương quan giữa các phân nhóm BKV và sự phát triển của nhiễm BKV ở những người nhận ghép thận [53] Như vậy, vai trò của biến thể kiểu gen BKV trong sinh bệnh học các hội

chứng lâm sàng vẫn chưa được khẳng định rõ ràng và cần được làm sáng tỏ thêm

15

Ngoài ra, những hiểu biết về kiểu gen BKV cần được hiểu rõ để đảm bảo chất lượng của các xét nghiệm chẩn đoán được thực hiện trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử Có bằng chứng cho thấy kiểu gen III và IV không khuếch đại tốt với một số bộ mồi PCR hiện đang được sử dụng Việc xác định kiểu gen của BKV cũng rất quan trọng để truy tìm dấu vết nhiễm trùng trong các nghiên cứu dịch

tễ học, ghi nhận các bệnh nhiễm trùng với nhiều chủng virus, xác định đáp ứng miễn dịch đối với nhiễm virus và thiết kế vắc-xin với khả năng bảo vệ rộng nhất Mặt khác, kiểu gen liên quan mật thiết tới cách thức virus phát sinh, lây lan trên toàn cầu từ điểm định vị địa lý đầu tiên để tiến hóa thành các chủng khác nhau dưới tác động của chọn lọc tự nhiên

1.4 Các phương pháp xét nghiệm chẩn đoán BKV

1.4.1 T ế bào học

Việc chẩn đoán sớm BKVN sau ghép thận ban đầu còn gặp nhiều khó khăn

và thách thức do triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu, nhiều trường hợp có thể

nhầm với giai đoạn thải ghép cấp khi sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch chống

thải ghép

Quy trình chẩn đoán được nhiều trung tâm hiện nay thực hiện bao gồm xét nghiệm nước tiểu để tìm “tế bào bẫy” (decoy cell), thể "Haufen" hoặc định lượng BKV trong nước tiểu và trong máu bằng kỹ thuật real-time PCR [71] Thể Haufen

có thể phát hiện được bằng kính hiển vi điện tử Việc xác định thể Haufen được báo cáo liên quan đến BKVN có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, với giá trị chẩn đoán dương tính (positive predictive value, PPV) và giá trị chẩn đoán âm tính (negative predictive value, NPV) đều trên 97% [37] Nước tiểu có thể được sàng lọc cho BKV

bằng phương pháp tế bào học hoặc định lượng BKV-DNA Các tế bào biểu mô ống

thận có nhiễm BKV được đổ vào nước tiểu - tế bào decoy (Hình 1.3) Trong so sánh

tế bào học nước tiểu với PCR nước tiểu, tế bào decoy có độ nhạy chỉ 25% và độ đặc

hiệu 84% đối với BKVN so với PCR nước tiểu đạt độ nhạy, độ đặc hiệu tương tứng

là 100% và 78% [33] Tuy nhiên, những kết quả ban đầu này cần được nghiên cứu

16

trên số mẫu lớn hơn, và nếu được kiểm chứng thì đây có thể là một phương pháp không xâm lấn, có chi phí thấp trong sàng lọc BKVN [71]

1.4.2 Sinh thiết thận

Hiện nay xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học (xác định bằng hóa mô miễn

dịch, in situ hybridization hay PCR) kèm theo bằng chứng của viêm thận kết mạc

hoặc creatinine huyết thanh tăng cao vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán BKVN Tuy nhiên, hiện nay xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học (xác định bằng hóa

mô miễn dịch, lai tại chỗ hay PCR) kèm theo bằng chứng của viêm thận kẽ hoặc creatinine huyết thanh tăng cao vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán BKVN Xét nghiệm được khuyến cáo thực hiện ít nhất 2 lần lặp lại, hạn chế tối đa sai số trong lấy mẫu và ưu tiên mẫu có chứa các mô tế bào tủy thận Do đó, khi có kết quả BKV trong máu kèm creatinine huyết thanh tăng cao hoặc khi tình trạng virus trong máu cao dai dẳng mặc dù đã giảm ức chế miễn dịch, bệnh nhân nên được chỉ định xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học [21] Chiến lược này dựa trên hiện tượng BKV trong máu được ghi nhận giảm có giá trị trong vòng 6 tháng sau khi giảm ức chế

miễn dịch Như vậy, việc theo dõi thường xuyên sự hiện diện của BKV trong máu

có vai trò rất quan trọng trong quản lý và theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận [24], [68]

