Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột gạo lứt lên men lactic giàu kefiran

Phương pháp lên men sữa gạo lứt sử dụng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp kefiran sẽ tận dụng được nguồn nguyên liệu phổ biến ở Việt Nam đồng thời cải tiến những yếu điểm của sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGÔ DUY KỲ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘT GẠO LỨT LÊN MEN

LACTIC GIÀU KEFIRAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Thị Việt Anh

TS Phạm Thế Hải

Hà Nội - Năm 2020

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS Nguyễn Thị Việt Anh, người đã hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại viện Cô đã luôn theo sát, chỉ bảo cho tôi những góp ý quý báu để tôi có thể hoàn thành tốt công việc

Tôi cũng rất biết ơn TS Phạm Thế Hải đã chỉ bảo, hướng dẫn tôi kiến thức kĩ năng mới để tôi hoàn thiện được luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Nguyễn Minh Thu, cùng toàn thể các

cô, chú, anh chị tại Bộ môn Công nghệ lên men đã chỉ dạy, hướng dẫn cho tôi

từ những ngày đầu tôi vào làm việc tại phòng, truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm trong công việc cũng như trong cuộc sống

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô trong Khoa Sinh học

- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung và

Bộ môn Vi sinh vật nói riêng đã giảng dạy và trang bị cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt khóa học

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, đã luôn ở bên, động viên cho tôi có thêm nghị lực để vượt qua khó khăn trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2020

Học viên

Ngô Duy Kỳ

i

Trang

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về gạo lứt ……… 3

1.1.1 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của hạt lúa - gạo lứt 4

1.1.1.1 Nước 4

1.1.1.2 Glucid 5

1.1.1.3 Protid 6

1.1.1.4 Lipid 7

1.1.1.5 Chất khoáng 7

1.1.1.6 Vitamin 7

1.1.1.7 Enzyme 8

1.1.1.8 Mùi thơm của gạo 9

1.1.1.9 Chất màu trong gạo lứt 9

1.1.2 Một số tác dụng của gạo lứt 9

1.2 Vi khuẩn lactic……… ……… …13

1.2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 13

1.2.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic 14

1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic 15

1.3 Kefir 16

1.3.1 Hệ vi sinh vật trong hạt nấm kefir 16

1.3.2 Vai trò của khuẩn lactic trong hạt nấm kefir 17

1.4.Exoplolysaccharide và những hiểu biết chung về Kefiran 20

1.4.1 Exopolysaccharide 20

1.4.2 Chức năng và các dạng đặc trưng của EPS 20

1.4.3 Tổng quan về kefiran 22

1.4.3.1 Ứng dụng của kefiran 23

1.4.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp kefiran ở vi khuẩn lactic 25

ii

1.4.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất Kefiran hiện nay………27

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu 29

2.1.1 Nguyên liệu 29

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp vi sinh 30

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 30

2.2.1.2 Phương pháp đánh giá khả năng tạo sinh khối vi khuẩn lactic 31

2.2.1.3 Phương pháp định tên chủng giống 31

2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lý 31

2.2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 32

2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng axit tổng (theo axit lactic) 33

2.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô hòa tan 34

2.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng kefiran (exopolysaccharide) 34

2.2.3 Phương pháp công nghệ 35

2.2.3.1 Phương pháp thủy phân bột gạo lứt 35

2.2.3.2 Phương pháp lên men 35

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 36

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho quá trình lên men gạo lứt giàu kefiran 37

3.1.1 Phân lập và sơ tuyển chủng vi khuẩn lactic 37

3.1.2 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp kefiran cao 39

3.2 Định danh chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn được 39

3.3 Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột gạo lứt lên men lactic giàu kefiran41 3.3.1 Sơ chế gạo lứt 41

3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nhân giống sinh khối thích hợp 43

3.3.2.1 Lựa chọn môi trường nhân giống 43

3.3.2.2 Khảo sát thời gian và nhiệt độ nhân giống 45

3.3.2.3 Khảo sát mật độ giống bổ sung vào môi trường lên men 46

iii

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men đến khả năng sinh

tổng hợp kefiran của chủng lựa chọn 47

3.3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dịch gạo thủy phân 47

3.3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường saccharose bổ sung 48

3.3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men bổ sung 49

3.3.3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung chất khoáng 50

3.3.4 Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp kefiran 51

3.3.4.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu 51

3.3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men 52

3.3.4.3 Động học của quá trình lên men sinh tổng hợp kefiran của chủng 53

3.3.5 Nghiên cứu điều kiện sấy phun tạo sản phẩm 54

3.3.5.1 Xác định nồng độ chất mang trong quá trình sấy phun 55

3.3.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô nguyên liệu đến chất lượng và hiệu suất thu hồi sản phẩm 57

3.3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun đến chất lượng và hiệu suất thu hồi sản phẩm ……….58

3.3.5.4 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến chất lượng sản phẩm 59

3.6 Quy trình sản xuất bột gạo lứt lên men lactic giàu kefiran 60

PHẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

4.1 Kết luận 64

4.2 Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

Rice – Yeast - Glucose

Rice – Yeast – Glucose - Peptone

Rice – Yeast – Peptone

deoxyribonucleic acid

Ribosomal ribonucleic acid

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong từng phần của hạt lúa 4

Bảng 1.2 So sánh thành phần của gạo lứt và gạo xát 4

Bảng 1.3 Tỷ lệ các protein của các bộ phận trong hạt gạo 7

Bảng 1.4 Thành phần vitamin trong các loại gạo 8

Bảng 1.5 Thành phần vi sinh vật có trong hạt kefir từ các nguồn gốc khác nhau 17

Bảng 1.6 Danh sách các exopolysaccharide 21

Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào của các chủng vi khuẩn lactic 37

Bảng 3.2 Đánh giá cảm quan gạo lứt rang và hiệu suất thủy phân trong cùng điều kiện 42

Bảng 3.3 Thành phần môi trường khảo sát nhân giống cấp 2 44

Bảng 3.4 Chất lượng của dịch gạo lứt thủy phân lên men lactic giàu kefiran 55

Bảng 3.5 Một số chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm bột gạo lứt lên men lactic giàu kefiran……… …….56

Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ maltodextrin đến chất lượng sản phẩm 56

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô nguyên liệu sấy đến chất lượng và hiệu suất thu hồi sản phẩm 57

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy phun đến chất lượng và hiệu suất thu hồi sản phẩm 58

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến chất lượng sản phẩm 60

Bảng 3.10 Kết quả phân tích sản phẩm sau quá trình sấy phun………60

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của kefiran 22

Hình 1.2 Cấu trúc của kefiran và kết nối tiểu cầu-kefiran được hiển thị bằng kính hiển vi quang học (Jenab et al., 2015) 24

Hình 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp HoPS 26

Hình 1.4 Sơ lược về sinh tổng hợp HePS 27

Hình 3.1 Khả năng tạo sinh khối và axit tổng số của các chủng vi khuẩn lactic 38

Hình 3.2 Khả năng tạo kefiran của các chủng lactic 39

Hình 3.3 Hình thái của chủng 40

Hình 3.4 Vị trí phân loại của chungrg với các loài có quan hệ họ hàng gần trong chi Lactobacillus dựa vào trình tự gen rRNA 16S 41

Hình 3.5 Gạo lứt sau khi được rang tại các nhiệt độ khác nhau 42

Hình 3.6 Khả năng sinh trưởng của chủng trên các môi trường nhân giống khác nhau 44

Hình 3.7 Khảo sát nhiệt độ và thời gian nhân giống trên môi trường RYGP

của chủng 46

Hình 3.8 Khảo sát tỉ lệ tiếp giống vào môi trường lên men 47

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ dịch gạo thủy phân

đến hàm lượng kefiran tạo thành 48

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ đường saccharose bổ sung

đến hàm lượng kefiran tạo thành 49

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men bổ sung đến hàm lượng kefiran tạo thành 50

Hình 3.12 Ảnh hưởng của việc bổ sung chất khoáng

đến hàm lượng kefiran tạo thành 51

Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH ban đầu môi trường lên men

