Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein pwo DNA polymerase tái tổ hợp ở e coli

vii MỞ ĐẦU Enzyme DNA polymerase là một trong những enzyme quan trọng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: 1 trong sinh học phân tử, nhằm nghiên cứu gen và hệ gen; 2 trong

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-Nguyễn Thị Thu Huyền

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH

CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thu Huyền

NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH

CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E COLI

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Lê Thọ Sơn

TS Hoàng Thị Mỹ Hạnh

Hà Nội - 2019

i

LỜI CẢM ƠN

Khoảng thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN là hành trang quý báu giúp em trưởng thành và có ích hơn trong cuộc sống

Lời đầu tiên em xin được cảm ơn các thầy cô của bộ môn Di truyền học đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt những kiến thức chuyên môn cho chúng em Thầy cô luôn quan tâm để cho chúng em có một môi trường học tập toàn diện và gần gũi nhất Em sẽ coi bộ môn Di truyền như ngôi nhà thứ hai của mình

Tiếp theo, em xin được cảm ơn hai thầy cô TS Lê Thọ Sơn và TS Hoàng Thị

Mỹ Hạnh đã đồng ý hướng dẫn cho em trong luận văn tốt nghiệp này Thầy cô không chỉ động viên em trong quá trình học tập mà còn cho em rất nhiều lời khuyên trong cuộc sống

Em cũng xin gửi lời cảm ơn trìu mến tới gia đình và bạn bè, những người luôn tin tưởng, hỗ trợ và dìu dắt em trong suốt thời gian qua Đặc biệt là bố, mẹ những người luôn hy sinh thầm lặng cho cuộc sống của em

Sau cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS Nguyễn Văn Sáng Thầy đã cho em có cơ hội hoàn thành luận văn tốt nghiệp này Thầy luôn là động lực

để em phát triển cũng như cố gắng hơn mỗi ngày

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN.02-2016.58

Nghiên cứu có sự hợp tác và hỗ trợ cung cấp trình tự gen mã hóa bới Công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa

Hà Nội, tháng 12 năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thu Huyền

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

MỞ ĐẦU vii

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Khái quát DNA polymerase 1

1.1.1 Phân loại DNA polymerase 1

1.1.2 Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase 1

1.1.3 Quá trình sao chép DNA 2

1.2 Ứng dụng của DNA polymerase 3

1.2.1 Kỹ thuật giải trình tự 4

1.2.2 Kỹ thuật PCR 5

1.3 Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase 6

1.3.1 Phân loại nguồn gốc 6

1.3.2 Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp 7

1.3.3 Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR 8

1.4 Công nghệ protein tái tổ hợp 10

1.4.1 Tổng hợp gen, tối ưu mã codon 10

1.4.2 Nhân dòng gen đích vào vector mong muốn 11

1.4.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp 12

1.4.4 Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp 16

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên vật liệu 19

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 19

2.1.3 Hóa chất và môi trường 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase 21

iii

2.2.2 Nhân dòng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase 22

2.2.3 Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở E coli 27

2.2.4 Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase 27

2.2.5 Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase 30

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Phân tích gen mã hóa Pwo DNA polymerase tái tổ hợp 33

3.2 Nhân dòng vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase 34

3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo 34

3.2.2 Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E coli BL21 (DE3) 35

3.2.3 Tách plasmid, kiểm tra trình tự 36

3.3 Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E coli 38

3.4 Tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase 38

3.4.1 Phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực nickel 39

3.4.2 Phương pháp tinh sạch kết tủa bằng muối ammonium sulfate 43

3.5 Xác định hoạt tính của protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase 44

3.5.1 Tối ưu thành phần buffer PCR 44

3.5.2 Hoạt tính sao chép 45

3.5.3 Khả năng chịu nhiệt độ cao 47

3.5.4 Hoạt tính khi có mặt chất ức chế 47

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

iv

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Sự đa dạng trong cấu trúc của một số loại DNA polymerase 2

Hình 2: Thành phần phức hệ sao chép DNA (replisome) ở vi khuẩn Cổ 3

Hình 3: Cây phát sinh của nhóm vi khuẩn Cổ chịu nhiệt 6

Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho một DNA polymerase 8

Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước tổng hợp gen bằng phương pháp POS 10

Hình 6: Thiết kế mồi nhân dòng gen mã hóa protein Pwo-pol 12

Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở E coli 15

Hình 8: Sơ đồ mô tả quá trình nhân dòng vector tái tổ hợp pEtM-Pwo 22

Hình 9: Sơ đồ quá trình tinh sạch protein Pwo-pol 27

Hình 10: Khuếch đại gen mã hóa Pwo-pol và xử lý enzyme cắt giới hạn 34

Hình 11: Biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo 35

Hình 12: Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp 36

Hình 13: So sánh trình tự amino acid của gen mã hóa Pwo DNA polymerase 37

Hình 14: Biểu hiện protein DNA polymerase ở E coli 38

Hình 15: So sánh sự phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao 39

Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sạch sắc ký ái lực 40

Hình 17: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC 41

Hình 18: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC 42

Hình 19: Tinh sạch bằng kết tủa muối AS bão hòa ở 4oC 43

Hình 20: Ảnh hưởng của pH đến sự ổn định của buffer PCR 44

Hình 21: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến khả năng khuếch đại đoạn gen ngắn 45

Hình 22: Hoạt tính sao chép của Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh sạch 46

Hình 23: Phản ứng của enzyme và protein tái tổ hợp ở nhiệt độ biến tính 98oC 47

Hình 24: Hoạt tính của các proein Pwo-pol trong phản ứng sử dụng khuôn genome 48

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự 4

Bảng 2: Đặc tính của một số enzyme DNA polymerase bền nhiệt 5

Bảng 3: Các chủng E coli phổ biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp 13

Bảng 4: Vị trí các đặc điểm của vector biểu hiện pEtM 16

Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock 20

Bảng 6: Trình tự cặp mồi nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA 22

Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR nhân dòng gen mã hóa Pwo-pol 23

Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt, nối gen và plasmid 24

Bảng 9: Trình tự các cặp mồi giải trình tự 26

Bảng 10: Thành phần hóa chất đổ gel điện di SDS-PAGE 30

Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen AcrH 30

Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen KOD 31

Bảng 13: Thành phần buffer bảo quản protein Pwo-pol 32

Bảng 14: Thành phần 10X buffer PCR tối ưu hoạt tính của protein Pwo-pol 32

Bảng 15: Phân tích sử dụng codon của gen mã hóa Pwo DNA polymerase 33

vii

MỞ ĐẦU

Enzyme DNA polymerase là một trong những enzyme quan trọng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: (1) trong sinh học phân tử, nhằm nghiên cứu gen và hệ gen; (2) trong y học, để chẩn đoán và phát hiện các bệnh di truyền, tầm soát ung thư; (3) trong nông nghiệp, như xác định các tác nhân gây bệnh cho cây trồng vật nuôi, thực vật biến đổi gen; (4) trong khoa học hình sự, để nhận diện các dấu chuẩn di truyền Mặc dù có vai trò quan trọng, nhưng ở Việt Nam việc tự sản xuất enzyme DNA polymerase vẫn gặp nhiều khó khăn về mặt quy trình và đánh giá chất lượng Các nghiên cứu nếu có đến nay, hầu hết là quy trình tối ưu cho dòng enzyme DNA polymerase thế hệ cũ với hoạt tính kém bền, kém ổn định Do vậy, nguồn enzyme DNA polymerase thế hệ mới sử dụng cho các mục đích phát triển khoa học công nghệ