Hình 1 3 Các t ế bào decoy trong nước tiểu [71]

1.4.3 Ch ẩn đoán sinh học phân tử

1.4.3.1 D ấu ấn sinh học Biomarker

17

Ngoài ra, dấu ấn sinh học mRNA trong BKVN cũng đang được quan tâm Trong công bố của Ding và cộng sự, giá trị là 6,5 × 105

VP1 mRNA/ng RNA được thiết lập như một ngưỡng dự báo của BKVN [85] Ngưỡng này đã được xác nhận trong một nghiên cứu khác, 12 trong số đó đã được kiểm tra sinh thiết BKVN [72] mRNA granzyme B nước tiểu và mức mRNA protease inhibitor -9 cũng được chứng minh là dự báo về sự suy giảm chức năng ghép, cho thấy các nghiên cứu mới trong tương lai Cơ sở dữ liệu mRNA nước tiểu có thể cung cấp thêm thông tin chẩn đoán và tiên lượng ngoài sinh thiết thận trong tương lai khi có những căn cứ rõ ràng hơn [71]

thời, BKV máu rò rỉ trong nước tiểu là phổ biến và có thể xảy ra ở 30% số người ghép thận [49] Với ưu điểm của real-time PCR huyết tương và giá trị tiên đoán của

nó lớn hơn cho BKVN, không cần thực hiện xét nghiệm nước tiểu BKV trước khi xét nghiệm huyết tương [71] Tuy nhiên, tương tự như các xét nghiệm real-time PCR trong theo dõi tải lượng EBV và CMV khác, hiện có sự khác biệt đáng kể trong cách thức phát triển kỹ thuật giữa các phòng thí nghiệm dẫn đến khó so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm khác nhau cũng như xác định một giá trị ngưỡng trong chẩn đoán và điều trị BKVN [24] Vấn đề này đã được Bechert và cộng sự nghiên cứu chi tiết khi so sánh kết quả giữa các kỹ thuật real-time PCR cũng như các bộ mồi đã công bố [63] Tuy nhiên, Hirsch và cộng sự xác định rằng mức BKV huyết tương > 104

copy/ml trong hơn 4 tuần có liên quan đến sự xuất hiện của BKVN với độ đặc hiệu 93% [34] và giá trị này cũng được nêu trong các hướng dẫn

và khuyến cáo gần đây [32], [68] Khuyến nghị này cũng đang được các trung tâm

18

ghép tạng sử dụng và cùng khảo nghiệm, sự thay đổi được xác nhận là ít nhất 1 log nồng độ [24]

Tuy nhiên, hiện nay xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học (xác định bằng hóa

mô miễn dịch, lai tại chỗ hay PCR) kèm theo bằng chứng của viêm thận kẽ hoặc creatinine huyết thanh tăng cao vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán BKVN Xét nghiệm được khuyến cáo thực hiện ít nhất 2 lần lặp lại, hạn chế tối đa sai số trong lấy mẫu và ưu tiên mẫu có chứa các mô tế bào tủy thận Do đó, khi có kết quả BKV trong máu kèm creatinine huyết thanh tăng cao hoặc khi tình trạng virus trong máu cao dai dẳng mặc dù đã giảm ức chế miễn dịch, bệnh nhân nên được chỉ định xét nghiệm sinh thiết mô bệnh học [21] Chiến lược này dựa trên hiện tượng BKV trong máu được ghi nhận giảm có giá trị trong vòng 6 tháng sau khi giảm ức chế

miễn dịch Như vậy, việc theo dõi thường xuyên sự hiện diện của BKV trong máu

có vai trò rất quan trọng trong quản lý và theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận [24], [68]