đến hàm lượng kefiran tạo thành 52

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng kefiran tạo thành 53

Hình 3.15 Động học của quá trình lên men tạo kefiran của chủng 54

Hình 3.16 Quy trình sản xuất bột gạo lứt lên men lactic giàu kefiran……….……61

1

MỞ ĐẦU

Thực phẩm chức năng là một trong những ngành phát triển nhanh nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm thông qua các kết quả nghiên cứu về phòng chống bệnh liên quan đến chế độ ăn để giữ gìn sức khỏe của người tiêu dùng Do nhu cầu thị trường ngày càng tăng đối với thực phẩm chức năng, một số nguyên liệu thực vật đã được khai thác để cải thiện hương vị và chất lượng dinh dưỡng Các nhà khoa học thực phẩm hiện đang khám phá vai trò có thể của chế độ ăn uống trong việc phòng ngừa cá bệnh mãn tính Gạo lứt được xem là một trong những nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng tốt cho sức khỏe Nhiều nghiên cứu chứng minh gạo lứt có thể tăng cường chức năng não và làm giảm mức độ chất béo Có nhiều công trình nghiên cứu đánh giá mối liên hệ của việc sử dụng các loại ngũ cốc nguyên cám, trong đó có gạo lứt, với việc giảm các nguy cơ bệnh tim mạch Chất xơ trong gạo lứt giúp làm giảm thiểu thời gian lưu, tiếp xúc của các tác nhân gây ung thư với

tế bào ruột kết Nguồn selen dồi dào trong gạo lứt là thành phần thiết yếu trong trao đổi chất, nâng cao khả năng chống oxy hóa và khả năng miễn dịch của cơ thể con người Với chế độ ăn nhiều gạo lứt còn giúp giảm cân và giảm nguy cơ tiểu đường của nhóm phụ nữ tuổi trung niên Tuy nhiên, do còn lớp cám chứa nhiều cellulose nên gạo lứt khó nấu chín mềm khi ăn sẽ gây ra hiện tượng khó tiêu, chướng bụng nếu không được nhai kỹ Do đó, gạo lứt chưa được sử dụng nhiều và ở thị trường Việt Nam cũng chưa có nhiều sản phẩm tốt cho sức khỏe được sản xuất từ gạo lứt Kefir là loại đồ uống chức năng được lên men từ sữa và các loại hạt bởi hỗn hợp nấm men và vi khuẩn lactic Nó được đánh giá là dạng thực phẩm có lợi cho sức khỏe, đặc biệt tốt cho gan, hệ thống tim mạch, và nâng cao khả năng miễn dịch Trong quá trình lên men kefir, kefiran là một exopolysaccharide được sinh tổng hợp

ra nhờ vi khuẩn lactic có trong kefir Kefiran có tác dụng kháng khuẩn, làm lành vết thương, hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư, ngoài ra còn nhiều ứng dụng tốt được sử dụng trong dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng Tuy nhiên, kefir còn chứa nhiều cồn, dioxide carbon, lipid, đường lactose, có hương vị chưa phù hợp với

2

người châu Á và một số nhóm đối tượng người tiêu dùng không sử dụng được sản phẩm chứa cồn, đường lactose… Phương pháp lên men sữa gạo lứt sử dụng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp kefiran sẽ tận dụng được nguồn nguyên liệu phổ biến ở Việt Nam đồng thời cải tiến những yếu điểm của sản phẩm kefir Sản phẩm tạo ra có chứa đầy đủ các thành phần tốt từ gạo lứt, không chứa cồn, CO2, ít chất béo và giàu kefiran tốt cho sức khỏe người tiêu dùng

Với mong muốn tạo ra sản phẩm giàu kefiran từ nguồn nguyên liệu gạo lứt, góp phần làm đa dạng các sản phẩm từ gạo lứt trên thị trường, nhằm thay thế dần sản

phẩm nhập ngoại, nâng cao giá trị nông sản trong nước, đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất bột gạo lứt lên men lactic giàu kefiran” được thực hiện

Nội dung chính của đề tài gồm:

- Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng chuyển hóa tinh bột thành dạng exopolysaccharide (kefiran) trên môi trường dịch gạo lứt thủy phân

- Nghiên cứu xây dựng điều kiện sinh tổng hợp exopolysaccharide từ vi khuẩn lactic trên môi trường dịch gạo lứt thủy phân

- Nghiên cứu quy trình công nghệ phối chế, sấy tạo sản phẩm chế phẩm bột gạo lứt lên men lactic có hàm lượng exopolysaccharide cao

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về gạo lứt

Gạo lứt (còn gọi là gạo rằn hay gạo lật) là loại gạo

được xay bỏ lớp vỏ trấu, không xát bỏ lớp cám Gạo

lứt được đánh giá là nguồn thực phẩm có tác dụng rất

tốt cho sức khỏe con người Thành phần của gạo lứt

gồm có tinh bột, protein, lipit, giàu chất xơ, nhóm các

vitamin B (B1, B2, B3, B5, B6), các thành phần

khoáng như sắt, canxi, selen, magie, mangan, các

nguyên tố vi lượng như paraaminobenzoic (PABA), gamaaminobutyric acid (GABA) Lớp cám của gạo lứt còn chứa chất dầu đặc biệt có tác dụng điều hòa huyết áp, giảm cholesterol xấu, ngăn ngừa các bệnh về tim [5][6]

Việt Nam là nước nông nghiệp, luôn đứng ở tốp đầu trong các nước xuất khẩu gạo trên thế giới, với sản lượng lúa năm 2018 ước tính đạt 44 triệu tấn (theo Tổng cục Thống kê, 2018) Tuy nhiên, gạo và các sản phẩm từ gạo của Việt Nam mặc dù xuất khẩu với số lượng lớn, nhưng giá thành xuất khẩu luôn đạt thấp hơn so với khu vực do chất lượng sản phẩm còn đạt thấp Nguyên nhân chủ yếu là do chất lượng gạo của Việt Nam chưa cao, chưa có sự đa dạng hóa các sản phẩm từ gạo, các sản phẩm chế biến từ gạo chủ yếu được sản xuất dưới dạng tiểu thủ công nghiệp Trong các sản phẩm gạo của Việt Nam, gạo lứt được coi là loại gạo giàu chất dinh dưỡng nhất với nhiều công dụng khác nhau Gạo lứt và các sản phẩm từ gạo lứt hiện đang được quan tâm nhiều tại thị trường Việt Nam và chủ yếu vẫn được sử dụng ở dạng gạo nấu, dùng cho nhóm đối tượng ăn thực dưỡng, ăn chay, nhóm người bệnh ăn kiêng, do đặc điểm khó sử dụng của chúng Một số công ty đã nghiên cứu sản xuất một số sản phẩm từ gạo lứt như trà gạo lứt, bột gạo lứt nảy mầm, phở gạo lứt, bánh

đa gạo lứt… nhằm đa dạng hóa sản phẩm từ gạo lứt Tuy nhiên, phương pháp sử dụng gạo lứt để nấu cơm, hay sản xuất các sản phẩm đơn giản trên từ gạo lứt chưa

4

thực sự nâng cao được giá trị sử dụng cũng như giá trị kinh tế của gạo lứt, nguồn nông sản có giá trị chức năng cao, tốt cho sức khỏe con người

1.1.1 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của hạt lúa - gạo lứt

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong từng phần của hạt lúa [5]

Thành

phần Protein

Tinh bột Đường Cellulose Pentose Chất

béo Tro

Các chất khác Hạt 10,07 59,00 4,43 2,76 8,10 2,24 2,18 1,22 Nội nhũ 12,91 79,56 3,54 0,15 2,72 0,67 0,45 - Phôi 41,30 Rất ít 25,12 2,46 9,74 15,04 6,31 0,03

Bảng 1.2 So sánh thành phần của gạo lứt và gạo xát [5]