ở Việt Nam đã và đang phải nhập từ nước ngoài Quá trình nhập khẩu thường kèm theo nhiều vấn đề không mong muốn cho người sử dụng như (1) thời gian vận chuyển kéo dài từ một đến vài tháng làm chậm tiến độ của đề tài, dự án; (2) chất lượng của enzyme bị ảnh hưởng do điều kiện bảo quản không đảm bảo trong thời gian dài; (3) bởi các yếu tố rủi ro mà giá thành mua enzyme từ các công ty hóa chất là rất đắt đỏ Hiện nay, các công ty công nghệ sinh học của Việt Nam đang rất cần nguồn enzyme được sản xuất trong nước với chất lượng tốt, tương đương với quốc tế nhưng có giá thành rẻ hơn, thời gian cung cấp nhanh hơn để làm nguyên liệu đầu vào cho việc phát triển các loại kit khác nhau Do vậy cần thiết phải xây dựng được quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase có chất lượng tốt tại các cơ sở nghiên cứu trong nước Việc sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp chủ động được nguồn nguyên liệu, giảm giá thành

và các chi phí vận chuyển khi phải nhập enzyme từ nước ngoài, tạo động lực cho sự phát triển của các công ty công nghệ sinh học của Việt Nam

Pwo-pol là enzyme có hoạt động ổn định nhất với các chuỗi DNA kích thước dưới 3 kb Hiện nay trên thị trường, enzyme này đang được thương mại hóa bởi một số hãng như Roche (Sigma), Genaxis và peQlab (Avantor) tuy nhiên quy trình sản xuất lại không được công bố Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein Pwo DNA

polymerase tái tổ hợp ở E coli” Mục đích của nghiên cứu nhằm góp phần đánh giá

chính xác hiệu quả sử dụng enzyme Pwo-pol ở quy mô phòng thí nghiệm đồng thời

3 Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E coli BL21 (DE3)

4 Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp

5 Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp tinh sạch được

1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát DNA polymerase

DNA polymerase là thành phần trung tâm tổng hợp nên các chuỗi DNA bổ sung theo khuôn mẫu trong tế bào sống [7] Ngoài những vai trò cơ bản nhằm duy trì tính toàn vẹn của bộ gen bởi quá trình sao chép và sửa chữa, DNA polymerase còn được sử dụng rộng rãi trong in vitro Vì vậy, nhiều enzyme DNA polymerase đã được phân lập để xác định cấu trúc và chức năng của chúng

1.1.1 Phân loại DNA polymerase

DNA polymerase thể hiện sự đa dạng cả trong cấu trúc và chức năng ở các sinh vật khác nhau Vào những năm 1950, nhà khoa học Arthur Kornberg và cộng

sự đã tìm thấy DNA polymerase (pol) I, đầu tiên ở vi khuẩn E coli Các nhà nghiên

cứu sau đó tiếp tục phát hiện thêm nhiều loại DNA pol thuộc các loài khác nhau cung cấp cho khoa học [25]

Theo phân loại dựa trên so sánh trình tự amino acid và mối quan hệ di truyền, các DNA pol được chia thành 7 họ lần lượt A, B, C, D, X, Y, RT Họ

polymerase A bao gồm Klenow Fragments của Escherichia coli và DNA polymerase I của Bacillus, Thermus aquaticus DNA polymerase, và T7 RNA –

DNA polymerases Họ polymerase B phụ thuộc DNA bao gồm các DNA

polymerase của phage T4, và RB69 Họ polymerase C (như DNA pol III của E

coli), họ polymerase D (như DNA pol II của Euryarchaeotic), họ polymerase X

(như DNA pol β của người), họ polymerase Y (như DNA pol IV, V của E coli), họ

polymerase RT

Mặt khác, dựa trên đặc điểm riêng của mỗi loại DNA polymerase có thể phân chúng thành các loại có đặc tính (1) sao chép (replicative) như pol α, γ; (2) sửa chữa (repairing) như pol β; (3) đọc sửa (proofreading) chiều 5’ – 3’ như pol δ, ε [44] Cụ thể, các DNA-pol có khả năng sao chép từ sinh vật nhân thực được tìm thấy trong họ polymerse B (pol α); từ vi khuẩn được tìm thấy trong họ polymerase

A (pol I) và C (pol III); và với vi khuẩn Cổ chúng thuộc họ polymerase B và D [2]

1.1.2 Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase

Hiện nay, các nghiên cứu đã xác định được nhiều cấu trúc của DNA polymerase Một số DNA pol đại diện ở hình 1 cho thấy sự đa dạng nhưng vẫn duy trì tính bảo thủ cao về mặt cấu trúc trong quá trình thực hiện chức năng của chúng

2

Hình 1: Sự đa dạng trong cấu trúc của một số loại DNA polymerase

Được so sánh bởi Steitz và cộng sự, 1999 [39]a Taq DNA polymerase liên kết DNA; b Cấu trúc bậc hai của HIV-RT và DNA; c Mô hình DNA liên kết với RB69 gp43; d Phức hợp cấu trúc bậc 3 pol β của chuột với DNA và dideoxy-NTP Các màu khác nhau biểu diễn các miền khác nhau tương ứng trên cả 4 cấu trúc: Miền “thumb” chuỗi màu xanh lá, miền “palm” chuỗi màu đỏ, miễn “finger” chuỗi màu xanh dương, chuỗi màu vàng là vị trí liên kết DNA, và chỉ duy nhất trong cấu trúc pol β của chuột có chứa miền màu tím có khả năng đọc sửa trong quá trình sao chép DNA

Theo quan sát tổng thể, các DNA polymerase có hình dạng giống cấu trúc bàn tay phải, bao gồm các miền “thumb,” “palm,” and “fingers” Miền palm có chức năng xúc tác phản ứng chuyển hóa phosphoryl Trong khi đó, miền finger đảm nhận các tương tác quan trọng với các nucleoside triphosphate của mạch khuôn DNA Miền thumb đóng vai trò xác định vị trí DNA xoắn kép, thúc đẩy quá trình dịch chuyển và gắn nucleotide của DNA polymerase (processivity) Nghiên cứu của Kim và cộng sự, 2008 đã so sánh sự tương đồng trong cấu trúc của Pfu DNA polymerase với KOD1 DNA polymerase (polB) Ngoài 3 thành phần quan trọng là các miền “fingers, palm, thumb” các DNA polymerase này còn có vùng exonuclease và N-terminal là những vùng có ý nghĩa quan trọng cho ứng dụng công nghệ sinh học [23]