1.5 Tình hình nghiên c ứu BKV

1.5.1 Tình hình nghiên c ứu phát triển kit

Nồng độ BKV-DNA xác định bằng kỹ thuật real-time PCR với trình tự đặc

hiệu cao của BKV được khuếch đại bằng một đầu dò huỳnh quang và số lượng bản sao khuếch đại được so sánh với đường cong chuẩn được tạo ra với các pha loãng

nối tiếp của một nồng độ BKV- DNA đã biết Hầu hết, các phòng thí nghiệm tự phát triển các xét nghiệm của mình nên đã có sự khác biệt đáng kể về kết quả định lượng và ngưỡng phát hiện Đồng thời, sự khác biệt về nguồn mẫu, quy trình tách chiết DNA, trình tự primer, probe và chủng BKV được sử dụng cho việc thiết lập đường chuẩn có thể ảnh hưởng đến kết quả định lượng và dẫn đến sự khó khăn khi đưa ra các quyết định khi can thiệp điều trị trên lâm sàng Hầu hết các xét nghiệm real-time PCR định lượng sử dụng chủng BKV kiểu gen I (Dunlop) như là trình tự tham chiếu để thiết kế mồi và probe [4]

19

Năm 2008, Hoffmann và cộng sự đã so sánh các kết quả từ 7 kit thương mại khác nhau sử dụng chủng Dunlop hoặc mẫu lâm sàng (the mixed patient standard,

MPS) làm mẫu tham chiếu, kết quả xét nghiệm cho thấy có hiện tượng không nhất quán (khác biệt > 1 log) được xác định trong 23% các xét nghiệm sử dụng MPS và 94% các xét nghiệm sử dụng Dunlop làm mẫu tham chiếu Hiện tượng này được phát hiện rõ nhất ở kiểu gen III và IV, do sự không phù hợp primer, probe cũng như

sự đa hình trình tự BKV-DNA [71] Một công trình khác đã khẳng định rằng các

thử nghiệm PCR của BKV bằng cách sử dụng kiểu gen I như là mẫu tham chiếu có

thể ít nhạy hơn với các dòng biến thể (ngưỡng phát hiện 104 copy/μl đối với biến

thể so với 10 copy/μl cho kiểu gen I) Đây là một vấn đề cần lưu ý vì các biến thể

phụ hiếm gặp của BKV có liên quan đến BKVN [69], có lẽ do khó khăn trong việc phát hiện chúng với tải lượng virus thấp Để khắc phục hạn chế này, các xét nghiệm nên được thống nhất thực hiện ở một phòng thí nghiệm phù hợp, đủ tiêu chuẩn để theo dõi cho một bệnh nhân, trong trường hợp có nghi ngờ với các biến thể hiếm

gặp trong quá trình theo dõi điều trị, biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân không tương quan với tải lượng virus, cần thực hiện các xét nghiệm phân tích sâu hơn về kiểu gen [71] Do các lựa chọn trong điều trị BKVN hiện nay còn hạn chế nên mục tiêu sàng lọc BKV theo quy trình giúp chẩn đoán sớm bệnh nhân khi có virus nước tiểu

hoặc virus máu và can thiệp điều trị phù hợp trước khi phát triển thành BKVN

Nghiên cứu tại Nhật Bản về phát triển kỹ thuật real-time PCR cho định lượng BKV đã được Iwaki KK và cộng sự công bố năm 2010 Nghiên cứu hướng

tới phân tích các điểm đa hình trên một vùng trình tự bảo tồn của BKV (vùng VP2) ảnh hưởng đến xét nghiệm phân tích định lượng BKV Sử dụng kết hợp các kỹ thuật phân tích, bao gồm phân tích biến đổi trình tự nucleotide trong các chủng của BKV, phân tích và so sánh trình tự axit amin trong vùng gen đích ở các thành viên của họ Polyomaviridae, dựa vào đó thiết kế mồi và probe cho xét nghiệm PCR và phát triển real-time PCR đối với vùng gen đích VP2 của BKV Kết quả đánh giá sơ bộ cho thấy, thử nghiệm BKV có dải nồng độ rộng 6log với giới hạn phát hiện thấp

nhất là 1,5 x 101

copy/phản ứng và độ chính xác cao với hệ số biến thiên nội phản

20

ứng thấp (CV<5%) Ngoài ra kỹ thuật cũng đưa ra độ nhạy và độ đặc hiệu cao đối

với BKV Công bố này rất có giá trị trong việc đánh giá tác động của các biến thể trình tự vùng VP2, đồng thời cung cấp nguồn dữ liệu phân tử BKV cho các nghiên

cứu về dịch tễ học [45]