5

chung, thóc gạo có các thành phần như nước, glucid, protein, cellulose, lipid, vitamin, khoáng vô cơ và các enzyme Các thành phần hóa học của hạt lúa phân bố không đồng đều trong các phần của hạt nên khi chế biến cần tách những phần không có hoặc ít chất dinh dưỡng, đồng thời tận dụng hợp lý những sản phẩm phụ còn nhiều chất dinh dưỡng [5][6][7]

1.1.1.1 Nước

Nước là một thành phần quan trọng của thóc gạo Lượng nước trong hạt ở dạng:

tự do và liên kết Lượng nước tự do trong thóc gạo tính bằng phần trăm gọi là thủy phần của thóc gạo Thóc gạo càng chín, thủy phần càng giảm dần Giai đoạn lúa bắt đầu chín, thủy phần chiếm khoảng 65- 70%, nhưng sang giai đoạn lúa chín hoàn toàn, thủy phần giảm xuống chỉ còn 16- 21%.[5]

Thủy phần của thóc có liên quan chặt chẽ và ảnh hưởng trực tiếp đến sự thay đổi về chất lượng của thóc gạo trong quá trình bảo quản

1.1.1.2 Glucid

Glucid hay còn gọi là carbonhydrate Glucid là thành phần chủ yếu và chiếm tỷ

lệ cao nhất trong thành phần hạt thóc Glucid của hạt thóc gồm các monosaccharide (glucose, fructose) và disaccharide (saccharose) Các chất đường này thường tập trung ở nội nhũ của hạt Ngoài ra, glucid của thóc gạo còn có các polysaccharide tinh bột, cellulose và hemicellulose.[5]

Tinh bột là thành phần chính của nội nhũ hạt gạo Thành phần carbonhydrate không phải tinh bột trong cám và phôi cao hơn nội nhũ Gạo lứt chứa khoảng 75% carbonhydrate và chiếm khoảng 85- 90% chất khô của gạo Hàm lượng amylose khoảng 12- 35% trong gạo thường Gạo nếp có hàm lượng amylopectin cao nên khi nấu sẽ dẻo Tinh bột của thóc gạo được tạo ra từ amylose và amylopectin Tinh bột của gạo tẻ có khoảng 17% amylose và 83% amylopectin Thóc nếp chứa nhiều amylopectin hơn gạo tẻ, hạt gạo trong thường chứa nhiều amylospectin hơn hạt gạo dài Tinh bột là một loại polysaccharide, cấu tạo bởi phân tử amylose, dây thẳng (gồm các gốc α-D-glucose liên kết với nhau nhờ liên kết 1,4-glucoside có phân tử

6

lượng khoảng 100.000- 160.000 Da) và phân tử amylopectin, dây phân nhánh glucose liên kết với nhau nhờ liên kết 1,4-glucoside và liên kết 1,6-glucoside có trọng lượng phân tử tới 400.000 Da) [5]

(α-D-Tinh bột trong phôi nhũ có thể chia thành 2 vùng: vùng cận aleurone và vùng trung tâm Có 3 dạng protein gắn ở trên màng, thuộc vùng cận aleurone nhưng chỉ

có một dạng protein gắn ở vùng trung tâm Những tinh thể protein hình cầu cực bé trong vùng cận aleurone có đường kính 0,5-0,75µm Những tinh thể protein lớn hơn, hình cầu trên cả hai vùng, có đường kính 1- 2µm Tinh thể protein ở vùng cận aleurone bị phân giải bởi pepsin và protease Loại hình thứ ba của protein ở vùng cận aleurone là “crytasalline”, có đường kính 2- 3,5µm, bị loại thải bởi pepsin nhưng đôi khi lại kháng lại protease trong những điều kiện về pH [12]

Vùng trung tâm là những hạt tinh bột hình đa giác, có kích thước 3- 9µm Độ cứng của phôi nhũ khác nhau tùy theo giống lúa Độ cứng của tinh bột được đo bằng giá trị Vicker microhardness (kg/mm2) Tinh bột tự nhiên được giữ trong hạt tinh bột Hạt tinh bột có đa diện, đường kính khoảng 2- 10µm Hạt tinh bột có cấu trúc lớp, trong mỗi lớp các phân tử amylose và amylopectin xếp xen kẽ với nhau theo hướng hướng tâm Ở bề mặt hạt tinh bột còn có một ít protein, chủ yếu là các enzyme tổng hợp tinh bột

Cellulose và hemicellulose là hai hợp phần chủ yếu có trong vỏ trấu và một phần có trong lớp vỏ quả (lớp aleurone) Chúng là những chất có liên quan chặt chẽ đến chỉ tiêu chất lượng thóc gạo Vì đây là những phần mà con người không thể tiêu hóa được

Đường tự do trong hạt thóc chủ yếu là saccharose, ngoài ra còn có một ít rafinose, glucose, fructose

1.1.1.3 Protid

Hàm lượng protid của thóc gạo thay đổi trong một khoảng khá rộng từ 5,6- 18,2% Thóc gạo ở Việt nam có hàm lượng protid chỉ chiếm khoảng 6- 12% nhưng lại chứa đầy đủ các acid amin cần thiết không thể thay thế được

7

Bảng 1.3 Tỷ lệ các protein của các bộ phận trong hạt gạo [5]

Đơn vị: % trong tổng số protein

Thành phần Albumin Globulin Promalin Glutelin

1.1.1.4 Lipid

Trong lúa gạo, hàm lượng chất béo rất nhỏ và tập trung ở lớp cám, aleurone và phôi hạt với hàm lượng chiếm trên 2% Lipid tồn tại ở dạng các chất béo không no bao gồm acid oleic (43,2%), acid linoleic (30,6%) và acid béo no như palmitic (15,5%) và lượng nhỏ các acid béo khác như acid stearic, acid miristis, acid linostearic… Trong thành phần chất béo còn có lượng nhỏ photpho Do đặc điểm trên nên trong quá trình bảo quản, nếu gặp điều kiện nhiệt độ cao kèm theo thủy phần của thóc gạo cao, quá trình oxy hóa chất béo vẫn dễ dàng xảy ra biến chất và làm hư hỏng thóc gạo.[6][7]

1.1.1.5 Chất khoáng [16]

Các chất khoáng vô cơ tập trung ở vỏ trấu, hạt và phôi Chất khoáng nhiều nhất trong vỏ trấu là silic (Si), trong phôi hạt là photpho (P), kali (K), magie (Mg) Lượng photpho trong hạt lúa tồn tại chủ yếu dạng phytin (83%) và ở dạng nucleotic (13%)

1.1.1.6 Vitamin [16]

Trong lúa gạo, thành phần vitamin chủ yếu là các vitamin tan trong nước, còn các vitamin tan trong chất béo chỉ có một lượng không đáng kể Trong các nhóm

8

tan trong nước, chứa nhiều nhất là B1, kế đến là vitamin B2 và B6, PP, B12… và vitamin H Phần lớn lượng vitamin tập trung ở lớp vỏ hạt, lớp aleurone và phôi hạt Phần nội nhũ hạt chứa lượng vitamin rất ít Vitamin là thành phần dễ mất trong quá trình chế biến và bảo quản lúa hạt Phần nội nhũ hạt chứa rất ít vitamin Vitamin là thành phần dễ mất trong quá trình chế biến và bảo quản lúa gạo

Bảng 1.4 Thành phần vitamin trong các loại gạo [5]

Tùy thuộc vào nhiệt độ, pH môi trường và các chất xúc tác mà các enzyme này

có cường độ hoạt động khác nhau, gây cho thóc có những biến đổi về chất lượng nhất định Có loại enzyme xúc tác phản ứng làm tăng chất lượng thóc gạo, nhưng cũng có loại enzyme hoạt động làm cho thóc gạo bị giảm chất lượng nghiêm trọng

Ví dụ như enzyme phosphorylase xúc tác phản ứng tổng hợp nên tinh bột giúp hạt hoàn thiện hơn về mặt chất lượng trong quá trình chín sau thu hoạch Nhưng ngược

9

lại, enzyme hydrolase (amylase, lipase…) khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ thủy phân các acid hữu cơ phức tạp thành mầm, làm mất giá trị kinh tế của thóc

