Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích hệ miễn dịch của cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l ) vùng đồng bằng sông cửu long trên đối tượng cá tra tt

Đây là nguồn hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được nghiên cứu về mặt hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất có thể sử dụng làm thuốc phục vụ cho đời sống,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

LÊ THỊ BẠCH

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH HỆ MIỄN DỊCH

CỦA CỎ SỮA LÁ LỚN (Euphorbia hirta L.)

VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

TRÊN ĐỐI TƯỢNG CÁ TRA

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

TP Cần Thơ – Năm 2020

Công trình được hoàn thành tại:

+ Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Học viện Khoa học và

Công nghệ – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam + Trường Đại học Catholique de Louvain, Bỉ

+ Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: …

Người hướng dẫn khoa học 2: …

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Tính cấp thiết của luận án

Ngành thủy sản Việt Nam gần đây đã phát triển mạnh mẽ và giữ vai trò quan trọng trong xuất khẩu Tuy nhiên, đi đôi với việc phát triển nuôi trồng thủy sản thì dịch bệnh cũng bùng phát mạnh mẽ

và gây thiệt hại đáng kể Việc sử dụng thuốc và hóa chất sẽ gây ra nhiều trở ngại cho nghề nuôi như sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng nhiều, ô nhiễm môi trường nuôi, sự tồn lưu thuốc trên cá thương phẩm ảnh hưởng đến sức khoẻ của người tiêu dùng và cũng

là rào cản cho các doanh nghiệp Việt Nam trong xuất khẩu thủy sản

Để hạn chế dịch bệnh cũng như việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản, một số giải pháp được nhiều người quan tâm và

áp dụng trong các mô hình nuôi thủy sản Trong đó, sử dụng thảo dược để thay thế kháng sinh, tăng cường hệ miễn dịch cho vật nuôi

và kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm thủy sản đang là hướng đi mới cho ngành thủy sản hiện nay

Với sự khác biệt lớn về khí hậu, từ vùng gần xích đạo tới giáp vùng cận nhiệt đới, cùng với sự phân hóa cao về địa hình đã góp phần tạo nên sự đa dạng về hệ sinh thái nói chung cũng như hệ thực vật nói riêng ở Việt Nam Bên cạnh đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời sử dụng nhiều loại thảo dược trong điều trị bệnh và tăng cường sức khoẻ Đây là nguồn hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được nghiên cứu về mặt hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất có thể

sử dụng làm thuốc phục vụ cho đời sống, hướng nghiên cứu này đang được nhiều nhà khoa học quan tâm

Cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), theo Đông y có nhiều

tác dụng Ngoài ra, theo kết quả sàng lọc ban đầu trên tác dụng tăng cường hệ miễn dịch cá tra của 20 loài dược thảo, Cỏ sữa lá lớn thể hiện hoạt tính khá tốt Tuy nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài này ở Việt Nam chưa nhiều Do

vậy đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích

hệ miễn dịch của Cỏ sữa lá lớn vùng Đồng bằng sông Cửu Long trên đối tượng cá tra” được thực hiện nhằm đóng góp thêm những

hiểu biết về thành phần hóa thực vật cũng như tác dụng sinh học của

loài Cỏ sữa lá lớn ở Việt Nam

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu thành phần hóa học chủ yếu của Cỏ sữa lá lớn nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm ứng dụng trong thủy sản nói riêng hay cuộc sống nói chung

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

1 Sàng lọc các loài dược thảo có hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra;

2 Phân lập các hợp chất từ toàn cây Cỏ sữa lá lớn thu hái tại thành phố Cần Thơ;

3 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học;

4 Đánh giá hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa và hiệu quả bảo vệ tế bào MIN6

khỏi ER stress của các cao chiết và một số hợp chất sạch phân lập được

NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế

về các vấn đề:

 Đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của chi Euphorbia

 Đặc điểm thực vật, công dụng trong dân gian, thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.)