Nghiên cứu gần đây tại Mỹ (2016) đã so sánh sự khác biệt về nồng độ DNA khi thiết kế mồi, probe dựa trên trình tự hai vùng gen là VP1 và LTA Sau khi phân tích hồi quy probit trên những dải nồng độ pha loãng khác nhau cho thấy giới

BKV-hạn phát hiện của kỹ thuật real-time PCR dựa trên trình tự gen VP1 và LTA lần lượt

là 1,8 x 102 copy/ml và 3,5 x 102 copy/ml với độ tin cậy 95% Phân tích độ nhạy và

độ đặc hiệu trên 116 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, xác định được độ nhạy và độ đặc

hiệu của kỹ thuật real-time PCR dựa trên trình tự gen VP1 và LTA lần lượt là 90%, 96% và 97%, 98% [40]

1.5.2 Tình hình nghiên c ứu hiện trạng nhiễm BKV

Ở nước ta cho đến nay mới chỉ có một vài công bố về ca lâm sàng nhiễm BKV ở bệnh nhân sau ghép thận Năm 2015, Hà Phan Hải An và cộng sự đã báo cáo một ca lâm sàng BKVN tại bệnh viện Hữu nghị Việt Đức ở một bệnh nhân suy

thận giai đoạn cuối được ghép thận từ người cho sống Sau ghép 8 tháng bệnh nhân

có biểu hiện tăng creatinine máu (156 µmol/l) trong khi đó tình trạng lâm sàng vẫn

ổn định và các xét nghiệm chức năng khác trong giới hạn bình thường Để xác định nguyên nhân gây suy chức năng thận ghép, bệnh nhân được chỉ định xác định tải lượng BKV và sinh thiết thận ghép chẩn đoán mô bệnh học Kết quả xét nghiệm xác định BKV bằng kỹ thuật real-time PCR cho thấy: BKV nước tiểu: 8,27x1010copy/ml; BKV máu: 1,7x104 copy/ml Kết quả sinh thiết thận ghép cho thấy có hình ảnh tổn thương ống thận và mô kẽ, thâm nhập tế bào đơn nhân mô kẽ Không thấy

có dấu hiệu tập trung tế bào viêm ở mao mạch quanh ống thận và ở ống thận, nhuộm hóa mô miễn dịch với CD4 âm tính Từ các kết quả xét nghiệm, bệnh nhân được chẩn đoán BKVN và được điều trị bằng điều chỉnh thuốc ức chế miễn dịch,

chức năng thận ghép được cải thiện và ổn định, tuy nhiên không thể hồi phục về

21

tình trạng ban đầu ngay sau ghép Từ ca bệnh lâm sàng trên cho thấy vấn đề chẩn đoán BKVN sau ghép còn nhiều thách thức nếu không có cách tiếp cận đúng và

việc chỉ định xét nghiệm xác định tải lượng BKV-DNA trong máu và nước tiểu đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị BKVN [1]

Công bố của Trịnh Hùng và cộng sự đã phát hiện 2 trường hợp nhiễm BKV (trong đó có 1 trường hợp đồng nhiễm BKV và CMV) trong quá trình sàng lọc và theo dõi điều trị sau ghép thận tại Bệnh viện 19-8 Bệnh nhân sau ghép thận cần theo dõi nguy cơ nhiễm BKV đặc biệt là trong năm đầu tiên Sử dụng các công cụ chẩn đoán như BKV- DNA trong nước tiểu và huyết tương, đánh giá mô bệnh học thận là rất quan trọng để chẩn đoán sớm Điều trị bằng việc giảm liều thuốc ức chế miễn dịch để ngăn ngừa tiến triển suy thận ghép giúp đem lại hiệu quả nhất định [2]