1.1.1.8 Mùi thơm của gạo [7]

Hương thơm trong gạo được tạo bởi 2-acetyl-1-pyroproline Tiêu chuẩn đánh giá theo Viện Lúa Quốc tế (IRRI) chia gạo thành 3 cấp: không thơm, hơi thơm, và thơm

1.1.1.9 Chất màu trong gạo lứt

Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định chất màu trong gạo lứt chính là anthocyanin, là chất màu thực vật thuộc nhóm flavonoid, nhưng có điểm khác cơ bản với flavonoid thông thường là không có nhóm cacbonyl ở C4 Có

3 nhóm anthocyanin chủ yếu là:

Pelargonidin (I): màu vàng cam hoặc hồng

Cyanidin (II): màu hồng xỉn

Delphinidin (III): màu đỏ hoặc tím

1.1.2 Một số tác dụng của gạo lứt

✓ Làm giảm lượng glucose trong máu:

Nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định rằng gạo lứt có khả năng kiểm soát

và làm giảm hàm lượng glucose trong máu của những người bị bệnh đái đường Lớp vỏ hạt và lớp alorong của gạo lứt có tác dụng làm giảm hàm lượng glucose trong máu, hàm lượng hemoglobin đã được glycosyl-hóa và cải thiện sự tổng hợp insulin ở các người bị bệnh đái đường type I và type II Các vitamin nhóm B, gamma-oryzanol, protein, các phức hợp carbohydrate, crôm, chất béo, chất xơ, các tocopherol, các tocotrienol và các chất kháng oxy hóa ở trong gạo lứt thảo dược đều đóng vai trò quan trọng và tích cực trong việc chuyển hóa glucose trong cơ thể, do

đó có thể kiểm soát, quản lý và điều hòa hàm lượng glucose trong máu ở người bị bệnh đái đường [5][6][7]

10

✓ Làm giảm cholesterol và phòng ngừa bệnh tim mạch:

Một số chất dinh dưỡng có trong gạo lứt thảo dược như chất xơ, carotenoid, phytosterolvà inositol hexaphosphate (IP6) đều có vai trò rất quan trọng trong việc phòng chống sự ngưng kết các tiểu huyết cầu và làm giảm hàm lượng cholesterol và triglyceride [5]

Theo nhiều nghiên cứu khoa học cho biết chất xơ trong gạo lứt giúp phòng ngừa các bệnh liên quan đến đường tiêu hóa và bệnh tim mạch

Các nhà khoa học đã tìm thấy ở trong chất cám bọc ngoài hạt gạo lứt có chất dầu tên là tocotrienol factor (TRF) có tác dụng trừ khử những chất hóa học gây nên hiện tượng đông máu và đồng thời giảm LDL-cholesterol (xấu) và làm tăng HDL-cholesterol (tốt) Bác sĩ Asaf Qureshi thuộc viện đại học Wisconsin, Hoa Kỳ đã thử nghiệm TRF trên một số người và cho kết quả giảm cholesterol từ 12 đến 16%

✓ Làm giảm nguy cơ của một số bệnh ung thư:

Nguyên nhân gây nên bệnh ung thư rất phức tạp, y học đã khuyến cáo mọi người, ngoài việc tránh các loại toxin (độc tố), cần phải ăn các loại thực phẩm lành,

an toàn vệ sinh thực phẩm, trong đó gạo lứt là một thực phẩm quan trọng nhất giúp phòng chống một số bệnh ung thư

Trong gạo lứt có chứa chất IP6 là một dược chất nổi tiếng có ích cho cơ thể Theo tạp chí Cancer, IP6 có hoạt tính chống ung thư rõ ràng và ngăn ngừa việc phát triển tế bào khối u trong ung thư đường ruột và ung thư gan Trong gạo lứt có chứa hàm lượng chất xơ cao, nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh mối liên quan hết sức mật thiết giữa việc cung cấp chất xơ cao trong chế độ ăn uống và việc giảm nguy cơ các bệnh ung thư ruột kết, ung thư vú Chất xơ cản trở việc phát triển các khối u bằng cách kết hợp với estrogen ở trong đường ruột và ngăn ngừa nó không bị tái hấp thụ ở trong dòng máu [7]

✓ Giảm cân ở những người bị bệnh béo phì:

11

Theo Tiến sĩ Nguyễn Thị Lâm, phó viện trưởng viện Dinh dưỡng quốc gia cho biết gạo lứt có chứa các thành phần có tác dụng hiệu quả với những người bệnh tiểu đường, rối loạn mỡ máu và đặc biệt là béo phì

Trong gạo lứt có chứa nhiều alpha lipoic acid được gọi là antoxidant chuyển hóa vì nó tham gia vào quá trình chuyển hóa hydratcarbon và chất béo Chất này có tác dụng làm giảm mỡ dự trữ, giảm béo thông qua sự tăng tự nhiên lượng glutathion

- một sản phẩm trung gian của insulin và liprin (hormone điều hòa trọng lượng cơ thể và mỡ dự trữ)

Ngoài ra, do chỉ được xay bỏ vỏ trấu mà giữ lại lớp cám lụa bên ngoài nên hạt gạo lứt vẫn giữ được hơn 90% chất dinh dưỡng đặc biệt là vitamin, các nguyên tố vi lượng có trong mỗi hạt gạo và rất giàu chất xơ Hàm lượng chất xơ trong gạo lứt cao gấp 2 lần so với gạo thường nên cơ thể sẽ tiêu hóa chậm hơn và mang lại cảm giác no lâu hơn

✓ Tăng hệ miễn dịch của cơ thể nhằm phòng chống các bệnh thoái hóa và chặn đứng hiện tượng lão hóa sớm:

Hệ thống miễn dịch trong cơ thể người có nhiệm bảo vệ cơ thể chống lại các yếu tố có hại như các vi sinh vật gây hại tấn công (vi khuẩn, vi rút, nấm, các loại ký sinh trùng) và chấm dứt việc hình thành và phát triển các tế bào bất bình thường Do

đó, hệ thống miễn dịch bảo vệ cơ thể người chống lại các loại bệnh tật và ốm đau Tuy nhiên, khi thiếu hụt chất dinh dưỡng, do ốm đau kéo dài, do các kim loại nặng hoặc do các chất độc hại cũng như do stress mà cơ thể chúng ta gặp hằng ngày có thể làm cho hệ thống miễn dịch bị suy yếu Việc tăng cường dinh dưỡng và hỗ trợ

hệ thống miễn dịch là một hoạt động cần thiết, đặc biệt là những người ở tuổi trên

50 bởi vì việc bảo vệ tự nhiên của cơ thể bị giảm sút theo tuổi tác

Các sterol và sterolin đều là những tác nhân hỗ trợ quan trọng giúp cho hệ thống miễn dịch của cơ thể chặn đứng các bệnh ưng thư, tiêu diệt các vi khuẩn, phá huỷ vi rút và làm chậm quá trình lão hóa Nồng độ sterolin và phytosterol ở trong gạo lứt cao, do đó nó có hiệu quả trong việc kháng vi rút và vi khuẩn

✓ Cải thiện chức năng của gan:

Trong gạo lứt có chứa nhiều chất dinh dưỡng có tác dụng hỗ trợ đặc biệt cho chức năng gan Inositol, phospholipid và vitamin nhóm B đều là những chất giải độc cho gan và cải thiện sự tái tạo tế bào gan Tocotrienol, gamma oryzanol và những chất kháng oxy hóa khác cũng có vai trò bảo vệ trong gan Ngoài ra, gạo lứt

có tác dụng giải độc cho cơ thể nên làm giảm nhẹ gánh nặng đối với gan.[7]