1.1.3 Quá trình sao chép DNA

Quá trình sao chép DNA là sự kiện quan trọng diễn ra trong mỗi chu kỳ của

tế bào [37] có sự tham gia của một bộ máy sao chép Trong đó, các thành phần chính đã biết có sự tương tác với nhau và với các protein khác (hình 2)

3

Hình 2: Thành phần phức hệ sao chép DNA (replisome) ở vi khuẩn Cổ

Nghiên cứu bởi Li và cộng sự [27], 2010 đã tinh sạch các protein này bằng phương pháp

dung hợp đuôi 6xHis-tag và tinh sạch sắc ký ái lực ở Thermococcus kodakarensis Trong

đó, leading strand: mạch tổng hợp liên tục; lagging strand: mạch tổng hợp gián đoạn Các thành phần của phức hệ này bao gồm enzyme DNA polymerase PolB, polD liên kết kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh (PCNA) tổng hợp nên các đoạn DNA mới; enzyme DNA ligase cũng liên kết với PCNA nối các đoạn tổng hợp ngược chiều tháo xoắn; còn enzyme

Fen I liên kết PCNA sửa chữa trình tự tổng hợp; với sự trợ giúp của các enzyme MCM

phức hệ protein duy trì liên kết với enzyme tháo xoắn helicase; GINS: liên kết trực tiếp với MCM-helicase và primase enzyme tổng hợp đoạn RNA ngắn; RPA: protein ngăn chặn sự đóng xoắn trở lại của sợi đơn)

Nhìn chung, các phức hệ sao chép DNA được duy trì khả năng hoạt động dựa trên những nguyên tắc chung ở cả ba giới vi khuẩn thông thường (bacteria), vi khuẩn Cổ (archaea), và sinh vật nhân thực (eukaryotes) Trong số các sinh vật nhân

sơ, bộ máy sao chép của vi khuẩn Cổ được xem là ít phức tạp hơn nhưng lại gần gũi với sinh vật nhân chuẩn hơn so với các loại vi khuẩn thông thường Thành phần chính được mô tả và có chức năng giống nhau giữa chúng là các DNA polymerase

như pol α tương ứng polB hoặc polD; pol δ, ε tương ứng với enzyme Fen I

1.2 Ứng dụng của DNA polymerase

Hai kỹ thuật PCR và giải trình tự là những kỹ thuật cốt lõi trong nghiên cứu

di truyền học Đặc biệt được ứng dụng trong các lĩnh vực khoa học và sự sống như: (1) trong Sinh học: bảo tồn sự đa dạng động thực vật, bảo tồn nguồn gen quý; (2) trong y học: phân tích đánh giá khả năng mắc các bệnh di truyền; (3) trong khoa học pháp y: nhận biết các dấu chuẩn di truyền (STR), các đoạn lặp, tìm kiếm đa hình; (4) trong nông nghiệp: tạo giống cây trồng vật nuôi có hiệu quả kinh tế; (5) trong vi sinh vật với môi trường: nghiên cứu khả năng tiến hóa, mức độ lây lan ảnh hưởng tới con người và các sinh vật khác DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong

cả hai kỹ thuật trên Cùng với sự phát triển nhanh chóng của các công ty công nghệ

tử Các công nghệ giải trình tự thế hệ kế tiếp (NGS) đã được phát triển và liên tục cải tiến từ năm 2005 đến nay

Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự

Được tổng hợp bởi Chen-Yao, 2014 [5]

Họ Bacteria (E coli) Eukaryote (Human) Archaea Viruses Enzyme

A Pol I Pol γ (p140/p55/p55) N.A T3, T5, T7 Klenow, KlenTaq, Taq

Pol θ (p100/p90/p80) Bst, Bsu, T7 Pol ν

B Pol II Pol α/primase Pol BI HSV-1 T4, Ф29, 9 N, KOD1

(p180/p68/pri2/pri1) Pol BII RB69, T4 Pfu, Vent Pol δ (p125/p66/p50/p12) Pol BIII Ф29

Pol ε (p260/p59/p17/p12) Pol ζ (p350/p24)

tách DNA-pol I của E coli) để kết hợp hiệu quả với 2 ′, 3′-dideoxynucleotide

(ddNTPs) dẫn đến chấm dứt chuỗi tổng hợp DNA (Atkinson và cộng sự, 1969) Tiếp theo với sự cải tiến hóa học, các chất nền nucleotide được sử dụng để giải trình

tự DNA trở nên lớn hơn và cồng kềnh hơn, enzyme Klenow ban đầu không còn kết hợp hiệu quả các cơ chất mới [5] Thay vào đó, sự đa dạng của DNA polymerase được sử dụng và thiết kế riêng cho các công nghệ giải trình tự tiếp theo Hiện nay, các polymerase bền nhiệt họ polA, pol B đã và đang được cải biến, thử nghiệm trên các thiết bị điện di mao quản (CE) và NGS

5

1.2.2 Kỹ thuật PCR

Kỹ thuật nhân bản gen bằng phương pháp PCR là ứng dụng tiềm năng nhất của các DNA polymerase bền nhiệt (bảng 2) được phát triển bởi Kary Mullis và cộng sự, 1986 [20] Như phân loại ở trên, DNA-pol thể hiện sự đa dạng rất cao về chủng loại cũng như đặc tính của chúng Hiện nay, khoảng hơn 50 loại khác nhau của nhóm DNA-polB bền nhiệt đã được phân lập và xác định hoạt tính [31]

Bảng 2: Đặc tính của một số enzyme DNA polymerase bền nhiệt

Được tổng hợp bởi Kay Terpe, 2013 [40]

Tên loài DNA-pol Họ Chịu nhiệt Tỉ lệ sai sót Kéo dài

(kb/phút)

Đọc sửa Đầu thò Crenarchaeota

DNA-polB hay còn được gọi là enzyme DNA polymerase thế hệ mới có đặc tính đọc sửa 3’ – 5’ exonuclease giúp quá trình nhân bản DNA diễn ra chính xác hơn khi so sánh với Taq-pol (thế hệ enzyme bền nhiệt đầu tiên, có nguồn gốc từ

Thermus aquaticus)

Các nhà nghiên cứu đã nhận ra rằng các loại DNA-polB của vi khuẩn Cổ đã giải quyết vô số vấn đề gặp phải với Taq-pol như (1) dễ mắc lỗi sao chép khi nhân những đoạn DNA lớn; (2) hạn chế kích thước đoạn DNA nhân lên được; (3) hiệu suất PCR giảm do sự bắt cặp không khớp của mồi; (4) sự kết hợp không theo khuôn mẫu của dAMP khi kết thúc tái bản, một nu A luôn được duy trì ở đầu của mỗi sản