1.6 Phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh

Các chỉ số đại diện cho độ tin cậy của cây chủng loại được xây dựng bao

gồm chỉ số bootstrap, chỉ số CI, chỉ số RI Chỉ số bootstrap là tần số xuất hiện của

một nhóm (cluster) trên số lần giản đồ được thiết lập, với đơn vị tính là % (phần trăm) Theo Felsenstein (1985), bootstrap là một công cụ hỗ trợ cho việc xây dựng cây phát sinh loài Chỉ số bootstrap nói lên độ tin cậy của sự gần gũi các thành viên

của nhóm trong cây phả hệ Trong khi đó, chỉ số CI (Consistency Index) là tỉ số đo tương thích giữa một cây bất kỳ trong tổng số các cây được phân tích có tổng số

22

nhánh ít nhất Giá trị CI biến động trong khoảng 1.0 (tương thích tối đa) tiệm cận đến 0 (ít tương thích nhất) Giá trị CI càng lớn thì kết quả có mức độ tin cậy càng cao Ngoài ra, RI (Retention Index) là chỉ số thể hiện số lượng tính trạng tương đồng của 2 hay nhiều giống cùng tổ tiên trên cây phân loại [90].

1.6.2 Đặc điểm của các phương pháp xây dựng cây chủng loại

Hai tiêu chí chính được sử dụng để phân loại các phương pháp xây dựng cây phát sinh gồm loại dữ liệu sử dụng làm đầu vào và thuật toán sử dụng để xác định cây Dữ liệu đầu vào có thể là dữ liệu phân tử hoặc có thể là dữ liệu khoảng cách

Dữ liệu phân tử đặc trưng bởi các chuỗi liên kết (nucleotide hoặc axit amin), trong khi đó dữ liệu khoảng cách là một ma trận với một thước đo khoảng cách tiến hóa

giữa mỗi cặp trình tự trong nhiều liên kết đã được tính toán Ưu điểm chính của dữ

liệu khoảng cách là cho phép tính toán nhanh chóng các cây phát sinh, tuy nhiên lại

mất thông tin khi chuyển từ dữ liệu phân tử sang dữ liệu khoảng cách

Phương pháp khoảng cách chỉ có thể được sử dụng trên dữ liệu khoảng cách,

dựa trên ý tưởng từng cặp trình tự sẽ được so sánh thẳng hàng và ứng với từng cặp, khoảng cách di truyền được xác định Thuật toán chỉ dừng lại khi tất cả các chuỗi đã được phân nhóm và các trình tự được nhóm lại sẽ xác định cấu trúc liên kết cây Phương pháp khoảng cách gồm hai thuật toán là UPGMA (Unweighted pair-group method using arithmetic averages) và NJ (Neighbour Joining)

UPGMA là thuật toán xây dựng cây đơn giản nhất với việc giả định tốc độ

tiến hóa không đổi của các chuỗi trong tất cả các nhánh của cây (giả định đồng hồ phân tử) Giả định này rất khó có thể xảy ra nếu các trình tự cách nhau với khoảng cách tiến hóa lớn Tuy nhiên, thuật toán này có ưu điểm là tạo ra cây có gốc với tốc

độ rất nhanh [90]

Bên cạnh đó, NJ là phương pháp tiến hóa tối thiểu ở mỗi bước trong quá trình tính toán phân cụm Khác với UPGMA, NJ không cho rằng tốc độ tiến hóa là như nhau trong tất cả các nhánh của cây và điều chỉnh tỷ lệ biến thể giữa các nhánh Phương pháp này bắt đầu với một cây gốc dạng như ngôi sao Mỗi cặp sẽ được

23

đánh giá riêng và tổng của tất cả các chiều dài nhánh được tính toán để hình thành cây Cặp có tổng nhỏ nhất thì có mối quan hệ gần nhất và do đó được nối lại với nhau để hình thành một nhánh mới Quá trình này được lặp lại cho đến khi chỉ có

một điểm đầu và một điểm cuối duy nhất Phương pháp NJ tương đối nhanh và thường cho kết quả tốt hơn phương pháp UPGMA [90]