Hiện nay, một trong những sản phẩm thông dụng từ gạo lứt là bột gạo lứt có giá trị dinh dưỡng cho sức khỏe, do trong bột gạo lứt chứa nhiều chất dinh dưỡng, chất

xơ và vitamin giúp ngăn ngừa một số căn bệnh liên quan đến tim mạch, cải thiện quá trình tiêu hóa, Gạo lứt có hai lớp, đó là lớp cùi ở ngoài và lõi (nội nhũ), giá trị của gạo lứt nằm ở lớp cùi Lớp cùi chứa 65% hoạt chất quan trọng, trong đó có protein, phần nội nhũ chủ yếu là tinh bột chỉ có giá trị cung cấp năng lượng cho cơ thể[6] Do vậy, khi chúng ta sử dụng bột gạo lứt thô rang xay thông thường với thành phần chính là tinh bột nên hàm lượng hoạt chất đưa vào cơ thể rất ít Ngoài ra, bột gạo lứt dạng này có đặc điểm chứa rất ít axit amin hòa tan, chủ yếu là protein ở dạng liên kết không hòa tan với khả năng hấp thụ kém Do vậy việc nghiên cứu công nghệ tạo ra sản phẩm bột gạo lứt giàu axit amin có ý nghĩa thực tiễn, tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, dễ hấp thụ Ngoài ra bột gạo lứt còn chứa canxi, magie và kali có lợi cho sức khỏe Với hàm lượng dinh dưỡng và dễ tiêu hóa, bột gạo lứt giàu axit amin là một loại thực phẩm rất tốt cho người già yếu, trẻ em suy dinh dưỡng, phụ nữ có thai và cho con bú có tác dụng bảo vệ sức khỏe người tiêu

13

dùng như phòng ngừa bệnh tim mạch, béo phì, tăng cholesterol trong máu, ung thư, tiểu đường và cả bệnh thận, loãng xương Các axit amin có nguồn gốc từ gạo lứt có hương vị đặc trưng, không gây dị ứng so với các axit amin có nguồn gôc từ đậu tương, ngũ cốc khác [12] [13] Đã có nghiên cứu về tỷ lệ hiệu suất tăng trọng của protein được thử nghiệm trên chuột cho thấy đối với protein từ gạo là 2,18 so với protein thịt bò là 2,3, do vậy protein từ gạo được cho là nguồn axit amin có giá trị Các nghiên cứu gần đây cho thấy protein thủy phân có nguồn gốc từ gạo dễ dàng tiêu hóa hơn các dạng protein thực vật khác, số lượng axit amin cao như trong sữa

mẹ, chứa đầy đủ các thành phần axit amin, bao gồm cả các axit amin không thay thế [13]

1.2 Vi khuẩn lactic

1.2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, thử nghiệm oxydase và catalase âm tính, hình que hay hình cầu, không tạo bào tử, không di động, kỵ khí tùy tiện Kích thước và hình dạng có thể khác nhau ở các chủng khác nhau, và sự thay đổi có thể xảy ra trong quá trình sinh trưởng [2]

Vi khuẩn lactic có thể phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, nhưng hầu hết chúng đều phát triển ở nhiệt độ tối ưu 20 - 30°C, một số loài ưa nhiệt phát triển ở nhiệt độ cao hơn 50 - 55°C Vi khuẩn lactic có pH tối ưu cho hầu hết các vi khuẩn lactic là gần điểm trung tính (pH = 7,0) Chúng có khả năng sinh axit và chịu axit rất tốt nên chúng có thể chiếm ưu thế so với các vi sinh vật khác trong môi trường giàu dinh dưỡng, vậy nên chúng thường là đại diện tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn trong giai đoạn cuối của quá trình lên men [1][3]

Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả lên men của vi khuẩn lactic Là nhóm sinh vật đa khuyết dưỡng (polyauxotrophile) đối với nhiều axit amin, bazo nucleic và vitamin, do đó chúng có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tạp [1]

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau thì khác nhau, đặc biệt là

nhu cầu về vitamin và nitơ Trong đó, Lactobacillus được coi là nhóm vi khuẩn có

14

đòi hỏi về dinh dưỡng cao nhất Chúng đòi hỏi không chỉ các cơ chất phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn có nhu cầu rất lớn về các yếu tố cần cho sự phát triển như vitamin, muối vô cơ

1.2.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là lợi khuẩn được biết đến từ rất lâu trước đây và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là thực phẩm và y học Chúng cạnh tranh và đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh, giúp cân bằng hệ vi sinh vật tự nhiên trong đường ruột, tiết các enzym tiêu hóa giúp tăng cường chuyển hóa thức ăn [1], [3], [7] Ngoài ra, chúng còn làm giảm lượng cholesterol trong máu, chữa các bệnh rối loạn đường ruột, bệnh viêm dạ dày cấp tính và chống lại hiện tượng nhờn thuốc sau thời gian điều trị kháng sinh dài ngày, đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, vitamin cho người bệnh, cho những người ăn kiêng Những vi khuẩn lactic có lợi thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic Các vi khuẩn lactic trong chế phẩm probiotic có khả năng bám chặt vào màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của

vi sinh vật gây bệnh Chúng sản xuất các axit lactic làm giảm pH đường ruột, tạo môi trường không thuận lợi cho vi sinh vật có hại phát triển Ngoài ra, chúng còn sản xuất chất kháng sinh, sinh H2O2, sản xuất các enzym tiêu hóa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (B1, B2, B6, B12), khử độc tố trong đường ruột Cho đến nay, các nghiên cứu về vi khuẩn lactic trên thế giới đang rất được quan tâm, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm với rất nhiều sản phẩm lên men lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn với axit lactic là nguyên

liệu rất cần thiết của nhiều ngành công nghiệp Đặc biệt, trong công nghiệp chế biến

và bảo quản thực phẩm như sữa chua, các loại dưa từ rau củ, tự bacteriocin được sinh ra bởi vi khuẩn lactic đã thu hút được sự chú ý rất lớn đặc biệt là tiềm năng như chất bảo quản thức ăn trong nhiều thế kỷ qua, và sản xuất bacteriocin chúng có thể thay thế các chất bảo quản hóa học để phòng ngừa sự hư hỏng do vi khuẩn hoặc sự gia tăng của vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm [1], [7]

15

1.2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic

✓ Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống:

Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn Nếu tỷ

lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men

✓ Ảnh hưởng của pH:

Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của ion H+ và OH- trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt Chính vì vậy, trong quá trình lên men lactic khi axit lactic tích lũy đủ lớn thì ức chế luôn cả hoạt động của vi khuẩn lactic (pH < 3,8)

Nói chung quá trình lên men sẽ dừng lại khi pH đạt giá trị 4,0 Các loài vi khuẩn lactic khác nhau thì pH thích hợp khác nhau, dao động trong khoảng từ 4,5 - 6,5 nhưng một số lại có thể phát triển ở pH = 9,6 và một số hoạt động ở pH = 3,2

như Lactobacillus fermentum có thể chịu được pH = 3 Sự liên quan giữa pH và

hiệu suất lên men của vi khuẩn lactic còn là vấn đề mà các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu

Các vi khuẩn lactic khác nhau sẽ thích hợp với khoảng pH khác nhau:

Leuconostoc : 6,3 - 6,5

Pediocccus : 5,5

Lactobacillus, Lactococcus : 5,6 - 6,2

16

Trong quá trình lên men lactic sản phẩm sinh ra cũng làm giảm pH môi trường

Do đó, nó cũng gây ức chế tới sự phát triển của vi khuẩn lactic Mỗi loại có khả năng chịu được những pH thấp khác nhau:

Leuconostoc : pH ≤ 5

Pediocccus : pH ≤ 3,5 - 4,4

Lactobacillus : pH ≤ 3,2 - 3,5

✓ Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi sinh vật Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Mỗi loại vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ thích hợp để phát triển Như loại ưa

ấm, sẽ phát triển ở khoảng nhiệt độ 25 - 35°C như: Lactobacillus casei, Lactococcus lactic subsp lactis, Lactococcus lactis subsp cremoris, Leuconostoc ; loại ưa nhiệt

sẽ phát triển ở khoảng nhiệt độ 35 - 45°C như: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri

✓ Ảnh hưởng của oxy:

Nhìn chung các vi khuẩn lactic chịu được môi trường giàu oxy Nhưng có một vài loài (sống trong đường tiêu hóa của động vật) là yếm khí nghiêm ngặt như