6

phẩm PCR Bên cạnh đó, các nghiên cứu động học tiết lộ rằng độ chính xác cao của các loại DNA-polB phụ thuộc rất nhiều vào sự kết hợp nucleotide chính xác cùng với khả năng đọc sửa exonucleoytic Do đó, DNA-polB của vi khuẩn Cổ đã được phát triển để tự xúc tác các phản ứng PCR với hiệu quả cao ngay cả khi có mặt của chất ức chế Đồng thời, các loại DNA-polB của vi khuẩn Cổ thường có độ sai sót thấp (khả năng đọc sửa 3’-5’ proofreading) nên được ứng dụng chính trong gây đột biến trực tiếp

So sánh các DNA-pol từ Thermococcus và Pyrococcus có tỷ lệ lỗi trung bình

thấp khoảng 10-6 (bảng 2) Trong đó, KOD1-pol có hiệu suất PCR tốt hơn về các tiêu chí như (1) kéo dài và tổng hợp sợi DNA nhanh hơn (extension rate); (2) hoạt động xúc tác hiệu quả hơn (higher processivity); (3) thể hiện hiệu suất vượt trội trong cả hai loại phản ứng PCR thông thường và real time PCR Tuy nhiên, chi phí sản xuất hoặc sử dụng enzyme này thường rất cao Vì vậy Pwo-Pol của vi khuẩn

thuộc chi Pyrococcus được sử dụng phổ biến hơn bởi độ bền cao, và cũng có độ

chính xác tương đương KOD1-pol

1.3 Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase

1.3.1 Phân loại nguồn gốc

Pwo DNA polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ Pyrococcus woesei thuộc chi Pyrococcus được mô tả bởi Zillig và cộng sự, 1987 [46] P woesei là một

trong những vi sinh vật ái cực đoan (extremophile) có khả năng sinh trưởng và phát triển trong những điều kiện khắc nghiệt nhất với nhiệt độ khoảng từ 95-103oC

7

Hệ gen của P woesei có sự tương đồng với các loài khác thuộc chi

Pyrococcus (hình 3) Theo thống kê, các trình tự của P woesei đã công bố trên ngân

hàng gen (28857 bp) bao gồm 22 gen đơn lẻ và 1 cụm ba gen (X59857) Khi so

sánh các trình tự này với các loài trong chi Pyrococcus thấy tỉ lệ tương đồng cao, giống đến 99% với các gen tương ứng của P furiosus

Một nghiên cứu khác đã tiến hành phân tích microarray DNA kết hợp PCR

trên tổng số 2065 khung đọc mở (ORF) của P woesei Kết quả đem so sánh với hệ gen của P furiosus cho thấy 105 ORF tương đồng bị thiếu trên hệ gen của P

woesei Các cụm gen thiếu này bao gồm một cụm (Mal I, PF1737 - PF1751) liên

quan đến chuyển hóa maltose và một cụm khác (PF0691 - PF0695) giúp loại bỏ các loại nitơ trong phản ứng độc hại So sánh với các loài khác trong cùng chi

Pyrococcus là P horikoshii và P abyssi, độ tương đồng khoảng 75%, do chúng

không có gen mã hóa amylase cũng như không có các yếu tố IS [19, 34]

1.3.2 Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp

Pwo DNA polymerase là một trong những enzyme bền nhiệt đã được nghiên

cứu biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn E coli Các công bố này chỉ ra, Pwo-pol tái tổ hợp có khả năng gây độc đối với tế bào biểu hiện E coli BL21 (DE3) Để

khắc phục vấn đề này, quá trình tối ưu biểu hiện Pwo-pol đã được tiến hành trên

trên tế bào vật chủ E coli BL21 (DE3) plysS [6, 12] Tuy nhiên, tất cả các nghiên

cứu đều chưa có đánh giá nhiều về đặc tính của protein tái tổ hợp này (bảng 2)

Pwo DNA polymease tự nhiên mang nhiều đặc tính nổi trội của nhóm enzyme bền nhiệt Do đó, việc phân tích các đặc tính của protein Pwo-pol ở trong tự nhiên sẽ giúp đánh giá chính xác hoạt tính của protien Pwo-pol tái tổ hợp trong nghiên cứu

Tương tự các DNA polymerae khác Pwo-pol cần một co-factor là các ion

Mg2+ hoặc Mn2+ để có thể xúc tác trong suốt quá trình Lượng ion Mg2+ hoặc Mn2+

sẽ bị mất đi nếu enzyme bị ức chế hoặc bất hoạt trong giai đoạn diễn ra phản ứng bởi các chất gây ức chế như phospholipit, EDTA, phenol… Một phản ứng PCR với xúc tác enzyme Pwo-pol có thể được tối ưu từ 1 – 10 mM MgSO4, 100 – 300 µM dNTP mỗi loại [1]

8

1.3.3 Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR

Khả năng bền nhiệt (Thermostability): đây là một trong những yếu tố cần

thiết cho phản ứng khuếch đại DNA Trong mỗi chu kỳ đều có bước biến tính làm tách mạch DNA bằng nhiệt độ cao (từ 94-98oC) Tính chất bền nhiệt của DNA polymerase phụ thuộc vào thời gian half-life của nó tại nhiệt độ cao nhất định Cụ thể Pwo-pol có thời gian half-life lên đến 2h tại 100oC [6] Thời gian bền nhiệt cũng phụ thuộc vào nồng độ protein hoặc một số điều kiện khác như các chất tẩy rửa (DTT, Tween 20), betaine (BSA) và đường Chưa có nhiều chứng minh độ pH hay nồng độ muối ảnh hưởng đến tính bền nhiệt của ezyme DNA polymerase

Tốc độ kéo dài chuỗi (Extension rate): đại diện cho số lượng dNTPs trùng

hợp mỗi giây trên mỗi phân tử DNA polymerase Tốc độ kéo dài chuỗi DNA phụ thuộc mạnh mẽ vào môi trường phản ứng và khuôn mẫu DNA Một số phân tử DNA có trình tự giàu GC, thậm chí có thể hình thành các cấu trúc ngăn chặn sự kéo dài mồi Tốc độ kéo dài của Pwo-pol sẽ tương tự với Pfu-pol khoảng 0.5-1.5 kb/phút, thấp hơn 5-10 lần enzyme Tkod-pol [40] Tốc độ kéo dài chuỗi không xem xét đến khả năng bám cũng như đọc sửa của của DNA polymerase ở trạng thái ổn định Tốc độ kéo dài như là sự khác biệt giữa tốc độ trùng hợp và loại bỏ các nucleotide ở đầu 3’

Đặc tính xử lý trình tự (Processivity): là xác suất, sau khi gắn nucleotide,

polymerase sẽ không tách khỏi DNA khi chuyển sang vị trí tiếp theo

Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho một DNA polymerase Được nghiên cứu bởi Pavlov và cộng sự, 2004 [31]

9

DNA polymerase nằm trên một điểm liên kết khuôn mẫu với primer (hình 4)