Phương pháp dựa trên ký tự có thể được sử dụng trên cả dữ liệu chuỗi và khoảng cách, dựa trên ý tưởng tạo ra tất cả các cấu trúc liên kết cây có thể từ các chuỗi dữ liệu đầu vào Cây có xác suất xuất hiện cao nhất là cây phù hợp nhất với

dữ liệu đầu vào Nhược điểm của các thuật toán này là rất tốn thời gian vì số lượng

cấu trúc liên kết cây phát triển rất nhanh với số lượng trình tự May mắn thay, có các phương pháp tìm kiếm tránh phải đánh giá tất cả các cây, tuy nhiên, việc đánh giá nhiều cây khác nhau làm cho các phương pháp dựa trên ký tự tốn nhiều thời gian hơn so với các phương pháp phân cụm (khoảng cách) Trong khi phương pháp phân cụm cho kết quả trong vòng vài giây thì phương pháp ký tự có thể mất vài phút, thậm chí là hàng giờ, tùy thuộc vào số lượng trình tự và độ dài của chúng Ưu điểm chính của các phương pháp dựa trên ký tự là chúng cho phép tính toán các chuỗi tổ tiên (nghĩa là chuỗi tại các nút bên trong của cây) và không bị mất thông tin (hoạt động trực tiếp trên nhiều dữ liệu căn chỉnh chuỗi) [90] Thuật toán này

gồm hai phương pháp là:

* MP (Maximum Parsimony: kh ả năng tối thiểu): cơ sở lý thuyết của

phương pháp này là ý tưởng triết học của William of Ockham, với giả thuyết tốt

nhất để giải thích một quá trình là một yêu cầu đặt ra các giả định nhỏ nhất Phân tích tối đa được áp dụng cho việc xây dựng cây phát sinh liên quan đến việc tính toán số lượng thay thế tối thiểu trên tất cả các vị trí cho mỗi cấu trúc liên kết để hình thành chiều dài cây Cây MP là cây có chiều dài cây tối thiểu với ưu điểm chính là phù hợp với các chuỗi liên quan rất xa do thông tin trong một số vị trí bảo tồn có xu hướng biến mất nếu sử dụng các phương pháp khoảng cách cho các chuỗi [90]

* ML (Maximum Likehood: kh ả năng tối đa): Đây là phương pháp tốn

nhiều thời gian nhất nhưng lại cho kết quả đáng tin cậy nhất với khả năng tái cấu

24

trúc chính xác các mối quan hệ giữa các chuỗi đã được tách ra trong một thời gian dài hoặc đang phát triển nhanh chóng, đòi hỏi một phương pháp sửa chữa cho nhiều

sự kiện đột biến tại cùng một vị trí Ứng với mỗi mô hình tiến hóa được chọn, phương pháp này sẽ tính toán khả năng xác suất mà một cây tiến hóa có thể có từ chuỗi trình tự phân tích Cây tiến hóa có xác suất cao nhất là cây cuối cùng được

chọn [90]

1.6.3 Ứng dụng cây chủng loại phát sinh trong xác định genotype BKV

Kiểu gen BKV có thể được xác định thông qua phương pháp huyết thanh học

và sinh học phân tử Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của lĩnh vực sinh học phân tử, việc xác định kiểu gen BKV có thể được thực hiện thông qua các phương pháp như PCR hoặc real-time PCR đa mồi, RFLP… Tuy nhiên, giải trình tự và xây

dựng cây chủng loại phát sinh là phương pháp tối ưu nhất với độ tin cậy, độ chính xác cao, đồng thời cho phép phân tích những đột biến SNP (Single Nucleotide Polymorphism) làm thay đổi độc lực của virus

Việc lựa chọn gen đích và phương pháp xây dựng cây chủng loại phù hợp để xác định kiểu gen là vấn đề mấu chốt giúp cây chủng loại phát sinh có độ tin cậy cao Nghiên cứu của Zhang-Yang Wang và cộng sự (2015) [87] trên 23 mẫu huyết tương và 95 mẫu nước tiểu dương tính với BKV dựa trên trình tự vùng gen VP2 và hai phương pháp phân tích UPGMA, Neighbour Joining cho độ tin cậy không cao khi giá trị bootstraps lần lượt là 25%-61% và 0%-17% Trong quá trình phân tích phát sinh dựa trên trình tự gen VP2, nghiên cứu này cho thấy phương pháp NJ không thể tạo ra một cây phát sinh gen phù hợp và chỉ ra rằng phương pháp UPMGA tốt hơn cho kiểu gen Mặt khác, đa hình cũng xuất hiện nhiều ở gen kháng nguyên T lớn, chiếm 11,39% trong tất cả các vị trí nucleotide Các locus đa hình BKV cũng đã được phát hiện khi so sánh các vùng kiểm soát không mã hóa (NCCR) Nghiên cứu của Luo C và cộng sự cho thấy cây phát sinh gen dựa trên kháng nguyên T lớn (LTA) cho phép tách kiểu gen I thành các phân nhóm I/a, I/b-1, I/b-2 và I/c, với giá trị bootstrap là 100%, tốt hơn so với bootstraps thu được khi sử

25

dụng chuỗi VP1 (giá trị bootstrap từ 71% đến 97%) Tuy nhiên, sự phân chia của các phân nhóm IV cho giá trị bootstraps không cao (33%) [58]

Do bộ gen của BKV có rất nhiều vị trí đột biến, đặc biệt khu vực mã hóa đa hình nhiều nhất trong bộ gen virus là VP1 nên các nghiên cứu phần lớn đều tập trung vào tính đa hình của gen VP1 cũng như các đột biến trong dư lượng axit amin được mã hóa bởi gen VP1 Hơn nữa, hầu hết các nghiên cứu trước đây xác định 4

kiểu gen BKV dựa vào trình tự toàn bộ gen hoặc trình tự vùng gen VP1 với công bố đầu tiên của Jin và cộng sự (1993) [47] Khi xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa trên trình tự gen VP1, phương pháp NJ thường được áp dụng cho gen VP1 do tính

đa dạng đa hình cao [15] Đáng chú ý là kiểu gen dựa trên gen VP1 mang lại định nghĩa rõ ràng hơn về các phân nhóm khi phân tích các đoạn gen ngắn hơn 300 bp [46] Điều này chỉ ra rằng VP1 mang nhiều thông tin hơn Nghiên cứu của Boukoum H và cộng sự (2016) [16] trên 72 bệnh nhân ghép thận tại Tunisia dựa trên đoạn trình tự 287 bp (1650-1936, chủng Dunlop-V01108) gen VP1 theo phương pháp xây dựng cây chủng loại phát sinh NJ cho thấy giá trị bootrap chính đều lớn hơn 60% Tương tự, những nghiên cứu khác [44],[56] cũng đều chỉ ra việc xác định kiểu gen BKV bằng việc phân tích đoạn trình tự 287 bp trên vùng lặp BC thuộc gen VP1 cho độ tin cậy, độ chính xác cao Do đó, kiểu gen BKV trên những

bệnh nhân ghép thận tại Việt Nam xác định trong nghiên cứu này dựa trên vùng gen VP1 (1630-1956) và phương pháp NJ

26

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên li ệu

2.1.1 M ẫu nghiên cứu

Mẫu huyết tương và nước tiểu của 131 bệnh nhân ghép thận (được thu thập

tại cùng một thời điểm sau ghép) tại Bệnh viện Quân y 103 trong giai đoạn từ năm

+ Dòng tế bào khả biến Escherichia DH5α được cung cấp bởi hãng

ThermoFisher Scientific, Hoa Kỳ

+ Vector tách dòng: Vector pGEM T easy cho phép chèn các đoạn có kích thước 6 bp - 10 kp Kích thước plasmid nhỏ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình

biến nạp dễ dàng Vector với hai đầu dính T giúp gắn kết đoạn chèn và vector dễ dàng hơn, thuận tiện cho quá trình thao tác Sản phẩm PCR đầu bằng tạo bởi DNA polymerase có chức năng đọc sửa, sau khi được gắn thêm đầu A sẽ gắn trực tiếp vào vector trong vòng 5 phút với hiệu suất 99% sản phẩm DNA tái tổ hợp Mặt khác, DNA tái tổ hợp có thể biến nạp vào tất cả các chủng E coli trong phòng thí

nghiệm Vector pGEM T easy chứa gen kháng kháng sinh ampicilin nên các tế bào nhận vector có thể mọc trên môi trường chọn lọc ampicilin Mặt khác, ở vị trí đa điểm có chứa gen lac Z bị gián đoạn bởi đoạn chèn Vì vậy, chỉ có những vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp mới mọc thành khuẩn lạc có màu trắng Những khuẩn lạc

27

không chứa đoạn chèn sẽ có màu xanh do gen lacZ hoạt động, mã hóa cho enzyme

β galactosidase, kết hợp với cơ chất X-gal và IPTG tạo sản phẩm có màu xanh

+ Bộ mẫu chuẩn được thiết lập bởi hãng Altona (RealStar® BKV PCR Kit, Đức, 2018)

Đây là bộ mẫu chuẩn đã được hiệu chỉnh từ bộ mẫu chuẩn của Tổ chức Y tế

Thế giới về BKV, đã được cấp chứng chỉ IVD (In vitro diagnostic) của châu Âu Bộ

mẫu chuẩn định lượng chứa DNA đặc hiệu BKV có dải nồng độ từ 1.00E+01 đến 1.00E+4 [IU/µl] Độ nhạy của kỹ thuật real-time PCR trung bình phát hiện được là 0,712 copy/μl (dao động từ 0,404 – 1,693 copy/μl, với độ tin cậy 95%) Độ đặc hiệu cũng được đánh giá trên những chủng polyomavirus khác hoặc trên những mầm

bệnh có ý nghĩa ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch như: Cytomegalovirus, Barr virus, Hepatitis A virus, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Herpes simplex virus 1, Herpes simplex virus 2, Human herpesvirus 6A, Human herpesvirus 6B, Human herpesvirus 7, Human herpesvirus 8, Human immunodeficiency virus 1, JC

Epstein-virus, Simian virus 40, Varicella-zoster virus

+ Bộ mẫu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới (1st WHO International

Standard for BK Virus DNA (2016, NIBSC code: 14/212)

Vào năm 2006 và năm 2008, Tổ chức Y tế thế giới đã tổ chức một cuộc họp

quốc tế để thảo luận về yêu cầu tiêu chuẩn hóa quốc tế các xét nghiệm BKV NAT (BKV nucleic acid test) với sự tham gia của các giáo sư từ các trường đại học, công

ty công nghiệp dược phẩm, các đơn vị ngoại kiểm (QCMD: Quality Control Molecular Diagnostics) và các tổ chức chính phủ (NIBSC: National Institute of Biologicals and Standards Control) Hai mẫu chuẩn BKV đông khô (subtype I/b-1

và subtype I/b-2) được pha trong 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5% albumin huyết thanh người, 0,1% D - (+) - Trehalose dehydrate được gửi tới 33 phòng thí nghiệm

từ 15 quốc gia phân tích đánh giá, mỗi phòng thí nghiệm sử dụng các xét nghiệm thường quy để phát hiện và định lượng BKV Kết quả khảo sát cho thấy trong 2

mẫu chuẩn thì mẫu chuẩn thứ 2 (code: 14/212) phù hợp nhất để sử dụng làm mẫu

28

chuẩn quốc tế của WHO Đây cũng là bộ mẫu chuẩn được lựa chọn để đánh giá chất lượng bộ mẫu chuẩn cũng như kỹ thuật real-time PCR tự phát triển trong nghiên

29

B ảng 2 1 Các bộ kit tách chiết, các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

1

Kit tách chiết DNA từ máu và nước tiểu

Exgene™ Blood SV

Gene - All (Hàn Quốc) GA-105-101

2

Kit tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu

QIAamp DNA Blood Mini Kit

Qiagen

3

Kit tinh sạch DNA từ gel agarose:

GeneJET Gel Extraction Kit

B ảng 2 2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu [82]

Kích thước (bp)

vòng trong

81bp

Mồi xuôi realtime PCR

realtime PCR

Pr BK

FAM- TCCAGGGGCAGCTCCCAAAAAGCC-

BHQ1

Taqman probe, realtime PCR

2.2 Thi ết bị chính

• Máy PCR: Master cycler PCR (Eppendorf)

• Máy Real-time PCR: Rotor-Gene Q MDx (QIAGEN)

• Bộ điện di DNA (Labnet)

• Máy chụp ảnh gel (UVP Eppendorf)

• Máy lắc Gyromax 737R (Amerex instrument)

• Tủ ấm (Shelab)

• Tủ cấy an toàn sinh học (Nuaire)

• Máy ly tâm lạnh (Heraeus)

31