Lactobacillus gasseri Khi có mặt của oxy các loại này không có khả năng

phosphoryl hóa, tổng hợp cytochrom, tổng hợp enzym Mặc dù các vi khuẩn lactic thường được gọi là các vi khuẩn yếm khí tùy tiện, thông thường các chuỗi vận chuyển electron không hoạt động nhưng quá trình oxy hóa khử DNA vẫn xảy ra Trong điều kiện hiếu khí, ở rất nhiều loại vi khuẩn lactic, phân tử DNA phản ứng với oxy để tạo nên H2O2 hoặc một phân tử nước nhờ NADH Trong quá trình lên men người ta thường sử dụng môi trường yếm khí để tránh nhiễm khuẩn từ môi trường bên ngoài và cho hiệu suất lên men tốt hơn

1.3 Kefir

1.3.1 Hệ vi sinh vật trong hạt nấm kefir [23], [25]

18

2 cm Hạt kefir là phức hệ vi sinh vật gắn với nhau bởi các polysaccharide Thành phần hợp thành hạt kefir là phức protein polysachharide béo, protein và carbohydrate

Phần ngoài của hạt kefir tập trung các tế bào vi khuẩn lactic, còn phía trong trung tâm thì nấm men là chủ yếu Ở vùng đệm, tỷ lệ vi khuẩn và nấm men thay đổi phụ thuộc vào khoảng cách tới bề mặt hạt kefir

Nhóm vi khuẩn lactic Lactobacillus chiếm khoảng 65 - 80% tổng số vi sinh vật

trong hạt kefir Chúng gồm các loài ưa ấm và ưa nhiệt, có thể thực hiện quá trình lên men lactic theo cơ chế đồng hình và dị hình

Kefir là kết quả của quá trình cộng sinh giữa các vi sinh vật có lợi là vi khuẩn lactic và nấm men Nó giống như probiotic, giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giúp việc tiêu hóa trở lên dễ dàng

Xuất phát từ sản phẩm sữa kefir lên men bởi vi khuẩn lactic và nấm men, các nhà nghiên cứu đã phân lập được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide, có kích thước phân tử tới hơn một triệu đơn vị đường glucose và galactose, từ nguồn ngũ cốc Exopolysaccharide, có nhiều ứng dụng tốt, được sử dụng như dạng dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng

1.3.2 Vai trò của khuẩn lactic trong hạt nấm kefir

Sữa được lên men chủ yếu là khu hệ vi khuẩn lactic và men sữa (Kefir) Dưới tác động của nhóm vi sinh vật này, đường lactose của sữa sẽ được chuyển hóa thành axit lactic và một lượng nhỏ rượu ethanol (nếu sử dụng men sữa) Còn protein trong sữa thì bị pepton hóa, sau đó chuyển thành các amino axit – những sản phẩm dễ tiêu hóa [23]

Thành phần môi trường có ảnh hưởng đến hình dạng tế bào (thường ở dạng hình cầu, hình que) Trong môi trường có hàm lượng rượu cao làm tế bào dài ra Rượu etylic còn có tác dụng kìm hãm sự phân chia tế bào mạnh hơn so với sự sinh trưởng của vi khuẩn Vi khuẩn lactic là thể kị khí, nhưng ở điều kiện hiếu khí chúng

19

vẫn sống và hoạt động kém [31][32] Một số vi khuẩn lactic điển hình ảnh hưởng đến quá trình lên men ở sữa:

Giống Streptocucus lactis có tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính

khoảng 0.5- 1 µm, sắp xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài Vi khuẩn này phát triển tốt trong môi trường sữa và một số môi trường pha chế từ sữa, trong khi lại phát triển kém trong môi trường nước thịt pepone Đây là loại vi khuẩn hiếu khí tùy tiện nên có thể phát triển sâu trong thạch và cho khuẩn lạc hình cây có nhánh Đặc điểm sinh hóa quan trọng là lên men glucose, lactose, maltose, galactose,

dextrin, không lên men saccharose Vì vậy, Streptococus lactis đóng vai trò quan

trọng trong công việc chế biến sữa chua Phát triển tốt ở nhiệt độ 30°C - 35°C, ở nhiệt độ này vi khuẩn gây đông tụ sữa chua 10- 12 giờ, độ axit giới hạn do

Streptococus lactis tạo nên thường dao động trong khoảng 110 - 120°T, mặc dù có

những chủng yếu chỉ tạo khoảng 90- 100°T Sữa được lên men chua bởi

Streptococus lactis luôn có hương vị đặc trưng của sản phẩm sữa chua

Giống Betabacteriu phát triển trên môi trường thạch tạo những khuẩn lạc giống

như khuẩn lạc trực khuẩn lactic ưa nhiệt Khi phát triển trong sữa, vi khuẩn này cho

ít axit, nếu cho dịch tự phân nấm men vào môi trường, vi khuẩn này phát triển hẳn lên, đường sữa bị lên men vởi vi khuẩn này không chỉ tạo thành axit lactic mà còn

tạo nhiều axit dễ bay hơi Trong sữa thường có hai loại chính là Betabacterium causasium và Betabacterium breve

Giống Leuconostoc là nhóm gồm những vi khuẩn lên men lactic điển hình

Chúng có dạng hình cầu đường kính từ 0.5- 0.8 µm và chiều dài khoảng 1.6 µm, nhưng trong môi trường axit chúng chọn ở hai đầu và dài ra sinh ra lượng axit có hạn vì thế không làm đông tụ sữa Trái lại, chúng hình thành từ các đường, acetyl metyl cacbonyl hoặc acetoin làm cho bơ thơm Loại vi khuẩn điển hình này là

Leuconostoc citrovosium được ứng dụng trong sản xuất bơ

Giống Lactobacillus có dạng hình que Đây là loại vi khuẩn lactic phổ biến

nhất Hình dạng của chúng thay đổi từ hình cầu méo ngắn cho đến hình que dài

20

Chẳng hạn Lactobacillus plantarum có hình dạnh que kích thước từ 0.7- 1.1 µm đến

3- 8 µm, sắp xếp thành chuỗi hoặc đứng riêng lẻ (Pederson, 1936), trong khi

Lactobacillus casei có dạng hình que ngắn hoặc hình que dài, tế bào hình que mảnh,

đôi khi hơi cong, sắp xếp thành cặp hay chuỗi

Tất cả sự khác nhau về hình thái tế bào này phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy Chiều dài tế bào thay đổi phụ thuộc rất lớn vào thành phần môi trường nuôi cấy, sự

có mặt của oxy cũng như điều kiện nuôi cấy

1.4 Exoplolysaccharide và những hiểu biết chung về Kefiran

1.4.1 Exopolysaccharide

Exopolysaccharide là một polymer có phân tử lượng lớn bao gồm các gốc đường, được tiết ra môi trường xung quanh trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Chúng tổng hợp một phổ rộng các polysaccharite đa chức năng bao gồm các polysaccharite nội bào, polysaccharide cấu trúc và polysaccharide ngoại bào hoặc exopolysaccharide (EPS) [28], [32]

Exopolysaccharide nói chung bao gồm các monosaccharide và một số nhóm các carbonhydrate (như acetate, pyruvate, succunate và phosphate) [27] Với những đặc tính đa dạng bởi sự kết hợp khác nhau giữa các gốc đường, exopolysaccharite đã được ứng dụng nhiều trong ngành công nghiệp thực phẩm và các ngành công nghiệp khác Các sản phẩm EPS do vi khuẩn tổng hợp qua quá trình đồng hóa có trạng thái dạng gôm keo hiện nay đang được đưa vào sử dụng trong kỹ thuật làm biofilm Việc tìm ra ngày càng nhiều hơn, phát triển mạnh hơn các sản phẩm có nguồn gốc từ EPS vi khuẩn đang trở thành cấp thiết đối với nhiều ngành công nghiệp mới

1.4.2 Chức năng và các dạng đặc trưng của EPS

Những lợi ích mà EPS do vi khuẩn lactic dản sinh ra đã được thừa nhận và chứng minh là tốt cho sức khỏe đối tượng sử dụng Tác dụng rõ rệt của EPS thể