Toàn cây Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.) được thu hái vào

cuối tháng 2 năm 2016 tại thành phố Cần Thơ Tên khoa học được

TS Đặng Minh Quân - Bộ môn Sinh, Khoa Sư phạm, Trường Đại học Cần Thơ giám định và mẫu tiêu bản được lưu trữ tại đây

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

 Hóa chất

Bản mỏng tráng sẵn silica gel Merck 60 F254 và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck) Silica gel pha thường và silica gel pha đảo RP-18 Sắc ký lọc gel: Sephadex LH-20 (GE Healthcare) Dung môi

triển khai cột: n-hexane, CHCl3, EtOAc, BuOH, MeOH được chưng cất lại trước khi sử dụng

 Thiết bị

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AV-600, Bruker BioSpin Inc., Billerica, MA, USA, tại Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản

 Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy: SCIEX X500 QTOF tại Viện Hóa học TPHCM và Viện Công nghệ Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy MicroTOF, Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA, USA, tại Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản

 Phổ UV-Vis được đo trên máy Jasco V-730; Độ quay cực được đo trên thiết bị ADP 440; Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy Stuart Scientific SMP3 Các phân tích này đều được thực hiện tại Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp điều chế 20 loại cao tổng

Đối với 20 mẫu thực vật, lấy 100 g bột nguyên liệu khô đã nghiền nhỏ của mỗi loại, thực hiện quá trình ngâm dầm trực tiếp

trong dung môi ethanol (5 lần × 24 giờ mỗi lần) Dịch chiết ethanol được gộp chung lại và cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các cao chiết ethanol tổng tương ứng

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

Sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột (CC)

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc và định danh

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như phổ tử ngoại (UV-Vis), phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) đồng thời kết hợp phân tích, so sánh tài liệu tham khảo

2.2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

2.2.4.1 Hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

Nguồn cá thí nghiệm: Cá tra (50 ± 5 gram/con) được chuyển

về phòng thí nghiệm từ trại giống ở Vĩnh Long Cá khi đem về trại thực nghiệm được trữ trong bể composite có sục khí liên tục, cho ăn bằng thức ăn công nghiệp theo nhu cầu của cá và thuần hóa hai tuần trước khi tiến hành thí nghiệm Trước khi bố trí thí nghiệm, cá được kiểm tra ngẫu nhiên về hình dạng, kí sinh trùng, vi khuẩn

Bố trí thí nghiệm: Tế bào bạch cầu (5×106 tế bào/mL) thu từ thận và máu ngoại vi cá tra dựa theo phương pháp của Boyum (1968)

và Pierrard et al (2012) Ficoll Paque PLUS (1.077 g/mL, GE

Healthcare, Uppsala, Sweden) được sử dụng để phân lập tế bào bạch cầu Tế bào thu được đuợc nuôi trong môi trường L-15 (pH 7.4,

Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) có bổ sung 5% huyết thanh thai bò (fetal bovine serum-FBS, Invitrogen), 1% Hepes 20 mM và 1% kháng sinh streptomycin/penicillin 10 000 UI (Invitrogen) và nuôi ở 28ºC

Thí nghiệm bao gồm các nghiệm thức được bổ sung cao chiết (tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung các loại cao chiết tại 2 nồng độ 10 và 100 μg/mL) và 2 nghiệm thức đối chứng (tế bào bạch cầu thu từ thận và từ máu ngoại vi được bổ sung DMSO 1%), mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần Sau 24 giờ bổ sung các cao chiết, tiến hành phân tích các chỉ tiêu miễn dịch: xác định hoạt tính lysozyme, bổ thể và tổng kháng thể

2.2.4.2 Hoạt tính kháng khuẩn của Cỏ sữa lá lớn

Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử (cao chiết và các chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn) được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn thể hiện qua sự hình thành vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch tạo ra trên đĩa petri và nồng

độ ức chế tối thiểu (MIC)

Khả năng kháng khuẩn của các mẫu thử và kháng sinh (Vancomycin HCl và Cefixim) được tiến hành đối với năm chủng vi

khuẩn gây bệnh trên thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas dhakensis-D, Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, và Vibrio parahaemolyticus đươ ̣c cung cấp từ Viện nghiên cứu nuôi

trồng thủy sản 2, thành phố Hồ Chí Minh

2.2.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa

Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH, ABTS•+ đã được chọn sử dụng

để đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết và các chất sạch phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn Ngoài ra, phương pháp đánh giá khả năng kháng oxi hóa trên tế bào MIN6 cũng đã được tiến hành

2.2.4.4 Hoạt tính bảo vệ tế bào β tụy tạng khỏi ER stress

Thapsigargin (TG) 2 µM được dùng để gây chết tế bào Tác dụng của các cao chiết hay chất phân lập bảo vệ tế bào khỏi sự chết được đánh giá bằng cách so sánh thống kê tỷ lệ sống của nhóm tế bào được xử lý với TG sau đó xử lý thêm với cao chiết hay chất phân lập so với nhóm chỉ được xử lý với TG Tỷ lệ sống của tế bào được đánh giá bằng phương pháp so màu dựa trên hoạt tính của enzyme dehydrogenase

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Sàng lọc các đối tượng nghiên cứu theo định hướng hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra

Dựa vào kết quả khảo sát kinh nghiệm dân gian trong các hộ nông dân nuôi trồng thủy sản kết hợp với lược khảo tài liệu, 20 loài thực vật đã được thu hái từ các tỉnh khác nhau của vùng ĐBSCL và được tiến hành sàng lọc hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch cá tra

Bảng 3.1 Danh sách các cao chiết ethanol tổng thu được

Bộ phận nghiên cứu

Hiệu suất điều chế cao (%)

1 Dây vác Cayratia trifolia (L.)

Domin Sóc Trăng Phần trên mặt đất 7.51

2 Rau sam Portulaca oleracea L Vĩnh Long Toàn cây 5.73

8 Rau má Centella asiatica (L.)

9 Sài đất Wedelia chinensis

(Osbeck) Merr Cần Thơ Toàn cây 5.76

đắng Momordica charantia L Vĩnh Long Lá 5.98

15 Giấp cá Houttuynia cordata

17 Tía tô Perilla frutescen (L.)

Britt Cần Thơ Phần trên mặt đất 5.42

Dựa vào kết quả sàng lọc đạt được, loài cây Cỏ sữa lá lớn hứa hẹn nhiều tiềm năng sẽ phân lập được các hợp chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra, bổ sung dữ liệu về các loài dược liệu

có tác dụng hỗ trợ phòng và trị bệnh cho đối tượng nuôi trồng thủy sản Vì vậy, đề tài đã chọn Cỏ sữa lá lớn là đối tượng nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học, đồng thời cũng khảo sát thêm hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân lập được từ loài cây này

3.2 Chiết tách, phân lập các hợp chất từ Cỏ sữa lá lớn

3.2.1 Xử lý nguyên liệu và điều chế các cao phân đoạn

Từ kết quả sàng lọc của 20 cao chiết trên tế bào bạch cầu thu

từ máu và từ thận cá tra đã cho thấy các cao chiết Cỏ sữa lá lớn, Diệp

hạ châu thân xanh, Gừng, Sầu đâu, Tỏi… có nhiều tiềm năng cải thiện đáng kể hệ miễn dịch trên cá tra khi so sánh với đối chứng Tế

bào bạch cầu thu từ máu và từ thận đều tăng đồng thời cả ba chỉ tiêu miễn dịch với thời gian tối ưu của thí nghiệm được chọn là 24 giờ, ở hai loại nồng độ 10 và 100 µg/mL

Kết quả sàng lọc đã hứa hẹn nhiều tiềm năng to lớn của Cỏ sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra đặc biệt là tế bào bạch cầu thu từ thận Ngoài ra, Cỏ sữa lá lớn đã được nghiên cứu ở một số nước trên thế giới Tuy nhiên, ở Việt Nam loài cây này chủ yếu mọc hoang, chưa được sử dụng nhiều trong ngành dược phẩm nước ta Mặc dù loài Cỏ sữa lá lớn có nhiều tác dụng chữa bệnh trong dân gian, nhiều hoạt tính sinh học đáng quý lại dễ tìm kiếm nhưng còn rất ít công trình nghiên cứu ở Việt Nam Với những lý do trên, đề tài đã lựa chọn Cỏ sữa lá lớn để tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học, đồng thời đánh giá thêm một số hoạt tính sinh học của các cao phân đoạn và một số hợp chất sạch phân lập được từ loài cây này

3.4 Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập

Từ loài Cỏ sữa lá lớn (Euphorbia hirta L.), đề tài đã phân lập

và xác định được cấu trúc hóa học của 22 hợp chất sạch (Bảng 4.24),

trong đó có một hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên và bảy hợp chất lần đầu được phân lập từ loài cây này Cấu trúc của các hợp chất này đã được xác định dựa trên các phương pháp phổ nghiệm hiện đại

Bảng 4.24 Tổng hợp các hợp chất phân lập được từ Cỏ sữa lá lớn Chất mới

Các hợp chất thuộc nhóm flavonoid

Các hợp chất thuộc nhóm phenol

Hợp chất diterpenoid

Các hợp chất thuộc nhóm triterpenoid

Hợp chất steroid

Hợp chất khác

6'

OH HO

O O OH HO

4 5 6 7

2 nồng độ 10 µg/mL và 50 µg/mL Sau 24 giờ bổ sung mẫu thử, tiến hành phân tích các chỉ tiêu: lysozyme, bổ thể, tổng kháng thể để đánh giá ảnh hưởng của Cỏ sữa lá lớn lên đáp ứng miễn dịch của tế bào bạch cầu cá tra

Kết quả phân tích cho thấy các nghiệm thức sau 24 giờ bổ

sung cao tổng, cao MeOH và cao n-hexane Cỏ sữa lá lớn tại nồng độ

100 µg/mL có hoạt tính lysozyme tăng cao đáng kể so với đối chứng Trong đó, tăng cao nhất ở nghiệm thức bổ sung cao MeOH (tăng khoảng hơn 2 lần so với đối chứng) và khác biệt có ý nghĩa thống kê

so với nghiệm thức đối chứng (p<0.01) Ngoài ra, cao EtOAc và cao BuOH cũng làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme tại nồng độ thấp (10 µg/mL) trên tế bào bạch cầu thận cá tra Tại nồng độ 10 µg/mL, quercitrin đã làm tăng đáng kể hoạt tính lysozyme; trong khi

taraxerol và rutin tuy cũng có làm gia tăng hoạt tính này nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với đối chứng

Hoạt tính bổ thể của tế bào bạch cầu thận tăng rõ rệt khi bổ sung cao EtOAc, cao BuOH và rutin ở nồng độ 10 µg/mL (p<0.01)

Sau 24 giờ bổ sung các cao chiết hay hợp chất sạch phân lập được, hàm lượng tổng kháng thể của các nghiệm thức bổ sung cao tổng, cao MeOH và cao BuOH của Cỏ sữa lá lớn đều khác biệt rõ rệt

và có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng Trong đó, hàm lượng tổng kháng thể ở nghiệm thức bổ sung 10 µg/mL cao BuOH

đã tăng 2.0 lần so với đối chứng Hàm lượng tổng kháng thể đã tăng

đáng kể ở nghiệm thức bổ sung cao tổng, cao MeOH và cao

n-hexane ở nồng độ 100 µg/mL Tuy nhiên, các chất phân lập khảo nghiệm đều không có tác dụng tăng cường nhiều hoạt tính tổng kháng thể sau 24 giờ bổ sung vào tế bào bạch cầu thận cá tra

Như vậy, kết quả thí nghiệm đã cho thấy cao chiết Cỏ sữa lá lớn có khả năng tăng cường hoạt tính lysozyme, hoạt tính bổ thể cũng như cho thấy hàm lượng tổng kháng thể cũng tăng cao khi có

sự tác động của cao chiết Cỏ sữa lá lớn Điều này chứng minh tiềm năng to lớn của Cỏ sữa lá lớn trong việc hỗ trợ tăng cường hệ miễn dịch trên cá tra

3.6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn

Khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết và chất phân lập

từ Cỏ sữa lá lớn được khảo sát trên năm chủng vi khuẩn gây bệnh

trên thủy sản: Aeromonas hydrophila-N, Aeromonas dhakensis-D, Aeromonas hydrophila-D, Aeromonas dhakensis-W, và Vibrio parahaemolyticus