Các hằng số tốc độ bậc một tương ứng: κ pol (bổ sung nucleotide); κ exo (cắt bỏ

nucleotide); κ off (phân ly polymerase từ phân tử DNA) Khi đó, giá trị processivity của chúng được tính theo công thức:

P = (κpol – κexo) / (κpol + κexo) + (κpol – κexo) / (κpol + κexo + κoff) Tương tự như khả năng kéo dài chuỗi, giá trị của P phụ thuộc vào trình tự DNA khuôn và thành phần phản ứng ví dụ như nồng độ muối

Hầu hết các enzyme DNA-polB có khả năng xử lý trình tự không cao khoảng

từ 4-30 nucleotide/1 lần bám của DNA polymerase [40] Điều này gây ra hạn chế với nhóm enzyme này trong một số ứng dụng sao chép DNA plasmid Một phương pháp hiệu quả để cải thiện nhược điểm này là các DNA-pol lai được dung hợp với một phần protein khác có khả năng bám DNA tốt (như Sso7d)

Sự chính xác (Fidelity): là một đặc tính của DNA polymerase, thể hiện số

nucleotide được chèn chính xác sau mỗi lần chèn sai Khả năng này cũng được hiểu

là hiệu quả xúc tác cho những cơ chất biến đổi của DNA polymerase Nếu DNA polymerse có khả năng xúc tác hiệu quả cao thì sự chính xác trong quá trình chèn nucleotide càng cao và ngược lại

Tốc độ đọc sai (Error-rate): Đối với các enzyme DNA polymerase bền

nhiệt, chúng có khả năng đọc sửa (proofreading) nhờ hoạt động exonuclease theo chiều 3’-5’ để khắc phục nhược điểm chèn sai [43] Tần số sai sót (đột biến) của Pwo-pol sau mỗi lần nhân đôi khoảng 10-6 thấp hơn 18 lần so với Taq-pol có sự sai sót từ 1.8x10-4 – 8.0x10-6 [40]

Các thành phần đệm PCR và điều kiện chu trình nhiệt có thể ảnh hưởng đến

độ chính xác của DNA polymerase theo các cách khác nhau hoặc ở các mức độ khác nhau Ví dụ, mặc dù các ion magie được xem như là co-factor giúp DNA polymerase xúc tác tổng hợp nucleotide chính xác, nhưng lượng magie dư thừa sẽ làm giảm độ chính xác của chúng Nồng độ nucleotide không đồng đều cũng sẽ làm giảm độ chính xác vì sự kết hợp sai của nucleotide nồng độ cao hơn sẽ xảy ra thường xuyên hơn Các điều kiện chu trình nhiệt như làm biến tính DNA đến nhiệt

độ cao trong thời gian dài có thể dẫn đến việc giải phóng các bazơ từ chuỗi liên kết phosphodiester, dẫn đến những sai sót [21]

10

1.4 Công nghệ protein tái tổ hợp

1.4.1 Tổng hợp gen, tối ưu mã codon

Hiện nay, các nhà khoa học có thể dễ dàng truy cập các dữ liệu tin sinh nhằm khuếch đại và tổng hợp một đoạn trình tự gen đích của đối tượng nghiên cứu Theo thống kê trên ngân hàng dữ liệu trình tự của NCBI, đã lưu trữ hệ gen của gần 50 nghìn loài sinh vật khác nhau trong đó bao gồm Eukaryotes (9631 trình tự); Prokaryotes (220559 trình tự); Viruses (33870 trình tự); Plasmids (19175 trình tự); Organelles (15058 trình tự) Từ nguồn dữ liệu quý giá này, các nhà khoa học tiếp tục phát triển nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein được mã hóa

Tổng hợp gen

Tổng hợp gen de novo là một công cụ thiết yếu trong các nghiên cứu sinh

học như tương tác protein nucleic acid, đột biến gen được định hướng và tối ưu hóa việc sử dụng codon để biểu hiện gen từ các trình tự đã biết Một số phương pháp sinh học phân tử như cắt enzyme giới hạn [29], enzyme nối ligase [11], sau đó khuếch đại bằng PCR hoặc chèn vào vector nhân dòng để biểu hiện protein tái tổ hợp [30] Tuy nhiên, quá trình này thường tạo ra các sản phẩm phụ hoặc không mong muốn do đột biến

Gen mã hóa protein Pwo-pol sử dụng trong nghiên cứu này được tổng hợp dựa trên quy trình lắp ráp oligonucleotide POS (patch oligonucleotide synthesis) như hình 5 bao gồm 3 bước chính: Phosphorylation, Ligase Chain Reaction, Polymerase Chain Reaction POs là một trong những phương pháp tổng hợp gen nhanh chóng và chính xác nhất

Bước 1:

Phosphorylation

Bước 2: LCR

Bước 3: PCR

Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước tổng hợp gen bằng phương pháp POS

Được nghiên cứu bởi Yang và cộng sự, 2011 [42]

Bước 3: PCR khuếch đại đoạn gen hoàn chỉnh sử dụng cặp mồi ở phía ngoài cùng

Tối ưu hóa việc sử dụng codon biểu hiện gen

Codon là mã bộ ba, được cấu tạo từ 4 loại nucleotide adenine (A), guanine (G), cytosine (C) and thymine (T) và có tất cả 64 mã bộ ba mã hóa cho hơn 20 loại acid amin khác nhau Vậy nên mã bộ ba có tính dư thừa, nhiều bộ ba có thể quy định cùng một loại acid amin Các sinh vật thường ưu tiên sử dụng các mã bộ ba riêng của chúng, điều này phản ánh sự cân bằng giữa chiều hướng của đột biến và chọn lọc tự nhiên cho hiệu quả dịch mã

Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều báo cáo về các gen có mức

độ biểu hiện cao ở một số vi sinh vật đã cung cấp nhiều thông tin về biểu hiện gen Trong đó, chủ yếu liên quan đến các gen mã hóa protein là yếu tố phiên mã / dịch

mã (TF), protein ribosome (RP), protease và chaperons (CH), các enzyme phân giải, sinh tổng hợp, chuyển hóa, quang hợp, hô hấp và glycolysis là các sản phẩm quan trọng đối với sinh lý tế bào Có lẽ, sự chuyển dịch trong thành phần axit amin của các gen này có thể giảm thiểu chi phí năng lượng sinh tổng hợp đáng kể cho sinh vật Bên cạnh các cơ chế khác, người ta cũng đề xuất rằng chuyển dịch codon (codon bias) có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen bằng cách tối ưu hóa tốc độ dịch

mã và do đó, các gen biểu hiện cao có thể được đặc trưng bởi tối ưu sử dụng mã bộ

ba so với các gen biểu hiện trung bình [35]

Có rất nhiều các mô hình đã đưa ra để đo lường mức độ chuyển dịch codon Trong đó, chỉ số CAI (Codon Adaptation Index) do Sharp và Li nghiên cứu đã nhanh chóng được sử dụng rộng rãi để dự đoán mức độ biểu hiện của các gen khác nhau [33] Giá trị của chỉ số CAI dao động từ 0 – 1, là 1 nếu một gen luôn được sử dụng các condon đồng nghĩa trong tập tham chiếu Chỉ số CAI được xem xét là phù

hợp cho biểu hiện gen ở E coli dao động từ 0.8 – 1, %GC của các gen từ 30 – 70%

tổng số nucleotide [14] Vì vậy, tối ưu hóa mã bộ ba là một bước quan trọng trong

nghiên cứu biểu hiện gen Pwo-pol để phù hợp với vật chủ biểu hiện E coli

1.4.2 Nhân dòng gen đích vào vector mong muốn

Kỹ thuật PCR nhân dòng gen

12

5’ ATG ATT CTG GAT GTG GAT TAT ATC AC - G CTG AAC ATT AAG AAA AGC TAA 3’

3’ TAC TAA GAC CTA CAC CTA ATA TAG TG - C GAC TTG TAA TTC TTT TCG ATT 5’

Coding strand

5’ ATG ATT CTG GAT GTG GAT TAT ATC AC - G CTG AAC ATT AAG AAA AGC TAA 3’

Start codon

3’ TAC TAA GAC CTA CAC CTA ATA TAG TG - C GAC TTG TAA TTC TTT TCG ATT 5’

ATT CTG GAT GTG GAT TAT ATC AC

C GAC TTG TAA TTC TTT TCG ATT Non-Coding strand

Complementary

Complementary

Mồi xuôi

Mồi ngược

Hình 6: Thiết kế mồi nhân dòng gen mã hóa protein Pwo-pol

Nhiều kỹ thuật đã được giới thiệu để lắp ráp các đoạn DNA khác nhau như PCR các đoạn trình tự chồng gối (overlaping), tuy nhiên phổ biến nhất trong kỹ thuật nhân dòng gen là việc sử dụng enzyme giới hạn Yêu cầu của phương pháp là trên cả hai trình tự DNA chèn và vector phải có cùng vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, chúng sẽ được nối lại từ các vết cắt kiểu đầu dính hoặc đầu bằng Tuy nhiên không phải khi nào đoạn gen đích cũng chứa vị trí cắt enzyme giới hạn tương ứng Việc sử dụng mồi PCR chứa các vị trí cắt enzyme giới hạn có thể giải quyết hiệu quả vấn đề này (hình 6) Đoạn gen đích được nhân bản bằng PCR cực kỳ nhanh chóng và hiệu quả với sự trợ giúp của DNA polymerase bền nhiệt Giải trình tự các sản phẩm PCR thu được, kiểm tra và phân tích dữ liệu trước khi chèn vào vector nhân dòng [16]

Escherichia coli được xem như là là một trong những bioreactor phù hợp

nhất trong phần lớn các thí nghiệm nhân dòng gen Vector plasmid chứa trình tự

gen của sinh vật lạ được chuyển vào và sao chép độc lập với hệ gen của vi khuẩn E

coli Đây được gọi là công nghệ DNA tái tổ hợp dựa trên cơ chế biến nạp

(transformation) trong tự nhiên của vi khuẩn nhưng được thực hiện theo phương pháp sốc nhiệt ở trong phòng thí nghiệm Trước khi xử lý sốc nhiệt, tế bào vi khuẩn

E coli được xử lý với canxi ở nồng độ cao khoảng 100mM Trong điều kiện môi

trường giàu canxi màng tế bào vi khuẩn tích điện dương hơn, và DNA plasmid tích

điện âm có xu hướng tiếp xúc lại gần màng tế bào vi khuẩn Tế bào khả biến E coli

sau đó xử lý sốc nhiệt từ 0-42oC dẫn đến màng tế bào bị mất đi một lượng các lipid

và protein [3] Ở trạng thái cấu trúc màng tế bào lỏng lẻo DNA plasmid dễ dàng chuyển vào bên trong, khả năng biến nạp tăng lên khoảng 60% so với khi biến nạp vào tế bào không xử lý với canxi [26]

1.4.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp

13

a Vật chủ biểu hiện

Các điều kiện vật chủ, vector và nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ nuôi cấy) là

ba yếu tố chính quyết định sự thành công trong biểu hiện protein tái tổ hợp Hiện nay, có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp từ đơn giản đến phức tạp nhưng phổ biến hơn cả là hệ thống biểu hiện ở prokaryote

Đặc điểm nổi bật của vật chủ E coli phù hợp biểu hiện protein tái tổ hợp

Một trong những vật chủ được ưu tiên để sản xuất protein tái tổ hợp là E

coli Ưu điểm: có tốc độ sinh trưởng nhanh (15 phút/chu kỳ sinh trưởng) và mật độ

tế bào cao, dễ thao tác, mức độ biểu hiện lớn trong thời gian ngắn và chi phí thực hiện thấp Nhược điểm: thiếu sự biến đổi sau dịch mã cho nhiều protein có tính chất phức tạp, kích thước protein biểu hiện bị hạn chế, đôi khi protein biểu hiện có thể ở

dạng thể vùi không tinh sạch được Tuy nhiên E coli được biết đến với toàn bộ hệ gen đã được giải mã Do đó, nhiều sửa đổi đã được thực hiện trên E coli để tối ưu

hóa chúng trở thành đối tượng tiềm năng cho nghiên cứu biểu hiện protein Các nỗ lực để tăng cường khả năng biểu hiện gen được thể hiện thông qua cải biến di truyền (genetic engineering) cũng như các kỹ thuật trên phạm vị toàn hệ gen (strain engineering) [28]

E coli bao gồm nhiều chủng Do đó, việc lựa chọn được vật chủ phù hợp có

thể đem lại hiệu quả biểu hiện cho các protein khác nhau Mặc dù các vật chủ đó cũng có những ưu điểm và nhược điểm riêng như trong bảng 3

Bảng 3: Các chủng E coli phổ biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp

Được tổng hợp bởi Hayat SMG và cộng sự, 2018 [13]

Lemo21

(DE3)

Gồm các đặc điểm của BL21 (DE3) Biểu hiện đồng thời được các dòng khác nhau bởi sự đa dạng mức độ của lysozyme

Phù hợp cho biểu hiện các protein khó như: các protein gây độc tố, các protein màng và ít tan

14

Tuner (DE3) Có sự biến đổi lac permerase (lacY)

Cho phép sự tiếp nhận đồng dạng ở tất cả các tế bào trong quần thể

Phù hợp biểu hiện protein gây độc và không tan

Phù hợp cho biểu hiện các protein dị hợp

Hơn một thập kỷ trước, Walker và cộng sự đã phân lập được các chủng E

coli đột biến C41 (DE3) và C43 (DE3) mang các đột biến dập tắt tự phát (suppresor

mutations) Vai trò của các đột biến này được cho rằng đã làm giảm độc tính gây ra

từ việc sản xuất protein nội bào dưới sự kiểm soát của promoter T7 Không có gì đáng ngạc nhiên, sau đó người ta đã phát hiện ra rằng các đột biến ở các chủng này làm giảm hiệu quả dịch mã của T7 RNA polymerase [9] Hiện nay, chúng được biết

đến là các chủng đột biến của E coli BL21 (DE3) và được sử dụng như một vật chủ

phổ biến biểu hiện protein tái tổ hợp E coli BL21 được định nghĩa là một trong

những loại chủng B thiếu Lon protease (tế bào chất) và protease OmpT (màng ngoài) DE3 là các chủng tương ứng có chứa lysogen λDE3, mang gen T7 RNA polymerase dưới sự kiểm soát của promoter lacUV5 T7 RNA polymerase sẽ được thể hiện bằng cách bổ sung chất cảm ứng isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) vào môi trường sinh trưởng [45]

b Vector biểu hiện

Vector biểu hiện (plasmid thiết kế) đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất protein tái tổ hợp Vector được thiết kế có khả năng nhân lên độc lập với

hệ gen của vật chủ nuôi cấy, dễ dàng thao tác và kiểm soát mức độ biểu hiện cũng

như tinh sạch protein tái tổ hợp

15

Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở E coli

Được xây dựng bởi Jia và Jeon, 2016 [17] a Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở

tế bào chất; b Cấu trúc vector sử dụng biểu hiện protein ở màng tế bào D tags (Detection);

P tags (Purification); S tags (Solubility and translation initiation); TT (Transcriptional terminator)

Cấu trúc vector biểu hiện phổ biến ở vi khuẩn E coli thường bao gồm các

yếu tố như marker chọn lọc là các gene kháng kháng sinh, điểm khởi đầu sao chép (Ori), promoter phiên mã (T7-promoter), vùng không dịch mã đầu 5’ (5’UTR) và vị trí bắt đầu dịch mã Bên cạnh đó, một điểm quan trọng khác của các vector biểu hiện là sự có mặt của đuôi dung hợp (His tag, GST tag…) nằm trên cùng khung đọc

mở với gen được biểu hiện, ngược chiều phiên mã với các yếu tố khác (hình 7) Vùng T7 promoter được sử dụng để kiểm soát mức độ biểu hiện của protein Cặp đuôi ái lực giúp định hướng biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp Đuôi lớn hơn

để bắt đầu biểu hiện protein, phát hiện tính tan và độ hòa tan của protein; đuôi nhỏ hơn sử dụng để tinh chế protein Các vị trí cắt enzyme như TEV protease hoặc thrombin được thiết kế trên vector để loại bỏ các đuôi ái lực sau khi tinh chế protein Với các protein tái tổ hợp sản xuất trong tế bào chất các đuôi ái lực được thiết kế gắn vời đầu C-terminus của protein đích (hình 7b) Trong khi đó, với các protein tái tổ hợp sản xuất ở màng các đuôi ái lực được thiết kế gắn vời đầu N-terminator của protein đích (hình 7a)

16

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hệ thống biểu hiện T7 RNA polymerase ở vector pET-M (là vector biến thể của pET-32a đã loại bỏ đuôi S-tag

và trình tự gen TrxA) trên tế bào vật chủ E coli BL21 (DE3)

Bảng 4: Vị trí các đặc điểm của vector biểu hiện pET-M

Đặc điểm pET-M (biến thể pET-32a) Giới hạn

Multiple cloning sites (AvaI-BamHI) 158-198

Khi protein tái tổ hợp đã dễ dàng được biểu hiện ở các vi sinh vật như E coli

thì yêu cầu đặt ra là cần có phương pháp để tinh sạch các protein tái tổ hợp này Do

đó, protein tái tổ hợp thường được dung hợp với một số đuôi ái lực như: histidine, Glutathione S-transferase (GST), vv…

poly-Một trong những phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực phổ biến là IMAC (Immobilized Metal-Affinity Chromatography) được sử dụng để tinh sạch các protein tái tổ hợp có chứa đuôi poly-histidine [38] IMAC dựa trên sự tương tác giữa các ion kim loại chuyển tiếp (như Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+) được cố định trên một mạng lưới gel (sepharose) với các chuỗi bên acid amin đặc biệt Histidine là axit amin có chứa vòng imidazole đóng vai trò là nhóm cho điện tử, nên dễ dàng hình thành liên kết phối hợp với kim loại chuyển tiếp bất động Vì vậy protein tái tổ hợp chứa chuỗi peptide gồm các histidine liên tiếp sẽ được giữ lại một cách hiệu quả trên mạng lưới gel IMAC Hơn nữa, chuỗi poly-histidine cũng dễ dàng được

17

rửa giải bằng cách điều chỉnh pH của dung dịch đệm rửa hoặc bổ sung imidazole tự

do như là chất cạnh tranh với histidine [4]

Phương pháp IMAC đã tinh sạch thành công trên các hệ thống vật chủ biểu

hiện như E coli, Saccharomyces cerevisiae, tế bào côn trùng, tế bào động vật với

hiệu suất tinh sạch cao lên đến 95% Tuy nhiên, yêu cầu đối với phương pháp là mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp phải đủ lớn để tạo nên sự đồng nhất Trong một số trường hợp, quy trình tinh sạch đuôi ái lực poly-histidine có thể được thay đổi để tăng độ tinh sạch như sử dụng hai đuôi ái lực hoặc kết hợp loại bỏ His-tag với các bước tinh sạch IMAC đảo ngược [24]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột tinh sạch Glass-Econo Column (kích thước lỗ màng 30 µm) có chứa các hạt gel gắn nickel (Ni-NTA Agarose, Qiagen) Khi có mặt nickel, các phân tử NTA cố định ion Ni2+ tạo nên mạng lưới ion kim loại có ái lực cao với đuôi 6xHis được gắn vào đầu N- của protein tái tổ hợp

b Phương pháp kết tủa ammonium sulfate

Thông thường, có rất ít protein chỉ hòa tan trong nước và hầu hết cần ít nhất một nồng độ muối nhỏ để duy trì nếp gấp và ổn định Ở trạng thái tự nhiên, protein

có khả năng tích điện âm hoặc dương tùy thuộc vào từng vùng Sự có mặt của muối giúp protein trung hòa điện tích bề mặt, ngăn ngừa sự kết tụ Tuy nhiên, khi nồng

độ muối tăng lên, protein tiếp tục tích điện dẫn đến sự kết tụ Độ tan của protein tăng khi thêm lượng muối nhỏ hơn 0.15 M Ngược lại, nếu nồng độ muối cao hơn, protein có xu hướng bị kết tủa Bên dưới là dãy các ion sắp xếp theo chiều salt-out giảm dần, salt-in tăng dần, với pH của dung dịch > pI của protein; và ngược lại nếu

pI của protein < pH của dung dịch [10]:

Anion: PO43- > SO 4 2- > CH3COO- > Cl- > Br- > ClO4- > SCN

-Cation: NH 4 + > Rb+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+

Ammonium sulfate (AS) là một trong những muối có độ hòa tan cao nhất, độ bão hòa dung dịch là 4.1 M ở 25oC, 4.06 M ở 20oC, 3.97 M ở 10oC, 3.93 M ở 4oC

và 3.9 M ở 0oC Khả năng hòa tan cao giúp chúng phân ly mạnh thành các ion âm

và ion dương, dễ dàng trung hòa điện tích cho protein Vì thế, muối AS được sử dụng trong phương pháp kết tủa mà vẫn duy trì được khả năng cuộn gập tự nhiên của protein Tùy thuộc vào khối lượng phân tử, cấu trúc không gian của mỗi protein

18

mà chúng sẽ kết tủa ở nồng độ muối khác nhau Ở nồng độ muối AS 90% độ bão hòa, tất cả các protein đều bị kết tủa [41] Protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp trong nghiên cứu theo lý thuyết bao gồm 790aa, có pI tương ứng 7.92 và khối lượng khoảng 92 kDa Theo một nghiên cứu tương tự, protein Taq DNA polymerase (kích thước ~90 kDa) đã được tinh sạch thành công sử dụng nồng độ muối AS khoảng 50% độ bão hòa trên tổng thể tích dung dịch [32] Tuy nhiên phương pháp kết tủa này được sử dụng phổ biến hơn khi tinh sạch các protein liên kết màng tế bào

19

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiên tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, và PTN Sinh học phân tử tế bào (Molecular Cell Biology Lab) thuộc Trung tâm Khoa học và Sự sống, Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN

2.1.1 Nguyên vật liệu

 Chủng vi sinh vật sử dụng trong nuôi cấy: dòng tế bào khả biến E coli BL21

(DE3) được lưu trữ trong bình ni tơ lỏng

 Vector biểu hiện protein tái tổ hợp trong nghiên cứu: plasmid pEtM (biến thể của PET32a) nhận được từ phòng thí nghiệm sinh học cấu trúc I thuộc Bộ môn Sinh học, Khoa khoa học, Đại học Quốc gia Singapore

 Gen mã hóa Pwo-pol và mồi nhân dòng gen được tổng hợp hóa học bởi công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị

 Thiết bị dùng trong sinh học phân tử: Máy PCR Mastercycler nexus Eppendorf (Đức), Bộ điện di ngang Mupid-one (Japan), bộ điện di đứng BioRad (Đức), hệ thống máy soi gel (Mỹ)

 Thiết bị dùng trong nuôi cấy vi sinh vật: Tủ an toàn sinh học, máy lắc nuôi vi khuẩn (Hàn quốc)

 Thiết bị dùng trong tinh sạch protein tái tổ hợp: Máy siêu âm LABONIC® M (Đức), Máy ly tâm ống epp 1.5 ml hoặc 2 ml, máy ly tâm ống falcon tốc độ cao Eppendorf, Cột tinh sạch Glass-Econo Column – BioRad (Đức)

2.1.3 Hóa chất và môi trường

Nghiên cứu sử dụng 2 loại môi trường (LB lỏng, LB agar) cho nuôi cấy vi khuẩn và một số dung dịch đệm, hóa chất stock được liệt kê trong bảng 5 Các hóa chất, dung dịch đệm được pha với các nồng độ stock (50X, 10X…) trước khi đem

sử dụng làm thành phần cho đệm điện di DNA, điện di protein, tinh sạch protein…

Hóa chất để pha các dung dịch đệm được mua từ các hãng uy tín như Merck, Thermo Scientific, Sigma Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng sử dụng một số bộ kit thương mại như kít tách chiết plasmid (Thermo Scientific), kít tinh sạch/thôi gel sản phẩm PCR và sản phẩm cắt, nối DNA/plasmid (iNtRon)

20

Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock

(thể tích)

Môi trường (1L) LB lỏng Tryptone 10 g

Yeast extract 5 g

Agar 15 g Đệm Stock (1L) Tris HCl 1 M Tris base 121.1 g

Đệm TAE, stock 50X (2 M Tris, 50 mM EDTA) là đệm chạy điên di gel agarose

Trong 1 lít bao gồm 242 g tris base; 57.1 ml acetic acid (đặc) và 100 ml EDTA 0.5

M, pH 8.0, lưu ý ban đầu chỉ đổ vào khoảng 800ml nước cất để hòa tan các hóa chất trước khi thêm nước cho đủ 1 lít vì các hóa chất có khối lượng lớn cũng chiếm một lượng thể tích nhất định

DNA loading dye (5X) tra mẫu DNA bao gồm 25% Glycerol, 25 mM EDTA, 0.5%

SDS, 0.08% BPB (bromophenol blue), sau khi pha hỗn hợp có màu tím

21

b Đệm điện di protein

Đệm Running 1X (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH8.3) là dung dịch

đệm chạy điên di gel SDS-PAGE Trong 1 lít running buffer 1X bao gồm 30.3 g tris base, 144 g glycine, 10 g SDS Tương tự pha đệm TAE, dùng khoảng 800 ml nước cất hòa tan các hóa chất trước khi thêm nước vào để được 1 lít dung dịch

SDS loading dye (5X) tra mẫu protein bao gồm 250mM Tris, pH 6.8, 10% (g/ml)

SDS, 30% Glycerol, 5% β-mercapitalethanol, 0.02% BPB, sau khi pha hỗn hợp có màu xanh lục đậm, có thể thay đổi tùy thuộc vào pH của dung dịch

Đệm nhuộm gel SDS-PAGE gồm có 0.1% (g/ml) Coomassie Brilliant Blue G-250

và 50% methanol, 10% acetic acid tổng thể tích dung dịch đệm

Đệm tẩy gel SDS-PAGE gồm có 40% methanol, 10% acetic acid tổng thể tích dung

dịch đệm

c Đệm tinh sạch và xử lý cột tinh sạch

Các dung dịch đệm sử dụng trong quá trình tinh sạch protein bằng cột sắc ký

ái lực nickel-resin:

Đệm A1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 5mM Imidazole

Đệm B1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 30mM Imidazole

Đệm C1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 500mM Imidazole

Đối với phương pháp tinh sạch protein bằng phương pháp kết tủa (NH4)2SO4

sử dụng 2 dung dịch đệm:

Đệm A2 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA

Đệm B2 bao gồm 50mM Tris HCl, 20% sucrose, 1mM EDTA

Đệm C2 bao gồm 50mM Tris HCl, 300mM NaCl

Đệm thẩm tách cho cả hai phương pháp bao gồm các thành phần: 20mM Tris-HCl,

pH 8.0, 200mM NaCl

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase

Chúng tôi sử dụng thông tin trình tự amino acid quy định protein DNA

polymerase I của vi khuẩn Pyrococcus woesei đã công bố trên GenBank

(AAB67984) để thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase Trình tự gen đích

được tối ưu biểu hiện phù hợp với vật chủ E coli sử dụng phần mềm online