21

hiện qua việc tạo thành một lớp vỏ bao bọc bên ngoài chống lại khả năng xâm nhiễm và sinh bệnh của vi khuẩn

Bảng 1.6 Danh sách các exopolysaccharide [22]

2 Alginate Azotobacter vinelandii

5 Curdlan Alcaligenes faecalis và Myxogenes

6 Cyclosophorans Agrobacterium spp, Rhizobium spp

và Xanthomonas spp

Leuconostoc dextranicum

8 Emulsan Lactobacillus hilgardii

9 Galactoglucopolysaccharide Acinetobacter calcoaceticus,

13 Hyaluronic acid Sinorhizobium meliloti

15 Kefiran Streptococcus equi, Lacobacillus

kefiranofacien

19 Scleroglucan Alcaligenes viscosus, Zymomonas

mobilis

20 Schizophyllan Aureobaidium pullulans

21 Schizophyllan Sclerotium rolfsii, Sclerotium

delfinii và Sclerotium glucanicum

22 Xanthan Schizophylum, Alcaligenes faecalis

campestris, Alcaligenes spp

22

1.4.3 Tổng quan về kefiran

Kefiran hay exopolysacarit (EPS), còn được gọi là polysacarit ngoại bào, được định nghĩa là các polyme carbohydrate có thể được sản xuất bởi các vi sinh vật khác nhau [10] Các biopolyme này được liên kết với các bề mặt tế bào ở dạng viên nang hoặc được tiết vào môi trường ngoại bào dưới dạng chất nhầy Vi tảo và vi khuẩn tạo ra một lượng lớn EPS, trong khi nấm men và nấm tạo ra một lượng nhỏ Một số

vi sinh vật thông qua quá trình lên men có thể tạo ra EPS với số lượng để sử dụng ở quy mô công nghiệp, bao gồm curdlan, xanthan và dextrangums

Exopolysacarit là có thể hòa tan trong nước có chuỗi dài hoặc phân nhánh gồm các monosacarit, chủ yếu là glucose, galactose, mannose và axit glucuronic hoặc các dẫn xuất của các loại đường này như rhamnose, theo các tỷ lệ khác nhau Các chất sinh học này được sử dụng làm chất nhũ hóa, chất ổn định, chất tạo keo, chất kết dính, chất bôi trơn, chất keo tụ và chất làm đặc, và chúng cũng được sử dụng trong sản xuất huyền phù và màng [22], [32] Những ứng dụng này dựa trên cấu trúc hóa học của các biopolymer

Hình 1.1 Cấu trúc của kefiran

EPS có thể thu được trong quá trình lên men của hạt kefir hoặc một số chủng

Lactobacillus trong một số môi trường như: sữa bò, sữa dê, sữa đậu nành, dịch

whey lactose [10], [22] Trong một nghiên cứu trước đây, người ta đã thấy rằng EPS thu được từ quá trình lên men của sữa đậu nành bao gồm các monome glucose và

23

galactose theo tỷ lệ 1,00: 0,43 Thành phần này được so sánh với thành phần monosacarit của polysacarit thu được từ kefir trong sữa bò, có tỷ lệ 1,00: 1,14 (glucose: galactose) [22]

Kefiran có nhiều tính chất, chức năng đặc biệt, nó có thể tạo thành gel ở nhiệt

độ thấp, vì vậy nó được sử dụng làm chất keo trong các ứng dụng thực phẩm Bên cạnh đó, các đặc tính chữa bệnh của kefiran như kháng nấm, kháng khuẩn, hoạt động chống oxy hóa, bảo vệ biểu mô và điều hòa miễn dịch đã thu hút sự chú ý như

là một chất bảo quản thực phẩm tiềm năng Do đó, việc sử dụng kefiran trong sản xuất màng bọc thực phẩm có tính chất cơ lý tốt, từ đó làm tăng thời hạn sử dụng, tăng chất lượng thực phẩm [26]

Kefiran cũng là thành phần chính trong các chất tạo màng sinh học Ghasemlou

et al (2011) đã nghiên cứu một màng ăn được mới chiết xuất từ kefiran, trong đó glycerol và sorbitol được sử dụng làm chất hóa dẻo Theo kết quả của họ, kefiran đóng vai trò cơ bản trong những màng phim ăn được này thông qua tác nhân tạo màng [19] [32]

Hoạt động chống oxy hóa Vì hoạt động chống oxy hóa của các chất chống oxy hóa là thông qua việc duy trì quá trình oxy hóa, chúng có thể bảo quản thực phẩm như các gốc tự do Do đó, kefiran đã được sử dụng như một chất bổ sung chống oxy hóa tự nhiên, nhờ hoạt động chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư của nó Một trong những ứng dụng đáng chú ý khác của kefiran là sử dụng kết hợp chitosan

và kefiran, làm màng tổng hợp, trong đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và tính chất

24

cấu trúc (bao gồm cả tính chất cơ học, tính chất vật lý và tính thấm hơi nước) Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung chitosan vào các màng này giúp cải thiện hoạt động chống oxy hóa, các tính năng vật lý, tính thấm hơi nước và tính chất quang học, bên cạnh việc tăng cường độ giãn dài khi đứt, độ bền kéo, biến dạng đâm và cường độ đâm thủng màng [22]

Kefiran có thể được sử dụng như một chất kháng khuẩn và làm lành vết thương, chống lại một số chủng gây bệnh có sức đề kháng cao Các nghiên cứu gần đây về

hoạt động kháng khuẩn của kefiran ở Staphylococcus aureus và chuột Wistar với

các tổn thương trên da đã cho thấy rằng cả hai đều cho thấy hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm cao đối với tất cả các sinh vật [32] Trong nghiên cứu này, hoạt tính

kháng khuẩn cao nhất của kefiran đã được báo cáo chống lại Streptococcus pyogenes Tương tự như vậy, các nghiên cứu cho thấy kefiran làm tăng hoạt tính

kháng nấm chống lại một số loài nấm sợi và hoạt động kháng khuẩn chống lại các loài vi khuẩn Chức năng kháng khuẩn tuyệt vời của kefiran đã được báo cáo chống

lại Fusarium graminearum CZ1 và Streptococcus faecalis KR6 Ngoài ra, do hoạt

động chống nấm của kefiran, nó đã ngăn chặn việc sản xuất aflatoxin B1 của

Aspergillus flavus AH3

Hình 1.2 Cấu trúc của kefiran và kết nối tiểu cầu-kefiran được hiển thị bằng

kính hiển vi quang học (Jenab et al., 2015)

a Các tinh thể được làm từ kefiran và polysacarit

b Kết nối tiểu cầu và kefiran bằng kính hiển vi quang học

25

Kefiran cũng thu hút sự chú ý đáng kể như một vật liệu sinh học và y học mới,

do tính tương thích sinh học và độ nhạy nước của nó Người ta đã phát hiện ra rằng kefiran có thể có hiệu quả đối với quá trình chuyển hóa cholesterol, phòng ngừa một

số bệnh ung thư và các hoạt động chống ung thư bằng cách uống Kefiran cũng có thể được sử dụng để tăng sản xuất interferon từ các tế bào động vật Xem xét các

đặc tính chống tăng sinh của kefiran, kefiran được sản xuất trong ống nghiệm của L kefiranaciens đã trình bày hoạt động chống ung thư tốt chống lại nhiều tế bào ung

thư như ung thư cổ tử cung và tế bào gan

1.4.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp kefiran ở vi khuẩn lactic [32]

Về cơ bản, tùy thuộc vào thành phần của các đơn vị lặp lại và con đường sinh tổng hợp, EPS có thể được phân loại thành hai loại: homopolysacaride (HoPS) hoặc heteropolysacaride (HePS) (Hình 1.1) [32] Khối lượng phân tử của HePS dao động

từ 104 đến 106 Da, thường thấp hơn khối lượng phân tử trung bình của HoPS (lên tới khoảng 107 Da) Mức sản xuất HePS từ LAB thường thấp hơn so với HoPS Ngoài ra, các vi sinh vật sản xuất không sử dụng EPS của vi khuẩn làm nguồn năng lượng

Sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn là một quá trình phức tạp bao gồm số lượng lớn enzyme và protein điều hòa Về cơ bản, quá trình sinh tổng hợp EPS có thể được chia thành ba bước chính: thứ nhất, chất nền carbon được đồng hóa Thứ hai, các polysacarit được tổng hợp vị trí nội bào và cuối cùng, chúng thoát ra khỏi tế bào Sinh tổng hợp EPS trong LAB có bốn bước chính bắt đầu từ vận chuyển đường vào tế bào chất, tổng hợp đường-1-P, trùng hợp các đơn vị tiền chất và cuối cùng là vận chuyển EPS bên ngoài tế bào

Tổng hợp Homopolysaccharide (HoPS) là một quá trình tương đối đơn giản Một số đặc điểm của tổng hợp HoPS là ở đây: không có giai đoạn vận chuyển tích cực trong con đường tổng hợp, không tiêu tốn năng lượng và yêu cầu sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào, các enzyme ngoại bào này được đặt tên là glycosyltransferase và fructosyltransferase (FTF hoặc fructansucrase)

Hình 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp HoPS

Vận chuyển đường, tổng hợp nucleotide đường, đơn vị lặp lại tổng hợp và trùng hợp các đơn vị lặp lại được hình thành trong tế bào chất là bốn bước chính của quá trình tổng hợp Heteropolysaccharide (HePS) [32] Cơ chế tổng hợp của Hee HePS phức tạp hơn Trong quá trình này, các đơn vị nucleotide tiền chất như UDP-GalNac, GDP-fructose, dTDPrhamnose, UDP-galactose và UDP-glucose được tổng hợp nội bào từ glucose-1-phosphate và fructose-6-phosphate Ngoài ra, một số enzyme và/ hoặc protein có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp và bài tiết HePS Các nucleotide đường có vai trò thiết yếu trong sinh tổng hợp HePS Tầm quan trọng của các nucleotide đường, có nguồn gốc từ đường-1-P là: vai trò của chúng trong hoạt hóa đường (Kích hoạt đường là cần thiết cho phản ứng trùng hợp monosacarit, xen kẽ đường (epime hóa, khử carboxyl, khử hydrat hóa và vân vân) Cùng với các enzyme kích hoạt và biến đổi đường đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành các khối xây dựng và thành phần EPS cuối cùng Sinh tổng hợp HePS là quá trình tiêu thụ năng lượng Đây là một số bước mà năng lượng được sử dụng trong quá trình này: Một ATP là cần thiết để chuyển đổi đường thành

27

phốt phát đường, cần một ATP khác để tổng hợp từng nucleotide và cần thêm một ATP nữa để phosphoryl hóa chất mang lipid C55 isoprenoid (Hình 1.3)

Hình 1.4 Sơ lược về sinh tổng hợp HePS

1.4.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất Kefiran hiện nay

Hiện nay, kefiran là dòng sản phẩm chức năng mới được sử dụng thông dụng tại Nhật Bản, Mỹ, Hàn Quốc, dưới dạng bột, viên nén, dạng sệt…, có tác dụng điều hòa glucose trong máu, điều hòa huyết áp, kháng vi sinh, nâng cao chức năng miễn dịch cũng như chức năng gan [18], [26], [27], [30] Kefiran đã được nhập khẩu vào Việt Nam, được sử dụng như thực phẩm chức năng hoặc thực phẩm thực dưỡng Thông thường, các sản phẩm kefiran thường được sản xuất từ nguyên liệu là sữa tươi từ động vật hoặc từ môi trường tổng hợp Điều đó dẫn đến việc chi phí cho nguồn nguyên liệu cao, nhiều người có khả năng dị ứng với nguồn lactose từ sữa hoặc không sử dụng sản phẩm từ động vật không thể tiếp cận đến sản phẩm Vì vậy, việc đánh giá, khảo sát quá trình lên men lactic giàu kefiran từ gạo lứt để tạo sản phẩm giàu kefiran có nguồn gốc từ các loại hạt giúp đa dạng đối tượng có thể tiếp cận sản phẩm Việc sử dụng dịch gạo lứt thủy phân cho quá trình lên men cũng đáp ứng được một phần về mặt dinh dưỡng cho vi khuẩn lactic phát triển Ngoài ra,

28

nguồn nguyên liệu là gạo lứt cũng được đánh giá là phổ biến và rẻ hơn nguồn dinh dưỡng là sữa Bên cạnh đó cũng tận dụng được nguồn nguyên liệu, đa dạng hóa sản phẩm từ gạo lứt của Việt Nam

Đối với sản phẩm bột gạo lứt lên men lactic đã có một số nghiên cứu của các nhóm tác giả quan tâm tới khả năng lên men lactic của vi khuẩn lactic trên môi trường gạo lứt [4] Nhóm tác giả từ trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã có một

số kết quả nghiên cứu tạo sản phẩm đồ uống lên men lactic từ gạo lứt [3] Tuy nhiên, đây là dòng sản phẩm đồ uống có chứa acid lactic tương tự dạng sữa chua nhưng trên môi trường gạo nên về cảm quan còn nhiều điểm chưa lôi cuốn được người tiêu dùng Sản phẩm này hoàn toàn khác với sản phẩm lên men kefiran bởi vi khuẩn lactic Các nghiên cứu này cũng chỉ dừng ở quy mô phòng thí nghiệm Hiện nay, chúng tôi chưa tìm thấy một công trình nghiên cứu trong nước liên quan tới lên men kefiran từ vi khuẩn latic trên môi trường gạo lứt tại Việt Nam Trên thị trường hiện nay, sản phẩm kefiran đã được nhập nhiều về Việt Nam cho các đối tượng ăn thực dưỡng, ăn chay, chữa bệnh, thậm chí một số khách hàng thuộc nhóm đối tượng khác cũng sử dụng thường xuyên sản phẩm kefiran như dạng thực phẩm chức năng

để phòng bệnh

Ngoài ra, trên thế giới cũng đã có một số nghiên cứu khả năng sản xuất kefiran của một số chủng lactic trên các môi trường khác nhau như môi trường tổng hợp, môi trường từ lactose, đậu nành, tiểu mạch Các nghiên cứu này đều cho kết quả khả quan về việc tạo các sản phẩm giàu kefiran có nguồn gốc khác với sữa động vật

29

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

- Gạo lứt Khang Dân (Oryza sativa L var Indica): được thu mua tại xã Xuân

Hồng, huyện Xuân Trường, tỉnh Nam Định

- Vi khuẩn: vi khuẩn lactic được phân lập từ nguồn nấm sữa Kefir thu thập trên địa bàn Hà Nội

- Enzyme thương mại: Termamyl SC, Dextrozyme GA, Neutrase 0,8L được cung cấp bởi công ty Novozymes (Đan Mạch) Đây là enzyme endo-amylase với độ hoạt động là 120 KNU-S/g

- Hóa chất: được cung cấp bởi Công ty Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Trung Quốc, Việt Nam

+ Hóa chất môi trường: Pepton, cao thịt, cao nấm men, glucose, saccharose, tween 80, K2HPO4, CH3COONa, Triamonium citrate, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, muối tinh…

+ Hóa chất phân tích: DNS, Na2CO3, CuSO4,C4H4K2O6.H2O, phenol, phenol reagent, cồn, phenolphtalein, K3Fe(CN)6, KOH, methylen blue, methyl orange, HCl, NaOH…

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

Các dụng cụ thí nghiệm sử dụng trong quá trình nghiên cứu được sự cho phép

từ Bộ môn Công nghệ lên men, Viện Công nghiệp thực phẩm

- Dụng cụ: pipetman, pipet thủy tinh, ống nghiệm nút xoáy, đĩa petri, que cấy, que trang, bình tam giác, lọ thủy tinh, đũa thủy tinh, cốc đong, bình định mức…

- Thiết bị: